11 AULAaa AULA
INTRODUÇÃO AO LABORAT
INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO ÓRIO E SOLUÇÕESE SOLUÇÕES INSTRUÇÕES
INSTRUÇÕES
1.
1. Lembre-sLembre-se que o laboratóre que o laboratório é um io é um lugar para trablugar para trabalhos séalhos sérios e não para bririos e não para brincadeirncadeiras.as. 2.
2. Leia os guiaLeia os guias das prátis das práticas com antecedêcas com antecedência para obter melhor aprncia para obter melhor aproeitamento das auloeitamento das aulas.as. !.
!. "eali#"eali#e somente os e$pee somente os e$perimentos indrimentos indicados na aicados na aula. %ão é permitiula. %ão é permitido reali#ar aqueldo reali#ar aqueles nãoes não autori#ados.
autori#ados. &.
&. 'e'endo qualqndo qualquer d(ida solicite aos pro)essuer d(ida solicite aos pro)essores os deidoores os deidos esclarecs esclarecimentos.imentos. *.
*. +ompare,+ompare,a s aulas nos dia s aulas nos dias e nos laboras e nos laboratórios deatórios designasignados para sudos para sua turma.a turma. .
. %ão é pe%ão é permitido )umar ou conrmitido )umar ou consumir alimentosumir alimentos durants durante as aule as aulas práas práticas.ticas. /.
/. 0ara su0ara sua própria própria seguraa seguran,a ista um guarda-n,a ista um guarda-pó aental3 ao entrpó aental3 ao entrar no laboratar no laboratório.ório. 4.
4. %ão %ão troque troque os os reagereagentes ntes de ude uma mesma mesa a para para outra.outra. 5.
5. %o )inal de cada aula limp%o )inal de cada aula limpe e todtodo o o o matematerialrial6 6 0as0asse águse água de a de torntorneireira a nos tunos tubos e outrobos e outross materiais utili#ados. As pipetas deem ser colocadas dentro das cubas.
materiais utili#ados. As pipetas deem ser colocadas dentro das cubas. 17.
17. 8uando h8uando houer quebra ou douer quebra ou danos noanos nos materiais materiais ou aparelhs ou aparelhos comunios comunique aos proque aos pro)esso)essores.res. 11
11.. 9e eng9e engolir um pouco de áolir um pouco de ácido lae rapidcido lae rapidamente a bocamente a boca com bastaa com bastante águnte água e em seguia e em seguidada com solu,ão de carbonato de sódio 2:.
com solu,ão de carbonato de sódio 2:.
PRINCÍPIOS DE TÉCNICA PRINCÍPIOS DE TÉCNICA
a.
a. 0ipetas g0ipetas graduadraduadas não deem ser sopas não deem ser sopradas aradas ao )im o )im do escodo escoamento. 0ortamento. 0ortanto recomenanto recomenda- da-se empre
se empregagar r o o cocome,me,o o o o #e#eroro3 3 e e nãnão o o o )im )im da da grgradaduaua,ã,ão o papara ra didispspenensasar r ololumeumess pequenos.
pequenos. b.
b. Uma mesma pipeta não pode sUma mesma pipeta não pode ser usader usada para medir solu,a para medir solu,;es di)eren;es di)erentes a não ser qutes a não ser que se<ae se<a laada.
laada. c.
c. %un%unca aqca aquecuecer mateer material olrial olumétrumétrico.ico. d.
d. Antes Antes de retirde retirar de um )rasco uma sar de um )rasco uma solu,ão qolu,ão qualquerualquer ler o rótul ler o rótulo.o. e.
e. 0ar0ara a asaspirpirar ar solsolu,;u,;es de es de áciácidos e dos e álcálcalis concalis concentrentradoados usar uma s usar uma pippipeta de eta de segsegurauran,an,a pera3 antes testada com água.
pera3 antes testada com água. ).
). %unca %unca deoler uma solu,ão deoler uma solu,ão para para o o )rasco est)rasco estoque.oque.
UNIDADE DE VOLUME UNIDADE DE VOLUME
A unidade
A unidade )undamental )undamental de de olume olume na na medida medida de de l=quidos l=quidos é é o o litro litro l3 l3 e e o mo mililitro ililitro ml3 ml3 é é o o seuseu subm(ltiplo correspondente milésima parte do litro.
subm(ltiplo correspondente milésima parte do litro.
MATERIAIS FUNDAMENTAIS DE LABORATÓRIO MATERIAIS FUNDAMENTAIS DE LABORATÓRIO VIDRARIA
VIDRARIA - - >e um >e um modo geramodo geral enconl encontramtramos num laboraos num laboratóritório de o de 8u=m8u=mica dois tipoica dois tipos des de material de idro olumétrico e não olumétrico. >entre os olumétricos temos6 pipetas material de idro olumétrico e não olumétrico. >entre os olumétricos temos6 pipetas proetas e bal;es olumétricos.
proetas e bal;es olumétricos.
PIPETAS
PIPETAS - - 9ão de9ão destistinadnadas a tranas a trans)ers)erir deterir determinaminados oldos olumes de l=qumes de l=quido. ?á douido. ?á dois tipis tipos6os6 graduados e olumétricos. %estas práticas só pipetas graduadas são usadas. @las têm graduados e olumétricos. %estas práticas só pipetas graduadas são usadas. @las têm olumes de 1 2 * e 17 ml e permitem escoar olumes ariáeis de l=quido de acordo olumes de 1 2 * e 17 ml e permitem escoar olumes ariáeis de l=quido de acordo com a sua gradua,ão diidida em décimos ou centésimos de ml.
com a sua gradua,ão diidida em décimos ou centésimos de ml.
PROVETAS
PROVETAS - - +i+ilindlindros ros gradgraduadouados3 - 9s3 - 9ão de mão de mediedida oluda olumétrimétrica não ca não muito rmuito rigoigorosrosaa graduadas para diersos olumes de l=quido6 2* *7 177 2*7 ... ml.
graduadas para diersos olumes de l=quido6 2* *7 177 2*7 ... ml.
BA
BALÕES LÕES VOLVOLUMÉUMÉTRICTRICOSOS - - 9ã9ão o babal;l;es a)es a)ererididos a os a )i)im m de code contntererem um em um oolulumeme determinado por um tra,o de re)erência *7 177 2*7 *77 ... ml3. 9ão usados no determinado por um tra,o de re)erência *7 177 2*7 *77 ... ml3. 9ão usados no preparo de solu,;es que e$i<am grande e$atidão na sua concentra,ão. %o entanto para preparo de solu,;es que e$i<am grande e$atidão na sua concentra,ão. %o entanto para esta e$atidão ser garantida todas as opera,;es de preparo de solu,;es deem ser esta e$atidão ser garantida todas as opera,;es de preparo de solu,;es deem ser )eitas na temperatura do a)erimento do material olumétrico geralmente 27
)eitas na temperatura do a)erimento do material olumétrico geralmente 27oo +. +.
MA
MATERIAL NÃO VOLUMÉTRICOTERIAL NÃO VOLUMÉTRICO
s principais tipos de idraria utili#ados nestas práticas são6 tubo de ensaio béquer s principais tipos de idraria utili#ados nestas práticas são6 tubo de ensaio béquer B%'">UCD A LAE"A'F"B @ 9LUCG@9
1a AULA erlenmeHer e )unil. 9ão também )reqIentemente usados estantes e pin,as para tubos de ensaio.
TÉCNICA DE LEITURA DE MATERIAL VOLUMÉTRICO
Ja#-se pela obsera,ão da coincidência entre a curatura que se )orma na super)=cie lire do l=quido menisco3 e a gradua,ão e$istente no material olumétrico. A parte in)erior do menisco dee coincidir com o tra,o de gradua,ão correspondente ao olume dese<ado. 0ara eitar erro sua ista o menisco e o tra,o de gradua,ão deem estar num mesmo plano hori#ontal.
VELOCIDADE DE ESCOAMENTO
9e o escoamento )or muito rápido soprando na pipeta por e$emplo3 a quantitade de l=quido que resta na pipeta aderido s paredes será maior do que a que dee )icar. +om água considera-se o que o tempo m=nimo para o escoamento total de pipetas de 1 ml e * ml dee ser de 1* segundos.
EXPERIÊNCIAS
Treinaen!" #" $i$e!a% - 0rocure identi)icar as pipetas de di)erentes capacidades e gradua,;es 1 2 * e 17 ml3 que estão em sua bancada. Ja,a então os e$erc=cios seguintes come,ando com uma pipeta de 17 ml6
Bntrodu#a a e$tremidade in)erior da pipeta em água destilada contida em um béquer. Aspire com a boca até que o n=el da água ultrapasse o tra,o superior da a)eri,ão #ero3. 'ire rapidamente a boca da abertura da pipeta e obture a mesma com o indicador da mão direita. >iminua a pressão e$ercida pelo indicador sobre a abertura de modo a dei$ar a água cair&"!a a &"!a até que a parte in)erior do menisco coincida com o #ero mantendo a pipeta na ertical e a marca no n=el dos olhos3. Acertado o #ero comece então a escoar lentamente olumes ariáeis 17 ml 5 ml 4 ml / ml ml3 acertando a cada e# o menisco no #ero.
REPITA O EXERCÍCIO
+om uma pipeta de * ml escoando6 * ml - & ml - ! ml - 2 ml. +om uma pipeta de 2 ml escoando6 2 ml - 1/ ml - 1* ml - 1 ml.
LEMBRE'SE
Kolumes compreendidos entre 17 e * ml deem ser trans)eridos com uma pipeta de 17 ml olumes entre * ml e 2 ml deem ser trans)eridos com uma pipeta de * ml olumes entre 2 e 1 ml com uma pipeta de 2 ml e olumes entre 1 e 71 ml com uma pipeta de 1 ml.
SOLUÇÕES
As principais maneiras de de)inir a concentra,ão de uma solu,ão são atraés da percentagem da molaridade ou da normalidade.
Uma solu,ão percentual contém uma quantidade medida do soluto numa determinada quantidade do solente. s três principais tipos de solu,;es percentuais resultam da de)ini,ão destas quantidades por peso ou por olume6
1 - 9olu,ão percentual peso por olume - : p - @$.6 solu,ão de cloreto de sódio 2: 2 g do sal em 177 ml da solu,ão3
2 - 9olu,ão percentual peso por peso - : pp - @$.6 solu,ão de ácido clor=drico !/: !/ g do ácido em 177 g da solu,ão3
! - 9olu,ão percentual olume por olume - : - @$.6 solu,ão de ácido acético *: * ml do ácido em 177 ml da solu,ão3
Uma solu,ão molar é aquela que contém o peso molecular do soluto em gramas por
1a AULA litro de solu,ão. M representada por 1 N ou N. 0ode haer m(ltiplos ou subm(ltiplos do peso molecular 6 2 N - & N - 71 N - 72 N etc. Uma solu,ão N de cloreto de sódio contém *4* g p.m.3 do sal em um litro. Uma solu,ão 2 N conterá 2$*4*g O 11/ g. Uma solu,ão 71 N conterá *4* g.
9olu,;es normais são aquelas que contém um equialente-grama do soluto por litro de solu,ão. 0odemos ter m(ltiplos e subm(ltiplos do equialente-grama6 1 % 2 % 71 %... cálculo do equialente-grama depende da nature#a qu=mica do soluto. 9e um ácido calcula-se diidindo o peso molecular pelo n(mero de átomos de ? ioni#áeis. @$.6 sol. ?+l 1 % !* gl3P sol. ?+l 71 % !* gl3P sol. ?29& 1 % 542 O &5 gl3.
EXPERIÊNCIA ' PESA(EM E PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO
0reparar 2* ml de uma solu,ão de cloreto de sódio 27 : p.
TÉCNICA
+oloque todos os pesos da balan,a em #ero.
ponteiro dee estar no centro posi,ão de equil=brio.
9obre o prato coloque um béquer. bsere que o ponteiro deslocou-se para cima. Noa os pesos das escalas até restabelecer o equil=brio. 0or e$emplo se o béquer pesou 4 g o peso da escala de 17177 g deerá estar em 7 e o da escala 117 g em 4.
Anote o peso do béquer6 QQQQQQQQQQ
Ao peso do béquer some a quantidade de %a+l necessária para se preparar 2* ml da solu,ão a 27 : p.
Anote o resultado do cálculo béquer R %a+l6 QQQQQQQQQQQ
>esloque os pesos da balan,a até obter o total calculado. bsere que o equil=brio da balan,a )oi des)eito. 0ara restabelecê-lo adicione %a+l ao béquer. 'emos assim pesada a quantidade de sal necessária para se preparar os 2* ml da solu,ão a 27:.
Pre$ara)*" +a %",-)*"
Ao cloreto de sódio contido no béquer <unte cerca de 17 ml de água destilada. Nisture com bastão de idro até dissoler. 'rans)ira a solu,ão do sal para uma proeta de 2* ou *7 ml tomando cuidado para não perder l=quido. Ao béquer adicione * ml de água destilada e trans)ira para a proeta. +omplete o olume até a marca de 2* ml com água destilada não dei$ando ultrapassar a marca.
OBSERVAÇÕES
%as ciências modernas a tendência é substituir o termo peso por massa.
As quantidades de)inidas por olume são su<eitas a altera,;es signi)icatias pela temperatura. @m ambientes onde a temperatura não pode ser controlada rigorosamente é recomendáel de)inir todas as quantidades pelas massas.
SOLUÇÕES'TAMPÃO
'amp;es são solu,;es que resistem a aria,;es de p?. 9ão constitu=dos de ácidos )racos e seus sais ou de bases )racas e seus sais. @$.6 tampão acetato ácido acético R acetato de sódio3.
MECANISMO DE AÇÃO
Kamos tomar como e$emplo o tampão acetato.
9e a este tampão se adicionar um ácido )orte como o ?+l haerá )orma,ão de um sal
1a AULA neutro e de um ácido )racamente ioni#ado e o p? da solu,ão permanecerá quase o mesmo.
+?!+?
+?!+%a R ?+l → %a+l R +?!+?
sal neutro3 ácido )raco3
9e ao mesmo tampão adicionarmos uma base )orte como o hidró$ido de sódio haerá )orma,ão de acetato de sódio menos alcalino que o %a?3 e água. 'ambém neste caso o p? quase não se modi)icou.
+?!+? R %a? →+?!+%a R ?2 +?!+%a
TAMPÕES FISIOLÓ(ICOS
Um dos mecanismos de controle da neutralidade dos l=quidos celulares é deido a,ão de tamp;es. s principais tamp;es que estabili#am o p? do sangue na )ai$a de /!* a /&* são6 bicarbonatoácido carbSnico )os)ato e hemoglobina. A manuten,ão deste p? é importante porque alores de p? acima de // ou abai$o de 4 são incompat=eis com a ida.
EXPERIÊNCIAS COM TAMPÕES
>istribuir em quatro béquers marcados6 Eéquer 1 e 26 2* ml de água destilada
Eéquer ! e &6 2* ml de sol. tampão acetato 71 % p? *.
Nedir com papel indicador o p? apro$imado dos l=quidos dos & béquers. Anotar o resultado no quadro a seguir.
Aos béquers 1 e ! adicionar em cada uma gota de ?+l concentrado. Aos béquers 2 e & adicionar em cada uma gota de sol. %a? *7:.
Nisturar por lee agita,ão.
Nedir com papel indicador o p? dos l=quidos em cada béquer e anotar.
B./-er $0 ini#ia, $0 a$1% 0C, $0 a$1% NaO0
2 3 4 5
Easeado nos resultados da tabela o que concluiuT
2a AULA
AMINO6CIDOS 27 REAÇÃO XANTOPROTÉICA
0esquisa de 'irosina e 'ripto)ano
@sta rea,ão é positia com compostos portadores de radicais aromáticos substitu=dos. %as prote=nas estes radicais aparecem na tirosina e no tripto)ano.
'irosina 'ripto)ano
s radicais aromáticos destes aminoácidos reagem com o ácido n=trico )ormando nitroderiados que em meio alcalino são alaran<ados.
TÉCNICA
Narcar ! tubos de ensaio e colocar em cada um as seguintes substncias6 Ao no 1 - <untar 1 ml de ooalbumina
Ao no 2 - <untar 1 ml de amido
Ao no ! - <untar 1 ml de água tubo controle3
Adicionar a cada tubo 17 gotas de ácido n=trico concentrado muito corrosioP usar pipeta de * ml e apenas com imersão da ponta não com aspira,ão3. Agitar leemente e colocar no banho-maria )erente por * min. @s)riar em água corrente e acrescentar & ml de %a? 2 %. Anotar os resultados em )orma de tabela como segue marcando com um sinal R os3 testes3 positios3 e com um sinal - os negatios6
'ubo "ea,ão
1 2 !
aparecimento de colora,ão alaran<ada indica a positiidade do teste con)irmando a presen,a dos aminoácidos tirosina e tripto)ano. %as condi,oes descritas a )enilalanina não reage.
37 REAÇÃO DE MILLON
0esquisa de tirosina.
@sta rea,ão é deida a presen,a do grupo hidro$i)enil. %as prote=nas o (nico grupo deste tipo é encontrado no aminoácido tirosina. teste de Nillon usa como reagente o nitrato de merc(rio dissolido numa solu,ão de ácido n=trico. grupo hidro$i)enil produ# um )enolato de merc(rio de cor aermelhada.
TÉCNICA
Narcar ! tubos de ensaio e colocar em cada um as seguintes substncias6 Ao no 1 - <untar 1 ml de ooalbumina
Ao no 2 - <untar 1 ml de )enol 1 :
Ao no ! - <untar 1 ml de água tubo controle3
2a AULA Adicionar a cada tubo * gotas do reatio de Nillon corrosio e tó$ico3. Agitar leemente e colocar no banho-maria )erente por * min. @s)riar em água corrente e anotar os resultados em )orma de tabela como anteriormente. 8ue concluiu T
47 REAÇÃO DO BIURETO
"ea,ão geral para prote=nas.
@sta rea,ão é denominada Wdo biuretoXporque um composto chamado biureto é o mais simples que apresenta este teste positio. biureto é um composto arti)icial obtido pelo aquecimento )orte de uréia e tem a seguinte )órmula6
?2% - + - %? - + - %?2 Eiureto
biureto é o composto mais simples capa# de reagir em meio alcalino com cobre dialente produ#indo um comple$o de cor ioleta. utros compostos com duas liga,;es amida dispostas de maneira semelhante ao biureto respondem de maneira semelhanteP portanto obseramos a rea,ão do biureto principalmente com as prote=nas que têm muitas liga,;es pept=dicas6
- %? - +?" -CO ' N0 - +?" - CO ' N0 - +?" - CO ' N0 - +?" - CO ' N0 +?" +
-Liga,;es pept=dicas
s comple$os coloridos )ormados com cobre dialente em meio alcalino têm estruturas parecidas6
+omple$o +(prico do Eiureto +omple$o +(prico da 0rote=na
A rea,ão das prote=nas com o reatio do biureto não é muito sens=el porém é tão segura que ela é usada como re)erencial para a dosagem da concentra,ão protéica no plasma e soro do sangue humano.
TÉCNICA
Narcar ! tubos de ensaio e colocar em cada um 2 ml do reatio do biureto sul)ato c(prico comple$ado com tartarato em meio alcalino3.
Ao no 1 - <untar 1 ml de ooalbumina Ao no 2 - <untar 1 ml de amido
Ao no ! - <untar 1 ml de água tubo controle3
Nisturar por lee agita,ão dos tubos esperar 17 minutos anotar os resultados em )orma de tabela.
!a AULA
PROTEÍNAS REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
As prote=nas podem ser precipitadas de suas solu,;es por a,ão de ácidos )ortes por solu,;es concentradas de sais p.e. sul)ato de amSnio3 por solentes orgnicos p.e. álcool3 e ainda por sais de metais pesados em determinadas condi,;es. Ainda que super)icialmente parecidas as rea,;es de precipita,ão de prote=nas podem ter mecanismos muito di)erentes. A precipita,ão de prote=nas acompanha-se quase sempre de uma desnatura,ão das mesmasP no entanto s e#es esta mudan,a de con)orma,ão é reers=el. 0or outra lado e$istem )ormas de desnatura,ão irreers=el p.e. com bases )ortes ou detergentes3 que não leam as prote=nas precipita,ão.
27 PRECIPITAÇÃO PELO 6CIDO TRICLOROACÉTICO
Vcidos )ornecem =ons negatios e precipitam as prote=nas sob )orma de saisP no entanto este mecanismo em associado com uma destrui,ão daquelas partes da con)orma,ão natia que dependem de pontes de hidrogênio e de liga,;es iSnicas. A atiidade de ácidos particularmente e)icientes para precipitar prote=nas como p.e. os ácidos tricloroacético t(ngstico e p=crico e$plica-se porque estes reagentes atacam adicionalmente os centros hidro)óbicos das prote=nas.
TÉCNICA
Narcar ! tubos de ensaio e colocar em cada um 2 ml de ooalbumina. 0osteriormente adicionar em cada um as seguintes solu,;es cuidado36
Ao no 1 - <untar 1 ml sol. ácido acético 27 : Ao no 2 - <untar 1 ml sol. ácido clor=drico 27 : Ao no ! - <untar 1 ml sol. ácido tricloroacético 27 :
Agitar e misturar bem. bserar e anotar os resultados em )orma de tabela como segue marcando pelo n(mero de sinais R a quantidade de precipitado que apareceu.
'ubo 0recipitado
1 2 !
8ue concluiu sobre a e)iciência dos di)erentes ácidos para precipitar a prote=na T @$iste rela,ão entre a molaridade do ácido e o seu e)eito sobre a ooalbuminaT
37 PRECIPITAÇÃO COM SAIS DE METAIS PESADOS
As bases mesmo )ortes não precipitam as prote=nas apesar de elas quebrarem também as pontes de hidrogênio e liga,;es iSnicas. %o entanto o meio alcalino aumenta substancialmente o n(mero de cargas negatias presentes nas prote=nas. %estas condi,;es reatios como os =ons de metais pesados p.e. merc(rio chumbo3 precipitam as prote=nas deido )orma,ão de sais insol(eis proteinatos3 dos metais. M de se obserar que mesmo em ausência de prote=nas estes metais em condi,;es alcalinas )ormam hidró$idos também insol(eis. precipitado )inal consiste portanto de dois componentes3.
proteina R ? - proteina Y
prote=na - R metal R proteinato de metal insol(el metalR R ? - metal-? insol(el
!a AULA
TÉCNICA
Narcar ! tubos de ensaio e colocar em cada um 2 gotas de %a? corrosioP usar pipeta de * ml e apenas com imersão da ponta não com aspira,ão3.
Ao no 1 - <untar 1 ml de ooalbumina
Ao no 2 - <untar 1 ml de ooalbumina e * gotas de solu,ão de acetato de chumbo 17 : Ao no ! - <untar 1 ml de água e * gotas de solu,ão de acetato de chumbo 17 :
tubo controle3
Nisturar por lee agita,ão dos tubos esperar 17 minutos e anotar os resultados em )orma de tabela como segue marcando com um sinal - o teste negatio e com um ou ários sinais R a quantidade de precipitado que apareceu nos testes positios.
'ubo 0recipitado
1 2 !
8ue concluiu sobre a nature#a do precipitado no tubo no 2T
47 PRECIPITAÇÃO POR SATURAÇÃO SALINA E COM SOLVENTE OR(8NICO
Nuitas prote=nas são hidrosol(eis. 'odas elas deem sua solubilidade a uma e$tensa camada de água estruturada que interage com cargas elétricas e res=duos polares na super)=cie da molécula proteica. A adi,ão de sais sul)ato de amSnio3 ou solentes misturáeis com água álcool acetona3 lea a solata,ão das respectias moléculas ou =ons em competi,ão com a prote=na que se torna insol(el na retirada da sua camada super)=cial de água estruturada. %o entanto boa parte desta precipita,ão é reers=el pela adi,ão de mais água ao contrário das e$periências anteriores.
TÉCNICA
Narcar 2 tubos de ensaio e colocar em cada um 1 ml de ooalbumina. A seguir adicionar a estes tubos6
Ao no 1 - <untar ! ml de sol. saturada de sul)ato de amSnio Ao no 2 - <untar ! ml de álcool
Nisturar bem e dei$ar em repouso antes de anotar os resultados. >epois de * min adicionar a cada tubo * ml de água destilada e misturar outra e#. %a tabela abai$o utili#e um ou mais sinais R para indicar a quantidade de precipitado que apareceu antes e depois da adi,ão de água6
'ubo 1 precipitado 2 precipitado
após adi,ão de água3 1
2
8ue concluiu sobre a reersibilidade das precipita,;es nos tubos 1 e 2 T
!a AULA
57 PRECIPITAÇÃO ISOELÉTRICA
ponto isoelétrico de uma prote=na é o alor de p? no qual a molécula apresenta carga total nula.
As prote=nas apresentam uma solubilidade m =nima nos seus pontos isoelétricos ou se<a um má$imo de precipitacão. @ste e)eito pode ser demonstrado mais rapidamente em condi,;es que remoem parcialmente a prote,ão )ornecida pela camada super)icial de água o que pode ser obtido pela adi,ão de álcool.
TÉCNICA
Narcar ! tubos de ensaio e colocar em cada um 2 ml dos seguintes tamp;es6 Ao no 1 - solu,ão tampão p? 7
Ao no 2 - solu,ão tampão p? &/ Ao no ! - solu,ão tampão p? !7
A cada tubo adicionar 1 ml de ooalbumina e & ml de álcool. Nisturar bem por agita,ão e)iciente. bserar e anotar os resultados em )orma de tabela como segue marcando com um sinal R os3 testes3 positios3 e com um sinal - os negatios6
'ubo "ea,ão
1 2 !
8ue concluiu sobre o ponto isoelétrico da ooalbumina T 8uais aminoácidos ioni#ados são mais abundantes nesta prote=na T
&a AULA
EN9IMAS : UREASE
UREASE uréia amidohidrolase @.+.!.*.1.*3
A urease é uma en#ima encontrada nas sementes das leguminosas especialmente no )ei<ão de porco Canavalia ensiformis3 mas também nas sementes da melancia Citrullus vulgaris3. Atua especi)icamente sobre a uréia trans)ormando-a em +2 e amSnia.
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE
A atiidade da en#ima pode ser demonstrada )a#endo-a reagir com uma solu,ão de uréia a p? / muito )racamente tamponada. A solu,ão contém um indicador ermelho de )enol WKermelho %eutroX3 que muda de amarelo para rosa p? 4 a 4&3. @stando a en#ima atia ocorrerá libera,ão de N04 em quantidade su)iciente para sobrepu<ar a a,ão do tampão tornando o meio da rea,ão alcalino. +omo conseqIência da subida do p? a solu,ão originalmente amarela passa cor rósea.
urease
uréia R indicador → 2 %?! R +2 R indicador
substrato3 cor amarela produtos3 cor rósea
RESUMINDO; 9e a en#ima estier com atiidade ocorrerá mudan,a de cor de
amarela para rósea. 0or que T
27 TESTE DE ATIVIDADE EN9IM6TICA
Narcar 2 tubos e distribuir neles as substncias nas quantidades indicadas na tabela a seguir. %a (ltima coluna marque com um R ou um - a mudan,a de cor obserada6
'ubo s Uréia tamponada com indicador Ureas e Vgu a A [ Nudan, a de cor B 1 !ml !gotas - ' 2 !ml - !gotas A " 37 ESPECIFIDADE
A urease é altamente espec=)ica para a uréia. Bsto pode ser demonstrado )a#endo a en#ima reagir com um composto com estrutura semelhante do substrato a tiouréia
03N'CS'N03 e eri)icar se houe mudan,a de cor.
Narcar 2 tubos e distribuir neles as substncias nas quantidades indicadas na tabela a seguir. %a (ltima coluna marque com um R ou um - a mudan,a de cor obserada6
'ubos Uréia tamponada com indicador 'iouréia tamponada
com indicador Urease [A
Nudan, a de cor B 1 2ml - !gotas ' 2 - 2ml !gotas A " @%\BNA9 U"@A9@ 10
&a AULA
47 DESNATURAÇÃO PELO CALOR
>eido sua nature#a protéica as en#imas são sens=eis a,ão de temperaturas eleadas que podem destruir a )un,ão catal=tica do seu centro atio.
+olocar num tubo ! ml de água destilada e ! gotas de urease. Agitar. +olocar em banho maria )erente por ! minutos. @s)riar em água corrente.
@m outro tubo pipetar 2 ml de uréia tamponada e <untar 1 ml da urease )erida tubo anterior3. Agitar. Keri)icar se houe modi)ica,ão de cor da solu,ão nos pró$imos * minutos. @$plicar porque a urease )oi dilu=da antes de esquentar e porque a elea,ão da temperatura desnatura as prote=nas.
57 INIBIÇÃO
[rupos sul)idrila S03 pró$imos ao centro atio da urease são essenciais para a manuten,ão da con)orma,ão atia. +ompostos como os sais de metais pesados ?g 0b Ag3 ao se combinarem com os grupos 9? causam modi)ica,;es permanentes na
con)orma,ão da en#ima proocando diminui,ão e perda de sua atiidade6 en#ima - 9? R ?g2R → en#ima - 9 - ?gR R ?R
atia inatia
Narcar 2 tubos e distribuir neles as substncias nas quantidades indicadas na tabela a seguir. %a (ltima coluna marque com um R ou um - a mudan,a de cor obserada após * minutos de obsera,ão6
'ubos Urease Vgua ?g+l2
Uréia tamponada com indicador A [ Nudan,a decor B 1 !gotas 1ml 4gotas !ml ' 2 !gotas 1ml - !ml A " @%\BNA9 U"@A9@ 11
*a AULA
CARBOIDRATOS 27 TESTE DE MOLISC0
"ea,ão geral para carboidratos.
A a,ão desidratante de ácidos concentrados sobre os monossacar=deos lea )orma,ão de )ur)ural e deriados. As aldopentoses )ormam o )ur)ural e as he$oses produ#em o hidro$imetil)ur)ural. s alde=dos de )urano podem se condensar com )enóis e aminas dando compostos coloridos do tipo tri)enilmetano. @ste é o )undamento da rea,ão que é considerada geral para carboidratos e é conhecida como teste de Nolisch. "eagem pentoses e he$oses não apenas como monossacar=deos lires mas também são positios no teste todos os compostos que leam carboidratos ligados6 polissacar=deos glicoprote=nas glicolip=deos e outros que são hidrolisados pelo ácido sul)(rico concentrado. @$emplo6
*-?idro$imetil)ur)ural >eriado 'ri)enilmetano
TÉCNICA
Narcar ! tubos e distribuir neles6 tubo 1 - 2 ml de sol. glicose 1 : tubo 2 - 2 ml de sol. amido 1 :
tubo ! - 2 ml de água destilada tubo controle3
Aos ! tubos adicionar * gotas de sol. de al)a na)tol. Nisturar por lee agita,ão. 0ipetar #" -i!" #-i+a+" cerca de 2 ml de ácido sul)(rico e$tremamente corrosio não aspirar o ácido usar pipeta de 17 ml3 e dei$ar o ácido escoar lentamente pela parede do tubo sem agitar a )im de se )ormar uma camada de ácido por debai$o da solu,ão teste. 9em agitar colocar o tubo na estante. A rea,ão é positia quando aparece um anel ioleta na inter)ase. surgimento de colora,ão eserdeada na camada in)erior é deida a impure#as do na)tol. Anotar os resultados em )orma de tabela.
37 TESTE DE BIAL
"ea,ão para identi)ica,ão de pentoses.
mecanismo da rea,ão de Eial ou rea,ão do orcinol3 é semelhante ao da rea,ão de Nolisch ou se<a com ácido concentrado se )orma o )ur)ural. A di)eren,a é que neste caso o ácido usado é o ácido clor=drico e o )enol é o orcinol. +onsequentemente o produto )ormado e sua cor serão di)erentes.
TÉCNICA
Narcar ! tubos e colocar em cada um 1 ml do reatio de Eial ?+l com orcinol e Je+l!3. Ao tubo 1 adicionar 1 ml de solu,ão de pentose arabinose3
Ao tubo 2 adicionar 1 ml de solu,ão de glicose
Ao tubo ! adicionar 1 ml de água destilada tubo controle3
Lear os tubos ao banho-maria )erente por !7 segundos e anotar os resultados em )orma de tabela. teste é positio quando se )orma uma colora,ão eserdeada.
*a AULA
47 TESTE DE SELI<ANOFF
>istin,ão entre aldoses e cetoses.
%as condi,;es do teste as cetohe$oses trans)ormam-se nos deriados do )ur)ural mais rapidamente que as aldohe$oses. @m conseqIência nas re)eridas condi,;es e sendo curto o tempo de incuba,ão o resorcinol )orma um produto colorido apenas com as cetohe$oses. %o entanto prolongando-se o tempo de incuba,ão as aldoses reagem de maneira semelhante.
TÉCNICA
Narcar & tubos e colocar em cada um ! ml do reatio de 9eli]ano)) ?+l com resorcinol3. Ao tubo 1 adicionar 1 ml de solu,ão de )rutose
Ao tubo 2 adicionar 1 ml de solu,ão de glicose Ao tubo ! adicionar 1 ml de solu,ão de sacarose
Ao tubo & adicionar 1 ml de água destilada tubo controle3
+olocar todos os tubos ao mesmo tempo no banho-maria )erente e cronometrar o aparecimento de colora,ão ermelha. Anotar os resultados na seguinte tabela6
1min 2min &min min
Jrutose [licose 9acarose Vgua
8ual é o melhor tempo para di)erenciar entre a )rutose e a glicose T 8uem dos dois monossacar=deos é a cetose T 0or que a sacarose reageT
57 TESTE DE BENEDICT
"ea,ão para identi)icar carboidratos redutores.
s monossacar=deos e alguns dissacar=deos possuem em suas estruturas grupos alde=do ou cetona lires ou hidratados. @stes poderão redu#ir certos =ons metálicos contidos em reagentes especiais. A maioria destes reagentes contém sais de cobre e são usados para pesquisa de a,(cares redutores. Um destes reagentes é o de BENEDICT que contém sul)ato c(prico carbonato de sódio e citrato de sódio. @ste (ltimo composto produ# um comple$o a#ul com cobre dialente e isto eita a )orma,ão de hidró$ido c(prico insol(el no meio alcalino6
+uprocitrato +u2R3
9ob a,ão de um agente redutor o cobre dialente é redu#ido a cobre monoalente que não pode )ormar um comple$o sol(el com o citrato. +onseqIentemente o cobre precipita sob a )orma de hidró$ido cuproso de cor amarela. 0or aquecimento o hidró$ido cuproso passa a ó$ido cuproso de cor ermelha6
redutor calor
+uprocitrato +u2R3
→ hidró$ido cuproso +uR3 → ó$ido cuproso+uR3
sol(el a#ul insol(el amarelo insol(el ermelho
*a AULA
TÉCNICA
Narcar & tubos e colocar em cada um ! ml do reatio de Eenedict. Ao tubo 1 adicionar 1 ml de solu,ão de glicose
Ao tubo 2 adicionar 1 ml de solu,ão de )rutose Ao tubo ! adicionar 1 ml de solu,ão de sacarose
Ao tubo & adicionar 1 ml de água destilada tubo controle3
+olocar todos os tubos no banho-maria )erente por ! min. "etirar os tubos e anotar os resultados em )orma de tabela. que concluiu T
=7 TESTE DE IODO
Bdenti)ica,ão de polissacar=deos.
Alguns polissacar=deos reagem com iodo )ormando produtos coloridos. +om o amido a cor é a#ul com o glicogênio é castanho-aermelhado. s monossacar=deos não reagem. %o amido é a )ra,ão não rami)icada amilose3 que é responsáel pela )orma,ão do comple$o da cor a#ulP a amilopectina reage de )orma semelhante ao glicogênio.
TÉCNICA
Narcar ! tubos e distribuir neles6 'ubo 1 - 2 ml de amido 1 : 'ubo 2 - 2 ml de glicose 1 :
'ubo ! - 2 ml de água destilada tubo controle3
Aos ! tubos adicionar duas gotas da solu,ão de Lugol. @ste reatio é uma solu,ão de poli-iodetos produ#idos por dissolu,ão de iodo metálico numa solu,ão de iodeto de potássio e ele reage como se )osse iodo elementar. Anotar os resultados em )orma de tabela.
REVERSÃO DA REAÇÃO DO IODO PELO CALOR
+olocar o tubo 1 do ensaio anterior no banho-maria )erente por alguns minutos até o desaparecimento da cor a#ul. "es)riar em água corrente. que obserou T
A cadeia da amilose )ra,ão não rami)icada do amido3 tem a con)orma,ão de uma hélice que absore o iodo no interior da espiral. @ste comple$o )orma-se por intera,;es )racas que podem ser des)eitas pelo calor.
a AULA
0IDRÓLISE DO AMIDO
ai+" quando tratado por um ácido a quente so)re uma hidrólise sucessia dando árias de$trinas e como produtos )inais maltose e glicose.
As de$trinas têm tamanhos di)erentes mas conseram em princ=pio a estrutura em hélice do amido. @m consequência as de$trinas absorem o iodo e sua rea,ão com o reatio de L-&", gera solu,;es coloridasP as di)eren,as de colora,ão permitem classi)icar as di)erentes de$trinas. reatio de L-&", é uma solu,ão de poli-iodetos produ#idos por dissolu,ão de iodo metálico numa solu,ão de iodeto de potássio e ele reage como se )osse iodo elementar3. As cores obseradas são as seguintes6
ANB> cor a#ul
ANBL>@^'"B%A cor ro$a
@"B'">@^'"B%A cor alaran<ada A+"B>@^'"B%A não dá cor
A maltose e glicose possuem propriedades redutoras que podem ser reconhecidas pela rea,ão de BENEDICT7 reatio de BENEDICT contém sul)ato c(prico carbonato de sódio e citrato de sódio. (ltimo composto produ# um comple$o a#ul com cobre dialente que eita a )orma,ão de hidró$ido c(prico insol(el no meio alcalino. A a,ão de um agente redutor maltose e glicose3 redu# o cobre dialente a cobre monoalente o qual não pode )ormar um comple$o sol(el com citrato. +onsequentemente o cobre precipita sob )orma de hidró$ido cuproso de cor amarela. 0or aquecimento o hidró$ido cuproso passa a ó$ido cuproso de cor ermelha6
redutor calor
+uprocitrato +u2R3
→ hidró$ido cuproso +uR3 → ó$ido cuproso+uR3
sol(el a#ul insol(el amarelo insol(el ermelho
TÉCNICA
0reparar um banho de água )erente e numerar / tubos de ensaio.
%um @rlenmeHer colocar !7 ml da solu,ão de amido a 1* : e / ml de ?+l 2%. 'rans)erier ! ml desta mistura para cada um dos tubos.
Ao tubo 1 adicionar 1 gota do reatio de Lugol e obserar a cor a#ul que se desenole. +olocar os tubos restantes no banho de água )erente. +ada tubo será retirado ao término dos per=odos de tempo indicados no quadro abai$o e depois de res)riado em água corrente receberá uma gota de Lugol com e$ce,ão do tubo /.
Ao tubo / adicionar ! ml do reatio de Eenedict e retornar ao banho de água )erente. aparecimento de um precipitado ermelho ou alaran<ado indica a presen,a de substncia redutora no caso maltose ou glicose.
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"@ACD +N B>+" B>@%'BJB+A>90">U'9
1 7 2 2 ! * & 17 * 1* 27 / 2* "ea,ão de Eenedict ?B>"FLB9@ > ANB> 15
/a AULA
LIPÍDIOS 27 SAPONIFICAÇÃO
+olocar num tubo de ensaio grande 2* $ 277 mm3 cerca de 7* g de gordura animal e adicionar 17 ml de solu,ão alcoólica de _? 7* % e$tremamente corrosia não aspirar com a boca usar pipeta de 17 ml3.
Adaptar ao tubo de ensaio um tubo condensador cheio de água de torneira que irá minimi#ar a eapora,ão do álcool. +olocar o con<unto tubo grande R tubo condensador3 em banho maria )erente e dei$ar lá por * minutos. "etirar o tubo do banho e remoer o tubo condensador. >espre#ar qualquer sobra eentual de material sólido e continuar apenas com o l=quido contido no tubo grande.
Adicionar 17 ml de água destilada mistura de saponi)ica,ão. Agitar. bserar a )orma,ão de espumas. [uardar o conte(do do tubo para as e$periências seguintes.
37 PREPARAÇÃO DE 6CIDOS (RAXOS LIVRES
Adicionar mistura de saponi)ica,ão <á dilu=da com água destilada 1 ml de ácido clor=drico concentrado gota a gota agitando o tubo posteriormente com cuidado o ácido é corrosio portanto não aspirar com a boca usar pipeta de 17 ml3. +olocar noamente o tubo no banho maria até obter uma boa separa,ão de camada oleosa acima da camada aquosa os ácidos gra$os lires são pouco sol(eis na água e menos densos que ela3.
>ei$ar o tubo es)riar num recipiente com água gelada. A camada superior solidi)icará pois os ácidos gra$os de gordura animal são em grande parte saturados tendo alto ponto de )usão ao contrário dos ácidos gra$os insaturados que predominam na gordura egetal.
>ecantar o l=quido do tubo e guardar apenas a parte sólida para as e$periências seguintes.
47 SOLUBILIDADE DOS 6CIDOS (RAXOS LIVRES
"etirar com au$=lio de um bastão de idro uma pequena quantidade dos ácidos gra$os isolados e colocar num tubo de ensaio limpo e seco. Adicionar 2 ml de éter. Agitar. que obserouT
57 FORMAÇÃO DE SABÕES SOL>VEIS POR REDISSOLUÇÃO DOS 6CIDOS (RAXOS LIVRES7
Adicionar ao tubo da e$periência 2 que contém a maior parte dos ácidos gra$os isolados 17 ml de água destilada e * ml de solu,ão alcoólica de _? 7* % e$tremamente corrosia não aspirar com a boca usar pipeta de 17 ml3. Lear ao banho maria por ! minutos. Agitar. bserar a )orma,ão de espumas. +onserar o conte(do do tubo para a e$periência
seguinte.
=7 FORMAÇÃO DE SABÕES INSOL>VEIS
'omar 2 tubos de ensaio e pipetar em cada um 2 ml da solu,ão de sab;es sol(eis obtida na e$periência anterior. Ao primeiro adicionar 17 gotas de solu,ão de cloreto de cálcio *: e ao segundo 17 gotas de solu,ão de acetato de chumbo 17 :. bserar a )orma,ão de precipitados sab;es insol(eis de cálcio e chumbo além dos respectios hidró$idos3.
?7 REAÇÃO DO COLESTEROL COM O REATIVO DE LIEBERMAN'BURC0ARD
+olocar 1 ml de uma solu,ão dilu=da de colesterol em um tubo de ensaio limpo e seco. Adicionar 17 gotas de anidrido acético e ! gotas de ácido sul)(rico concentrado os dois
reatios são e$tremamente corrosios não aspirar com a boca usar pipeta de 17 ml3. bserar após alguns minutos o aparecimento de uma colora,ão eserdeada. @sta rea,ão de
/a AULA mecanismo o$idatio identi)ica os esteróides que possuem dupla liga,ão entre os carbonos * e anéis A e E3 como o colesterol.
+L@9'@"L +V'B% +A"E`%B+
0@%'A@%ZLB+
4a AULA
IDENTIFICAÇÃO DE 6CIDOS NUCLÉICOS
s ácidos nucléicos presentes num tecido especialmente o >%A3 podem estar )irmemente ligados a cátions ou a prote=nas catiSnicas tais como histonas e protaminas. Assim estas prote=nas estarão presentes <untamente com os ácidos nucleicos quando estes
(ltimos )orem precipitados a partir de um homogenato de )=gado de rato. s polinucleot=deos podem ser precipitados pela a,ão de solu,;es salinas ou por álcool em presen,a de sais. %esta prática usamos um método mais antigo que utili#a o ácido tricloroacético para precipitar comple$os nucleoprotéicos. precipitado nucleoprotéico é posteriormente dissociado a quente libertando-se os ácidos nucléicos sob )orma de oligonucleot=deos sol(eis enquanto que as prote=nas permanecem insol(eis. @m seguida no e$trato sol(el dos oligonucelot=deos será testada a presen,a dos a,(cares caracter=sticos do RNAe DNA.
A rea,ão do orcinol reatio de Eial3 permite identi)icar o RNA atraés da ribose presente. >etermina,;es quantitatias )oram procedidas usando esta rea,ão con)orme 9chneider ?oogebom e >ische 9ch]art# 15!/3.
R ?+l R orcinol
"ibose → Jur)ural → >eriado 'ri)enilmetano
%o passado a rea,ão da di)enilamina com deso$irribose )oi muito utili#ada para identi)icar e determinar quantitatiamente o DNArea,ão descrita por >ische em 15!7 e mais usada na sua ersão modi)icada por Eurton em 15*3. >%A em meio ácido é hidroli#ado libertando deso$irribose e esta atraés do seu grupamento +? lire reage com a di)enilamina com )orma,ão de composto de cor a#ul com absor,ão a 77 nm.
TÉCNICA
1. bten,ão de homogenato de )=gado de rato. 2. @$tra,ão de ácidos nucleicos do homogenato.
!. Bdenti)ica,ão deDNA no e$trato ácido pela rea,ão da di)enilamina. &. Bdenti)ica,ão deRNA no e$trato ácido pela rea,ão do orcinol.
PROCEDIMENTO
27 O@!en)*" +e e!ra!" #i+" +e #i+"% n-#,.i#"%7
1.1. ?omogeni#ar o )=gado de um rato em noe olumes de sol. ácido c=trico 2:. 0ipetar 2 ml do homogenato num tubo de centr=)uga e adicionar 1 ml de sol. ácido tricloroacético 27 :. Agitar. >ei$ar em repouso por 17 minutos.
1.2. +entri)ugar a 2777 rpm por 17 minutos. >espre#ar o sobrenadante.
1.!. Ao sedimento ácidos nucleicos e prote=nas3 <untar * ml de sol. ácido tricloroacético *:. Nisturar cuidadosamente com bastão de idro e decantar a suspensão para um tubo de ensaio o tubo de centr=)uga não pode ser esquentado3.
1.&. Lear ao banho maria )erente por 27 minutos. @s)riar e trans)erir noamente a supensão para o tubo de centr=)uga.
1.*. +entri)ugar a 2777 rpm por 17 minutos. >ecantar o sobrenadante para um tubo de ensaio limpo o sobrenadante conterá quase todo "%A e >%A e$istente nos 2 ml de homogenato usados inicialmente3.
37 I+en!ii#a)*" +"% #i+"% n-#,ei#"% n" e!ra!" #i+"7
2.1. I+en!ii#a)*" +" DNA. 0ipetar num tubo de ensaio 2 ml do sobrenadante da etapa 1.* e em outro tubo 2 ml de água destilada Eranco3. Adicionar aos dois tubos 2 ml do reatio da di)enilamina corrosio não aspirar com a boca usar pipeta de 17 ml3. Agitar. Aquecer os dois tubos a 177o + por 17 minutos. que obserouT
2.2. I+en!ii#a)*" +" RNA. 0ipetar num tubo de ensaio 72 ml do sobrenadante da etapa 1.* e em outro tubo 72 ml de água destilada Eranco3. Adicionar aos dois tubos 74 ml de água destilada e 2 ml do reatio de orcinol corrosio não aspirar com a boca usar pipeta de 17 ml3. Agitar. Lear ao banho maria )erente por 17 minutos. que obserouT
