UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LABORATÓRIO DE FISIOLOGIA CARDIOVASCULAR
Efeitos da restrição alimentar sobre o sistema renina
angiotensina e sua influência nas respostas
cardiovasculares de ratas Fischer
Aluna: Aline Maria Arlindo de Souza
Ouro Preto 2017
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Efeitos da restrição alimentar sobre o sistema renina
angiotensina e sua influência nas respostas
cardiovasculares de ratas Fischer
ALUNA: Aline Maria Arlindo de Souza
ORIENTADOR: Prof. Dr. Deoclécio Alves Chianca Jr CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Rodrigo Cunha Alvim de Menezes
Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração: Bioquímica Metabólica e Fisiológica.
Ouro Preto 2017
Apoio financeiro
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia Cardiovascular do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade de Ouro Preto, com financiamento da CAPES, CNPq, FAPEMIG e UFOP e no Center for the Study of Sex Differences in Health, Aging and Disease no Departamento de Medicina da Georgetown University com o auxílio da CAPES e NIH 1R01HL119.
Agradecimentos
Agradeço primeiramente aos meus pais, Miria Arlindo e Admir de Souza, por acreditarem na educação e me incentivarem há cada dia a continuar minha formação.
Aos meus orientadores, Prof. Dr Rodrigo Cunha Alvim de Menezes por me adotar como aluna e comprar essa batalha, além dos ensinamentos e discussões; Prof Dr Deoclécio Alves Chianca Jr, por acreditar em mim e abrir as portas do laboratório onde tudo se iniciou.
Ariane, minha irmã, obrigada pela paciência, convivência e apoio durante todo esse tempo;
Tiago, obrigada pelo apoio, companheirismo e cumplicidade;
Minhas queridas fiéis companheiras de labuta, Ms Aline Rezende, Ms Laura Batista, Ms Glenda Viggiano, Ms Sylvanna Noronha e Ms Fernanda S. Silva, obrigada pelo apoio nas horas de crise, ajuda na execução dos experimentos e discussões. Sem vocês o caminho para realização desse trabalho teria sido mais árduo e longo.
Todos (ex) integrantes do laboratório de Fisiologia Cardiovascular (LFC) que de alguma maneira também contribuíram para que este trabalho fosse possível de se realizar.
Todos do Laboratório de Imunoparasitologia (LIP) pela amizade e ensinamentos, em especial Prof. Dr Luis Carlos Afonso Crocco;
Aos funcionários do LFC, Milton de Paula e Marly Lessa, e aos funcionários do NUPEB que sempre estavam dispostos em ajudar, sempre com muita dedicação.
Lilian e Érica, do CCA – Centro de Ciência Animal, obrigada pela atenção e paciência; Thank you, Dr Sandberg from Georgetown University - Washington - DC - USA, for accept me as a lab member, for the lessons and opportunity to grow as a researcher. My lab mattes, Ms Amrita Pai and Ms Parnika Kadam, thank you for the help and support since the first day that we met. Dr West, thank you for the discussions, I learned a lot. Thank you, Dr Speth from NOVA University - Fort Lauderdale - FL - USA for accept me in your lab and teach me new techniques and lessons. Hong Ji, Xie Wu and all the lab team, thank you for the help and support during all this time;
Obrigada aos membros da banca por aceitarem o convite e contribuírem para a melhoria desse trabalho.
Esse trabalho jamais seria possível de ser realizado sem a participação de todos vocês. Obrigada!!!
Sumário
1. INTRODUÇÃO ... 14
1.1 RESTRIÇÃO ALIMENTAR ... 14
1.2 SISTEMA RENINA ANGIOTENSINA ... 16
1.2.1 Descoberta... 16
1.2.2 Angiotensinogênio ... 18
1.2.3 Angiotensina-[1-8] ... 18
1.2.4 Outros peptídeos do sistema renina angiotensina... 19
1.2.5 Principais enzimas associadas ao SRA... 20
1.2.6 Receptores do sistema renina angiotensina ... 22
2. OBJETIVOS ... 28
2.1 OBJETIVO GERAL ... 28
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ... 28
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 29
3.1MODELO EXPERIMENTAL ANIMAL -RESTRIÇÃO ALIMENTAR ... 29
3.2FÁRMACOS E SOLUÇÕES ... 29
3.3CONFECÇÃO DOS MATERIAIS UTILIZADOS ... 30
3.4CIRURGIAS E PROCEDIMENTOS PARA ANÁLISE CARDIOVASCULAR ... 31
3.5CUIDADOS PÓS-OPERATÓRIOS ... 32
3.6REGISTROS E ANÁLISES DA PRESSÃO ARTERIAL MÉDIA (PAM) E FREQUÊNCIA CARDÍACA (FC)... 32
3.7PROCEDIMENTO PARA INFUSÃO DE DROGAS ... 32
3.8CARACTERIZAÇÃO DOS EFEITOS DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR NO PERFIL HEMODINÂMICO ... 34
3.9DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS PEPTÍDEOS DO SRA ... 35
3.10DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS DA ECA,ECA2 E RENINA ... 36
3.11DETERMINAÇÃO DOS RECEPTORES DE ANGIOTENSINA ... 37
3.12ANÁLISE ESTATÍSTICA... 38
4. RESULTADOS ... 39
4.1PARÂMETROS FISIOLÓGICOS E HEMODINÂMICOS ... 39
4.2EFEITO DA RA SOBRE A RESPONSIVIDADE À ANG-[1-10] ... 39
4.3EFEITO DA RA SOBRE A RESPONSIVIDADE À ANG-[1-8] ... 40
4.4EFEITO DA RA SOBRE A RESPONSIVIDADE À ANG-[1-7] ... 41
4.5EFEITO DA RA NA ATIVIDADE PLASMÁTICA DA ECA,ECA2 E RENINA ... 42
4.6EFEITO DA RA NA CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DOS PEPTÍDEOS DE ANGIOTENSINA E ANGIOTENSINOGÊNIO... 44
4.7EFEITO DA RA NA EXPRESSÃO DOS RECEPTORES AT1,AT2 E MAS NAS ARTÉRIAS MESENTÉRICAS ... 47
4.8EFEITO DA RA NA RESPONSIVIDADE AO LOSARTAN (ANTAGONISTA DO RECEPTOR AT1) ... 48
4.9EFEITO DA RA NA RESPONSIVIDADE À L-FENILEFRINA (AGONISTA DO RECEPTOR 1 ADRENÉRGICO) ... 49
5. DISCUSSÃO ... 51
6.
CONCLUSÃO ... 58Lista de figuras
FIGURA 1: A EVOLUÇÃO DO ENVELHECIMENTO E OS EFEITOS DA RA NA SOBREVIDA.ADAPTADO DE (13). AL:AD LIBITUM;RA: RESTRIÇÃO ALIMENTAR. ... 16 FIGURA 2: SISTEMA RENINA ANGIOTENSINA SIMPLIFICADO. ABREVIAÇÕES: ECA (2): ENZIMA CONVERSORA DE ANGIOTENSINA (2);MAS R,RECEPTOR MAS;DAP: ASPARTYL AMINOPEPTIDASE; NEP: ENDOPEPTIDASE NEUTRA; PEP: PROLIL ENDOPEPTIDASE; (P)RR: RECEPTOR PRORENIN; TOP: THIMET OLIGOPEPTIDASE.AMP-A: AMINOPEPTIDASE A;AMP: AMINOPEPTIDASE N.FIGURA ADAPTADA DE (38,84,85). ... 22 FIGURA 3:ESQUEMA SIMPLIFICADO DA CANULAÇÃO DA ARTÉRIA (VERMELHO) E DA VEIA (AZUL) FEMORAL
(128) ... 32 FIGURA 4: EFEITO DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR NOS EFEITOS DA ANG-[1-10] SOBRE A PAM E FC.
COMPARAÇÃO DA VARIAÇÃO DA PAM(A) E FC(B) NO DECORRER DO TEMPO E COMPARAÇÃO DA ALTERAÇÃO MÁXIMA OBTIDA PARA A PAM (C) E FC (D) APÓS INFUSÃO IV DE ANG-[1-10] EM RELAÇÃO AOS VALORES BASAIS ANTERIORES AO VEÍCULO (VEI) E CAPTOPRIL (CAP) EM RATAS CONTROLE (CT) E SUBMETIDAS À RESTRIÇÃO ALIMENTAR (RA) (N=7/GRUPO). *P<0,05 VS. CT
ATRAVÉS DO TESTE DE ANOVA TWO-WAY ANOVA SEGUIDO DO TESTE DE BONFERRONI (TEMPO;
DIETA).#P<0,001 VS. VEÍCULO, MESMO GRUPO ATRAVÉS DA ANÁLISE NÃO PAREADA E TESTE T DE
STUDENT E ‡P<0,002 VS.CT, MESMO TRATAMENTO, ATRAVÉS DO TESTE DE VARIÂNCIA ANOVA TWO WAY, SEGUIDO DO PÓS TESTE DE BONFERRONI... 40 FIGURA 5: EFEITO DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR NOS EFEITOS DA ANG-[1-8] SOBRE A PAM E FC.
COMPARAÇÃO DA VARIAÇÃO DA PAM(A) E FC(B) NO DECORRER DO TEMPO E COMPARAÇÃO DA ALTERAÇÃO MÁXIMA OBTIDA PARA A PAM (C) E FC (D) APÓS INFUSÃO IV DE ANG –[1-8] EM RELAÇÃO AOS VALORES BASAIS EM RATAS CONTROLE (CT) SUBMETIDAS À RESTRIÇÃO ALIMENTAR
(RA) (N=8/GRUPO). *P<0,0001 VS. CT ATRAVÉS DO TESTE DE ANOVA TWO-WAY ANOVA
SEGUIDO DO TESTE DE BONFERRONI (TEMPO; DIETA). #P<0,01 VS. VEÍCULO, MESMO GRUPO
ATRAVÉS DA ANÁLISE NÃO PAREADA E TESTE T DE STUDENT E ‡P<0,0001 VS. CT, MESMO TRATAMENTO, ATRAVÉS DO TESTE DE VARIÂNCIA ANOVA TWO WAY, SEGUIDO DO POS TESTE DE
BONFERRONI. ... 41 FIGURA 6: EFEITO DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR NOS EFEITOS DA ANG-[1-7] SOBRE A PAM E FC.
COMPARAÇÃO DA VARIAÇÃO DA PAM(A) E FC(B) NO DECORRER DO TEMPO E COMPARAÇÃO DA ALTERAÇÃO MÁXIMA OBTIDA PARA A PAM (C) E FC (D) APÓS INFUSÃO IV DE ANG-[1-7] EM RELAÇÃO AOS VALORES BASAIS EM RATAS CONTROLE (CT) E SUBMETIDAS À RESTRIÇÃO
ALIMENTAR (RA) (N=9-10/GRUPO).*P<0,05 VS. CT ATRAVÉS DO TESTE DE ANOVA TWO-WAY
ANOVA SEGUIDO DO TESTE DE BONFERRONI (TEMPO; DIETA). ... 42 FIGURA 7:EFEITO DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR NA ATIVIDADE DA RENINA,ECA E ECA2 EM AMOSTRAS DE PLASMA. COMPARAÇÃO DA ATIVIDADE PLASMÁTICA DA RENINA (P=0,9242) (A) (N =10-7/GRUPO), VELOCIDADE DA FORMAÇÃO DE SUBSTRATO DA ECA(B) (N=8/GRUPO) E ECA2 (D) (N=8/GRUPO) E CURVA REPRESENTATIVA DA FORMAÇÃO DE SUBSTRATO NO DECORRER DO TEMPO DA ECA(C) E ECA2(E) EM RATAS CONTROLE (CT) E SUBMETIDAS À RESTRIÇÃO ALIMENTAR (RA). RAZÃO DA FORMAÇÃO DA ANG-[1-10] PARA AGT (P=0,3631) (F), ANG-[1-8] PARA AGT (P=0,4750) (G) E ANG-[1-8] PARA ANG-[1-10] (P=0,0330)(H). *P<0,001 VS.CT ATRAVÉS DO TESTE DE ANOVA TWO-WAY SEGUIDO DO TESTE DE BONFERRONI (TEMPO; DIETA);‡P<0,05 VS. CT, MESMO TRATAMENTO ATRAVÉS DO TESTE T DE STUDENT. PRA: PLASMA RENIN ACTIVITY;
ATIVIDADE PLASMÁTICA DA RENINA. ... 43 FIGURA 8: EFEITO DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR NA CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DOS PEPTÍDEOS DE ANGIOTENSINA E ANGIOTENSIONEGÊNIO.COMPARAÇÃO CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE AOGEN
APÓS INFUSÃO DE VEÍCULO OU ANG-[1-10](A)(N=8/GRUPO), CONCENTRAÇÃO DOS PEPTÍDEOS DE ANGIOTENSINA APÓS INFUSÃO IV DE VEÍCULO NO GRUPO CONTROLE (B) E RESTRIÇÃO ALIMENTAR
(C)(N=10-11/GRUPO) E CONCENTRAÇÃO DOS MESMOS PEPTÍDEOS APÓS INFUSÃO IV DE ANG -[1-10] (D E E) (N=8/GRUPO). ‡P=0,0001 VS. CT, MESMO TRATAMENTO ATRAVÉS DO TESTE DE VARIÂNCIA ANOVA TWO WAY SEGUIDO DO POST TESTE DE BONFERRONI;#P<0,05 VS. VEÍCULO,
MESMO GRUPO ATRAVÉS DO TESTE T DE STUDENT, NÃO PAREADO. ... 46
FIGURA 9: EFEITO DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR NO RNAM DOS RECEPTORES AT1, AT2 E MAS NAS ARTÉRIAS MESENTÉRICAS. COMPARAÇÃO DA VARIAÇÃO NA EXPRESSÃO DOS RNAM DOS RECEPTORES AT1(A),AT2(B) E MAS (C) EM RATAS CONTROLE (CT) E SUBMETIDAS À RESTRIÇÃO
ALIMENTAR (RA)(N=8-9/GRUPO)‡P<0,006 VS.CT ATRAVÉS DA ANÁLISE NÃO PAREADA E TESTE T DE STUDENT... 48 FIGURA 10:EFEITO DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR NOS EFEITOS DO BLOQUEIO DO RECEPTOR AT1 SOBRE
A PAM E FC.COMPARAÇÃO DA VARIAÇÃO DA PAM (A) E FC (B) NO DECORRER DO TEMPO E COMPARAÇÃO DA ALTERAÇÃO MÁXIMA OBTIDA PARA A PAM (C) E FC(D) APÓS INFUSÃO IV DE
LOSARTAN EM RELAÇÃO AOS VALORES BASAIS EM RATAS CONTROLE (CT) SUBMETIDAS À RESTRIÇÃO ALIMENTAR (RA)(N=9-10/GRUPO).*P<0,0001 VS.CT ATRAVÉS DO TESTE DE ANOVA
TWO-WAY ANOVA SEGUIDO DO TESTE DE BONFERRONI (TEMPO; DIETA).#P<0,05 VS. VEÍCULO,
MESMO GRUPO ATRAVÉS DA ANÁLISE NÃO PAREADA E TESTE T DE STUDENT E ‡P<0,0001 VS.CT,
MESMO TRATAMENTO, ATRAVÉS DO TESTE DE VARIÂNCIA ANOVA TWO WAY, SEGUIDO DO POS TESTE DE BONFERRONI. ... 49
FIGURA 11: EFEITO DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR NA ATIVAÇÃO DOS RECEPTORES 1-ADRENÉRGICOS SOBRE A PAM E FC.COMPARAÇÃO DA VARIAÇÃO DA PAM(A) E FC(B) NO DECORRER DO TEMPO E COMPARAÇÃO DA ALTERAÇÃO MÁXIMA OBTIDA PARA A PAM(C) E FC(D) APÓS INFUSÃO IV DE L-FENILEFRINA EM RELAÇÃO AOS VALORES BASAIS EM RATAS CONTROLE (CT) SUBMETIDAS À RESTRIÇÃO ALIMENTAR (RA) (N=9/GRUPO). *P<0,001 VS. CT ATRAVÉS DO TESTE DE ANOVA
TWO-WAY ANOVA SEGUIDO DO TESTE DE BONFERRONI (TEMPO; DIETA).‡P<0,05 VS.CT, MESMO TRATAMENTO, ATRAVÉS DO TESTE DE VARIÂNCIA ANOVA TWO WAY, SEGUIDO DO PÓS TESTE DE
Lista de tabelas
TABELA 1: EFEITO DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR SOBRE OS PARÂMETROS HEMODINÂMICOS E FISIOLÓGICOS ... 39
TABLE 2: EFEITO DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR NA CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DOS PEPTÍDEOS DO SISTEMA RENINA-ANGOTENSINA ANTES E APÓS INFUSÃO IV. DE ANG-[1-10] ... 47
Lista de abreviaturas
aa: aminoácido;
ACE: angiotensin converting enzyme;
AGT: Angiotensinogênio;
AMP-A: Aminopeptidase A;
AMP-N: Aminopeptidade N;
AN: Anorexia nervosa;
Ang: Angiotensin; angiotensina;
AT
1aR: Angiotensin type 1a receptor;
AT
2R: Angiotensin type 2 receptor;
BP: Blood pressure;
BW: Body weight;
CALERIE: Comprehensive Assessment of Long term Effects of Reducing Intake of Energy
Cap: Captopril;
CCA: Centro de Ciência Animal;
CT: Control;
CVLM: Bulbo ventrolateral caudal;
DAP: Aspartil aminopeptidase;
ECA: Enzima conversora de angiotensina;
ECA2: Enzima conversora de angiotensina 2;
FC: Frequência cardíaca;
FR: Food restriction;
HR: Heart rate;
IFN-γ: Interferon gama;
IL-6: Interleucina-6;
IRAP: Aminopeptidase regulada por insulin;
KO: Knockout;
LC-MS/MS: Cromotografia líquida e espectroscopia de massa em tandem;
LDL: Lipoproteína de baixa densidade;
MAP: Mean arterial pressure;
masR: mas receptor;
NEP: Endopeptidase neutral;
NTS: Núcleo do trato solitário;
P(RR): Receptor da pro-renina;
PAM: Pressão arterial média;
PAP: Pressão arterial pulsátil;
PBS: Tampão fosfato-salino;
PE: Polietileno;
PEP: Prolil endopeptidase;
PVN: Núcleo paraventricular do hipotálamo;
qPCR: Real-time polymerase chain reaction;
RA: Restrição alimentar;
RVLM: Bulbo ventrolateral rostral;
SHR: Rato espontaneamente hipertenso;
SRA: Sistema renina angiotensina;
TNF-α : Fator de necrose tumoral alfa;
TOP: Thimet olipeptidase;
UCP: Uncoupling proteins;
Veh: Vehicle;
Resumo
Introdução: Insuficiência cardíaca, desregulação autonômica, hipotensão e bradicardia são problemas comuns nos casos de restrição alimentar (RA) severa e é bem estabelecido que o sistema renina angiotensina aldosterona (SRAA) é importante no controle da pressão arterial através da ação sobre vários órgãos. Entretanto pouco se sabe sobre o SRAA e sua influência nas respostas cardiovasculares na RA.
Objetivo: Nós avaliamos o efeito da RA na via metabólica da Ang-[1-8] na regulação da pressão arterial para investigar como a RA pode causar hipotensão enquanto simultaneamente aumenta a atividade do sistema nervoso simpático.
Metodologia e Resultados: Foram usadas ratas Fischer mantidas em dieta controle (CT), ad libitum, ou RA (60%) por 14 dias. O efeito da Ang-[1-8] sobre a pressão arterial média (PAM) foi menor nos animais com RA mesmo ocorrendo uma ativação maior da via metabólica da Ang-[1-8]. O metabolismo da Ang-[1-10] e seu precursor angiotensinogênio (AGT), foram aumentados pela RA como evidenciado pelo aumento da atividade da enzima conversora de angiotensina (ECA) plasmática e elevada concentração de Ang-[1-8]. Após a infusão de Ang-[1-10], houve também aumento na concentração de AGT e na conversão da Ang-[1-10] para outros metabólitos de angiotensina incluindo Ang-[2-10], Ang-[2-8] e Ang-[3-8]. Embora a Ang-[1-8] causou uma resposta pressora menor na RA, foi encontrado que o RNAm para o receptor AT1 foi aumentado
em vasos mesentéricos enquanto nenhuma alteração foi observada na expressão dos receptores AT2 e Mas. Além da expressão, a responsividade do receptor AT1 na RA foi aumentada após
infusão de losartan. Entretanto, após infusão de fenilefrina, a amplitude da resposta pressora foi a mesma que a observada no grupo CT.
Conclusão: Nossos resultados sugerem que as vias metabólicas da angiotensina estão ativadas constantemente no modelo de RA aumentando a concentração plasmática da Ang-[1-8] e seus peptídeos downstream em compensação a hipotensão, bradicardia e hipovolemia.
Abstract
Rationale: Heart failure, autonomic imbalance, hypotension and bradycardia are common problem in anorexia nervosa (AN) and is well known that the angiotensin system is important to control the blood pressure through many organs, however nothing is known about the angiotensin (Ang) system and its influence in the cardiovascular responses in AN.
Objective: We examined the effect of food restriction (FR) on Ang-[1-8] metabolic pathways in blood pressure regulation to investigate how FR can cause hypotension while simultaneously increasing the sympathetic nervous system.
Methods and Results We used female Fischer rats maintained on a control (CT) or severe FR (60%) diet for 14 days. The mean arterial pressure (MAP) response to Ang-[1-8] was attenuated in FR rats even though the systemic Ang-[1-8] metabolic pathway was activated. Metabolism of Ang-[1-10] and its precursor, angiotensinogen, were increased by FR as evidenced by increased plasma angiotensin converting enzyme (ACE) activity and elevated plasma Ang-[1-8] and angiotensinogen levels before and after Ang-[1-10] infusion. There was also increased conversion of Ang-[1-10] to other angiotensin metabolites including Ang-[2-10], Ang-[2-8] and Ang-[3-8]. Although Ang-[1-8] causes a lower MAP response, we found that AT1R mRNA expression was
increased in mesenteric vessels whereas no differences were observed in the mRNA expression of angiotensin type 2 receptor (AT2R) and mas receptor (masR). Furthermore, the AT1 blockage
with losartan caused a higher depressor effect in FR, even no difference was seen in the maximum BP response with phenylephrine infusion.
Conclusions: Our results suggest that angiotensin metabolic pathways are constantly activated in FR model to increase the Ang-[1-8] and its downstream peptides in order to compensate for the hypotension, bradycardia and hypovolemia.
1. Introdução
1.1 R
ESTRIÇÃO ALIMENTARRestrição alimentar (RA) é uma intervenção dietética na qual a ingestão de calorias e/ou nutrientes é reduzida abaixo do normal consumido ad libitum. Essa redução pode ocorrer em diferentes proporções e quantidades ocasionando diferentes consequências ao organismo. A restrição de alimentos pode acontecer por diferentes razões, uma delas é por fatores psicológicos como no caso da anorexia nervosa. Nesse caso os pacientes, por influência da mídia e/ou por alterações psicológicas começam a apresentar distorções da imagem corporal, medo excessivo de ganhar peso, começam a rejeitar o alimento ou reduzem drasticamente sua ingestão (1). Outra situação patológica em que ocorre a redução na ingestão de alimentos é no caso de pacientes com AIDS que não estão sob tratamento (2) ou pacientes com câncer durante o tratamento de quimioterapia no qual os fármacos utilizados interferem no apetite e paladar (3). Existe ainda a restrição de alimentos que ocorre em consequência ao escasso acesso ao mesmo, seja for fatores ambientais como seca ou sociais como guerras e pobreza (4, 5).
Independente dos motivos que ocasionam a restrição alimentar, muitos trabalhos veem estudando as consequências para o organismo do simples fato de reduzir a ingestão de alimentos. Ultimamente um tópico muito estudado é a RA e sua influencia na longevidade e prevenção de doenças. Em 1935 foi publicado o primeiro estudo sobre esse assunto, o qual observou que após reduzir 20% da ingestão alimentar de ratos, os mesmos apresentaram um aumento na sobrevida de quase 69% para machos e 3% para fêmeas (6). Posteriormente, outro estudo utilizando macacos Rhesus encontrou que após 30% de redução na ingestão alimentar diária por 20 anos diminuiu a incidência de doenças relacionadas ao envelhecimento como diabetes, câncer e atrofia cerebral (7). Um dos efeitos da RA em mamíferos é a redução do aparecimento de câncer devido a possível inibição da proliferação celular e aumento da apoptose (8) ou ainda a RA aumenta a eficiência dos mecanismos de reparo de DNA e reduz os danos oxidativos (9).
Recentemente um estudo translacional foi iniciado na tentativa de entender os efeitos da RA no ser humano. Esse estudo começou em 2007 e chama-se CALERIE (Comprehensive Assessment of Long term Effects of Reducing Intake of Energy). Ele tem como objetivo avaliar os efeitos bioquímicos e fisiológicos da restrição calórica, mantendo a
necessidade mínima de nutrientes requerida pelo organismo de indivíduos eutróficos. Os resultados preliminares são publicados constantemente e dentre alguns achados encontra-se: redução do peso corporal em 10% após 6 meses de 25% de restrição calórica e melhora nos marcadores de risco cardiovascular e de diabetes (10). Outro estudo avaliando os efeitos cardíacos após a RA observou que camundongos machos quando receberam 30% a menos de comida por 7 dias, houve um efeito cardioprotetor sendo menores as ocorrências de complicações do infarto do miocárdio (11). No caso de pacientes obesos a RA possui inúmeros efeitos benéficos associados ao sistema cardiovascular. Esses efeitos foram demonstrados no trabalho de revisão de Garcia-Prieto (2016), o qual mostrou uma melhora do perfil lipídico, redução da pressão arterial e no remodelamento vascular (12).
Com o passar dos anos e o crescente número de pesquisas sobre RA começou-se a observar que diferentes quantidades calóricas ou de nutrientes consumidos influenciavam na resposta do organismo. A partir do momento que iniciou a comparação entre a composição de dietas, foi possível observar que algumas espécies, quando em situação de baixo consumo alimentar, apresentavam término precoce da fase reprodutiva. De maneira oposta, outras espécies apresentam vida longa e fértil em resposta a redução na ingestão de alimentos (13). Outros estudos também relatam que a RA pode não afetar a longevidade e sim reduzir o tempo de vida, como no caso de borboletas, moscas, fungos e camundongos (14).
Levando em consideração a variabilidade de resposta entre espécies e as inúmeras possibilidades de modelos de RA, foi necessário definir limites e padrões de respostas. Essa divisão, de uma forma simples, consiste em dividir os tipos de RA que geram efeitos benéficos e os tipos que geram efeitos maléficos ao organismo. Muitos trabalhos relatam que essa redução de alimentos sem comprometer o aporte de nutrientes essenciais estaria em torno de 20-40% de redução na ingestão média diária (15). Na verdade, independente do percentual utilizado para RA, o fator mais importante é considerar se a RA para aquele individuo está causando má nutrição ao organismo. Nesse caso, o individuo não terá efeitos benéficos como longevidade (16) (Figura 1).
Figura 1: A evolução do envelhecimento e os efeitos da RA na sobrevida. Adaptado de (13). AL: Ad libitum; RA: restrição alimentar.
Em contrapartida, protocolos de RA envolvendo desnutrição além de comprometerem o tempo de vida, causam efeitos deletérios ao sistema cardiovascular. Em protocolos alimentares com 50-60% de redução na ingestão diária de ratos, mostraram que a dieta ocasionou hipotensão, bradicardia, diminuição da contração cardíaca (+dP/dt) e diminuição do relaxamento do ventrículo esquerdo (-dP/dt), disfunção do miocárdio e aumento de epinefrina e noraepinefrina no tecido cardíaco (17, 18). Além disso, em estudos realizados em nosso laboratório, publicados recentemente (19), demonstram que o modelo de restrição alimentar de 60% durante 14 dias causou uma diminuição no peso corporal, desnutrição, alto catabolismo proteico, diminuição do colesterol total e LDL, hipotensão, bradicardia e anestro. Também foram observadas alterações após experimentos no sistema nervoso simpático com α e β bloqueadores, como maior responsividade dos receptores α1 adrenérgicos. Assim, sabendo das complicações no sistema cardiovascular decorrente da RA, o foco desse trabalho foi estudar as vias envolvidas com o controle da pressão arterial e frequência cardíaca, como o sistema renina angiotensina.
1.2 Sistema renina angiotensina
1.2.1 Descoberta
O sistema renina angiotensina (SRA) é um dos principais mecanismos humoral responsável pelo controle das funções cardiovasculares e do equilíbrio hidroeletrolítico, tendo um grande efeito sobre a pressão arterial em longo prazo. A hiperatividade desse sistema na circulação sanguínea e em diferentes tecidos está relacionada com o desenvolvimento e a manutenção de doenças cardiovasculares, entre elas a hipertensão arterial (20).
Esse sistema começou a ser descoberto em 1898 quando Tigerstedt e Bergman realizaram diversos experimentos. Um dos experimentos era fazer um extrato renal de coelho e o injetar por via intravenosa em outro coelho com o propósito de observar modificações na pressão arterial. Após alguns testes eles puderam concluir que o extrato de rim possuía algo que era solúvel em água e álcool e possuía um efeito pressor. Também observaram que esse efeito era perdido quando o extrato era preparado a partir da medula renal ou quando a amostra era aquecida. Assim, através de alguns experimentos eles descreveram pela primeira vez uma substância produzida pelo rim, com coloração castanha, que possuía um efeito pressor e passaram a chamá-la de renina (171).
Quase 40 anos se passaram e pouquíssimos relatos foram feitos sobre essa grande descoberta, sendo quase esquecida até ser novamente discutida em estudos de 1934 (21). Após alguns anos, pesquisadores começaram a avaliar o efeito da renina quando incubada com globulinas do sangue. Observaram que a renina na presença de globulinas ocasionava um aumento na pressão arterial. A partir disso, foi sugerido pela primeira vez que a renina era uma enzima e que seu substrato era uma proteína presente no sangue. Outra importante definição também feita a partir desse trabalho foi a identificação do produto da renina, chamado a partir de então de “hypertensin” (22). Dez anos após este relato, Leonard Skeggs e colaboradores na tentativa de purificar “hypertensin” acabaram isolando duas substâncias pressoras, ao invés de uma. O achado inesperado mostrou que a substância pressora inicial, chamada de hypertensin I, era formada a partir da ação da renina sobre seu substrato, o qual era convertido rapidamente em um segundo substrato que possuía resposta pressora aproximada a hypertensin I. Esse segundo substrato foi chamado de hypertensin II, o qual futuramente veio a ser chamado de angiotensina (23). Outro fato histórico importante foi a descoberta de que havia outra enzima presente no plasma que produzia hypertensin II (24). Dessa forma, em 1955 foi a primeira vez que descreveram a enzima conversora de hypertensin, ou seja, a enzima que converte hypertension I em hypertensin II, atualmente conhecida como enzima conversora de angiotensina (ECA) (25).
Com essas descobertas o sistema renina angiotensina começou a ser definindo. Hoje sabe-se que esse sistema compreende em vários peptídeos, enzimas e receptores. Além disso, esse sistema não é mais considerado como um sistema sistêmico, mas sim local, pois todos os componentes requeridos para geração dos peptídeos de angiotensina foram detectados em células de múltiplos lugares no corpo. Assim iniciou-se a abordagem de um conceito de função intrácrina. A síntese de angiotensina passa a ocorrer além dos locais clássicos: rim (renina), fígado (angiotensinogênio), pulmão (ECA) (26). Um estudo que demonstrou essa produção local
de Ang foi em 1998 quando pesquisadores queriam determinar se a Ang-[1-10] e Ang-[1-8] cardíaca eram produzidas localmente ou derivadas da circulação. Após alguns experimentos puderam concluir que o coração pode manter sua produção (>90%) de Ang-[1-8] mesmo quando a concentração plasmática de Ang é suprimida. O mesmo efeito foi observado no rim (27, 28).
1.2.2 Angiotensinogênio
O angiotensinogênio (AGT), primeira proteína na via do SRA, é uma glicoproteína com 485 aminoácidos (aa), incluindo o peptídeo sinal composto por 33aa. A região N-terminal é o local onde a renina irá atuar para separar um peptídeo com 10 aminoácidos que será chamado de Ang-[1-10], também conhecido por Ang I (29). O AGT é produzido não somente por hepatócitos, mas também nos túbulos proximais do rim, no cérebro por astrócitos e em menor quantidade por neurônios (30, 31).
São vários os estímulos para secreção do AGT, por exemplo camundongos que receberam infusão de Ang-[1-8] apresentaram um aumento de 2x na concentração plasmática de AGT. Existe um mecanismo de feedback positivo da Ang-[1-8] sobre o AGT que é controlado por um balanço de feedback negativo sobre a renina, a enzima que limita a síntese dos peptídeos de angiotensina (32). O AGT pode também ter sua produção estimulada ou inibida pela Ang-[1-8] ou por citocinas como Interferon gama (IFN-γ), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-6 (IL-6). A resposta de estimulação ou inibição vai depender de qual via de sinalização intracelular está sendo ativada (33, 34).
Outras enzimas, além da renina, foram relatadas exercerem um efeito sobre o AGT, como a catepsina G, proteinase 3, calicreína, elastase, tonina. No caso da catepsina G, esta pode agir sobre o AGT produzindo Ang-[1-8] ao invés da clássica conversão à Ang-[1-10] (35-37).
1.2.3 Angiotensina-[1-8]
A Ang-[1-8] é um dos principais peptídeos da via da angiotensina, composto por 8aa (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) e é considerada o composto mais bioativo da via. Como descrito anteriormente, a Ang-[1-8] pode ser sintetizada através da ação de proteases como renina, catepsinas, elastase sobre a Ang-[1-10], ou pela degradação do AGT diretamente à Ang-[1-8] através da ação de enzimas como elastase, catepsinas, tonina. Outra possível via de formação da Ang-[1-8] é através de uma via independente da ação da renina, porém ainda não foi
identificada a enzima responsável por essa reação (38). Essa via de formação compreende na degradação do AGT em Ang-[1-12] e este peptídeo por sua vez é degradado à Ang-[1-8] pela ação da ECA e quimases (39). Uma vez que Ang-[1-8] foi formada, esta torna-se susceptível à ação de enzimas como aminopeptidase A que irá converte-la à Ang-[2-8] ou como é conhecida Ang III. A Ang-[2-8], por sua vez torna-se o substrato da aminopeptidase N sendo convertida à Ang-[3-8] ou como é classicamente chamada, Ang IV (40). Outra opção ainda de ação sobre a Ang-[1-8] é a conversão desse peptídeo à Ang-[1-7] através da ação da ECA2 (41) ou ainda pode ser convertida diretamente à Ang-[3-8] por ação da DAP.
A maioria dos efeitos da Ang-[1-8] são mediados por sua ligação a dois receptores acoplados à proteína G, receptor de angiotensina tipo 1 (AT1) e tipo 2 (AT2). Embora o receptor
AT2 seja conhecido por exercer efeitos opostos do receptor AT1, muitos efeitos da Ang-[1-8] são
mediados através da ativação do receptor AT1 (42). Posteriormente nesse trabalho, cada receptor
será descrito mais detalhadamente. Entretanto alguns dos efeitos periféricos da Ang-[1-8] incluem vasoconstrição com consequente disfunção endotelial (43), aumento na secreção e síntese de aldosterona (44). Em casos de insuficiência cardíaca, esse peptídeo em altas concentrações ocasiona disfunção diastólica do ventrículo esquerdo devido a indireta estimulação do sistema nervoso simpático pela angiotensina (45). Quando a Ang-[1-8] foi administrada de forma exógena em rins isolados e a constrição das arteríolas aferentes e eferentes foram medidas, pôde-se observar que ocorreu uma constrição dose-dependente em ambas arteríolas, com consequente redução no fluxo sanguíneo renal e na filtração glomerular (46). Outro importante efeito periférico da Ang-[1-8] é o controle da síntese e secreção da renina, a qual é reduzida em altas concentrações de Ang-[1-8] (47). Ang-[1-8] também foi demonstrada promover aumento na síntese de angiotensinogênio intra-renal (33), estimula a liberação de vasopressina pela hipófise posterior a qual ocasiona aumento na retenção de líquidos nos ductos coletores renais e ainda, a Ang-[1-8] está relacionada com o estímulo da sede (48).
1.2.4 Outros peptídeos do sistema renina angiotensina
A Ang-[1-10], um dos primeiros peptídeos da via a ser descoberto, é um peptídeo composto por 10aa (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu) que é formado através da remoção dos 10 últimos aa localizados na região C-terminal do AGT através da ação das enzimas renina, catepsina D ou elastase (49). A Ang-[1-10] por sua vez se torna substrato de diversas enzimas como a ECA, tonina, catepsina B e G. Essas enzimas convertem a [1-10] em Ang-[1-8] (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) após a remoção de 2 aa na região C-terminal (49, 50).
Outra possível conversão da Ang-[1-10] é através da ação da aminopeptidase A que converte esse peptídeo de 10 aa em um peptídeo com 8 aa, Ang-[2-10] (Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) que se torna em uma próxima reação o substrato da ECA, produzindo a Ang-[2-8] (Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) (51). Outra possibilidade ainda de degradação da Ang-[1-10] é sofrer a ação da ECA2 e ser convertida em Ang-[1-9] (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His) (52) ou por ação de outras três enzimas, endopeptidase neutra (NEP), thimet oligopeptidase (TOP) e prolil endopeptidase (PEP) ser convertida à Ang-[1-7] (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro) (53, 54).
O heptapeptídeo, Ang-[1-7], foi descoberto em 1988 após experimentos com homogenato de cérebro de cães (55). No entanto, a Ang-[1-7] foi considerada um peptídeo inativo do SRA por um longo tempo. Atualmente a Ang-[1-7] é considerada um componente importante do SRA podendo ser gerada a partir da Ang-[1-10] e Ang-[1-8], como descrito anteriormente, ou ainda através da conversão da Ang-[1-9] pela ECA ou NEP. Uma vez formada, a Ang-[1-7] pode ser hidrolisada pela ECA, formando Ang-[1-5] ou por aminopeptidases e DAP, originando Ang-[2-7] e Ang-[3-7], considerados peptídeos inativos até o momento (56-58).
De uma forma mais geral, sabe-se hoje que os peptídeos do sistema renina angiotensina atuam em diferentes receptores, que serão descritos posteriormente, porém resumidamente a Ang-[1-8] e Ang-[2-8] se ligam no receptor AT1 ou AT2, no caso da Ang-[1-8]. A Ang-[3-8] se liga
no receptor AT4, Ang-[1-7] no receptor Mas com indícios de ligação no receptor AT2, renina e
pro-renina se ligam no receptor propro-renina (38, 59) (Figura 2).
1.2.5 Principais enzimas associadas ao SRA
A renina, como descrita anteriormente, é uma enzima sintetizada na forma inativa, sendo essa forma chamada de pro-renina. A pro-renina pode ser sintetizada no rim, glândulas adrenais, retina, ovários, cérebro e testículos. Após a síntese do precursor da renina, o mesmo sofre uma transformação irreversível através da ação proteolítica nas células justaglomerulares renais e é armazenada até o momento da liberação (60). Alguns estudos vêm demonstrando que a renina também está presente em astrócitos. Um estudo utilizando cultura de neurônios hipotalâmicos encontrou marcação positiva para a proteína da renina em neurônios e astrócitos através de marcação com imunohistoquímica (61). Um diferencial no cérebro é que existem duas isoformas da renina, a que será secretada e a isoforma intracelular. A isoforma que é secretada parece ser dispensável na regulação cardiovascular (62) e pouco se sabe até o momento quais são os estímulos centrais para produção e liberação da renina no cérebro. Algumas hipóteses sugerem que o cérebro possui um mecanismo de formação de angiotensina diferente da via clássica, o
qual talvez possua uma síntese de peptídeos independente da renina e que as respostas estariam envolvidas com um receptor da renina, receptor pro-renina (51). No entanto, os estímulos para liberação da renina sistêmica ocorrem quando os barorreceptores renais detectam redução na pressão arterial, pressão de perfusão renal ou na concentração de sódio (63). A secreção de renina pode ser inibida quando há um aumento na pressão arterial ou quando há aumento da concentração de Ang-[1-8] por mecanismo de feedback negativo (64). Aumento na secreção de renina pode ser em resposta a estimulação dos receptores -adrenérgico nas células justaglomerulares (65).
Enquanto a renina tem a expressão limitada a tecidos específicos, outra enzima chamada ECA pode ser encontrada em diversos lugares. Essa enzima é caracterizada como uma zinco metaloprotease transmembrana contendo dois sítios catalíticos ativos, ambos podendo ser inibidos por inibidores da ECA como o Lisinopril, porém a isoenzima presente em testículos, foi observada possuir somente um sítio catalítico ativo (66). A ECA pode ser encontrada nos ovários, testículos, intestino em especial no jejuno, coração, rim (67), na parede dos vasos sanguíneos, mais especificamente na superfície das células endoteliais (68) e células do sistema imunológico (69). A grande diferença da renina para a ECA é que a renina é uma enzima altamente especifica, enquanto a ECA é promiscua, capaz de agir sobre diversos substratos (70). Além desses tecidos já citados, o RNAm da ECA foi encontrado em regiões do cérebro como plexo coroide, cerebelo, bulbo, hipocampo e hipófise (71, 72). Usando a técnica de autorradiografia pode-se observar altas concentrações da proteína ECA no plexo coroide, vasos sanguíneos, órgão suboficial da lamina terminal, área postrema, núcleo do trato solitário (NTS) e núcleo motor dorsal do vago (73). Já a ECA encontrada no sangue ou em fluídos biológicos é praticamente toda derivada de células endoteliais que, no caso do pulmão, seriam dos capilares pulmonares (74, 75) através da ação de enzimas proteolíticas da família das metaloproteases (76).
Além da ECA, em 2000 pesquisadores descobriram uma zinco metaloprotease homóloga a ECA, tendo 61% de homologia na sequência de aminoácidos e com alta expressão de RNAm no coração, rim, testículos e ovários, sugerindo uma possível contribuição com a homeostase da pressão arterial e fertilidade (77, 78). Essa enzima passou a ser chamada de ECA2. A ECA2 é uma enzima que fica na membrana celular e é altamente expressa em órgãos como rim e coração, sendo os pontos clássicos para regulação cardiovascular. No rim ela é encontrada principalmente nas arteríolas renais na túnica média, enquanto que a ECA é mais localizada na região endotelial (79). Entretanto nas bordas em escova dos túbulos proximais há co-localização da ECA e ECA2 (80). Outros tecidos com expressão da ECA2 são pulmão, fígado, sistema nervoso central (70,
81, 82) e sangue, porém esse último é em resultado da liberação enzimática através da ação da ADAM17, liberando o domínio extracelular ativo da ECA2 (83).
Figura 2: Sistema renina angiotensina simplificado. Abreviações: ECA (2): enzima conversora de angiotensina (2); Mas
R, Receptor Mas; DAP: aspartyl aminopeptidase; NEP: Endopeptidase neutra; PEP: prolil endopeptidase; (P)RR: receptor prorenin; TOP: thimet oligopeptidase. AMP-A: aminopeptidase A; AMP: aminopeptidase N. Figura adaptada de (38, 84, 85).
1.2.6 Receptores do sistema renina angiotensina
O sistema renina angiotensina envolve diversos receptores como: Receptor AT1 que
Receptor pro-renina: Algumas enzimas no sistema renina angiotensina possuem interação com receptores, como o caso da renina/pro-renina e seu receptor pro-renina (PPR). O PPR é um receptor que foi clonado em 2002 e possui um sítio de ligação para a renina e seu precursor pro-renina, sendo a afinidade para a pro-renina maior (86). Há hipóteses de que o receptor pro-renina funcione como um dímero, pois quando a renina se liga no receptor ela não é internalizada e nem degradada (87). O RNAm desse receptor pode ser encontrado em diversos tecidos como coração, cérebro, placenta, nas artérias e túbulos distais do rim, fígado e pâncreas (88, 89). Os mecanismos de ativação desse receptor ainda não estão totalmente caracterizados, porém sabe-se que o receptor da renina é capaz de iniciar um sinal intracelular pela ativação da via ERK1/ERK2 e também atua como cofator aumentando a eficiência de quebra do AGT pela ligação renina-receptor. Além disso o receptor da renina pode facilitar a geração e atuação da Ang-[1-8] na superfície celular (90).
O PPR foi demonstrado estar envolvido com a indução de glomeruloesclerosis (91) e sua ativação independente de Ang-[1-8] em células HEK promoveu formação de fibrose (92). No caso do cérebro o bloqueio do PPR foi relacionado com redução da pressão arterial e do tônus simpático para o coração e para o vaso, houve também redução da expressão do receptor AT1 e
nos níveis de vasopressina (93). Outra funcionalidade observada no SNC do PPR foi que sua super-expressão no SON estimula a secreção de vasopressina e altera o balanço hídrico de ratos normais, além disso sua deleção diminuiu a PAM e FC de ratos espontaneamente hipertensivos (SHR) (94). Muitos estudos ainda precisam ser feitos para melhor compreensão dos efeitos desse receptor no sistema renina angiotensina-aldosterona.
Receptor AT1: Lin e Goodfriend em 1970, após incubarem a suprarrenal com o radioligante
Ang-[1-8], descreveram o primeiro receptor funcional para a Ang-[1-8]. O receptor de angiotensina tipo 1 ou AT1 é um receptor com 7 alças transmembrana da família de receptores acoplados a proteína
G. Em 1992, pesquisadores conseguiram pela primeira vez identificar dois distintos genes para o receptor AT1 em ratos, designados de AT1A e AT1B. O gene do receptor AT1B apresentou ser 94%
idêntico ao receptor AT1 de vasos sanguíneos de ratos e 91% idêntico ao receptor presente na
suprarrenal de bois (95). Devido a grande semelhança entre os receptores AT1A e AT1B é muito
difícil distingui-los baseado somente em suas propriedades de interação com outras proteínas e sinalização intracelular, tonando-se praticamente impossível a produção de anticorpos e ligantes específicos à cada um. A alternativa para esse problema é a utilização de probes baseados na sequência do RNAm. A expressão de RNAm para ambos receptores foi avaliada e observou-se que o subtipo AT1A predominou no fígado, pulmão, aorta e todos os segmentos do néfron com
exceção dos glomérulos. O subtipo AT1B é quase que exclusivamente expresso na hipófise
anterior. Ambos receptores são expressos em proporções iguais na zona glomerulosa da supra renal e nas células mesangiais do glomérulo renal (96).
Após a Ang-[1-8] ou Ang-[2-8] se ligarem no receptor AT1, o mesmo sofre mudanças
conformacionais que promovem a interação com a proteína G ou -arrestins que desencadeiam diferentes respostas de sinalização intracelular (97). As respostas associadas ao receptor AT1
são inúmeras e influenciam quase todos os sistemas do corpo. Inicialmente os efeitos desse receptor eram restritos a regulação do apetite ao sódio e sede, porém com o decorrer das pesquisas foi observado que algumas respostas eram especificas ao tecido em questão (98). No sistema vascular, a estimulação do receptor AT1 altera a resposta vascular e hemodinâmica
causando vasoconstrição e consequente aumento da pressão arterial que a longo prazo se associa ao desenvolvimento de hipertensão (99). Se caso a estimulação ocorrer nos receptores localizados na supra renal, haverá liberação de aldosterona que irá estimular o transporte de sódio (100); no rim a ativação do receptor AT1 está associada com a contribuição do
desenvolvimento de doenças crônicas renais, albuminúria e injúria renal (101).
Receptor AT2: O receptor AT2 é um receptor com estrutura semelhante ao AT1, eles possuem
uma semelhança em torno de 34% na sequência de aminoácidos e o receptor AT2 também é
acoplado a proteína G e possui 7 alças transmembrana (102). Esse receptor é altamente expresso em tecido fetal e tem sua expressão reduzida drasticamente após o nascimento, sugerindo que ele seja importante no desenvolvimento fetal (103). No tecido adulto, o receptor AT2 é expresso principalmente em vasos de resistência de ratos (104), no rim sendo mais
especifico nas células epiteliais, túbulos corticais e células intersticiais (105), no coração, supra renal, ovários (106) e cérebro. No cérebro sua expressão acontece predominantemente durante a fase embrionária, já na vida adulta sua expressão fica restrita a algumas regiões encefálicas que possuem funções cognitivas, de comportamento e locomoção (107). Em um estudo onde marcaram o RNAm dos receptores de angiotensina, foi possível observar que o receptor AT2
possuia uma distribuição mais abrangente no cérebro (108).
Em contraste com o receptor AT1, o receptor AT2 foi observado não sofrer internalização
em resposta ao seu agonista, permanecendo na membrana celular após sua ativação com possível não desensitização em respostas a longo prazo (120). Os efeitos da ativação do receptor AT2 normalmente são contra-regulatórios aos efeitos do receptor AT1, ou seja, após sua
estimulação foi observado efeito antiproliferativo e pró-apoptótico em células do endotélio vascular (109), vasodilatação (110) e diminuição da hipertrofia cardíaca (111). Entretanto os
efeitos e a via de sinalização do receptor AT2 ainda não são claros e muitos estudos encontram
resultados contraditórios. Em 1996 um estudo realizado com ratos tratados por 3 semanas com Ang-[1-8] ou veículo na presença ou ausência do antagonista do receptor AT2 observou que o
bloqueio crônico do receptor AT2 não afetou a concentração plasmática de Ang-[1-8] e a
reatividade vascular. Outro significante achado foi que o bloqueio crônico do receptor AT1 junto
com infusão de Ang-[1-8] resultou em níveis normais de pressão arterial, porém com desenvolvimento de hipertrofia cardíaca e fibrose (112).
Um fato interessante entre os receptores AT1 e AT2 é a possibilidade da formação de
heterodímeros. O receptor AT2 pode se ligar diretamente ao receptor AT1 e antagonizar suas
funções, inibindo a funcionalidade do receptor AT1. Esse mesmo mecanismo foi demonstrado em
células transfectadas, fibroblasto fetal e biopsia de miométrio de gestantes (113).
Receptor AT4: O receptor AT4 foi descoberto em 1992 no hipocampo de cobaia e foi
caracterizado como o receptor com alta afinidade pelo peptídeo Ang-[3-8] (114). Porém, posteriormente foi observado que o mesmo receptor é uma amino peptidase regulada por insulina acabou sendo chamado de IRAP (115). Esse receptor foi identificado em diferentes tecidos como vasos sanguíneos, rim, intestino, suprarrenal, próstata e algumas regiões do cérebro relacionadas ao processamento da memória e com importância no controle motor (116). Um dos efeitos mais marcantes do receptor AT4 é na resposta da memória. Em um estudo com infusões crônicas do
agonista do receptor AT4 no ventrículo lateral foi demonstrado uma melhora na memória espacial
de ratos (117). No rim pouco se sabe sobre o efeito do receptor AT4. Em um estudo com rim de
ratos foi observado a presença desse receptor no corpo celular e na membrana apical dos túbulos proximais convolutos, no córtex renal e na medula. Assim como a Ang-[3-8] diminuiu o transporte de sódio nos túbulos proximais (118). Em um estudo, o qual avaliaram o efeito da Ang-[3-8] na disfunção cardíaca induzida por Ang-[1-8], observaram que Ang-[3-8] via receptor IRAP melhorou a disfunção cardíaca, inibiu a apoptose e a hipertrofia de cardiomiócitos, assim como também inibiu a síntese de colágeno (119). Outra função do receptor AT4 é em relação ao metabolismo
energético, o qual reduz a termogênese via UCP-1 (uncoupling proteins) no tecido adipose marrom e no metabolismo de adipócitos (120).
Um fato importante a ser realçado aqui é que nem todas as repostas induzidas pelo peptídeo Ang-[3-8] são efetuadas através da ativação do receptor AT4, algumas delas podem ser
mediadas pelo receptor AT1. Um exemplo desse tipo de resposta é o aumento da pressão arterial
se sabe da importância desse receptor na regulação cardiovascular e mais estudos são necessários para melhor compreensão.
Receptor Mas: Após a utilização de antagonistas seletivos das ações da Ang-[1-7], D-[Ala7]-Ang-[1-7] - (A-779), estudos demonstraram que esse peptídeo se ligava a diferentes receptores existentes na via clássica da angiotensina (AT1 e AT2). Assim identificaram um receptor que
pertence a família dos receptores acoplados à proteína G e que é funcional para Ang-[1-7], ou seja, o receptor Mas (59). Esse receptor teve sua expressão identificada em neurônios de de regiões cerebrais como hipocampo, amigdala, córtex e áreas com importância no controle cardiovascular como NTS, núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN), rostro ventrolateral do bulbo (RVLM) e ventrolateral caudal do bulbo (CVLM) (122). Além do cérebro, o rim apresentou alta expressão do receptor Mas, sendo encontrado principalmente nos vasos renais e nos túbulos proximais (123).
O eixo ECA2/Ang-[1-7]/Mas tem sido sugerido como uma via importante no SRA com efeitos contra regulatórios da ECA/Ang-[1-8]/AT1. Após infusão de Ang-[1-7] intravenosa houve
aumento do fluxo sanguíneo renal, mesentérico e cerebral, assim como houve aumento do índice cardíaco e diminuição da resistência total periférica. Entretanto nessa dose utilizada não houve alterações na pressão arterial e frequência cardíaca (124). Outros estudos demonstram que Ang-[1-7] através do receptor Mas possui efeito antiproliferativo, reduzindo o crescimento de cardiomiócitos após infarto do miocárdio (125) e antitrombótico (126). Apesar de muitos estudos serem publicados ultimamente sobre os efeitos da Ang-[1-7], pouco se sabe sobre o real efeito do receptor Mas e se todos os efeitos da Ang-[1-7] são realmente sempre mediados pelo receptor Mas e não através de outros possíveis receptores como AT2 ou até mesmo AT1. Esse tipo de
argumento é levado em consideração principalmente quando se refere ao cérebro. A Ang-[1-7] pode induzir uma resposta similar à da Ang-[1-8] na regulação da PAM quando injetada na RVLM, CVLM e NTS (38). Outro caso a se pensar sobre a especificidade da Ang-[1-7] ao receptor Mas foi após cortes histológicos de rim tratados com 125I-Ang-[1-7] não houve muita diferença entre
camundongos Mas-knockout (KO) e selvagem, e mesmo alterando a concentração do ligante radioativo, a marcação foi praticamente ausente (123). Mais questionamentos surgiram quando ratos tratados com PD123319, antagonista do receptor AT2, não apresentaram respostas
vasodepressora após infusão de Ang-[1-7] (127). Muitos estudos estão sendo feitos para avaliar tanto a função do peptídeo Ang-[1-7] quanto a função do receptor Mas, porém ainda existem questões a serem respondidas quando se refere a especificidade da resposta.
Hipótese
Sabendo dos efeitos da restrição alimentar sobre o funcionamento cardiovascular e sua influencia sobre a pressão arterial e sistema nervoso simpático, além de estar bem estabelecido que o sistema renina angiotensina está relacionado com controle de pressão arterial e SNS, o intuito desse trabalho foi investigar os efeitos da restrição alimentar no sistema renina angiotensina periférico determinando os locais de alteração e seus efeitos na regulação da pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC).
2. Objetivos
2.1 Objetivo geral
Avaliar o efeito da restrição alimentar no sistema renina-angiotensina em ratas Fischer
2.2 Objetivos específicos:
- Determinar o efeito da restrição alimentar no volume sanguíneo, peso corporal, concentração plasmática de sódio e potássio, pressão arterial e frequência cardíaca basal;
- Determinar o efeito da restrição alimentar na responsividade do sistema renina angiotensina periférico;
- Determinar o efeito da restrição alimentar na concentração plasmática dos peptídeos do sistema renina angiotensina;
- Determinar o efeito da restrição alimentar na atividade plasmática da ECA, ECA2 e renina; - Determinar o efeito da restrição alimentar nos receptores angiotensinérgicos em vasos de resistência.
3. Material e métodos
Para realização deste trabalho, foram utilizadas ratas Fisher com aproximadamente 4 meses de idade, pesando entre 200-220g. Os animas foram cedidos pelo Centro de Ciência Animal da Universidade Federal de Ouro Preto – CCA - Brasil ou comprados na Harlam® - EUA. Antes de iniciar os experimentos, os animais ficaram três dias no biotério de experimentação para ambientalização e passado esse período os animais foram alojados em caixas individuais de 30x19x13cm durante todo o período de tratamento dietético. Os animais foram mantidos em uma temperatura média de 23 ± 1ºC, com um ciclo claro-escuro de doze horas e todos os animais receberam água ad libitum.
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com aprovação prévia do Comitê de Ética de uso de animais da Universidade Federal de Ouro Preto, CEUA_UFOP (Protocolo no
2016/02) e pelo comitê de ética da Universidade de Georgetown (Protocolo no. 16:1234). Os
experimentos foram realizados sempre seguindo as normas da Lei Arouca (Lei 11.794) e o Guia de Uso e Cuidados de Animais de Laboratório do National Research Council, EUA.
3.1 Modelo experimental animal - Restrição alimentar
O modelo de restrição alimentar utilizado foi de 60% por 14 dias. Primeiramente a ingestão alimentar de cada rato foi quantificada por duas semanas. Após a determinação do consumo médio diário, o grupo experimental passou a receber diariamente 60% a menos e o grupo controle permaneceu recebendo ração ad libitum. A ração utilizada foi a ração comercial Nuvilab® e a redução da oferta de ração consistiu na redução de calorias, de macro e micronutriente e esse protocolo foi seguido por 14 dias. Todos os animais foram pesados diariamente antes de receberem a ração e a ração foi oferecida todos os dias uma hora antes de iniciar o ciclo escuro.
3.2 Fármacos e soluções
Ang-[1-10]: Sigma, St. Louis, MO, EUA - iv: 154 nmol/L; dose: 0,1mL/100g de animal;
Ang-[1-7]: Sigma, St. Louis, MO, EUA - iv: 191 nmol/L, dose: 0,1mL/100g de animal;
Azul de Evans: Sigma, St. Louis, MO, EUA – iv: 0.3 mg/ml; 0,2mL Captopril: Sigma, St. Louis, MO, EUA – iv: 9.2 mmol/L; 0,2mL
L-fenilefrina: Sigma, St. Louis, MO, EUA – iv: 50μg/mL; Velocidade de infusão de 2,2mL/h com volume infundido de 0,1mL. A seringa utilizada foi de vidro com o tamanho de 57mm.
Heparina: 125UL em 25mL. A quantidade utilizada de heparina foi o suficiente para preenchimento das cânulas arteriais.
Inactin: Sigma, St. Louis, MO, EUA - 100mg/mL Dose:0.1mL/100mg de peso corporal
Isoflurano: Cristália Ltda, Itapira, SP, Brasil - Administrado por via aérea na dose de 2 – 2,5% em 2L de oxigênio (O2) por minuto.
Ketoflex 1% p/v (Cetoprofeno): Mundo Animal, Pindamonhangaba, SP, Brasil - Dose: 0,03mL/300g de peso corporal no volume de 0,1mL/300g de animal, via i.m.
Losartan: Sigma, St. Louis, MO, EUA - i.v. dose de 10mg/Kg de peso no volume de 0,1mL/100g de peso, i.c.v. (ventrículo lateral) utilizou-se a dose 10µg por animal no volume de 2µL.
MLN406 - EMD Milllipore, Billerica, MA, USA - 20 µmol/L
Pentabiótico Veterinário: Fort Dodge Animal Health, Hialeah, FL, USA - Dose: 4.800UI de penicilina, 2mg de estreptomicina e 2mg de diidroestreptomicina por kg de peso. O volume injetado foi 0,1 mL/100g de animal por via i.m.
Substrato: Abz-Phe-Arg-Lys(Dnp)-Pro-OH - GenScript (Piscataway, NJ, USA) Mca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OH - Enzo Life Science (Farmingdale, NY, USA)
3.3 Confecção dos materiais utilizados
Confecção das cânulas arteriais e venosas
As cânulas arteriais e venosas foram confeccionadas a partir da junção por aquecimento de um tubo de polietileno (PE) 50 mm a outro tubo de PE de 10 mm de circunferência. As medidas utilizadas foram as seguintes: cânula arterial – 13,0cm de PE 50 mm soldado em 3,0 cm de PE 10 mm. Cânula venosa – 13,0 cm de PE 50 mm soldado em 2,0 cm de PE10 mm.
3.4 Cirurgias e procedimentos para análise cardiovascular
Implante das cânulas arterial e venosaNo 14o dia, os animais foram submetidos aos procedimentos pré-cirúrgicos (sedação e
anestesia) para o implante das cânulas na artéria e veia femoral utilizando o anestésico inalatório (Isofluorano 2 – 2,5% - 2 L/min de O2). A região inguinal e do dorso foram tricotomizadas seguido
de assepsia com polivinil pirrolidona iodo degermante. Através de uma pequena incisão na região inguinal, o trígono femoral foi exposto, os vasos femorais identificados e separados do nervo femoral. Um cateter de polietileno foi introduzido na artéria femoral até alcançar a aorta abdominal. No caso de experimentos com infusões de drogas i.v., outro cateter de polietileno foi inserido na veia femoral (Figura 3). Após a introdução dos cateteres, estes foram passados pelo tecido subcutâneo do animal, com o auxílio de um pequeno tubo de metal (trocáter), até a sua exteriorização na região interescapular. Para garantir a não oclusão do cateter por formação de trombo, o mesmo foi preenchido com solução de salina heparinizada e a ponta do cateter exposta no dorso foi obstruída com um pino de aço inoxidável. Terminado o procedimento, os locais de incisão foram suturados e os animais tiveram um período de recuperação de 48Hs (128).
Figura 3: Esquema simplificado da canulação da artéria (vermelho) e da veia (azul) femoral (128)
3.5 Cuidados pós-operatórios
Após as cirurgias, todos os animais receberam injeção sub cutânea (s.c.) de cetoprofeno e uma dose profilática de penicilina, para prevenção de inflamações e infecções, e posteriormente foram alocados em gaiolas individuais. Após passar o efeito do anestésico, os animais foram mantidos na sala de experimentos sob condições de temperatura, luminosidade e níveis de ruído controlados, com dieta de acordo com o protocolo previamente estabelecido e água ad libitum.
3.6 Registros e análises da pressão arterial média (PAM) e frequência
cardíaca (FC)
Para registro dos parâmetros cardiovasculares, a cânula inserida na artéria femoral foi conectada a um transdutor, que ligado a um sistema de aquisição de dados Power Lab 4/20 (ADInstruments) possibilitou o registro da pressão arterial pulsátil (PAP). As oscilações de pressão captadas foram amplificadas e convertidas em sinais enviados a uma placa de aquisição de dados, através de uma placa de conversão analógico/digital. O software de leitura Chart 7 for Windows realizou a coleta contínua da PAP, calculando a partir desta, os valores de FC e PAM.
3.7 Procedimento para infusão de drogas
Para a infusão endovenosa, uma seringa de 1 mL foi conectada na parte externa do cateter que foi inserido na veia femoral e aproximadamente 0,2 mL das respectivas drogas foi injetado em bolus. Após injetar a droga, a seringa foi retirada e uma outra seringa contendo PBS (tampão fosfato-salino) foi conectada ao cateter com a intenção de empurrar a droga residual com o PBS.
Desenho experimental para infusão de drogas
caixas, 2h antes de iniciar o registro. Os animais foram conectados ao sistema de registro e apenas após a PAM e FC demonstraram estar estáveis, foi iniciado o protocolo experimental. Foi considerado como período basal quando a PAM e FC mantiveram-se constantes por no mínimo 10 min e isso foi seguido independente da droga administrada.
Ang-[1-10]: No primeiro dia de registro foi administrado captopril, esperou-se 10 min e logo em seguida foi administrado Ang-[1-10], a qual teve sua resposta registrada por 40 min. No segundo dia foi injetado veículo e Ang-[1-10] em seguida. Captopril e veículo foram administrados em dias alternados de maneira randômica.
Ang-[1-8]: No primeiro dia de registro foi administrado Ang-[1-8] e resposta foi registrada por 30min. No segundo dia o veículo foi administrado e o registro seguiu-se por 30 min novamente. Veículo e Ang-[1-8] foram administrados em dias alternados de maneira randômica.
Ang-[1-7]: No primeiro dia de registro foi administrado Ang-[1-7] e a resposta foi registrada por 40min. No segundo dia o veículo foi administrado e o registro seguiu-se por 40 min novamente. Veículo e Ang-[1-7] foram administrados em dias alternados de maneira randômica.
Losartan: No primeiro dia de registro foi administrado Losartan e resposta foi registrada por 40min. No segundo dia o veículo foi administrado e o registro seguiu-se por 40 min novamente. Veículo e Losartan foram administrados em dias alternados de maneira randômica.
Análise dos registros
Os valores de PAM e FC foram registrados continuamente. Os valores basais para PAM e FC foram obtidos calculando-se a média dos 2min de registro anteriores a infusão de drogas. A partir da infusão continuou-se calculando a média de cada parâmetro a cada 2min até o final do registro para posterior cálculo do gráfico em forma de curva. A variação da PAM e FC foram calculadas subtraindo o valor basal da máxima/mínima reposta obtida após a injeção de drogas/veículo para o cálculo do gráfico em barra. Como os valores basais diferem por causa do tratamento dietético, todos os valores foram normalizados pelo valor basal de cada animal, ou seja, os gráficos foram expressos como alterações causadas pela droga em relação ao basal.
3.8 Caracterização dos efeitos da restrição alimentar no perfil
hemodinâmico
Determinação da concentração plasmática de sódio e potássio
Para avaliar o efeito da restrição alimentar no perfil hemodinâmico, foram utilizadas ratas sem cirurgia prévia. Os animais foram anestesiados com isoflurano e o sangue foi coletado através de punção cardíaca. Todas as amostras foram centrifugadas a 13.000g por 10min para separação do plasma e posterior congelamento no freezer -80C. As amostras de plasma foram diluídas 200x em uma solução padrão para leitura no fotômetro de chamas (Cole-Parmer_model 2655-10) para determinação da concentração plasmática de sódio e potássio.
Determinação do volume plasmático - Azul de Evans
O volume plasmático foi determinado através da técnica de azul de Evans. Seguido uma coleta prévia de sangue para utilização futura como leitura basal, infundiu-se através de um cateter posicionado dentro da veia femoral o corante azul de Evans (0,3 mg/ml). Após 5 e 10 min da infusão do corante, uma amostra de sangue foi retirada com volume aproximado de 0,2 mL e posteriormente essas amostras foram centrifugadas para separação do plasma. A curva padrão foi feita utilizando 1% de plasma como solvente do corante nas seguintes concentrações 0, 1, 5, 10, e 20 g/ml. Uma amostra de 100 µL de plasma foi adicionada no leitor de placa com excitação de 610 nm para determinar a concentração do corante nos tempos de coleta 5 min e 10 min, assim como para determinar o background de cada amostra utilizando o plasma coletado antes da injeção de corante. A correção do background foi feita subtraindo o valor obtido para a amostra basal dos valores observados em cada tempo de coleta. O volume plasmático foi então calculado dividindo a quantidade de corante injetada pela quantidade em cada amostra corrigida pelo background. O volume total de plasma foi então estimado através do cálculo da média de diluição obtida entre o tempo 5 e 10 min (129).
3.9 Determinação da concentração dos peptídeos do SRA
RAS-FINGERPRINT®
Após os animais serem anestesiados com Inactin, o sangue foi coletado através da punção cardíaca com auxílio de uma seringa contendo heparina e inibidor de protease específico para enzimas do sistema renina angiotensina enviado pela empresa Attoquant Diagnostics, Viena-Austria. Em um segundo grupo, após serem anestesiados, os animais receberam uma infusão endovenosa de Ang-[1-10] e o sangue foi coletado após 10min. As amostras foram centrifugadas (2000g, 4°C, 10min), o plasma coletado e armazenado no freezer -80C. O metabolismo dos peptídeos foi realizado como descrito por Sharp, 2015 (130). A quantificação dos peptídeos foi realizada por cromatografia líquida e espectroscopia de massa em tandem (LC-MS/MS).
As amostras de sangue foram coletadas usando o cocktail de inibidor de proteases que bloqueia todo o metabolismo da via da angiotensina como metaloproteases (ácido etilenediaminetetraacetico, 1,10-fenantrolina), aspártico proteases (pepstatina A), cisteina proteases (p-ácido hidroximercuribenzoico), serina proteases (AEBSF) e inibidores específicos para renina e aminopeptidase A e N com a concentração final de 5% v/v (Attoquant Diagnostics, Vienna, Austria). As amostras foram estabilizadas e misturadas com isótopo-marcado para cada padrão respectivo aos peptídeos Ang-[1-10], Ang-[2-8], Ang-[1-7], Ang-[1-5], Ang-[2-8], Ang-[3-8], Ang-[2-10], Ang-[2-7], Ang-[1-9] e Ang-[3-7] na concentração de 200 pg/ml. Seguindo a extração de fase sólida baseada no C18, as amostras foram submetidas a análise de LC-MS/MS usando uma coluna analítica de fase reversa (Acquity UPLC® C18, Waters) operando em linha com um XEVO TQ-S espectrômetro de massa triplo quadrupolo (Waters) no modo MRM. Os padrões internos foram usados para corrigir a recuperação dos peptídeos da preparação da amostra para cada amostra e para cada peptídeo. As concentrações dos peptídeos foram calculadas considerando os fatores de resposta correspondente na curva de calibração apropriada na amostra original, em condições que os sinais excederam a razão sinal-ruído de 10.
Angiotensinogênio
Para quantificação do AGT sanguíneo foi realizado um imunoensaio enzimático, Elisa. Primeiramente o soro foi diluído 2500x e posteriormente foram seguidas as recomendações do fabricante do kit (IBL, Hamburg, Alemanha).
3.10 Determinação das atividades enzimáticas da ECA, ECA2 e Renina
ECAFoi utilizado o substrato fluorogênico Abz-Phe-Arg-Lys(Dnp)-Pro-OH (GenScript, USA). Em cada poço de uma placa de 96 poços foi adicionado 80µL do tampão de reação (1 M NaCl, 0.5 mM ZnCl2, 75 mM Tris, pH 7.5) na presença de veículo ou ECA inibidor. Atividade enzimática
total foi medida na presença de veículo (tampão). Atividade não específica à ECA foi definida como a atividade medida na presença de 20µM de captopril - Inibidor da ECA (Sigma Chemical Co, MO, USA). Atividade específica da ECA foi definida como atividade da ECA menos atividade não específica. Para reação foi adicionado em cada poço 10µL de plasma diluído 10x, 10µL do substrato fluorogênico para atingir a concentração final de 60µM. A formação do produto foi determinada a 37oC pela leitura da fluorescência em função do tempo usando um leitor de placa
(FLUOstar Omega, BMG LABTECH Inc, NC, USA) com onda de excitação de 320nm e emissão de 410nm. A velocidade inicial foi determinada utilizando a parte linear da reação (10-60min) e calculada a partir da razão de aumento da fluorescência em função do tempo. Protocolo adaptado (131).
ECA2
Foi utilizado o substrato fluorogênico Mca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OH (Enzo Life Science, USA). Foi adicionado em cada poço de uma placa de 96 poços 85μL do tampão de reação (1 M NaCl, 0.5 mM ZnCl2, 75 mM Tris, pH 7.5) na presença de veículo ou do inibidor da ECA (captopril)
ou ECA2 (MLN-4760). Atividade enzimática total foi medida na presença do tampão. Atividade não específica da ECA foi definida na presença de 20μM captopril (Sigma Chemical Co, MO, USA). Atividade de peptidase não específica foi definida na presença de 20µM de captopril e 20µM de MLN-4760 (EMD Milllipore, USA). A atividade específica da ECA2 foi definida como atividade não específica da ECA menos atividade não específica de peptidases. Imediatamente
