1 Autora, Bolsista CNPq (ITI-A): Graduação em paula1989banhara@gmail.com.
2 Analista da Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna 3 Pesquisadora da Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna
4 Orientadora: Pesquisadora da Embrapa Meio Ambiente, Jaguariú OBTENÇÃO DE NANOPART
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
Paula Banhara¹; Márcia Regina
RESUMO – Um dos grandes desafios
antibióticos comerciais são utilizados para controlar essas doenças pode levar à resistência de tais medicamentos
alternativos e inovadorespara o controle como uma boa alternativa. No entanto
limitam seu uso. Neste trabalho, nanopartículas poliméricas carregadas preparadas pelo método denanoprecipitação,
Aeficiência de encapsulamento foi determinada
de alta eficiência e detecção por arranjo de diodos, utilizando calibração externa para quantificação do carvacrol.A atividadeantimicrobiana
avaliada por meio da determinação da Concentração Inibitória Bactericida Mínima (CBM) frente
satisfatoriamente encapsulado pelo método de nanoprecip encapsulamento de 69,64±4,42%
encapsulado e isolado foram iguais, sendo
evidenciando o aumento do efeito inibitório do carvacrol quando na forma nanoencapsulada estudos preliminares realizados abrem perspectivas para soluções mais seguras e eficazes que empregam compostos de origem
Palavras-chaves: Nanoprecipitação;
A): Graduação em Tecnologia em Processos Químicos, FATEC, Campinas 2 Analista da Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna – SP.
3 Pesquisadora da Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna – SP.
4 Orientadora: Pesquisadora da Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna – SP; sonia.queiroz@embrapa.br. OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS MUCOADESIVAS CONTENDO CARVACROL
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IN VITRO CONTRA Streptococcus
Márcia Regina Assalin2; Ana Lúcia Penteado³; Sonia Claudia do Nascimento de
Queiroz4
Nº 20416
Um dos grandes desafios na piscicultura é a ocorrência de doenças.
são utilizados para controlar essas doenças, porém, seu uso prolongado de tais medicamentos. Deste modo, faz-se necessário o uso de métodos
para o controle sanitário em peixes. Os óleos essenciais apresentam No entanto, fatores como a baixa solubilidade em água
Neste trabalho, nanopartículas poliméricas carregadas
nanoprecipitação, utilizando-se poly-ε-caprolactone (PCL) foi determinada de forma indireta, por meio da
e detecção por arranjo de diodos, utilizando calibração externa para quantificação A atividadeantimicrobiana in vitro da nanopartícula carregada com carvacrol
inação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Bactericida Mínima (CBM) frente àbactéria Streptococcus agalactiae
satisfatoriamente encapsulado pelo método de nanoprecipitação, com eficiência de 69,64±4,42%. Os resultados de CIM e CBM obtidos
iguais, sendo de 62,5 µg/ml e 390,625 µg/ml
evidenciando o aumento do efeito inibitório do carvacrol quando na forma nanoencapsulada reliminares realizados abrem perspectivas para soluções mais seguras e eficazes que empregam compostos de origem vegetal para o controle de doenças em peixe.
Nanoprecipitação; sanidade, tilápia, bacterioses, óleos essenciais
Tecnologia em Processos Químicos, FATEC, Campinas-SP;
SP; sonia.queiroz@embrapa.br.
CULAS MUCOADESIVAS CONTENDO CARVACROL E Streptococcus agalactiae
udia do Nascimento de
ultura é a ocorrência de doenças. Diferentes , porém, seu uso prolongado se necessário o uso de métodos Os óleos essenciais apresentam-se como a baixa solubilidade em água e volatilidade Neste trabalho, nanopartículas poliméricas carregadas com carvacrol foram caprolactone (PCL) e quitosana. por meio da cromatografia líquida e detecção por arranjo de diodos, utilizando calibração externa para quantificação in vitro da nanopartícula carregada com carvacrol foi (CIM) e da Concentração Streptococcus agalactiae. Carvacrol foi tação, com eficiência de obtidos para o carvacrol 390,625 µg/ml,respectivamente, evidenciando o aumento do efeito inibitório do carvacrol quando na forma nanoencapsulada. Os reliminares realizados abrem perspectivas para soluções mais seguras e eficazes que
para o controle de doenças em peixe.
ABSTRACT – One of the great challenges to be overcome in fish farming is the occurrence of diseases. Different commercial antibiotics are used to control these
prolonged use can lead to the resistance of such drugs.
innovative methods for sanitary control in fish. Essential oils are a good alternative. However, factors such as low water solubility and volatility limit its use. In this work, polymeric nanoparticles loaded with carvacrol were prepared by the nanoprecipitation method, using poly
(PCL) and chitosan. The encapsulation efficiency was indirectly determined, using high performance liquid chromatography and detection by diode array, using external calibration to quantify the carvacrol. The in vitro antimicrobial activity of the nanoparticle loaded with carvacrol was evaluated by determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (CBM) against the bacterium
satisfactorily encapsulated by the nanoprecipitation method, with encapsulation efficiency of 69.64 ± 4.42%. The MIC and CBM results obtained for the encapsulated and isolated carvacrol were the same, being 62.5 µg / ml and 390.625 µg / ml,
of carvacrol when in the nanoencapsulated form. The preliminary studies carried out open perspectives for safer and more effective solutions that use compounds of plant origin to control diseases in fish.
Keywords: Nanoprecipitation; sanity
1. INTRODUÇÃO
O Brasil está entre os quatro maiores produtores mundiais de tilápia com forte tendência de crescimento da produção (MEDEIROS; ALBUQUERQUE
podem comprometer a sustentabilidade da p quais levam à redução do valor comercial, bacterianas e consequente aumento da mortalidade problema, diferentes antibióticos são utilizados
levar ao desenvolvimento de resistência pelas bactérias patogênicas e deixar resíduos nos alimentos
Assim, métodos alternativos e inovadores para o controle de doenças em peixes que sejam efetivos e ambientalmente seguros precisam ser implementados de forma a contribuir com a superação desses desafios da piscicultura
One of the great challenges to be overcome in fish farming is the occurrence of ifferent commercial antibiotics are used to control these diseases;
prolonged use can lead to the resistance of such drugs. It is necessary to use alternative and innovative methods for sanitary control in fish. Essential oils are a good alternative. However, factors such as low water solubility and volatility limit its use. In this work, polymeric nanoparticles
pared by the nanoprecipitation method, using poly
(PCL) and chitosan. The encapsulation efficiency was indirectly determined, using high chromatography and detection by diode array, using external calibration to he carvacrol. The in vitro antimicrobial activity of the nanoparticle loaded with carvacrol was evaluated by determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (CBM) against the bacterium Streptococcus agalactiae
satisfactorily encapsulated by the nanoprecipitation method, with encapsulation efficiency of 69.64 ± 4.42%. The MIC and CBM results obtained for the encapsulated and isolated carvacrol were the same, being 62.5 µg / ml and 390.625 µg / ml, respectively, showing the increased inhibitory effect of carvacrol when in the nanoencapsulated form. The preliminary studies carried out open perspectives for safer and more effective solutions that use compounds of plant origin to control
sanity, tilapia, bacteriosis, essential oils.
O Brasil está entre os quatro maiores produtores mundiais de tilápia com forte tendência de MEDEIROS; ALBUQUERQUE, 2019).Um dos grandes
podem comprometer a sustentabilidade da piscicultura é a ocorrência de doenças em peixes levam à redução do valor comercial, devido às lesões provocadas pelas infecções
aumento da mortalidade (HERNANDES 2016).
tes antibióticos são utilizados. No entanto, o uso intensivo de antibióticos pode levar ao desenvolvimento de resistência pelas bactérias patogênicas, contamina
alimentos(REGITANO; LEAL, 2010; TAVARES-DIAS; MARIANO, 2015) , métodos alternativos e inovadores para o controle de doenças em peixes que sejam efetivos e ambientalmente seguros precisam ser implementados de forma a contribuir com a
desafios da piscicultura (SOARES et al., 2020).
One of the great challenges to be overcome in fish farming is the occurrence of diseases; however, their to use alternative and innovative methods for sanitary control in fish. Essential oils are a good alternative. However, factors such as low water solubility and volatility limit its use. In this work, polymeric nanoparticles pared by the nanoprecipitation method, using poly-ε-caprolactone (PCL) and chitosan. The encapsulation efficiency was indirectly determined, using high chromatography and detection by diode array, using external calibration to he carvacrol. The in vitro antimicrobial activity of the nanoparticle loaded with carvacrol was evaluated by determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Streptococcus agalactiae. Carvacrol was satisfactorily encapsulated by the nanoprecipitation method, with encapsulation efficiency of 69.64 ± 4.42%. The MIC and CBM results obtained for the encapsulated and isolated carvacrol were the respectively, showing the increased inhibitory effect of carvacrol when in the nanoencapsulated form. The preliminary studies carried out open perspectives for safer and more effective solutions that use compounds of plant origin to control
O Brasil está entre os quatro maiores produtores mundiais de tilápia com forte tendência de Um dos grandes desafios que icultura é a ocorrência de doenças em peixes, as devido às lesões provocadas pelas infecções . Para contornar esse . No entanto, o uso intensivo de antibióticos pode contaminar o meio ambiente DIAS; MARIANO, 2015). , métodos alternativos e inovadores para o controle de doenças em peixes que sejam efetivos e ambientalmente seguros precisam ser implementados de forma a contribuir com a
A utilização de compostos naturais se mostra antibióticos para controlar a proliferação de micro desenvolvidos no caso de resistência
essenciais, são produtos naturais que consistem em combinações de inúmeras moléculas v
geralmente compostos por monoterpenos, sesquiterpenos, fenilpropanoides e outras substâncias com baixas massas moleculares
farmacêuticas, cosméticas, agrícolas
entanto, óleos essenciais são compostos voláteis instáveis
ser degradados facilmente (por oxidação,volatilização,aquecimento protegidos de fatores externos (ASBAH
Carvacrol (2-metil-5-(1-metiletil)
pertencente ao grupo dos fenóis monoterpênicos, biossintetizado a partir de terpineno, por meio de p-cimeno. É encontrado em plantas aromáticas e em diversos óleos essenciais de plantas da família Labiatae, como por exemplo,
Corydothymus. Nos Estados Unidos e na Europa, foi aprovado como aditivo alimentar
seguro, sendo utilizado como agente aromatizante em doces, bebidas e goma de mascar (NOSTRO; PAPALIA, 2012).
Figura 1
É descrito em várias pesquisas que o carvacrol apresenta uma alta diversidade de propriedades biológicas, tais como atividades anti
antitumoral, analgésica, inseticida, antiparasitária e antimicrobiana (NOSTRO Estes estudos têm mostrado que a atividade antimicrobiana relaciona
interação que o carvacrol possui com as membranas celulares dos diverso (ALMEIDA, 2015). Segundo Helander
células de Escherichia coli e Photobacterium leiognathi
submeterem as células ao carvacrol, chegaram à conclusão de que este composto ocasiona a desintegração da membrana citoplasmática, devido à liberação de lipopolissacarídeos, redução dos níveis de ATP intracelular e aumento dos níveis de ATP extracelular
atribuiu a atividade antibacteriana do carvacrol à capacidade deste de permeabilizar e despolarizar A utilização de compostos naturais se mostra como uma alternativa favorável ao uso de para controlar a proliferação de micro-organismos patogênicos, assim como para serem desenvolvidos no caso de resistência aos antibióticos (NOSTRO; PAPALIA, 2012).
são produtos naturais que consistem em combinações de inúmeras moléculas v
geralmente compostos por monoterpenos, sesquiterpenos, fenilpropanoides e outras substâncias (MARTINS, 2012).Eles têm sido usados para diversas aplicações farmacêuticas, cosméticas, agrícolas e em indústrias alimentícias(ASBAHANI
são compostos voláteis instáveis e frágeis, consequentemente, podem ser degradados facilmente (por oxidação,volatilização,aquecimento ou luz) se não estiverem
ASBAHANI et al., 2015).
metiletil)-fenol), cuja estrutura está mostrada na Figura 1, pertencente ao grupo dos fenóis monoterpênicos, biossintetizado a partir de terpineno, por meio de
cimeno. É encontrado em plantas aromáticas e em diversos óleos essenciais de plantas da por exemplo, os gêneros Origanum, Satureja,
. Nos Estados Unidos e na Europa, foi aprovado como aditivo alimentar
seguro, sendo utilizado como agente aromatizante em doces, bebidas e goma de mascar
Figura 1. Estrutura química do carvacrol.
É descrito em várias pesquisas que o carvacrol apresenta uma alta diversidade de es biológicas, tais como atividades anti-inflamatória, antioxidante, antimutagênica, antitumoral, analgésica, inseticida, antiparasitária e antimicrobiana (NOSTRO
Estes estudos têm mostrado que a atividade antimicrobiana relaciona-se essencialmente com a que o carvacrol possui com as membranas celulares dos diverso
Segundo Helander et al. (1998 apud ALMEIDA, 2015, p. 4) e
Photobacterium leiognathi, que são bactérias Gram negativas, após submeterem as células ao carvacrol, chegaram à conclusão de que este composto ocasiona a desintegração da membrana citoplasmática, devido à liberação de lipopolissacarídeos, redução dos
mento dos níveis de ATP extracelular. O estudo de Xu
atribuiu a atividade antibacteriana do carvacrol à capacidade deste de permeabilizar e despolarizar como uma alternativa favorável ao uso de organismos patogênicos, assim como para serem PAPALIA, 2012). Óleos são produtos naturais que consistem em combinações de inúmeras moléculas voláteis, geralmente compostos por monoterpenos, sesquiterpenos, fenilpropanoides e outras substâncias para diversas aplicações ASBAHANIet al., 2015). No e frágeis, consequentemente, podem luz) se não estiverem
, cuja estrutura está mostrada na Figura 1, é pertencente ao grupo dos fenóis monoterpênicos, biossintetizado a partir de terpineno, por meio de cimeno. É encontrado em plantas aromáticas e em diversos óleos essenciais de plantas da , Thymbra, Thymus e . Nos Estados Unidos e na Europa, foi aprovado como aditivo alimentar considerado seguro, sendo utilizado como agente aromatizante em doces, bebidas e goma de mascar
É descrito em várias pesquisas que o carvacrol apresenta uma alta diversidade de inflamatória, antioxidante, antimutagênica, antitumoral, analgésica, inseticida, antiparasitária e antimicrobiana (NOSTRO; PAPALIA, 2012). essencialmente com a que o carvacrol possui com as membranas celulares dos diversos micro-organismos . (1998 apud ALMEIDA, 2015, p. 4) em estudo com que são bactérias Gram negativas, após submeterem as células ao carvacrol, chegaram à conclusão de que este composto ocasiona a desintegração da membrana citoplasmática, devido à liberação de lipopolissacarídeos, redução dos O estudo de Xu et al. (2008) atribuiu a atividade antibacteriana do carvacrol à capacidade deste de permeabilizar e despolarizar
a membrana citoplasmática de
fluorescente combinada com a citometria de fluxo
a diminuição da taxa de fluorescência em razão das alterações provocadas sobre a permeabilidade da membrana, por causa da interação desta com o carvacrol.
Por meio da nanotecnologia
tais como sua solubilidade em água, aumento da estabilidade e tempo de ação, proteção contra a degradação prematura, além de possibilitar a liberação sustentada
al.,2015).
Dentre os diferentes tipos de nanopartículas que podem ser utilizadas, as poliméricas têm sido aplicadas no desenvolvimento de nanocarreadores de diferentes compostos. (PASCOLI 2018; VURRO et al., 2019). É
controlada, capazes de aumentar a eficiência e solubilidade dos compostos além de oferecer proteção aos compostos bioativos sujeitos à degradação prematura, atrelados aos benefícios de biodegradabilidade e biocompatibilidade
Vários polímeros naturais e sintéticos, tais como poli
sódio têm sido utilizados no encapsulamento de diferentes compostos levando a formação de nanopartículas de diferentes tamanhos
interação entre as nanocápsulas e o tecido alvo, pesquisadores usam “coatings nanopartículas dando uma carga catiônica (+) ou aniônica (
com moléculas específicas que se ligam a receptores celulares. Nanopartículas revestidas com quitosana têm desperta a mucosa. Estudos t
da quitosana ajudam a modelar a liberação sustentada dos ativos Na aquicultura, a imersão é
ou imunomoduladores aos peixes
a forma de exposição aos medicamentos e sua absorção pelo peixe
da dose aplicada. O uso de nanocarreadoresmucoadesivos é uma alternativa administração de medicamentos e imunomoduladores em sistemas de imersão superfície mucosa do peixe resultando em
O objetivo deste trabalho foi preparar nanopartículas poliméricas utilizando o polímero biodegradável
propriedades mucoadesivas quitosana
encapsulamento na atividade antimicrobiana frente a bactéria
a membrana citoplasmática de E. coli. Para testar esta hipótese, a equipe
fluorescente combinada com a citometria de fluxo. Conforme os ensaios realizados, demonstrou fluorescência em razão das alterações provocadas sobre a permeabilidade da membrana, por causa da interação desta com o carvacrol.
meio da nanotecnologia é possível alterar algumas propriedades intrínsecas à molécula tais como sua solubilidade em água, aumento da estabilidade e tempo de ação, proteção contra a degradação prematura, além de possibilitar a liberação sustentada dos ati
Dentre os diferentes tipos de nanopartículas que podem ser utilizadas, as poliméricas têm no desenvolvimento de nanocarreadores de diferentes compostos. (PASCOLI
É considerada a forma mais simples de sistemas de liberação controlada, capazes de aumentar a eficiência e solubilidade dos compostos além de oferecer proteção aos compostos bioativos sujeitos à degradação prematura, atrelados aos benefícios de
lidade e biocompatibilidade (PASCOLI et al., 2018).
Vários polímeros naturais e sintéticos, tais como poli-ε-caprolactona, qu
m sido utilizados no encapsulamento de diferentes compostos levando a formação de iferentes tamanhos (NURUZZAMAN et al., 2016).Buscando uma melhor interação entre as nanocápsulas e o tecido alvo, pesquisadores usam “coatings
nanopartículas dando uma carga catiônica (+) ou aniônica (-) ou até mesmo funcionalizando m moléculas específicas que se ligam a receptores celulares. Nanopartículas revestidas com
mucosa. Estudos têm demonstrado que as propriedades mucoadesivas da quitosana ajudam a modelar a liberação sustentada dos ativos (BERNI-NETO
, a imersão é um dos principais métodos de administração de medicamentos peixes. No entanto a eficiência destes está diretamente relacionada com a forma de exposição aos medicamentos e sua absorção pelo peixe, que é variável e dependente da dose aplicada. O uso de nanocarreadoresmucoadesivos é uma alternativa
administração de medicamentos e imunomoduladores em sistemas de imersão resultando em pouco efeito residual na água (SILVA,
O objetivo deste trabalho foi preparar nanopartículas poliméricas carregadas com carvacrol utilizando o polímero biodegradável poly-ε-caprolactone (PCL) e o biopolímero natural com
uitosana,pelo método de nanoprecipitação
encapsulamento na atividade antimicrobiana frente a bactéria Streptococcus agalactiae.
. Para testar esta hipótese, a equipe usou a coloração Conforme os ensaios realizados, demonstrou-se fluorescência em razão das alterações provocadas sobre a permeabilidade
é possível alterar algumas propriedades intrínsecas à molécula, tais como sua solubilidade em água, aumento da estabilidade e tempo de ação, proteção contra a dos ativos (ASBAHANI et
Dentre os diferentes tipos de nanopartículas que podem ser utilizadas, as poliméricas têm no desenvolvimento de nanocarreadores de diferentes compostos. (PASCOLI et al., considerada a forma mais simples de sistemas de liberação controlada, capazes de aumentar a eficiência e solubilidade dos compostos além de oferecer proteção aos compostos bioativos sujeitos à degradação prematura, atrelados aos benefícios de
quitosana e alginato de m sido utilizados no encapsulamento de diferentes compostos levando a formação de Buscando uma melhor interação entre as nanocápsulas e o tecido alvo, pesquisadores usam “coatings” superficiais nas ) ou até mesmo funcionalizando-as m moléculas específicas que se ligam a receptores celulares. Nanopartículas revestidas com m demonstrado que as propriedades mucoadesivas
NETO, 2014).
um dos principais métodos de administração de medicamentos . No entanto a eficiência destes está diretamente relacionada com que é variável e dependente da dose aplicada. O uso de nanocarreadoresmucoadesivos é uma alternativa promissora para administração de medicamentos e imunomoduladores em sistemas de imersão poraderirem à
(SILVA, et al., 2018). carregadas com carvacrol caprolactone (PCL) e o biopolímero natural com e avaliar o efeito do Streptococcus agalactiae.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Obtenção das nanopartículas poliméricas e determinação da eficiência de encapsulamento
Os experimentos para o preparo das nanopartículas contendo carvacrol foram realizados Central Analítica de Resíduos e Contaminantes
Para a obtenção dos sistemas,
Neto, (2014). Primeiramente, foram preparadas duas soluções, uma aquosa (ácido acético 0,2% (v/v), quitosana e Tween 80) e outra orgânica (acetona, PCL e carvacrol, no caso das nanopartículas carregadas) completamente miscíveis. Um volume de 3 mL da fase orgânica foi adicionado à solução aquosa (9 mL)
0,5 mL/min sob agitação magnética (400 rpm). M
minutos e submeteu-se à evaporação do solvente orgânico sob baixa pressão.
A eficiência de encapsulamento (ee%) foi calculada de forma indireta, através da diferença da massa de carvacrol adicionada na nanoformulação (
na fase aquosa (m fase aquosa). A massa de carvacrol na fase aquosa foi obtida após a filtração de 500 µl da nanoformulação em microfiltros
centrifugados à 14.000 rpm, 20°
cromatografia líquida de alta eficiência, utilizando detecção por arranjo de diodos em comprimento de onda de 274 nm. O analito sofreu eluição
HPLC) até 80% em 10 minutos, mantendo totalizando 20 minutos de corrida
fluxo 0,800 mL min-1 e volume de injeção de 20 µ
de 9,6 minutos. Os ensaios de quantificação foram realizados por meio de utilizando-se uma curva analítica, na faixa de 2,5 a 40 µg mL
2.2. Avaliação da atividade in vitro
A atividade antimicrobiana de carvacrol isolado e na forma de nanopartícula foi avaliada pela determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), por meio da técnica da microdiluição e pela determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM), através da semeadura em placas de Petri (NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATOY STANDARDS
determinação da CIM foi realizada em placas de microdiluição com 96 poços, dispostos em 12 colunas (1 a 12) e 8 linhas (A a
inseridos 100µL de caldo TSB. Em seguida, inseriu
Obtenção das nanopartículas poliméricas e determinação da eficiência de
Os experimentos para o preparo das nanopartículas contendo carvacrol foram realizados Contaminantes da Embrapa Meio Ambiente, em
Para a obtenção dos sistemas, utilizou-se o método da nanoprecipitação descrito por Berni Primeiramente, foram preparadas duas soluções, uma aquosa (ácido acético 0,2% (v/v), quitosana e Tween 80) e outra orgânica (acetona, PCL e carvacrol, no caso das egadas) completamente miscíveis. Um volume de 3 mL da fase orgânica foi adicionado à solução aquosa (9 mL) via drop wise (gotejamento controlado e contínuo) na
sob agitação magnética (400 rpm). Manteve-se a agitação magnética por mais 15 se à evaporação do solvente orgânico sob baixa pressão.
ficiência de encapsulamento (ee%) foi calculada de forma indireta, através da diferença da massa de carvacrol adicionada na nanoformulação (m total experimental) e a massa prese
fase aquosa). A massa de carvacrol na fase aquosa foi obtida após a filtração de 500 µl da nanoformulação em microfiltros Amicon® ultra-0.5 com corte molecular de 10 kda,
14.000 rpm, 20° Ce durante 40 minutos. A quantificação do carvacrol foi feita por cromatografia líquida de alta eficiência, utilizando detecção por arranjo de diodos em comprimento de onda de 274 nm. O analito sofreu eluição em modo gradiente, iniciando em 50% metanol (grau mantendo-se por mais 3 minutos e retornando ao equilíbrio inicial, totalizando 20 minutos de corrida, a coluna utilizada foi C18, 5 µm, 250 x 4,6 mm (Phenomenex),
e volume de injeção de 20 µL. O tempo de retenção atribuído ao carvacrol foi de 9,6 minutos. Os ensaios de quantificação foram realizados por meio de
se uma curva analítica, na faixa de 2,5 a 40 µg mL-1. O ensaio foi realizad
vitro contra bactéria causadora infecções
A atividade antimicrobiana de carvacrol isolado e na forma de nanopartícula foi avaliada pela determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), por meio da técnica da microdiluição e pela determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM), através da semeadura em placas
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATOY STANDARDS
determinação da CIM foi realizada em placas de microdiluição com 96 poços, dispostos em 12 a H). Em cada um dos poços das placas de microdiluição foram inseridos 100µL de caldo TSB. Em seguida, inseriu-se numa microplaca 100µL da substância pura Obtenção das nanopartículas poliméricas e determinação da eficiência de
Os experimentos para o preparo das nanopartículas contendo carvacrol foram realizados na , em Jaguariúna – SP. se o método da nanoprecipitação descrito por Berni-Primeiramente, foram preparadas duas soluções, uma aquosa (ácido acético 0,2% (v/v), quitosana e Tween 80) e outra orgânica (acetona, PCL e carvacrol, no caso das egadas) completamente miscíveis. Um volume de 3 mL da fase orgânica foi (gotejamento controlado e contínuo) narazão de se a agitação magnética por mais 15 se à evaporação do solvente orgânico sob baixa pressão.
ficiência de encapsulamento (ee%) foi calculada de forma indireta, através da diferença total experimental) e a massa presente fase aquosa). A massa de carvacrol na fase aquosa foi obtida após a filtração 0.5 com corte molecular de 10 kda, ficação do carvacrol foi feita por cromatografia líquida de alta eficiência, utilizando detecção por arranjo de diodos em comprimento em modo gradiente, iniciando em 50% metanol (grau se por mais 3 minutos e retornando ao equilíbrio inicial, 250 x 4,6 mm (Phenomenex), tempo de retenção atribuído ao carvacrol foi de 9,6 minutos. Os ensaios de quantificação foram realizados por meio de padronização externa, O ensaio foi realizado em triplicata.
em peixe
A atividade antimicrobiana de carvacrol isolado e na forma de nanopartícula foi avaliada pela determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), por meio da técnica da microdiluição e pela determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM), através da semeadura em placas NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATOY STANDARDS, 2003). A determinação da CIM foi realizada em placas de microdiluição com 96 poços, dispostos em 12 H). Em cada um dos poços das placas de microdiluição foram se numa microplaca 100µL da substância pura
carvacrol e em outra microplaca carvacrol na forma de nanopartícula concentração inicial de 0,5 mg mL
subsequentes foram obtidas após partindo-se da concentração inicial de 0,5
transferência de 100µL do conteúdo ao poço subsequente. Para os poços da linha H, foram dispensados 100µL do conteúdo, de modo a igualar o volume total de cada poço. Posteriormente, foram inseridos 10 µL da suspensão dos micro
As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37° última diluição dos óleos essenciais na qual não foi verificad pela adição de uma solução 0,5% de cloreto,2,3,5
coloração vermelha na suspensão
incubação. A Concentração Bactericida Mínima (CBM) concentração da formulação capaz de
da semeadura, em Agar Mueller
CIM, o efeito bacteriostático foi determinado pe microdiluição. Após a semeadura, as placas de
37ºC, por 24h. A CBM foi considerada a menor concentração que impediu
das bactérias ou permitiu a formação de até três Unidades Formadoras de Colônia (UFC). Foi realizado controle positivo com adição de cloranfenicol mais
com meio TSB mais a bactéria em estudo.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃ
A metodologia de preparo das nanopartículas pelo método da nanoprecipitação foi baseada na descrita por Berni-Neto (2014), substituindo
utilizado pelo autor no encapsulamento da violaceína pelo de peso molecular médio de 10.000 g mol-1.Ébem estabelecido na literatura que fatores como a natureza do princípio ativo
(hidrofobicidade/hidrofilicidade), propriedades físico
peso molecular) e a estrutura das nanopartículas estão intimamente relac do ativo da nanopartícula. O método de nanoprecip
(PCL) resulta em elevada eficiência de encapsulamento de ativos insolúveis em água como o carvacrol (MELO, 2011).A opção da quitosana se d
devido à sua carga positiva proveniente dos agrupamentos aminas presentes em sua molécula. Desta forma, a adição de quitosana na formulação pode proporcionar uma carga superficial positiva às nanopartículas, dando a estas propriedades de
carvacrol e em outra microplaca carvacrol na forma de nanopartícula
mL-1 na primeira linha da placa de microdiluição. As concentrações
subsequentes foram obtidas após diluição seriada dos compostos na placa de microdiluição, se da concentração inicial de 0,5 mg mL-1 (linha A) até 0,0078125 mg mL
transferência de 100µL do conteúdo ao poço subsequente. Para os poços da linha H, foram dispensados 100µL do conteúdo, de modo a igualar o volume total de cada poço. Posteriormente, uspensão dos micro-organismos (1,5 × 107 UFC/mL) em todos os poços
As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37° C, por 48 horas. A CIM correspondeu à última diluição dos óleos essenciais na qual não foi verificado o crescimento do micro
5% de cloreto,2,3,5-trifenil-tetrazólio (TTC). A revelação
na suspensão indicou que houve crescimento microbiano após o período de incubação. A Concentração Bactericida Mínima (CBM) foi usada para
da formulação capaz de inibir o crescimento bacteriano visívele
da semeadura, em Agar Mueller-Hinton, de alíquotas de 10µL das diluições correspondentes da CIM, o efeito bacteriostático foi determinado pela ausência de crescimento nos poços da placa de microdiluição. Após a semeadura, as placas de Petri foram incubadas em estufa bacteriológica a
, por 24h. A CBM foi considerada a menor concentração que impediu
mitiu a formação de até três Unidades Formadoras de Colônia (UFC). Foi realizado controle positivo com adição de cloranfenicol mais S. agalactiae ao meio TSB e negativo com meio TSB mais a bactéria em estudo.
ESULTADOS E DISCUSSÃO
preparo das nanopartículas pelo método da nanoprecipitação foi baseada Neto (2014), substituindo-se PCL de peso molecular de 65.000 g mol utilizado pelo autor no encapsulamento da violaceína pelo de peso molecular médio de 10.000 g
.Ébem estabelecido na literatura que fatores como a natureza do princípio ativo (hidrofobicidade/hidrofilicidade), propriedades físico-químicas do polímero (relacionados com seu peso molecular) e a estrutura das nanopartículas estão intimamente relacionadas com a liberação do ativo da nanopartícula. O método de nanoprecipitação utilizando-se um polímero hidrofóbico (PCL) resulta em elevada eficiência de encapsulamento de ativos insolúveis em água como o
A opção da quitosana se deu pela sua propriedade de
sua carga positiva proveniente dos agrupamentos aminas presentes em sua molécula. Desta forma, a adição de quitosana na formulação pode proporcionar uma carga superficial positiva
stas propriedades de mucoadesão (SOSNIKet al
carvacrol e em outra microplaca carvacrol na forma de nanopartícula para obtenção da na primeira linha da placa de microdiluição. As concentrações diluição seriada dos compostos na placa de microdiluição, (linha A) até 0,0078125 mg mL-1 (linha H), pela
transferência de 100µL do conteúdo ao poço subsequente. Para os poços da linha H, foram dispensados 100µL do conteúdo, de modo a igualar o volume total de cada poço. Posteriormente, UFC/mL) em todos os poços. , por 48 horas. A CIM correspondeu à o crescimento do micro-organismo . A revelação de uma crescimento microbiano após o período de foi usada para saber qual a menor r o crescimento bacteriano visívele foi obtida por meio Hinton, de alíquotas de 10µL das diluições correspondentes da la ausência de crescimento nos poços da placa de etri foram incubadas em estufa bacteriológica a , por 24h. A CBM foi considerada a menor concentração que impediu o crescimento visível mitiu a formação de até três Unidades Formadoras de Colônia (UFC). Foi ao meio TSB e negativo
preparo das nanopartículas pelo método da nanoprecipitação foi baseada se PCL de peso molecular de 65.000 g mol-1,
utilizado pelo autor no encapsulamento da violaceína pelo de peso molecular médio de 10.000 g .Ébem estabelecido na literatura que fatores como a natureza do princípio ativo químicas do polímero (relacionados com seu ionadas com a liberação se um polímero hidrofóbico (PCL) resulta em elevada eficiência de encapsulamento de ativos insolúveis em água como o eu pela sua propriedade de mucoadesão, sua carga positiva proveniente dos agrupamentos aminas presentes em sua molécula. Desta forma, a adição de quitosana na formulação pode proporcionar uma carga superficial positiva
Carvacrol foi satisfatoriamente encapsulado nas na resultando em eficiência de encapsulamento de
pelo método de nanoprecipitação resultam em eficiência de encapsulamento maiores que 70% (MELO, 2011). São comparáveis com
método de encapsulamento de ativos SHAKER, MADY, 2017).CAMPOS
funcionalizadas com ciclodextrina contendo carvacrol e linalol
iônica, obtendo 93.9±0.58% e 86.9±0.9% de eficiência de encapsulamento para carvacrol e linalol respectivamente. Os autores atribuíram a alta eficiência de encapsulamento
destes compostos e à forte afinidade pelo núcleo hidrofóbico da nanopartícula ou hidrofóbica da ciclodextrina presente neste sistema.
A Figura 2 apresenta os cromatogramas
liquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos a eficiência de encapsulamento.
Figura 2. Cromatogramas típicos obtidos pela técnica de HPLC quantificar do carvacrol. A) amostra e B) padrão de carvacrol 20
Carvacrol foi satisfatoriamente encapsulado nas nanopartículas de PCL e
resultando em eficiência de encapsulamento de 69,64±4,42%. Compostos apolares encapsulados ão resultam em eficiência de encapsulamento maiores que 70% São comparáveis com outros trabalhos que envolvem a nanoprecipitação como método de encapsulamento de ativos (COLA et al., 2016; HAGGAG et al
AMPOS et al. (2018) prepararam nanopartículas dequitosana funcionalizadas com ciclodextrina contendo carvacrol e linalol, utilizando o método de gelificação 93.9±0.58% e 86.9±0.9% de eficiência de encapsulamento para carvacrol e linalol pectivamente. Os autores atribuíram a alta eficiência de encapsulamento
forte afinidade pelo núcleo hidrofóbico da nanopartícula ou hidrofóbica da ciclodextrina presente neste sistema.
s cromatogramas típicos do carvacrol pela técnica de cromatografia liquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos (HPLC-DAD), utilizada para quantificar
Cromatogramas típicos obtidos pela técnica de HPLC . A) amostra e B) padrão de carvacrol 20 µg mL-1.
culas de PCL e quitosana, Compostos apolares encapsulados ão resultam em eficiência de encapsulamento maiores que 70% outros trabalhos que envolvem a nanoprecipitação como et al., 2020;SHAABAN, (2018) prepararam nanopartículas dequitosana utilizando o método de gelificação 93.9±0.58% e 86.9±0.9% de eficiência de encapsulamento para carvacrol e linalol pectivamente. Os autores atribuíram a alta eficiência de encapsulamentoà hidrofobicidade forte afinidade pelo núcleo hidrofóbico da nanopartícula ou à cavidade
o carvacrol pela técnica de cromatografia , utilizada para quantificar
O efeito do encapsulamento na atividade antimicrobiana do carvacrol frente Streptococcus agalactiae foi avaliado.
produtos testados contra S. agalactiae
carvacrol isolado e para a forma de nanopartícula
Figura 3. Concentração Inibitória Mínima (CIM) da nanopartícula contra Streptococcusagalactiae, onde C
C4= 0,03125mg mL-1;C5 = 0,0625 mgmL-1.
Após observação do plaqueamento realizado em triplicata, observou
concentrações 390,625 µg mL-1
forma de nanopartícula, confirmando portanto o efeito bactericida d de nanopartícula.
Conforme a classificação
com PCL, contendo o carvacrol,apresentou uma atividade µg mL-1, já o carvacrol isolado apresentou uma atividade
A efetividade das nanopartículas pode ser explicada pela proteção do carvacrol contra sua rápida volatilização e degradação
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8
O efeito do encapsulamento na atividade antimicrobiana do carvacrol frente
foi avaliado. Os valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos S. agalactiaeforam 390,625 µgmL-1 e 62,5 µgmL-1,
a forma de nanopartícula (Figura3).
Concentração Inibitória Mínima (CIM) da nanopartícula contra C1= 0,0039 mg mL-1; C2 = 0,0078 mg mL-1; C 0,0625mg mL-1; C6 = 0,125 mg mL-1;C7 = 0,25 mg mL
Após observação do plaqueamento em placas de Agar Mueller-Hinton observou-se que não houve crescimento da bactéria
e 62,5 µg mL-1, respectivamente para carvacrol isolado e para a
forma de nanopartícula, confirmando portanto o efeito bactericida do composto isolado e na forma
a classificação descrita por Freires et al. (2015), a nanopartícula apresentou uma atividade muito forte, com um valor , já o carvacrol isolado apresentou uma atividade forte com um valor entre 101
as nanopartículas pode ser explicada pela proteção do carvacrol contra sua rápida volatilização e degradação, além se ser liberado de forma sustentada das nanoestruturas
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8
O efeito do encapsulamento na atividade antimicrobiana do carvacrol frente à bactéria Os valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos , respectivamente para
Concentração Inibitória Mínima (CIM) da nanopartícula contra
C3= 0,0156 mg mL-1; mg mL-1; C8 = 0,5
Hintonno teste do CBM, da bactéria nas repetições, nas , respectivamente para carvacrol isolado e para a o composto isolado e na forma
. (2015), a nanopartícula de quitosana com um valor menor de 100 com um valor entre 101-500 µg mL-1.
as nanopartículas pode ser explicada pela proteção do carvacrol contra sua além se ser liberado de forma sustentada das nanoestruturas.
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8
O resultado alcançado mostrou realização de estudos in vivo a fim de em tilápia infectada comS. agalactiae
A presente pesquisa reforça que
obtenção de nanopartículas a fim de alcançar um maior desenvolvimento desta área, de modo que a eficiência de encapsulamento de ativos seja sempre alta. Com isso, podem ser desenvolvidas novas tecnologias para controle de doenças causadoras de mortalidade e perda de produtividade na aquicultura. As vantagens desses novos materiais é a diminuição do uso de antibióticos comerciais, maior preservação ambiental e maior segurança quanto ao consumo deste alimento.
Os estudos realizados abrem perspectivas para soluções mais seguras e ef empregam compostos de origem
contendo carvacrol possui a vantagem de diminuir a volatilidade do princípio ativo, maior efeito residual por ser de liberação lenta e sofrer menor degradaç
característica de mucoadesão, diminuindo a perda para o ambiente.
4. CONCLUSÃO
É possível sintetizar nanopartículas de quitosana encapsulamento do carvacrol. A nanoprecipitação mostrous
destas nanopartículas que resultaram num aumento da atividade antimicrobiana do carvacrol frente à bactériaS. agalactiae.
5. AGRADECIMENTOS
Parceria celebrada entre o BNDES, FEA e Embrapa, com aporte de recursos SAP/MAPA, contrapartida da Embrapa e apoio do CNPq
6. REFERÊNCIAS
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mostrou-se promissor e a próxima etapa a fim de avaliar a eficiência da nanopartícula e S. agalactiae.
pesquisa reforça que estudos adicionais devem ser realizados no âmbito da as a fim de alcançar um maior desenvolvimento desta área, de modo que a eficiência de encapsulamento de ativos seja sempre alta. Com isso, podem ser desenvolvidas novas tecnologias para controle de doenças causadoras de mortalidade e perda de produtividade na aquicultura. As vantagens desses novos materiais é a diminuição do uso de antibióticos
maior preservação ambiental e maior segurança quanto ao consumo deste alimento. Os estudos realizados abrem perspectivas para soluções mais seguras e ef
empregam compostos de origem vegetal para o controle de doenças em peixe.
contendo carvacrol possui a vantagem de diminuir a volatilidade do princípio ativo, maior efeito residual por ser de liberação lenta e sofrer menor degradação por luz. Além disso, possui característica de mucoadesão, diminuindo a perda para o ambiente.
possível sintetizar nanopartículas de quitosana com PCL apresentando alta eficiência de encapsulamento do carvacrol. A nanoprecipitação mostrouser um método adequado para a síntese que resultaram num aumento da atividade antimicrobiana do carvacrol frente
BNDES, FEA e Embrapa, com aporte de recursos SAP/MAPA, contrapartida da Embrapa e apoio do CNPq. Projeto BRS Aqua (
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promissor e a próxima etapa do trabalho será a avaliar a eficiência da nanopartícula e validar a tecnologia
devem ser realizados no âmbito da as a fim de alcançar um maior desenvolvimento desta área, de modo que a eficiência de encapsulamento de ativos seja sempre alta. Com isso, podem ser desenvolvidas novas tecnologias para controle de doenças causadoras de mortalidade e perda de produtividade na aquicultura. As vantagens desses novos materiais é a diminuição do uso de antibióticos
maior preservação ambiental e maior segurança quanto ao consumo deste alimento. Os estudos realizados abrem perspectivas para soluções mais seguras e eficazes que
para o controle de doenças em peixe.A nanopartícula contendo carvacrol possui a vantagem de diminuir a volatilidade do princípio ativo, maior efeito ão por luz. Além disso, possui
apresentando alta eficiência de adequado para a síntese que resultaram num aumento da atividade antimicrobiana do carvacrol frente
BNDES, FEA e Embrapa, com aporte de recursos do BNDES,
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