thu nhận enzyme amylase từ Aspergillus Oryzae

L

LỜ Ờ I MI MỞ Ở ĐẦĐẦUU Enzyme amylase là m

Enzyme amylase là mộột trong nht trong những enzyme đƣợ ững enzyme đƣợ c quan tâm nghiên cc quan tâm nghiên cứứu u ssớ ớ mm và nhi

và nhiềều u nhnhấất t hihiệện nay. Cácn nay. Các ứứng ng ddụụng ng ccủủa enzyme trong nhia enzyme trong nhiều lĩnhều lĩnh vvựực khác nhauc khác nhau ngày càng đƣợ 

ngày càng đƣợ c quan tâm nghiên cc quan tâm nghiên cứứu. Ngoài nhu. Ngoài nhữữngng ứứng dng dụụng tiêu bing tiêu biểu đƣợ ểu đƣợ c trình bàyc trình bày ở 

ở trên, enzyme amylase còn cótrên, enzyme amylase còn có ứứng ng ddụụng trong sng trong sảản n xuxuấất t gigiấấm, m, bbộột t ngngọọt, bánh kt, bánh kẹẹo,o, nƣớc trái cây… Ngày nay ngƣời ta đang nghiên cứ

nƣớc trái cây… Ngày nay ngƣời ta đang nghiên cứu các nguu các nguồồn amylase có chn amylase có chất lƣợ ất lƣợ ngng cao và có th

cao và có thểể ssảản xun xuấất theo quy mô công nghit theo quy mô công nghiệp đồệp đồng thng thờ ờ i khi khắắc phc phụục nhc nhữững hng hạạn n chchếế ccủa các phƣơng pháp sảủa các phƣơng pháp sản xn xuuấất tt tạo enzyme amylase năng suấạo enzyme amylase năng suất cao.t cao. ỞỞ ViViệt Nam bƣớ ệt Nam bƣớ cc đầu đã có nhiề

đầu đã có nhiều nghiên cu nghiên cứứuu ứứng dng dụụng enzyme amylase trong chng enzyme amylase trong chếế bibiếến nông sn nông sảản, thn, thựựcc ph

phẩẩm, nhm, nhấất làt là trong lĩnh vựtrong lĩnh vực sc sảản xun xuất bia, rƣợ ất bia, rƣợ u, chu, chếế bibiếến tinh bn tinh bộộtt.. Hi

Hiện nay, αện nay, α-amylase là m-amylase là mộột trong nht trong những enzyme đƣợ ững enzyme đƣợ c c ssửử ddụụng ng rrộộng rãi trongng rãi trong nhi

nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệều lĩnh vực nhƣ công nghiệp thựực php th c phẩm, chăn nuôi thú y, chẩn đoán bệnh…Trongẩm, chăn nuôi thú y, chẩn đoán bệnh…Trong công nghi

công nghiệệp thp thựực phc phẩm, αẩm, α--amylase đóng vai trò đặamylase đóng vai trò đặc bic biệệt quan trt quan trọọngng Thông qua s

Thông qua sựự ththủủy phân tinh by phân tinh bột, αột, α-amylase t-amylase tạạo ra nho ra nhữững ng ssảản n phphẩẩm có giá trm có giá trịị dinh dƣỡng nhƣ dextrin, maltose, glucose…

dinh dƣỡng nhƣ dextrin, maltose, glucose… Trƣớc đây, ngƣờ 

Trƣớc đây, ngƣờ i ta thu nhi ta thu nhận αận α-amylase từừ malt là ch-amylase t malt là chủủ yyếếu. Ngày nay, vu. Ngày nay, vớ ớ i ni nềềnn công nghi

công nghiệệp phát trip phát triểển n mmạạnh kéo theo nhu cnh kéo theo nhu cầầu u vvềề αα--amylase tăng cao nên việamylase tăng cao nên việc c ápáp ddụụng nhng nhữững kng kỹỹ thuthuậật tit tiếến bn bộộ trong nuôi ctrong nuôi cấấy vi sinh vy vi sinh vật đểật để thu dthu dễễ dàng hơn với lƣợ dàng hơn với lƣợ ngng llớn αớn α-amylase là r-amylase là rấất ct cầần thin thiếếtt

L

LỜ Ờ I MI MỞ Ở ĐẦĐẦUU Enzyme amylase là m

Enzyme amylase là mộột trong nht trong những enzyme đƣợ ững enzyme đƣợ c quan tâm nghiên cc quan tâm nghiên cứứu u ssớ ớ mm và nhi

và nhiềều u nhnhấất t hihiệện nay. Cácn nay. Các ứứng ng ddụụng ng ccủủa enzyme trong nhia enzyme trong nhiều lĩnhều lĩnh vvựực khác nhauc khác nhau ngày càng đƣợ 

ngày càng đƣợ c quan tâm nghiên cc quan tâm nghiên cứứu. Ngoài nhu. Ngoài nhữữngng ứứng dng dụụng tiêu bing tiêu biểu đƣợ ểu đƣợ c trình bàyc trình bày ở 

ở trên, enzyme amylase còn cótrên, enzyme amylase còn có ứứng ng ddụụng trong sng trong sảản n xuxuấất t gigiấấm, m, bbộột t ngngọọt, bánh kt, bánh kẹẹo,o, nƣớc trái cây… Ngày nay ngƣời ta đang nghiên cứ

nƣớc trái cây… Ngày nay ngƣời ta đang nghiên cứu các nguu các nguồồn amylase có chn amylase có chất lƣợ ất lƣợ ngng cao và có th

cao và có thểể ssảản xun xuấất theo quy mô công nghit theo quy mô công nghiệp đồệp đồng thng thờ ờ i khi khắắc phc phụục nhc nhữững hng hạạn n chchếế ccủa các phƣơng pháp sảủa các phƣơng pháp sản xn xuuấất tt tạo enzyme amylase năng suấạo enzyme amylase năng suất cao.t cao. ỞỞ ViViệt Nam bƣớ ệt Nam bƣớ cc đầu đã có nhiề

đầu đã có nhiều nghiên cu nghiên cứứuu ứứng dng dụụng enzyme amylase trong chng enzyme amylase trong chếế bibiếến nông sn nông sảản, thn, thựựcc ph

phẩẩm, nhm, nhấất làt là trong lĩnh vựtrong lĩnh vực sc sảản xun xuất bia, rƣợ ất bia, rƣợ u, chu, chếế bibiếến tinh bn tinh bộộtt.. Hi

Hiện nay, αện nay, α-amylase là m-amylase là mộột trong nht trong những enzyme đƣợ ững enzyme đƣợ c c ssửử ddụụng ng rrộộng rãi trongng rãi trong nhi

nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệều lĩnh vực nhƣ công nghiệp thựực php th c phẩm, chăn nuôi thú y, chẩn đoán bệnh…Trongẩm, chăn nuôi thú y, chẩn đoán bệnh…Trong công nghi

công nghiệệp thp thựực phc phẩm, αẩm, α--amylase đóng vai trò đặamylase đóng vai trò đặc bic biệệt quan trt quan trọọngng Thông qua s

Thông qua sựự ththủủy phân tinh by phân tinh bột, αột, α-amylase t-amylase tạạo ra nho ra nhữững ng ssảản n phphẩẩm có giá trm có giá trịị dinh dƣỡng nhƣ dextrin, maltose, glucose…

dinh dƣỡng nhƣ dextrin, maltose, glucose… Trƣớc đây, ngƣờ 

Trƣớc đây, ngƣờ i ta thu nhi ta thu nhận αận α-amylase từừ malt là ch-amylase t malt là chủủ yyếếu. Ngày nay, vu. Ngày nay, vớ ớ i ni nềềnn công nghi

công nghiệệp phát trip phát triểển n mmạạnh kéo theo nhu cnh kéo theo nhu cầầu u vvềề αα--amylase tăng cao nên việamylase tăng cao nên việc c ápáp ddụụng nhng nhữững kng kỹỹ thuthuậật tit tiếến bn bộộ trong nuôi ctrong nuôi cấấy vi sinh vy vi sinh vật đểật để thu dthu dễễ dàng hơn với lƣợ dàng hơn với lƣợ ngng llớn αớn α-amylase là r-amylase là rấất ct cầần thin thiếếtt

PH

PHẦẦN 1N 1

T

T

Ổ

Ổ

NG QUAN

NG QUAN

1. GI

1. GIỚ Ớ I THII THIỆỆU SU SẢẢN PHN PHẨẨMM 1.1 Định nghĩa

1.1 Định nghĩa

1.1.1 Enzyme 1.1.1 Enzyme

Trong cơ thể

Trong cơ thể ssốống (các tng (các tếế bào) luôn luôn xbào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổảy ra quá trình trao đổi chi chấất. St. Sựự traotrao đổ

đổi i chchấất t ngngừừng thì sng thì sựự ssốống không còn tng không còn tồồn n ttại. Quá trình trao đổại. Quá trình trao đổi i ccủủa a mmộột t chchấất là tt là tậậpp hhợ ợ p cp củủa ra rấất nhit nhiềều các phu các phảảnn ứứng hóa hng hóa họọc phc phứức tc tạạp. Các php. Các phảảnn ứứng này có liên quan chng này có liên quan chặặtt ch

chẽẽ vvới nhau và điềới nhau và điều chu chỉỉnh lnh lẫẫn nhau. Enzyme là hn nhau. Enzyme là hợ ợ p chp chấất protein xúc tác cho các pht protein xúc tác cho các phảảnn ứứng hóa hng hóa học đó. Chúng có khảọc đó. Chúng có khả năng xúc tác đặnăng xúc tác đặc hic hiệệu các phu các phảảnn ứứng hóa hng hóa họọc nhc nhất địất địnhnh và đả

và đảm bm bảảo cho các pho cho các phảảnn ứứng xng xảảy ra theo my ra theo mộột chit chiều hƣớ ều hƣớ ng nhng nhất địất định vnh vớ ớ i ti tốc độốc độ nhnhịịpp nhàng trong cơ thể

nhàng trong cơ thể ssốống.ng.

Enzyme có trong h

Enzyme có trong hầầu u hhếết các lot các loạại ti tếế bào cbào của cơ thểủa cơ thể ssốống. Chính do nhng. Chính do nhữững tácng tác nhân xúc tác có ngu

nhân xúc tác có nguồồn gn gốốc sinh hc sinh học nên Enzyme còn đƣợ ọc nên Enzyme còn đƣợ c gc gọọi là các chi là các chấất xúc tác sinht xúc tác sinh hhọọc (biocatalysators) nhc (biocatalysators) nhằm đểằm để phân biệệt vphân bi t vớ ớ i các chi các chấất xúc tác hóa ht xúc tác hóa họọcc

Chúng là ch

Chúng là chấất xúc tác sinh ht xúc tác sinh họọc không chc không chỉỉ có vai trò quan trcó vai trò quan trọọng trong quá trìnhng trong quá trình sinh trƣở 

sinh trƣở ng, phát tring, phát triểển n ccủủa a mmọọi sinh vi sinh vậật mà nó còn git mà nó còn giữữ vai trò rvai trò rấất quan trt quan trọọng trongng trong công ngh

công nghệệ chchếế bibiếến thn thựực phc phẩẩm, trong y hm, trong y họọc, trong kc, trong kỹỹ thuthuậật phân tích, trong công nght phân tích, trong công nghệệ gen và b

gen và bảảo vo vệệ mmội trƣờ ội trƣờ ng.ng.

1.1.2 Enzyme Amylase 1.1.2 Enzyme Amylase

Amylase là m

Amylase là mộột t hhệệ Enzyme rEnzyme rấất t phphổổ bibiếến trong thn trong thếế gigiớ ớ i sinh vi sinh vậật. Các Enzymet. Các Enzyme này thu

này thuộộc nhóm Enzyme thc nhóm Enzyme thủủy phân, xúc tác phân giy phân, xúc tác phân giảải liên ki liên kếết nt nộội phân ti phân tửử trong nhómtrong nhóm polysaccharide v

polysaccharide vớ ớ i si sựự tham gia ctham gia của nƣớ ủa nƣớ c.c.

RR’

RR’ + + H-OHH-OH  RH RH ++ R’OHR’OH Amylase th

Amylase thủủy phân tinh by phân tinh bộột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrint, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hhạạn chn chế. Các Enzyme Amylase có trong nƣớ ế. Các Enzyme Amylase có trong nƣớ c bc bọt (còn đƣợ ọt (còn đƣợ c gc gọọi là ptyalin), trong di là ptyalin), trong dịịchch

tiêu hóa của ngƣời và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợ i, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Trong nƣớ c bọt của ngƣờ i có ptyalin nhƣng ở một số loài động vật có vú thì không có nhƣ ngựa, chó, mèo... Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non nhờ Amylase của tuyến tụy (còn đƣợ c gọi là amylopsin). Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bở i nấm men.

Amylase là một trong những loại Enzyme đƣợ c ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm.

1.2 Nguồ n gố  c

1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đƣờ ng ở nhiệt độ từ 4000C – 6000C.

 Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu đƣợ c kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành đƣờ ng, và đặt tên là Diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là Amylase). Sau này theo đề nghị của Duclo, Enzyme phân giải tinh bột đƣợ c gọi là Amylase.

 Năm 1851: Leuchs đã phát hiện nƣớ c bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành đƣờng. Sau đó, các Enzyme Amylase trong nƣớ c bọt, trong dịch tiêu hóa của ngƣời và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu đƣợ c quan tâm nghiên cứu.

 Năm 1862, Danilevxki đã tách đƣợ c Amylase của tuyến tụy bằng phƣơng pháp hấp thụ chọn lọc.

 Năm 1949, Schwimmer đã xác định đƣợ c số chu chuyển của α-Amylase là 19000.

 Năm 1950, Englard và Singer cho biết số chu chuyển của -Amylase là 250000. Đến năm 1952, ngƣời ta đã thu đƣợ c 72 Enzyme ở trạng thái kết tinh trong đó có 4 Enzyme α-Amylase.

 Năm 1971, Uxtinilov và cộng sự bằng phƣơng pháp điện di trên gel  poliacrylamid đã xác định đƣợ c sự có mặt của một lƣợ ng lớn α-Amylase và glucoamylase trong canh trƣờ ng nấm mốc và một lƣợ ng nhỏ các phân đoạn có hoạt lực dextrinase và transglucosilase.

Hiện nay các nƣớ c trên thế giớ i sản xuất hàng trăm tấn chế phẩm Enzyme, trong đó Nhật là nƣớ c có truyền thống lâu đờ i nhất, sau đó đến Anh, Pháp, Mỹ, Đan Mạch, Thụy Điển,... đặc biệt hãng Novo của Đan Mạch là 1 trong những hãng sản xuất Enzyme nổi tiếng trên thế giớ i. Bên cạnh đó trong những năm gần đây các nƣớ c Đông Âu và Trung Quốc cũng bắt đầu nghiên cứu và sản xuất Enzyme.

Nếu nhƣ ở Tây Âu mạch nha từ lúa mạch là nguồn Enzyme chủ yếu cho việc chuyển hóa tinh bột thành đƣờ ng, thì ở Viễn Đông Amylase thƣờng đƣợ c sản xuất từ nấm mốc trên môi trƣờ ng nuôi cấy là các loại ngũ cốc có chứa tinh bột. Nhƣ hãng  Novo đã có nhiều chế phẩm Enzyme Amylase đang đƣợ c sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp nhƣ: Công nghiệp sản xuất rƣợ u bia, công nghiệp sản xuất bột giặt, công nghiệp giấy…

1.3 Phân loại 

Hiện nay, có sáu loại Enzyme Amylase đƣợ c xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( Enzyme nội bào ) và Exoamylase ( Enzyme ngoại bào ).

- Endoamylase : gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm Enzyme khử nhánh.

Nhóm Enzyme khử nhánh này đƣợ c chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase ( hay α-dextrin 6-glucanohydrolase ) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10). Các Enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.

- Exoamylase. Đây là những Enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của

chuỗi polysaccharide. Nhóm này gồm có:

+ β-Amylase (EC 3.2.1.2)

Các loại Enzyme endoAmylase và exoAmylase

* Sự khác biệ t giữ  a các loại Enzyme Amylase:

- Các loại Enzyme Amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau ở pH hoạt động và tính ổn định vớ i nhiệt

- Tốc độ phản ứng của Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa của cơ chất. Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau.

- Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt động, pH tối ƣu và các đặc điểm thủy phân khác nhau.

1.3.1 Enzyme α-Amylase ( α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1)

a) C ấ u t ạo

Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lƣợ ng thấp, thƣờ ng nằm trong khoảng 50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trƣờ ng hợp đặc biệt nhƣ α-Amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lƣợng lên đến 130.000 Dal. Đến nay ngƣời ta đã

biết rất rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhƣng chỉ có 2 loại α-Amylase là taka-Amylase từ Apergillus oryzae và α-Amylase của tụy lợn đƣợ c nghiên cứu kỹ

về hình thể không gian cấu trúc bậc 3. Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của

Amylase Exoamylase β-Amylase γ-Amylase Endoamylase Enzym khử nhánh α-Amylase Khử trực tiếp α-dextrin 6-glucanohydrolase Khử gián tiếp oligo-1,6-glucosidase (transglucosylase)

chuỗi mạch acid amin và về vùng kị nƣớ c cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các Enzyme α-Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tƣơng tự nhau.

C ấ u trúc không gian của α-Amylase b) Cơ chế tác d ụng của α-Amylase

α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-Amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ  chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-Amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song vớ i tốc độ rất chậm.

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá trình hai giai đoạn:

+ Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lƣợ ng lớ n dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớ t của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).

+ Giai đoạn 2 (giai đoạn đƣờ ng hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu vớ i iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-Amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dƣớ i

tác dụng của α-Amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose (vì vậy, ngƣờ i ta cho rằng α-Amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1).

+ Sau đó, các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose. Qua một thờ i gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-Amylase lên amylopectin cũng xảy ra tƣơng tự nhƣng vì không phân cắt đƣợ c liên kết α-1,6-glycoside ở  chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đƣờ ng nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%.

Tóm lại, dƣớ i tác dụng của α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thƣờng α-Amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu vớ i Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-Amylase là tính chất đặc trƣng của nó. Vì vậy, ngƣời ta thƣờ ng gọi loại Amylase này là Amylase dextrin hóa hay Amylase dịch hóa.

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-Amylase: + Giai đoạn dextrin hóa:

Tinh bột dextrin phân tử lƣợ ng thấp

+ Giai đoạn đƣờ ng hóa:

Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide

Amylase oligosacharide poliglucose

Maltose maltotriose maltotetrose

c) Đặc tính α-Amylase

α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-Amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-Amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lƣợ ng amino acid cấu thành nên phân tử Enzyme:

+ α-Amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine.

+ Trọng lƣợ ng phân tử của α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da (Knir 1956; Fisher, Stein, 1960 ).

+ Amylase dễ tan trong nƣớ c, trong dung dịch muối và rƣợ u loãng.

+ Protein của các α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH = 4,2 - 5,7 ( Bernfeld P, 1951 ).

α-Amylase là một metaloEnzyme. Mỗi phân tử α-Amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhƣng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của Enzyme, duy trì hoạt động của Enzyme (Modolova, 1965). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của Enzyme khi bị tác động bở i các tác nhân gây biến tính và tác động của các Enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-Amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy  phân cơ chất. α-Amylase bền vớ i nhiệt độ hơn các Enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lƣợ ng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+. Tất cả các Amylase đều bị kiềm hãm bở i các kim loại nặng nhƣ Cu2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại nhƣ : Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hƣở ng mấy đến α-Amylase. Một đặc điểm cần lƣu ý là hầu hết α-Amylase khá bền với tác động của protease nhƣ pepsin, trypsin, papain...

C ấ u trúc phân tử tinh bộ t do Enzyme α-Amylase phân cắ t tạ o thành dextrin  tớ i hạ n phân nhánh.

Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dƣớ i tác dụng của Amylase nấm sợ i chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Nồng độ α-Amylase của vi sinh vật tƣơng đối lớ n có thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành đƣờ ng lên men. Còn các α-Amylase của nấm mốc thì mức độ đƣờng hóa đến glucose và maltose có thể lên tớ i 84 - 87%.

Độ bền đối vớ i tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-Amylase của

 Asp.oryzae bền vững đối vớ i acid tốt hơn là α-Amylase của malt và vi khuẩn  Bac.subtilis. Ở pH= 3,6 và 0oC, α-Amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30

phút; α-Amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-Amylase của nấm sợi hình nhƣ không giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi 1989). Trong dung dịch α-Amylase nấm sợ i bảo quản tốt ở pH = 5,0 - 5,5; α-Amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu đƣợ c pH từ 2,5 - 2,8. Ở 0oC và pH = 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ .

 Bả ng 1.1: M ộ t số tính chấ  t củ a α-Amylase từ vi sinh vậ t

Tên vi sinh vật pH_opt T_opt Phân tử lƣợ ng

(kD)

 Bacillus acidocaldarius 3,5 75 68  Bacillus stearothermophilus 4,5 – 6,5 65 – 73 48

 Bacillus subtilis 5,3 – 6,4 50 47  Acinetobacter sp.I  7,0 50 – 55 55  Acinetobacter sp.II  7,0 50 – 55 65  Bacteroides amylophilus 6,3 43 92  Micrococcus halobius 6,0 – 7,0 50 – 55 89 Streptomyces hygroscopicus 5,0 – 6,0 50 – 55 48 Streptomyces aureofaciens 4,6 – 5,3 40 40 Thermonospora curvata 5,5 – 6,0 65 62  Aspergillus prysee 5,5 – 5,9 40 52  Mucor pusillus 3,5 – 4,0 65 – 70 48  Lipomyces kononenkaae 5,5 40 38 Schwaniomyces castellii 6,0 60 40

1.3.2 Enzyme β - Amylase (β -1,4-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2)

a) C ấ u t ạo

β-Amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm. Ở trong các hạt ngũ cốc nảy mầm, β-Amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết 1,4 α-glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch . Maltose đƣợ c tạo thành do sự xúc tác của β-Amylase có cấu hình β.

Ở ngũ cốc, β-Amylase tham gia vào sự phân giải của tinh bột trong quá trình nảy mầm của hạt. Ở lúa, β-Amylase đƣợ c tổng hợ p trong suốt quá trình của hạt và hầu nhƣ không đƣợ c tổng hợ p ở hạt khô. Ở lúa mạch, Enzyme có mặt ở trong hạt khô, nó đƣợc tích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt, khi ở dạng liên kết, Enzyme này

là một phân tử có trọng lƣợ ng phân tử là 64.000 Da và khi bị phân cắt bở i một protease sẽ đƣợc phóng thích dƣớ i dạng tự do và có khối lƣợ ng phân tử là 59.000 Da .

b) Cơ chế tác d ụng của β -Amylase

β-Amylase là một Enzyme ngoại bào (exoenzyme). Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất . β-Amylase phân cắt các liên kết 1,4glucoside nhƣng khi gặp liên kết 1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớ n có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside và đƣợ c gọi là β-dextrin.

Cơ chế tác dụng của β-Amylase lên tinh bột

Tinh bột maltose (54-58%) + β-dextrin (42-46%) (glucogen)

Tinh bột bị thuỷ phân đồng thờ i bở i cả α và β-Amylase thì lƣợ ng tinh bột thuỷ phân tớ i 95%.

c) Đặc tính của β -Amylase

β-Amylase là một albumin, tâm xúc tác có chứa nhóm – SH , nhóm X-COOH và vòng imidazol của các gốc histidine và là Enzyme ngoại bào (exoEnzyme )

β-Amylase không bền khi có Ca2+, β-Amylase bị kìm hãm bở i Cu2+, Hg2+, urea, iodineoacetamide, iodine, ozon…

β-Amylase chịu nhiệt kém hơn α-Amylase nhƣng bền hơn vớ i acid. β-Amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 700C. Nhiệt độ tối thích của β-Amylase là 550C, pH 5,1 – 5,5.

Tham gia vào cơ chế tác dụng của β-Amylase thƣờ ng có một nhóm caboxyl thể hiện tính chất ái nhân và một nhóm imidazol thể hiện tính chất ái electron. Sự nghịch đảo hình thể của cacbon anome (C1) đƣợ c thực hiện nhờ việc tạo thành hợ p chất đồng hoá trị trung gian kiểu este axetal giữa cacbon anome và nhóm cacboxyl của tâm hoạt động. Sau đó este này bị phân huỷ bởi tác động của 1 phân tử nƣớ c lên nhóm cacboxyl để giải phóng ra α-maltose và hoàn nguyên nhóm cacbxyl của Enzyme.

- amylase   

 Bả ng 1.2: Các đặ c tính của β -Amylase Nguồn gốc Enzyme pH_opt T_opt Phân tử lƣợ ng (kD) Đại mạch 5,2 - 56 Lúa mì 5,2 – 5,6 55 64,2 Đỗ tƣơng 5,4 55 57 Khoai lang 5,0 – 6,0 50 – 55 50  B.cerus 7,0 40 58  B.polymyxa 7,5 40 42  B.megaterium 6,5 40 - 65 58

1.3.3  Enzyme γ-Amylase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3)

a) C ấ u t ạo

γ-Amylase (glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase ) là những Enzyme có thể thuỷ phân đƣợ c cả hai kiểu liên kết của các mạch α-glucan để giải phóng ra ở  dạng β. Glucoamylase hay γ-Amylase chủ yếu đƣợ c tạo ra bở i các vi sinh vật. Đặc biệt là kiểu nấm mốc Aspergillus, Penicillium và Rhizopus

Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lƣợ ng phân tử lƣợ ng dao động rất lớ n từ 27.000 đến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của Enzyme

Nói chung, các amyloglucosidase đều chứa các gốc methioni, tritophan, và một nửa gốc cystein. Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt động của Enzyme vẫn chƣa đƣợ c làm sáng tỏ, tất cả các amyloglucosidase từ nấm mốc đều là glucoprotein chứa từ 5 - 20% gluxit trong đó chủ yếu là các monosaccharid, glucose mannose, galactose và glucosamin

Các amyloglucosidase chủ yếu đƣợ c tạo nên từ hai iso-Enzyme I và II khác nhau ở  khả năng thuỷ phân tinh bột ở  trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng. Amyloglucosidase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở  trạng thái rắn, ngƣợ c lại amyloglucosidase II không có cả hai tinh chất này .

b) Cơ chế hoạt động

Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thuỷ  phân đƣợ c các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhƣng rất chậm (10 - 30 lần ). Tốc độ thuỷ phân cũng phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận vớ i các liên kết glucozit đƣợ c thuỷ phân , cũng nhƣ kích thuớ c và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân . Nhất là vớ i các α-glucan mạch dài (amylose và amylopectin) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là vớ i các maltodextrin và các oligosaccharit.

c) Tính chấ t 

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside. Khi thuỷ phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lƣợ t từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Enzyme này có nhiều tên gọi khác nhau: α-1,4; α-1,6-glucan- 4; 6-glucohydrolase; glucoamylase; amyloglucosidase; taka-Amylase B; γ-Amylase… Là Enzyme ngoại bào.

Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside .

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin, panose, iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần có sự tham gia cuả các loại Enzyme khác. Glucoamylase thuỷ giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so vớ i các chất có phân tử nhỏ. Các polisaccharide có nhánh nhƣ amylopectin, glucogen, β-dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh.

Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH = 3,5 – 5,5 và nhiệt độ 500C. Nó bền với acid hơn α-Amylase nhƣng kém bền hơn trong rƣợ u, acetone và không đƣợ c bảo vệ bở i Ca2+.

1.3.4. Oligo 1,6-glucosidase (dextrinase tớ i hạ n) (EC 3.2.1.10)

Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6  –  glucoside trong isomaltose, panose và các dextrin tớ i hạn thành đƣờ ng có thể lên men đƣợ c. Enzyme này có ở vi sinh vật nhƣng đồng thời cũng có trong các hạt nảy mầm (đại mạch, thóc nảy mầm). Ngoài oligo – 1,6 – glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc, hạt nảy mầm còn có amylopectin – 1,6 – glucosidase hay R – Enzyme và dextrin – 1,6 – glucoside hay amylo –  1,6 – glucoside hay dextrin-6-glucocanhydrolase. Hai loại Enzyme này đều thuỷ phân dextrin triệt để hơn α-Amylase và β-Amylase do đó trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn .

Nhiệt độ tối thích cho các hoạt động của các dextrinase là 400C và pH tối thích là 5,1.

1.3.5. Enzyme pullulanase ( α-dextrin 6-glucosidase) (EC 3.2.1.41)

Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pululan và các dextrin tớ i hạn. Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hƣở ng lớn đến tác động của Enzyme. Đặc biệt là sự có mặt của hai liên kết α-1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho Enzyme phân cắt liên kết này

Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bở i các liên kết α-1,4. Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai gốc maltose nối nhau bằng liên kết 1,6 glucoside. Tác dụng hiệp đồng của α-Amylase và pullulanase làm nó bị thủy phân hoàn toàn.

1.3.6. α-glucosidase hay maltase ( α-D,glucoside-glucohydrolase)(EC 3.2.1.20) Nhiều loại nấm sợ i sản sinh Enzyme này. Giống nhƣ glucomylase, nó thủy  phân maltose thành glucose nhƣng không thủy phân tinh bột. Maltase và glucozyltranferase là một Enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4, trong các glucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đƣờ ng và rƣợ u.

2. NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT

Enzyme Amylase có trong các tế bào sinh vật , động thực vật , các loại nấm mốc. Muốn thu nhận Enzyme cần chiết rút ra khỏi tế bào.

Trong cơ thể sinh vật, Enzyme ở trong tế bào chất và các cấu tử tạo nên tế bào nhƣ nhân microsom … Enzyme không có khả năng đi qua màng tế  bào, để đi vào dung dịch chiết. Vì vậy việc đầu tiên là cần phải phá vỡ màng tế bào. Việc phá vỡ cấu trúc tế bào có thể sử dụng một số cách sau :

+ Biện pháp cơ học nhƣ nghiền xay vớ i bột thuỷ tinh , cát thạch anh hoặc máy xay đồng hoá…

+ Bằng dung môi hữu cơ nhƣ butanol, axeton, glycerin, etyl axetat …

+ Bằng sóng siêu âm, tia X, tia UV…

Sau khi nghiền nhỏ Enzyme đƣợ c chiết rút bằng nuớ c hay dung dịch đệm thích hợ p, hoặc dung dịch muối trung tính …

Dung dịch thu đƣợ c sau khi chiết ngoài Enzyme còn có các tạp chất khác nhƣ protein phi Enzyme, muối, gluxit …

Chúng ta cần loại bỏ để thu nhận Enzyme có độ tinh khiết cao. Có rất nhiều  phƣơng pháp tinh sạch Enzyme sau đây là một số phƣơng pháp cơ bản đƣợ c sử dụng

rộng rãi và có hiệu quả :

+ Để loại muối và tạp chất có trọng lƣợ ng phân tử nhỏ ta dùng phƣơng pháp thẩm tích qua màng bán thấm. Tinh chất của màng này sẽ cho chất có trọng lƣợ ng phân tử nhỏ đi qua . Các chất có trọng lƣợ ng phân tử lớ n bị giữ lại (Enzyme, protein...).

+ Để loại protein lạ và tạp chất có trọng lƣợ ng phân tử cao ta dùng phối hợ p nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ sắc kí hấp phụ, sắc kí trao đổi ion, điện di lọc gel…

 2.1 T ừ thự  c vậ t

Đƣợ c lấy từ nhiều nguồn nhƣ: Đại mạch (hodeum sativum):

+ Giống 2 hàng: sản xuất malt làm bia

+ Giống nhiều hàng (4,6 hàng): làm thức ăn cho gia súc. Lúa (oryza sativa L.): chủ yếu ở vùng Đông Nam Á

Ngô (zea mays): có nhiều loại ngô: ngô đá, ngô bột, ngô răng ngựa. Hạt ngô có màu trắng, màu vàng hay màu hồng. Ngô màu vàng do có sự hiện diện của carotenoid và zeaxanthine ở  trong nội nhũ. Ngô màu hồng là do trong nội nhũ của ngô có anthocyanin.

Các bướ  c quy trình sả n xuấ  t malt khô

Sấy khô Thu nhận, xử lý, làm sạch, phân lo i Mầm rễ khô Tách mầm rễ Sấy khô Nảy mầm Ngâm Không khí 

Malt khô sản xuất bia Malt khô bảo quản

Bảo quản Đại mạch

Quá trình thủ y phân tinh bộ t củ a các Enzyme Amylase

 2.2 T ừ độ ng vậ t

Enzyme Amylase có trong tụy tạng của động vật. Tụy tạng là ống dạng chùm, dài, lớ n, nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng. Chiều dài của tụy tạng khoảng 30-35cm, và nặng khoảng 80-150g. Bên trong có những vách ngăn nhỏ chia tụy tạng thành nhiều thùy nhỏ. Tụy tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết.

Thu nhận Amylase từ động vật phần lớ n là từ dịch tụy tạng. 98% tụy tạng đƣợ c cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tế bào tuyến. Các tế bào này tiết Enzyme tiêu hoá vào trong tá tràng.

 2.3 Từ Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 

 2.3.1 Nguyên liệu tạo môi trườ  ng nuôi cấ  y.

Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thƣờ ng là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên nhƣ cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác.Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì đƣợ c sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dƣỡ ng cần thiết cho VSV phát triển. Mặt khác khi tạo môi trƣờ ng, chúng thƣờ ng có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lƣợng không khí lƣu chuyển trong khối nguyên liệu.

Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề sâu (Sử dụng môi trƣờ ng hoàn toàn lỏng): Nguyên liệu nuôi cấy phổ biến là dịch đƣờng nhƣ glucose, fructose, sacarose,  pepton,… nồng độ thích hợ p khoảng 10 - 15%.

 2.3.2 Môi trường lỏng .

Ở môi trƣờng lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trƣờng, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trƣờng) và pha khí (không khí). Ở đây, VSV sẽ sử dụngchất dinh dƣỡng từ dung dịch môi trƣờng, O2 từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ đƣợc tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trƣờng. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối vi sinh vật.

 Hình 1.1: Lên men trong môi trườ  ng l ỏ ng ở quy mô phòng thí nghiệ m (5L) (www.khoahoc.com.vn)

 2.3.3  Môi trườ  ng bán rắ n

Phần lớ n các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme, ngƣời ta thƣờ ng sử dụng môi trƣờng đặc. Để tăng khả năng xâm nhập của không khí  vào trong lòng môi trƣờng, ngƣời ta thƣờ ng sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trƣờ ng. Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trƣờ ng, nhận chất dinh dƣỡ ng từ hạt môi trƣờ ng và sinh tổng hợ p ra enzyme nội bào và ngoại bào.

Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trƣờ ng, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật. Vi sinh vật không chỉ phát triển trên

bề mặt môi trƣờng, nơi ngăn cách pha rắn (môi trƣờ ng) và pha khí (không khí) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trƣờ ng nằm hẳn trong lòng môi trƣờ ng. Môi trƣờ ng nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợ p. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trƣờ ng lại, không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trƣờ ng, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợ i cho VSV phát triển. Thông thƣờ ng ngƣời ta thƣờ ng tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợ p lý. Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme, ngƣờ i ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trƣờ ng, tạo điều kiện thuận lợ i không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trƣờng. Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn (môi trƣờng đặc) này rất thích hợ p cho len men ở nấm mốc  Asp.oryzae.

 A. B.

 Bả ng 1.3: Tính chấ  t củ a amylase thu nhậ n từ các nguồ n khác nhau. (Nguyễ  n Tiế  n Thắ ng, Gíao trình công nghệ enzyme 2008)

Nguồn thu nhận Giớ i hạn pH

(pH tối ƣu) Khối luợ ng phân tử (Dalton) Nhiệt độ tối ƣu (oC)  B. subtilis 4,5 – 6,5 48.000 60  B. licheniformis 5,0 – 9,0 22.500 90  B.stearothermophilus 4,0 – 5,2(3,0) 96.000 80  B. cereus 6,0 – 7,0 90.000 50 – 55 Pseudomonas 6,7 – 7,0 62.000 45  Hình 1.2: Lên men trên môi trườ  ng rắ n.

 A: lên men k  ỵ khí trong nồi bằng đấ t nung,

Tụy 6,0 – 7,0 45.000

Malt 4,5 – 9,5 (5,5) 52.000 70

 Aspergilus oryzae 5,0 51.000 50 – 60

3. GIỐNG VI SINH VẬT

 3.1 Vi sinh vậ t trong sả n xuấ  t enzyme Amylase

 Nhóm enzyme amylase, đa phần đƣợ c tổng hợ p bở i nấm mốc và vi khuẩn, một số ít từ nấm men. Các chủng nấm mốc nhƣ: Asp. Oryzae, Asp. ninger, Asp. awamori,  Asp. Usamiii, Rhizopus neveus, Mucor sp,... và một số loài vi sinh vật khác nhƣ:  Endomycopsis.Fibuliger, Endomyces sp, Saccharomyces diastaticus,... tạo amylase,

glucoamylase, glucozil transferase. Từ vi khuẩn Bac. Diastaticus, Bac. Subtilis, Bac.  Mesentericus, Bac. Amylosolvens... thƣờng để thu α-amylase chịu nhiệt độ cao.

Mỗi chủng vi sinh có thể tổng hợ p nhiều loại enzyme nhƣng khối lƣợ ng mỗi loại enzyme tổng hợp đƣợ c khác nhau. Ví dụ: chủng Asp. Oryzae (mốc vàng) tổng

hợ p nhiều amylase nhƣng ít glucoamylase và glucozil-transferase. Còn chủng Asp. ninger , Asp.awamori (mốc đen) thì ngƣợ c lại.

Amylase của vi khuần có khả năng dịch hóa cao (tạo dextrin), khả năng đƣờ ng hóa kém hơn amylase nấm mốc, nhƣng có ƣu điểm là chịu nhiệt cao (900C). Ở Nhật, hàng năm sản xuất 7.000 tấn amylase từ vi khuẩn.

3.2 Đặc điểm sinh lý, dinh dưỡ  ng và cơ chế tổ  ng hợ  p sả n phẩ  m trao đổ i chấ  t

 3.2.1 N ấ  m mố  c Aspergillus Oryzae

a) Đặc điểm nấm mốc

 Aspergillus Oryzae ( Asp. Oryzae) là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales,

lớ p Ascomycetes (nang khuẩn). Cơ thể sinh trƣở ng của nó là một hệ sợ i bao gồm những sợ i rất mảnh, chiều ngang 5 -7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang,

chia sợ i thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào). Từ những sợ i nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính.

Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thƣờ ng dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy

bằng mắt thƣờng. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…

Đặc điểm của giống Asp.oryzae là giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại

bào (amylase, protease, pectinasa,…), ta rất hay gặp chúng ở  các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhƣng không đƣợ c rửa sạch, ở cặn bã bia,  bã rƣợ u, ở lõi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớ p mốc, có màu

sắc đen ,vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợ i sẽ mọc thành mốc mớ i

 Hình 1.3: Aspergillus Oryzae (mố  c vàng hoa cau)

b)Ứng dụng của Asp. Oryzae

Dịch quả sau khi nghiền và tách bỏ vỏ thƣờ ng chứa các thành phần tế bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao. Để tăng hiệu suất trích ly dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nƣớ c quả và giảm bớ t một số công đoạn, việc bổ sung Endoglucanase rất quan trọng. Enzyme này là

điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa. Sự kết hợ p của glucanase và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào.

Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase đã đƣợ c sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl do đó giảm lƣợ ng diacetyl đƣợ c tạo thành, rút ngắn thờ i gian cần thiết để ủ bia. Trong dịch lên men có chứa một lƣợ ng β-glucan, chất này ảnh hƣở ng tớ i khả năng lọc và gây đục cho bia.

 3.2.2 Baciluus Subtili

 s

a) Đặc điểm vi khuẩn

 B. Subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí hay kỵ

khí tùy ý. Thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất. Có khả năng di động, sinh nội bào tử. Tế  bào sinh dƣỡng có dạng hình que, kích thƣớc chiều rộng từ 0,7 – 0,8 μm, chiều dài từ 2,0 – 3,0 μm. Không kết thành chuỗi, bắt phẩm nhuộm đồng đều, không tạo bao nang.

 Hình 1.4: Bacillus subtilis Hình 1.5: Vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân chia tế bào. Bào tử B. Subilis có dạng ellip đến hình cầu, kích thƣớc chiều rộng 0,6 –  0,9

μm, chiều dài 1,0 – 1,5 μm, nằm giữa hay trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào,  phần lớn đƣợc tạo thành ở 48 giờ. Mỗi cá thể chỉ tạo một bào tử, bào tử có khả năng

Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch đĩa

Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch đĩa,, khuẩn lạc tròn, không đều hay phânkhuẩn lạc tròn, không đều hay phân tán.tán. Đƣờng kính khuẩn lạc từ 3 – 

Đƣờng kính khuẩn lạc từ 3 –  5 mm, m5 mm, màu vàng xám, rìa có hình răng cƣàu vàng xám, rìa có hình răng cƣ a. Sau 1a. Sau 1 –  – 44 ngày bề mặt khuẩn lạc nhăn nheo, màu h

ngày bề mặt khuẩn lạc nhăn nheo, màu hơi nâu.ơi nâu.

 Hình 1.6 

 Hình 1.6  . Khuẩn lạc B. subtilis trên thạch đĩa . Khuẩn lạc B. subtilis trên thạch đĩa

Trong môi trƣờng lỏng sinh khối tạo màng mỏng có lớp bao phủ. Do bào tử Trong môi trƣờng lỏng sinh khối tạo màng mỏng có lớp bao phủ. Do bào tử chiu nhiệt cao nên

chiu nhiệt cao nên B. subtilis B. subtilis có thể gây hƣcó thể gây hƣ hỏng một số thực phẩm hộp tạo mùi vịhỏng một số thực phẩm hộp tạo mùi vị khókhó

chịu. chịu.

Sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và mannitol nhƣng không tạo Sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và mannitol nhƣng không tạo khí (sử dụng nguồn nitơ là muối amonium).

khí (sử dụng nguồn nitơ là muối amonium).

Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrit từ nitrate. Trong điều kiện kỵ khí, Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrit từ nitrate. Trong điều kiện kỵ khí, không sinh khí từ môi trƣờng lỏng chứa nitrate.

không sinh khí từ môi trƣờng lỏng chứa nitrate.

Một đặc điểm dùng để phân biệt với các vi khuẩn khác là làm tan chảy

Một đặc điểm dùng để phân biệt với các vi khuẩn khác là làm tan chảy gelatinegelatine nhanh chóng.

nhanh chóng.

Bảng 1

Bảng 1.4..4. Một số phản ứng sinh hoá củaMột số phản ứng sinh hoá của B. subtilis B. subtilis Phản ứng sinh hoá

Phản ứng sinh hoá Kết quảKết quả

Ho

Hoạạt tính Catalaset tính Catalase ++

Sinh Indol

Sinh Indol

--MR

VP VP ++ SSửử ddụụng Citrateng Citrate ++ Kh Khửử NitrateNitrate ++ Tan ch

Tan chảảy gelatiny gelatin ++

Phân gi

Phân giảải tinh bi tinh bộộtt ++

Arabinose Arabinose ++ Xylose Xylose ++ Saccharose Saccharose ++ Manitol Manitol ++ Glucose Glucose ++ Lactose Lactose --Maltose Maltose ++ (Theo Holt, 1992) (Theo Holt, 1992)  Nhiệt

 Nhiệt độ độ tối tối thích thích củacủa B.  B. subtilissubtilis vào khoảng 36vào khoảng 36 - - 5050ooC. Nhiều loài vẫn phátC. Nhiều loài vẫn phát

triển đƣợc ở 60

triển đƣợc ở 60ooC. Nồng độ muối ăn làm ngừng phát triển là 10 – C. Nồng độ muối ăn làm ngừng phát triển là 10 – 15%.15%. Ng

Ngƣời ta đã chứng minhƣời ta đã chứng minh B.  B. subtilissubtilis có tập tính “ăn lẫn nhau” (cannibalism).có tập tính “ăn lẫn nhau” (cannibalism).

(( phƣơng pháp đơn giản để thoát khỏi những trƣờng hợp điều kiện sốn phƣơng pháp đơn giản để thoát khỏi những trƣờng hợp điều kiện sống giới hạng giới hạn).).

 B.

 B. subtilissubtilis có khả năng sinh tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhaucó khả năng sinh tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau nhƣnhƣ::

subtilin, subtilosin A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillanene, subtilin, subtilosin A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillanene, difficidin…

difficidin…(theo tài liệu tổng hợp của Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).(theo tài liệu tổng hợp của Nguyễn Quỳnh Nam, 2006). Phân bố trong đất và các chất hữu

Phân bố trong đất và các chất hữu ccơ bị phân hủy và là một đối tƣợng dùngơ bị phân hủy và là một đối tƣợng dùng trong nghiên cứu khả năng lây bệnh trong phòng thí nghiệm

trong nghiên cứu khả năng lây bệnh trong phòng thí nghiệm..

 B.

 B. subtilissubtilis không đƣợc xem là mầm bệnh gây bệnh cho ngƣời. Chúngkhông đƣợc xem là mầm bệnh gây bệnh cho ngƣời. Chúng ththƣờngƣờng

có trong thực phẩm nhƣng hiếm khi gây ngộ độc thực phẩm. có trong thực phẩm nhƣng hiếm khi gây ngộ độc thực phẩm.

b)

b)  Phân loại Phân loại

Bảng 1

Bảng 1.5.5. Bảng phân loại của. Bảng phân loại của Bacillus subtilis Bacillus subtilis

c)

c)  Bộ gen Bộ gen

 Năm 1997,

 Năm 1997, ngời ngời ta đã ta đã hoàn tất hoàn tất việc nghiên việc nghiên cứu cứu về trình về trình tự gen tự gen củacủa B.subtilis B.subtilis

và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn. và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn.

Bộ gen chứa 4,2 mega

Bộ gen chứa 4,2 mega-- base,  base, xấp xấp xỉ xỉ 4100 4100 gen. gen. Trong Trong số số đó, đó, chỉ chỉ có có 192 192 gengen không thể thiếu đƣợc, 79 gen đợc dự đoán là thiết yếu.

không thể thiếu đƣợc, 79 gen đợc dự đoán là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đềuPhần lớn gen thiết yếu đều cócó liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào.

liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào.

d)

d) Ứng dụng của Bacillus subtilisỨng dụng của Bacillus subtilis

Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc,

Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc,  Bacillus  Bacillus subtilissubtilis làlà

một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lƣợng khá lớn (15

một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lƣợng khá lớn (15-20%)-20%) từtừ tinh bột.

tinh bột.

Trong y dƣợc,

Trong y dƣợc, Bacillus  Bacillus subtilissubtilis đƣợc đóng thành ống thuốc Subtilis 10 mlđƣợc đóng thành ống thuốc Subtilis 10 ml trịtrị

 bệnh

 bệnh tiêu tiêu chảy chảy cho cho trẻ trẻ em em do do vi vi khuẩnkhuẩn ColiformColiform gây ra, bệnh đƣờng ruột do lịgây ra, bệnh đƣờng ruột do lị trựctrực

tràng, đắp các vết thƣơng lở loét ngoài da. tràng, đắp các vết thƣơng lở loét ngoài da.

Phân loại khoa học Phân loại khoa học

Giới

Giới : Bacteria: Bacteria HọHọ : Bacillaceae: Bacillaceae Ngành : Firmicutes

Ngành : Firmicutes GiốngGiống : Bacillus: Bacillus Lớp

Lớp : : Bacilli Bacilli Loài Loài : : subtilissubtilis Bộ Bộ : Bacillales: Bacillales Tên kép Tên kép  Bacillus subtilis  Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835 (Ehrenberg 1835 Cohn 1872) Cohn 1872)

Sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây  bệnh nhƣ nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae,... Ngƣời ta thấy

rằng sự phát triển của Bacillus subtilis trong cây làm tăng khả năng tổng hợp các

 peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ ( Rhizobacterium). Khả năng này đƣợc ứng

dụng trong kiểm soát sinh học.

Ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) bổ sung trong thức ăn nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trởng; giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc;  bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lƣợng nƣớc ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi.

Hệ enzyme của B. subtilis đƣợc sử dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa.

Chúng có thể biến đổi các dạng chất thải độc hại thành những dạng hợp chất vô hại của nitrogen, carbon dioxide, và nƣớc.

Một chủng Bacillus subtilis đƣợc biết trƣớc đây là Bacillus natto đƣợc dùng

trong sản xuất thực phẩm thƣơng mại của Nhật tƣơng tự nhƣ thực phẩm cheonggukjang của Hàn Quốc.

 B. subtilis tái tổ hợp đƣợc sử dụng trong sản xuất polyhydroxyalkanoates (PHA)

và chúng có thể sử dụng malt phế thải nhƣ là nguồn cacbon, nhờ vậy chi phí sản xuất PHA giảm.

Phần 2

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

1. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME THEO PHUONG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Quy trình sản xuất mốc giống

Chuẩn bị môi trƣờ ng thạch nghiêng Cấy truyền Ống mốc giống Nuôi cấy 30-32 C trong 5-6 ngày Giống trong ống thạch nghiêng  Nƣớ c vô trùng

Trộn đều bào tử Mốc giống trong_{bình tam giác}

Nuôi cấy 30-32 C trong 5-6 ngày Chuẩn bị môi trƣờ ng

trong bình tam giác

Trộn giống 0,5-10% Nuôi mốc 60h Sấy khô Bao gói Mốc giống cho sản xuất Làm tơi Ngô mảnh, hấp thanh trùng

1.1 . Theo Phương Pháp Nuôi Cấ  y Bề M ặ t

Quy trình công nghệ thu nhậ n enzyme amylase từ Asp. Oryzae Nguyên liệu Xử lý nguyên liệu Hấp thanh trùng Làm nguội Trộn giống vi sinh vật Nuôi cấy Thu nhận chế phẩm enzyme thô Chế phẩm enzyme thô đem tinh chế Nghiền mịn Trích ly Lọc Kết tủa Chế phẩm enzyme tinh khiết

Cồn hoặc sulfat amon

Bã Dùng trong chăn nuôi

Chế phẩm enzyme thô đem sử dụng Giống cho sản xuất

Nhân giống Giống vi sinh vật

Thuyết minh quy trình

Hấp thanh trùng: dƣớ i áp suất hơi 1-1,5 atm trong thờ i gian 45-60 phút.

Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vào môi trƣờng đã thanh trùng, ủ thành đống vài giờ . Khi cấy vào môi trƣờ ng dinh dƣỡ ng, bào tử sẽ phát triển thành tế bào nấm mốc và tạo ra các loại enzyme mà ta mong muốn.

Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trƣờng đƣợ c trải đều ra các khay vớ i chiều dài 2-3cm, rồi đƣợc đƣa vào phòng nuôi cấy ở  28-32oC, không cần điều chỉnh pH. Thờ i gian nuôi nấm sợ i thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ . Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trƣờ ng bán rắn khi nuôi bằng phƣơng pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:

 Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thờ i gian bắt đầu nuôi cấy.

o Nhiệt độ tăng rất chậm.

o Sợ i nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. o Thành phần dinh dƣỡ ng bắt đầu có sự thay đổi.

o Khối môi trƣờ ng còn rờ i rạc.

o Enzyme mớ i bắt đầu đƣơc hình thành.

 Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ .

o Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợ i nấm có màu trắng xám o Môi trƣờng đƣợ c kết lại khá chặt.

o Độ ẩm môi trƣờ ng giảm dần.

o Nhiệt độ môi trƣờ ng sẽ tăng nhanh có thể lên tớ i 40-45oC.

o Các chất dinh dƣỡ ng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh

của nấm sợ i.

o Enzyme amylase đƣợ c tổng hợ p mạnh.

Giai đoạn 3: giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ .

o Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh

dƣỡ ng sẽ chậm lại.

o Nhiệt độ của khối môi trƣờ ng giảm, do đó làm giảm lƣợ ng không

khí môi trƣờ ng xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/  1giờ .

1.1.1. Thu nhậ n sả n phẩ  m

Toàn bộ khối lƣợng enzym thô amylase đƣợc đem đi nghiền nhỏ để phá vỡ  thành tế bào và làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô.

Sử dụng những chất trợ nghiền (cát thạch anh và bột thủy tinh) khi nghiền. Trƣớ c khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải đƣợ c rửa sạch, sấy khô ở  nhiệt độ lớn hơn 1000C để loại bỏ nƣớ c và tiêu diệt VSV. Sau khi nghiền mịn, ngƣời ta cho nƣớc vào để trích ly enzym α-amylase. Cứ một phần chế phẩm enzym thô, ngƣờ i ta cho 4-5 phần nƣớ c, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc (chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợ p bã rồi mới cho gia súc ăn). Dịch thu nhận đƣợ c vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nƣớ c, các chất hòa tan khác từ khối môi trƣờ ng nuôi cấy. Dùng cồn và sunfat amon để kết tủa enzyme.Trong khi tiến hành kết tủa, ngƣờ i ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme.

Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzyme thô, ngƣờ i ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ 4-70C. Theo thờ i gian, các enzyme sẽ đƣợ c tạo kết tủa và lắng xuống đáy, ngƣờ i ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm > 70%W).

1.1.2 Ưu và nhược điể  m Ưu điể m :

Lƣợng enzyme đƣợ c tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thƣờng cao hơn rất nhiều so vớ i nuôi cấy chìm.

Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trƣờ ng sinh khối vi sinh vật, enzyme và nƣớ c). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.

Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp.

Trong trƣờ ng hợ p bị nhiễm các vi sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trƣờ ng đặc là môi trƣờng tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ hoàn toàn đƣợ c an toàn.

 Nhược điể m : Phƣơng pháp này tốn khá lớ n diện tích cho nuôi cấy. Trong

 phƣơng pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trƣờng (môi trƣờ ng lỏng hoặc môi trƣờ ng bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích.

1.2. Theo Phương Phá p Nuôi C ấ  y Bề Sâu: Quy trình công nghệ

Thuyết minh quy trình

Hấp khử trùng ở nhiệt độ 118 – 125 0C, thờ i gian 40 – 60 phút, để nguội dến nhiệt độ bình thƣờ ng và tiếp giống vi sinh vật vào môi trƣờ ng, tỷ lệ giống đƣa vào là 2  – 2,5 %. Sau đó quá trình nuôi cấy đƣợ c thực hiện theo 2 phƣơng pháp: nuôi cấy theo

chu kỳ hay nuôi cấy liên tục.

 Nuôi cấy theo chu kỳ là phƣơng pháp nuôi cấy trong 1 thiết bị lên men. Sau 1 chu kỳ nuôi từ 2 – 4 ngày ở 28 – 320C ngƣờ i ta thu nhận toàn bộ dịch nuôi cấy nhƣ là 1 loại chế phẩm enzyme thô. Phƣơng pháp này không đòi hỏi kỹ thuật cao nhƣng năng suất thấp.

 Nuôi cấy liên tục là để khắc phục tình trạng trên. Quá trình nuôi cấy liên tục có thể nuôi cấy trong 1 thiết bị, cũng có thể thực hiện trong nhiều thiết bị. Phƣơng

Vi Sinh V ật  Dịch nuôi cấy (mật rỉ) Hấp thanh trùng Trộn giống vi sinh vật Nuôi cấy Amylase thô

pháp này có lợ i là nếu chất lƣợ ng sản phẩm ra cuối cùng ra ta thu nhận đuợc chƣa đạt yêu cầu đặt ra ta có thể khắc phục bằng hai cách.

o Cách thứ nhất: làm cho thời gian lƣu của dung dịch và tế bào vi

sinh vật trong thiết bị lâu hơn.

o Cách thứ hai là: ta tiến hành hoàn lƣu dịch lên men hòa chung vớ i

dòng môi trƣờng để tái lên men. 1.2.1 Thu nhậ n sả n phẩ  m

Dung dịch sau khi nuôi cấy theo phƣơng pháp bề sâu đƣợ c tách khỏi sinh khối và các thành phần không hòa tan bằng phƣơng pháp ly tâm. Dịch thu thƣờ ng chứa 2 –  3% chất khô hòa tan. Hàm lƣợ ng chất này rất nhỏ, do đó ta cần phải cô đặc chúng cho đến khi khối lƣợ ng dịch giảm đi 5 – 10 lần ở điều kiện chân không.

1.2.2 Ưu và nhược điể  m Ưu điể m:

Phƣơng pháp nuôi cấy hiện đại dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao

Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợ p enzyme cao và lựa chọn tối ƣu thành phần môi trƣờng, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu đƣợ c tinh khiết hơn, đảm bảo vô trùng.

 Nhược điể m:

Đòi hỏi phải đƣợ c vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợ p, thanh trùng môi trƣờng dinh dƣỡ ng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy.

Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thƣơng lớ n và thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao.

2. TINH SẠCH ENZYME Các bƣớc cơ bản

Loại tạp chất và chất không tan: lọc; ly tâm

Trích ly: hấ  p phụ hay dung môi.

Tinh sạch: sắc ký, điện di, k ế t t ủa phân đoạn.

Hoàn thiện: sấ  y hay k ế t tinh

Phƣơng pháp “diêm tích” : là phƣơng pháp k ế t t ủa phân đoạn enzyme

bằng muối trung tính nhƣ : (NH4)2SO4, NaCl, (Na2SO4, MgSO4 …) Bƣớ c 1: Loại bỏ tạp chất

Lọc: kích thướ c

+ Vấn đề: độ nhớ t

+ Thiết bị: máy lọc khung bản -Ly tâm: kích thướ c và t ỉ tr ọng

 Hình 2.1: Thiế  t bị l ọ c khung bả n Bƣớ c 2: Ly trích

Yêu cầu: không biến tính E

Phá màng tế bào: enzyme nội bào

+ Hóa học: P tt ; sấ  y khô, lysozyme, acid, kiề m, chấ  t tẩ  y Triton X-100,… + Cơ học: đồ ng hóa, nghiền, sóng siêu âm,…

+ Ly trích: dung môi chiế  t rút là dung d ịch đệ m có pH gầ n vớ i pH enzym . + Sắc ký hấp phụ: vớ i enzyme loãng

Bƣớ c 3: Tinh sạch

Loại bỏ: protein tạp chất Các phƣơng pháp tinh sạch + Phƣơng pháp kết tủa

- Bằng dung môi: aceton, etanol ở t o thấ  p -Bằng muối: (NH 4)2SO4

+ Phƣơng pháp sắc ký: - Sắc ký trao đổi ion - Sắc ký hấp thụ

- Sắc ký lọc gel

GEL FILTRATION CHROMATOGRAPHY

Sắc ký trao đổ i ion

Sắ c ký hấ  p thụ

 Dialysis – thẩ  m thấ  m, thẩ  m tách

 Hình 2.5: Túi Cellophane (Cellophane bag) Phƣơng pháp điện di:

Chất mang: giấy, bản mỏng, SDS-polyacrylamide - Dựa: khác nhau về điện tích, kích thƣớ c.

- Chất khử: mercaptoetanol, dithithreitol (DTT) Bƣớ c 4: Hoàn thiện:

Tạo ra: enzym khô, tinh thể rắn, xốp. - Sấy, kết tính.

- Lọc, ly tâm. - Tính ổn định cao - Bảo quản: < 20oC.

Phƣơng pháp xác định hoạt tính

Nguyên tắc: Hoạt tính xúc tác của enzyme tính trong một đơn vị thờ i gian nhất định đƣợc xác định thông qua: lượng cơ chấ t giảm hoặc là sự tăng hàm lượ ng sản  phẩ m tạo thành.

- Các phƣơng pháp: hoá học, lý học, lý hóa để xác định sự biến đổi hàm lƣợ ng của cơ chất hay sản phẩm tạo thành.

Đơn vị đo

* IU = 1 mol / phút = 10-6mol/60s * Katal (kat) = 1 mol / 1s = 60.106 IU

-Hoạt độ riêng: đánh giá độ sạch của chế phẩm E. Số ĐVHĐ/khối lƣợ ng. Phƣơng pháp xác định hoạt độ

+ Quang phổ: đo lượ ng sản phẩ m tạo thành.

- Khi xác định hoạt tính xúc tác protease, dùng phản ứng tạo màu giữa tyrozin (do thủy phân protein) vớ i chất nhuộm màu Folin. Và do biến đổi mật độ quang (OD) của dung dịch màu này ở 650-720nm.

- Ƣu điểm:

Độ nhạy cao, sự chính xác

Thời gian xác định nhanh chóng Tiến hành đơn giản.

+ Đo độ nhớ t: vớ i sản phẩ m có độ nhớ t thấp hơn cơ chất.

- Thí dụ:

Thủy phân acid nucleic Thủy phân tinh bột Thủy phân protein.

- Thí dụ: thủy phân sucrose Glucose: +52,5o

Fructose: -92,4o Sucrose: +65o

+ Đo áp suất: sản phẩm là chất khí hay làm mất chất khí. - Thí dụ:

H2O2 → H2O + O2

Lipit + H2O → glycerol + acid béo

+ Chuẩn độ: sản phẩm/cơ chất có thể bắt màu vớ i thuốc thử. * Phƣơng pháp sắc ký: giấy, bản mỏng, HPLC, GC,…

PHẦN 3

ỨNG DỤNG CỦA ENZYME AMYLASE TRONG CÔNG

NGHIỆP

 3.1 Ứng dụng của enzyme amylase trong công nghệ dệt 

Trong công nghệ dệt, ngƣời ta thƣờng tiến hành xử lý vải bằng nhiều loại bột khác nhau nhƣ: bột khoai tây, bột gạo và một số chất khác nhƣ: gelatin, guar gum, poly-vinyl alcohol, methacrylate, trong đó tinh bột đƣợc sử dụng nhiều nhất.

Sau khi đƣợc hồ hóa để làm mịn vải, ngƣời ta tiến hành quá trình rũ hồ vải. Phƣơng pháp làm sạch hồ tinh bột đƣợc sử dụng là enzyme amylase.

Trƣớc đây, ngƣời ta sử dụng enzyme -amylase của malt hay pancreatic amylase để phá hủy nhanh lƣợng tinh bột thừa, đầu tiên ta đƣa nhiệt độ đến nhiệt độ sôi sau đó làm giảm nhiệt độ xuống 500C hay 600C và cho enzyme amylase vào.

 Ngày nay, ngƣời ta sử dụng -amylase của vi khuẩn thay cho amylase malt và pancreatin. Enzyme -amylase của vi khuẩn chịu nhiệt độ, chúng hoạt động mạnh ở  nhiệt độ 85 – 900C. Một số enzyme amylase của Bacillus subtilic có khả năng hoạt

động ở 105 – 1150C.

 Bảng  3.1: Bảng thống kê một số enzyme amylase được sử dụng trong công  nghệ Dệt 

Loại enzyme Khoảng pH

hoạt động

Nhiệt độ tối ƣu

Chất hoạt hóa, chất làm ổn định

-amylase của malt 4,5-5,5 55-65 Ca2+

Amylase pancreatin 6,7-7,5 45-50 NaCl, Ca2+

-amylase nấm sợi 4,5-5,5 55-65 Ca2+

-amylase vi khuẩn 5,5-7,5 75-85 NaCl, Ca2+

Tuy nhiên còn tùy thuộc vào điều kiện kinh tế, sản xuất, nguồn amylase mà ngƣời ta tiến hành chọn lựa enzyme rũ hồ vải cho phù hợp.

 QUY TRÌNH RŨ HỒ VẢI:

1. Giai đoạn làm sạch vải 

Đƣợc thực hiện trong nƣớc đun sôi, vải hấp thụ đến 90 – 100% nƣớc, vải đƣợc rửa sạch các chất bẩn.

Các hạt tinh bột trƣng nở, giúp cho quá trình phân giải tinh bột nhanh hơn. 2. Giai đoạn ngâm

 Ngƣời ta bổ sung một số chất để điều chỉnh pH và làm ổn định điều kiện môi trƣờng cho amylase hoạt động.

Đối với -amylase, ngƣời ta thƣờng cho vào 300g NaCl, 50g CaCl2, khoảng 50g những chất không phải là anionic trong 100 lít nƣớc ở nhiệt độ 65 – 700C.

Sau đó ngƣời ta cho vào 100 – 200g amylase với hoạt tính 3000SKB/g.

Đối với enzyme -amylase chịu nhiệt, ngƣời ta cho vào 100 lít ở nhiệt độ 70 –  8000C khoảng 39g CaCl2 và 400g NaCl, pH điều chỉnh khoảng 6 – 8.

3. Giai đoạn phân giải tinh bột 

Thƣờng sử dụng dung dịch Iodine để kiểm tra quá trình phân giải. Thời gian: 2 phút – 16 giờ.

Tùy thuộc vào hoạt tính enzyme. 4. Giai đoạn rửa dung dịch

sử dụng 5 – 10g NaOH/1 lít nƣớc để rửa, làm sạch vaỉ.  Nhiệt độ: 95 – 1000C.