INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E DO pH NA ATIVIDADE DE
CELULASES PRODUZIDAS POR Mucor circinelloides EM PALHA
DE CANA-DE-AÇÚCAR
S. de O. SANCHO1, T. C. MACIEL2, L. M. N. PAIXÃO1, S. L. do R. de OLIVEIRA2 e S. RODRIGUES1
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Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Tecnologia de Alimentos
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Universidade Federal do Ceará, Centro de Tecnologia, Departamento de Engenharia Química E-mail para contato: soraya_sancho@hotmail.com
RESUMO – As enzimas são normalmente utilizadas em suas condições ideais, onde demonstram maior atividade, alcançando assim uma velocidade de reação máxima. Deste modo, é necessário determinar os parâmetros ideais para a obtenção da maior atividade enzimática. Em virtude do exposto, o presente estudo objetivou avaliar a influência da temperatura e do pH na atividade enzimática de celulases produzidas por Mucor circinelloides, por Fermentação em Estado Sólido, utilizando a palha de cana-de-açúcar como substrato. Os resultados indicaram que a atividade da enzima foi mais efetiva em temperatura de 60 °C, sendo a atividade obtida igual a 3,15 ± 0,30 FPU/ g, e em pH próximo à neutralidade (6,0), com atividade igual a 3,64 ± 0,10 FPU/ g, denotando grande importância do ponto de vista industrial, pois além de evitar a corrosão nas tubulações, seus efluentes não necessitarão de tratamentos para correção de pH, sendo favorável para a indústria biotecnológica em diversas áreas.
1. INTRODUÇÃO
As celulases são as enzimas-chave no processo de bioconversão de material celulósico em produtos úteis (Chandra et al., 2012), sendo sua produção por fungos, amplamente disseminada na natureza, incluindo uma grande variedade de espécies, tais como Trichoderma, Penicillium e Aspergillus.
Mucor circinelloides é um fungo filamentoso não patogênico dimórfico que pertence à classe dos zigomicetos (Wolff, 2002). Este fungo tem despertado a atenção de pesquisadores, devido a sua alta capacidade de secreção de celulases, que são capazes de converter vários materiais celulósicos e hemicelulósicos à glicose e xilose (Saha, 2004; Takano; Hoshino, 2012).
A maioria das enzimas apresenta um valor de pH para o qual a sua atividade é máxima e a medida que ele se afasta desse valor ótimo, a velocidade da reação diminui. A temperatura é outro fator relevante, pois tem influência direta na velocidade das reações enzimáticas. Normalmente existe
uma temperatura ótima e valores mais altos levam à perda da estrutura nativa da enzima, comprometendo a sua capacidade catalítica (Borzani et al., 2001; Pribowo et al., 2012).
Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi determinar a temperatura e pH ótimos para a determinação da atividade celulolítica por M. circinelloides CCT 7737, utilizando a palha da cana-de-açúcar como substrato em Fermentação em Estado Sólido.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Substrato utilizado para fermentação
A palha da cana-de-açúcar, proveniente de colheita mecanizada, foi fornecida pelo Centro de Tecnologia Canavieira (SP). Inicialmente o material foi triturado em moinho de facas tipo Willye modelo Star FT 50 (Fortinox) utilizando-se peneira em aço inox com malha mesh 20. Em seguida foram acondicionados em recipientes plásticos, hermeticamente fechados, e armazenados em freezer à temperatura de -18°C.
2.2. Micro-organismo utilizado
O fungo produtor de celulases foi isolado da casca do coco verde (Cocos nucifera L.), caracterizado e identificado molecularmente como Mucor circinelloides CCT 7737.
2.3. Composição do meio de cultura
Foi utilizado 3,0 g de substrato (palha de cana-de-açúcar) umidificado com 9,5 mL de solução salina em pH 5,5, com a seguinte composição: 1,89 g/L de (NH4)2SO4 e 0,21 g/ L de KH2PO4. Em
seguida, foram acondicionados em frascos Erlenmeyers de 250 mL, homogeneizados com auxílio de bastão de vidro e autoclavados à temperatura de 121°C por 15 minutos. O meio esterilizado foi inoculado com uma suspensão de 1 × 106 esporos/mL e incubado de forma estática em estufa B.O.D a 30 °C por 24 horas.
2.4. Recuperação da enzima do meio fermentado
Após cada fermentação, a recuperação da enzima do meio fermentado ocorreu pela adição de 20 mL de tampão acetato de sódio (pH 6,5), sendo submetida à agitação de 200 rpm, em agitador orbital, por 30 minutos a 30 °C, de acordo com Oliveira (2010). Em seguida, o material foi filtrado em papel de filtro Whatman n° 1, sendo este denominado de extrato enzimático bruto e utilizado para a quantificação da atividade celulásica.
2.5. Determinação da atividade de enzimas celulases
A atividade celulásica total foi quantificada segundo a metodologia de Ghose (1987) modificada, sendo utilizados a temperatura e pH ótimos para o ensaio enzimático, pré-determinados em ensaios de otimização (dados não mostrados), sendo expressa em FPU/g.
2.6. Determinação da temperatura e do pH de atividade enzimática
Foram realizados dois ensaios univariados para a determinação da temperatura e do pH da atividade celulolítica. No primeiro, o valor do pH foi mantido constante, sendo avaliada a influência da temperatura na atividade enzimática. Foi analisada uma faixa entre 40 e 80 °C, em pH fixo, de acordo com Oliveira (2010).
No segundo ensaio foi avaliada a influência do pH na atividade enzimática. O valor do pH do tampão adicionado ao meio fermentado, para recuperar a enzima, variou entre 4,0 e 10,0. Com o objetivo de alcançar a faixa de pH desejada, foram utilizados os tampões acetato de sódio (pH 4,0 a 6,5), fosfato de sódio (pH 7,0 a 8,0) e glicina NaOH (pH 8,5 a 10,0), com força molar igual a 20 mM.
2.7. Análise estatística
Os ensaios foram realizados em triplicata sendo calculadas a média e o desvio padrão de cada uma delas. Os planejamentos experimentais foram efetuados com o auxílio do software Statistica 7.0 (Statsoft). A análise de variância (ANOVA) foi utilizada para determinar a significância do modelo matemático ao nível de 90% de confiança. Alguns dados foram tratados pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Determinação da temperatura e do pH de atividade enzimática
É possível observar na Figura 1 que os maiores valores para a enzima de Mucor circinelloides CCT 7737, foram obtidos nas temperaturas de 60, 70 e 80 °C, com atividades da ordem de 3,15 ± 0,30; 3,01 ± 0,09 e 2,85 ± 0,09 FPU/ g, respectivamente. O teste de Tukey indicou não haver diferença significativa ao nível de 95% de confiança, de modo que optou-se por escolher a temperatura menor (60 °C), sendo esta utilizada para o próximo ensaio de determinação do pH.
Figura 1 - Influência da temperatura de celulases produzidas por M. circinelloides CCT 7737 em palha de cana-de-açúcar. As barras de erro indicam desvio padrão (n = 3).
Mesmo comportamento foi observado por Andrade et al. (2011) que estudaram o efeito da temperatura, na atividade de celulases produzidas por Trichoderma sp. IS-05 e de uma preparação comercial com atividade celulolítica (CAREZYME), tendo encontrado 60 °C como a temperatura ótima para ambas as enzimas.
Singh et al. (2009) em seu estudo com uma enzima termoestável, produzida por A. heteromorphus, também encontraram a temperatura de 60 °C como a que maximizou a atividade enzimática. Resultado semelhante foi obtido por Ncube et al. (2012) que avaliaram o comportamento da celulase produzida por A. niger frente a temperatura de determinação da atividade enzimática e verificaram que 65 °C foi o melhor valor para este parâmetro.
Cabe destacar que a tolerância de celulases a altas temperaturas não é uma característica comum. Xu et al. (2014), estudaram a estabilidade de celulases numa ampla faixa de temperatura e pH, e concluíram que na temperatura de 80 °C, durante 40 minutos, a enzima apresentou uma redução da ordem de 17%. Balasubramanian e Simões (2014) estudaram a estabilidade térmica de carboximetilcelulase e verificaram que na temperatura de 50 °C, durante duas horas, a enzima reteve 84,4% de sua atividade. No estudo realizado por NG et al. (2010), os autores avaliaram a estabilidade térmica de β-glucosidase purificada a 58 °C e observaram que nesta temperatura, a atividade foi reduzida a metade de sua atividade inicial em duas horas de reação.
Em relação ao parâmetro de pH, é possível observar na Figura 2 os resultados encontrados para a atividade celulásica máxima de Mucor circinelloides CCT 7737 produzido em palha de cana-de-açúcar.
Figura 2 - Influência do pH na atividade de celulases produzidas por M. circinelloides CCT 7737 em palha de cana-de-açúcar. As barras de erro indicam desvio padrão (n = 3).
De acordo com a Figura 2, é possível observar que os maiores valores para atividade enzimática ocorreram nos pH’s 6,0 (3,64 ± 0,10 FPU/ g); 6,5 (3,25 ± 0,09 FPU/ g); 7,5 (2,95 ± 0,19 FPU/ g); 8,0 (3,25 ± 0,09 FPU/ g) e 9,5 (3,44 ± 0,49 FPU/ g), não diferindo significativamente pelo teste de Tukey, ao nível de 95% de confiança. Deste modo, o pH 6,0 foi o selecionado.
Vários relatos na literatura indicam faixas ácidas para este parâmetro, na atividade enzimática de celulases produzidas por fungos. Andrade et al. (2011) e Delabona et al. (2013) encontraram pH igual a 3,0 como o que maximizou a atividade catalítica de celulases produzidas a partir de A. fumigatus e Trichoderma sp. IS-05. Ncube et al. (2012) produziram celulases de A. niger por FES, e encontraram a atividade máxima em pH 4,0. Singh et al. (2009) verificaram que o pH 4,8 foi o ótimo para a atividade das celulases produzidas por A. heteromorphus.
4. CONCLUSÃO
A linhagem fúngica de Mucor circinelloides CCT 7737 apresentou atividade enzimática máxima igual a 3,64 ± 0,10 FPU/ g que decorreu do emprego da temperatura de 60 °C em pH 6,0. Tal combinação consiste num diferencial atrativo dessa enzima, em relação à maioria das relatadas na literatura cientifica, sob o ponto de vista industrial, tendo em vista que grande parte das celulases reportadas apresentam valores de pH ótimo dentro de faixa ácida.
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