Departamento de Engenharia Química
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
ESTRATÉGIAS DE INDUÇÃO DO ANTÍGENO 503
RECOMBINANTE DE Leishmania i. chagasi EXPRESSO EM
Escherichia coli M15
LUAN TALES COSTA DE PAIVA VASCONCELOS
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos
Coorientador: Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior
Natal/RN
Fevereiro/2018
ESTRATÉGIAS DE INDUÇÃO DO ANTÍGENO 503
RECOMBINANTE DE Leishmania i. chagasi EXPRESSO EM
Escherichia coli M15
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN, em cumprimento às exigências para obtenção do grau de mestre em Engenharia Química, sob a orientação do Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos e coorientação do Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior.
Natal/RN
Fevereiro/2018
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Vasconcelos, Luan Tales Costa de Paiva.
Estratégias de indução do antígeno 503 recombinante de Leishmania
i. chagasi expresso em Escherichia coli M15 / Luan Tales Costa de
Paiva Vasconcelos. - 2018. 91 f.: il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Natal, RN, 2018.
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos.
Coorientador: Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior.
1. Antígeno recombinante - Dissertação. 2. Escherichia coli
recombinante - Dissertação. 3. Antígeno 503- Dissertação. 4. Indução - Dissertação. 5. Leishmaniose - Dissertação. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Júnior, Francisco Canindé de Sousa. III. Título.
Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química – PPgEQ. Área de concentração: Engenharia Química. Linha de pesquisa: Processos Químicos, Biotecnológicos e Catálise, Natal/RN, 2018, Brasil.
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos
Coorientador: Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior
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RESUMO: Com cerca de 900.000 a 1,3 milhões de novos casos anualmente, a Leishmaniose
é um complexo de doenças que pode ser fatal se não dada a devida atenção. Apesar de sua relevância na saúde pública, ainda não existe uma vacina capaz de prevenir a doença em humanos, e seu tratamento é caro e agressivo à saúde. O presente estudo tem como objetivo otimizar os parâmetros de indução do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em
Escherichia coli recombinante. Dessa forma, para a indução foi utilizada a lactose nas
concentrações de 0,1; 1,0 e 10 g/L, e o isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) nas
concentrações de 20,0; 100,0; 500,0 e 1000,0 M como moléculas indutoras em diferentes densidades celulares (densidade óptica a 600 nm de 0,5 e 1,0) de modo a analisar a influência do instante de indução no rendimento da proteína de interesse. Os resultados mostraram que a
concentração de IPTG de 100,0 M foi a que mais favoreceu a produção do antígeno (0,087 g/L), sendo esta concentração de IPTG 10 vezes menor do que utilizada em trabalhos anteriores para esse tipo de sistema, e para a lactose foi a de 1,0 g/L (0,016 g/L). Dessa forma, a indução com 100,0 M de IPTG permitiu obter o antígeno 503 com uma concentração 5,6 vezes maior que a máxima obtida quando a lactose foi usada como indutor.
Palavras-chave: Antígeno 503, Escherichia coli recombinante, Leishmaniose, indução.
ABSTRACT
With nearly 900,000 to 1.3 million new cases annually, Leishmaniosis is a complex of diseases that can be fatal if not given proper attention. Despite its relevance in the public health system, there is no vaccine capable of preventing disease in humans so far, and its treatment is expensive and aggressive to human health. Vaccination remains the most practical and realistic way of fight against the disease, thus, the production of recombinant antigens as a pathway towards a vaccine acquisition is necessary. In addition, the optimization of the strategy of the recombinant antigen’s production is of interest so it can make the process viable. Therefore, the present study aims to optimize the induction parameters of the 503 Leishmania i. chagasi antigen expressed in recombinant Escherichia coli. Hence, the induction at different cell densities (optical density at 600 nm of 0.5 and 1.0) was evaluated in order to analyse the influence of the induction time on the yield of the protein of interest. In this segment, lactose and isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) were used as inducer molecules, using various concentrations: 0.1 g/L, 1.0 g/L and 10 g/L for lactose and 20 μM, 100 μM, 500 μM and 1000 μM for IPTG. The results presented that the concentration of IPTG that obtained the higher antigen levels was that of 100 μM (0.087 g/L), a 10-fold lower concentration than was being previously used in this type of system, and for lactose it was 1 g/L (0.016 g/L). Thus, the induction with 100 μM allowed to obtain the antigen with a concentration 5.6 times higher than the lactose induction maximum concentration.
1. Introdução ... 14
2. Objetivos ... 17
2.1. Objetivo geral ... 17
2.2. Objetivos específicos ... 17
3. Revisão bibliográfica ... 19
3.1. Leishmaniose visceral americana ... 19
3.1.1. Antígeno 503 ... 21
3.2. Tecnologia do DNA recombinante ... 22
3.3. Proteínas recombinantes expressas em Escherichia coli ... 23
3.4. Operon lac ... 25
3.5. Estratégias de indução e produção de ácido acético ... 26
3.5.1. IPTG e lactose ... 28 4. Material e métodos ... 30 4.1. Microrganismo ... 30 4.2. Meio de cultivo ... 30 4.2.1. Antibióticos ... 30 4.3. Inóculo ... 31 4.4. Ensaios em shaker ... 31
4.4.1 Avaliação da influência dos indutores na expressão do antígeno 503 ... 32
4.4.2. Indução em shaker ... 32
4.5. Estratégia experimental ... 33
4.5.1. Determinação da biomassa ... 33
4.5.2. Determinação do ácido acético ... 34
4.5.3. Avaliação do rompimento celular... 34
4.6. Determinação dos parâmetros cinéticos ... 36
4.6.1. Cálculo das velocidades específicas de transformação ... 36
4.6.2. Cálculo da produtividade em células e de produto em células ... 37
4.7. Análise estatística ... 37
5. Resultados e Discussão ... 40
5.1. Influência da concentração de IPTG e do instante de indução ... 40
5.1.2. Produtividade de proteínas em células (Pp/x) e velocidade de crescimento específico (x) ... 45
5.1.3. Antígeno ... 50
5.2. Avaliação dos ensaios utilizando lactose ... 54
5.2.1. Biomassa, proteína total e densidade celular ... 54
5.2.2. Produtividade de proteína em células (Pp/x) e velocidade de crescimento específica (x) ... 60
5.2.3. Antígeno ... 63
5.3. IPTG versus lactose ... 64
6. Conclusões ... 68 7. Referências bibliográficas ... 70 APÊNDICE 1 ... 79 APÊNDICE 2 ... 81 APÊNDICE 3 ... 82 APÊNDICE 4 ... 83 APÊNDICE 5 ... 88
Figura 1: Mapa da distribuição de casos reportados da Leishmaniose Visceral no mundo em 2013. Adaptado (WHO, 2015). ... 20 Figura 2: Esquema do fator de alongamento 1- de L. infantum mostrando sua sequência de aminoácidos. Fonte: GenBank número CAC35543.1 ... 21 Figura 3: Ilustração do funcionamento do operon lac (VAZ, 2011) ... 25 Figura 4: Estratégia experimental do estudo. Fonte: Autor. ... 33 Figura 5: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio I utilizando IPTG como indutor de concentração 20 M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução... 41 Figura 6: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio III utilizando IPTG como indutor de concentração 100 M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução... 41 Figura 7: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio V utilizando IPTG como indutor de concentração 500 M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução... 42 Figura 8: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio VII utilizando IPTG como indutor de concentração 1000 M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução.... 42 Figura 9: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (●) e velocidade de crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio I utilizando IPTG com concentração 20 M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução. ... 46 Figura 10: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (●) e velocidade de crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio III utilizando IPTG com concentração 100 M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução. ... 47 Figura 11: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (●) e velocidade de crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio V utilizando IPTG com concentração 500 M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução. ... 47 Figura 12: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (●) e velocidade de crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio VII
indução. ... 48 Figura 13: Eletroforese de amostras purificadas. A seta representa a banda da proteína de interesse. De acordo com as colunas: (1) Marcador de bandas proteicas padrão; (2) Amostra do instante de 3 h do ensaio III (IPTG a 100 M e DO600 0,5) de maior proteína total; (3) Amostra do instante de 7 h do ensaio III (IPTG a 100 M e DO600 0,5) de maior proteína total; (4) Instante de 3 h do ensaio X (lactose a 1 g/L e DO600 0,5); (5) Instante de 8 h do ensaio XI (lactose a 1 g/L e DO600 1,0); (6) Instante de 8 h do ensaio X (lactose a 1 g/L e DO600 0,5). ... 52 Figura 14: Perfil de Biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio IX utilizando lactose como indutor de concentração 0,1 g/L e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução. ... 55 Figura 15: Perfil de Biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio X utilizando lactose como indutor de concentração 1 g/L e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução. ... 55 Figura 16: Perfil de Biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio XI utilizando lactose como indutor de concentração 1 g/L e DO600 de 1,0. A seta representa o instante de indução. ... 56 Figura 17: Perfil de Biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio XII utilizando lactose como indutor de concentração 10 g/L e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução. ... 56 Figura 18: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (■) e velocidade de crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio IX utilizando lactose a 0,1 g/L como indutor e DO600 0,5. A seta representa o instante de indução. ... 61 Figura 19: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (■) e velocidade de crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio X utilizando lactose a 1 g/L como indutor e DO600 0,5. A seta representa o instante de indução. ... 61 Figura 20: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (■) e velocidade de crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio XI utilizando lactose a 1 g/L como indutor e DO600 1,0. A seta representa o instante de indução. ... 62
utilizando lactose a 10 g/L como indutor e DO600 0,5. A seta representa o instante de indução. ... 62 Figura 22: Curva de calibração para a determinação da biomassa a partir da leitura da DO600. ... 80 Figura 23: Curva de calibração para determinação de ácido acético a partir da leitura da intensidade dos picos no HPLC. ... 81 Figura 24: Correlação do massa molecular dos padrões inibidor de tripsina (20,1 kDa), anidrase carbônica (30,0 kDa), albumina (66,0 kDa) e fosforilase b (97,0 kDa) e a distância percorrida no gel de eletroforese da Figura 13. ... 82 Figura 25: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio II utilizando IPTG como indutor de concentração 20 M e DO600 de 1,0. A seta representa o instante de indução... 83 Figura 26: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio IV utilizando IPTG como indutor de concentração 100 M e DO600 de 1,0. A seta representa o instante de indução... 84 Figura 27: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio VI utilizando IPTG como indutor de concentração 500 M e DO600 de 1,0. A seta representa o instante de indução... 84 Figura 28: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio VIII utilizando IPTG como indutor de concentração 1000 M e DO600 de 1,0. A seta representa o instante de indução.... 85 Figura 29: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (●) e velocidade de crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio II utilizando IPTG com concentração 20 M e DO600 de 1,0. A seta representa o instante de indução. ... 85 Figura 30: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (●) e velocidade de crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio IV utilizando IPTG com concentração 100 M e DO600 de 1,0. A seta representa o instante de indução. ... 86 Figura 31: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (●) e velocidade de crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio VI
indução. ... 86 Figura 32: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (●) e velocidade de crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio VIII utilizando IPTG com concentração 1000 M e DO600 de 1,0. A seta representa o instante de indução. ... 87 Figura 33: Teste Tukey com os dados de biomassa máxima dos ensaios de I a VIII utilizando IPTG como indutor da Tabela 3. Valores com asterisco na mesma coluna não apresentam diferenças significativas com 95% de confiança. ... 88 Figura 34: Teste Tukey com os dados de proteína máxima dos ensaios de I a VIII utilizando IPTG como indutor da Tabela 4. Valores com asterisco na mesma coluna não apresentam diferenças significativas com 95% de confiança. ... 88 Figura 35: Teste Tukey com os dados de biomassa máxima dos ensaios de IX a XII utilizando lactose como indutor da Tabela 5. Valores com asterisco na mesma coluna não apresentam diferenças significativas com 95% de confiança. ... 89 Figura 36: Teste Tukey com os dados de proteína máxima dos ensaios de IX a XII utilizando lactose como indutor da Tabela 6. Valores com asterisco na mesma coluna não apresentam diferenças significativas com 95% de confiança. ... 89
Tabela 1 - Composição do meio de cultivo 2xTY (VAZ, 2011). ... 30 Tabela 2 – Planejamento experimental para avaliação da influência do instante de indução e dos indutores IPTG e lactose na expressão do antígeno 503. ... 31 Tabela 3: Parâmetros cinéticos de crescimento celular máximos obtidos nos ensaios de indução com IPTG. ... 45 Tabela 4: Padrão de produção de proteínas e produtividade do ponto de máximo obtidas nos ensaios utilizando IPTG como indutor. ... 52 Tabela 5: Parâmetros de biomassa dos ensaios realizados com lactose. ... 59 Tabela 6: Parâmetros de proteína dos ensaios utilizando a lactose. ... 64 Tabela 7: Comparação de diferentes parâmetros obtidos na utilização de IPTG e lactose como molécula indutora. ... 65
LVA Leishmania Visceral Americana IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
DEQ Departamento de Engenharia Química
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
DO Densidade óptica
DO600 Densidade óptica a 600 nm
LV Leishmania Visceral
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
IMAC Cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de Dodecil Sulfato de Sódio
APS Persulfato de amônio
Px Produtividade em células (g/h) Pp Produtividade em proteínas (g/h)
Pp/x Produtividade de células em proteína (g/g) x Velocidade de crescimento específica
Capítulo 1
Introdução
1. Introdução
As leishmanioses compreendem um complexo de doenças com enorme diversidade clínica e epidemiológica causadas por protozoários do gênero Leishmania (Ordem
Kinetoplastidae, família Trypanosomatidae), transmitidos por insetos flebotomíneos. Desse
modo, o indivíduo infectado manifesta sinais e sintomas de acordo com a espécie do protozoário, podendo apresentar as formas cutânea, mucocutânea, cutânea difusa e visceral. O tipo mais perigoso dentre as variações da Leishmaniose visceral americana (LVA) é a sua forma visceral (AYATOLLAHI; BAFGHI; SHAHCHERAGHI, 2015; BRAZ et al., 2002; KARAMI; DOUDI; SETORKI, 2013; WILSON; JERONIMO; PEARSON, 2005).
A LVA é uma doença infectocontagiosa presente em 75 países. O Brasil está entre os 6 países que representam 90% das ocorrências da mesma no mundo todo. Na América latina as formas mais comuns da doença são as cutâneas e mucocutâneas, com quase 90% dos casos desta última ocorrendo na Bolívia, Peru e Brasil onde a forma da doença é associada a zonas rurais e ou regiões de pobreza (ESTEVA; VARGAS; VARGAS DE LEÓN, 2017; SOUSA-GOMES et al., 2017)
Em geral são estimados, anualmente, cerca de 900.000 a 1.3 milhão de novos casos da doença com aproximadamente 20.000 a 30.000 mortes relacionadas a mesma ao redor do mundo. Devido a expansão da população humana para regiões selváticas, é estimado que cerca de 350 milhões de pessoas estejam em risco de contrair qualquer forma da doença (WHO, 2016).
No Brasil, a LVA tem uma taxa anual de incidência de 4.200 a 6.300 casos anualmente. Na região do Nordeste, a Leishmaniose consegue atingir cerca de duas mil pessoas a cada ano. O acréscimo do número de pessoas que tem chance de serem infectadas deve-se as condições geográficas, principalmente, por condições climáticas, na qual a alta pluviosidade favorece a proliferação do mosquito vetor da doença e mais pessoas, assim, são propensas a correrem o risco de serem contaminadas, com uma taxa de mortalidade de 7,0% (JERONIMO et al., 2004; SELVAPANDIYAN et al., 2012; SOUSA-GOMES et al., 2017).
Entretanto, ainda não existe uma vacina capaz de prevenir a LVA em humanos, apesar dos avanços nas áreas de biologia molecular e da imunologia. Assim, se faz necessário a produção de antígenos recombinantes para a produção de vacinas e kits de diagnóstico. Nesse contexto, o desenvolvimento da engenharia genética possibilitou a expressão de tais proteínas recombinantes em organismos hospedeiros, desde organismos pequenos como bactérias e fungos, até plantas e mamíferos (BORZANI et al., 2001; VALDEZ-CRUZ et al., 2010).
Como cada proteína recombinante é diferente, a expressão da mesma deve ser definida de acordo com o caso em particular. Existem várias escolhas a se fazer ao produzir proteínas recombinantes, como por exemplo, o sistema de expressão, o meio e as condições de cultivo (KRAUSE; NEUBAUER; NEUBAUER, 2016)
A estratégia de indução e, por consequência, a seleção do indutor, tem seu papel importante na resposta celular pós-indução, em virtude que o indutor não afetar somente o crescimento celular mas, também, o gene a ser ativado para a expressão e, consequentemente, o conjunto de proteínas acumuladas nas células (VÉLEZ et al., 2014).
Nesse contexto, a maioria das publicações focam no uso do isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) como indutor da expressão da proteína recombinante (CHENG et al., 2007; LIN; HSIAO; CHOU, 2002; LIU; CHANG; LEE, 1999; WEN et al., 2005). Apesar disso, o fato do IPTG ser de alto custo e potencialmente tóxico para as células restringe suas aplicações com indutor de proteínas recombinantes em escala industrial. A lactose, por outro lado, é um indutor mais acessível financeiramente, natural e biodegradável, que pode também ser usado em sistemas de expressão baseados no operon lac (BRIAND et al., 2016; VÉLEZ et al., 2014).
Em trabalhos anteriores do grupo de pesquisa em Engenharia de Bioprocessos do Departamento de Engenharia Química (DEQ) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), foram otimizados processos para viabilizar a produção e utilização do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli. Por exemplo, Vaz (2011) analisou a influência das condições de cultivo na produtividade do antígeno, obtendo seu maior valor quando utilizado o meio de cultivo 2xTY em biorreator de bancada, com a indução sendo realizada na fase exponencial com lactose a 10 g/L e 400 rpm. Além disso, Sousa Júnior, (2015) e Leitão, (2016) avaliaram a recuperação e a purificação do antígeno 503 de Leishmania chagasi expresso em E. coli utilizando a adsorção em leito expandido, de modo a viabilizar o processo e remover toxinas.
Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo analisar a influência de indutores (IPTG e lactose) na expressão da proteína de interesse – antígeno 503 – avaliando-se diferentes estratégias de indução como o uso de diferentes densidades ópticas (DO) do meio no momento de indução e a concentração do indutor.
Capítulo 2
Objetivos
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Determinar as concentrações de IPTG e lactose como diferentes estratégias de indução para a máxima expressão do antígeno 503 expresso em E. coli.
2.2. Objetivos específicos
o Para cada ensaio proposto, avaliar os níveis de proteínas totais, biomassa, ácido acético, produtividade de produtos em células e a velocidade de crescimento específica;
o Avaliar a influência da concentração do indutor, e a densidade óptica (DO) na expressão do antígeno 503 em cultivos realizados em shaker;
o Estudar a influência do IPTG e da lactose nas condições de indução (concentração do indutor e DO no instante da indução) durante o cultivo;
o Averiguar o efeito da concentração do indutor e do tipo (IPTG ou lactose) empregadas sobre os parâmetros da máxima expressão do produto de interesse, comparando-os com trabalhos anteriores.
Capítulo 3
Revisão bibliográfica
3. Revisão bibliográfica
3.1. Leishmaniose visceral americana
A Leishmaniose visceral americana é um tipo de doença que é causada por um protozoário do gênero da Leishmania. Este para completar seu ciclo de vida necessita de no mínimo dois hospedeiros e, assim, é classificada como uma zoonose, um tipo de doença que pode ser transmitida entre animais vertebrados, incluindo o ser humano (GILLESPIE et al., 2016; SAÚDE, 2014).
Diferentes espécies do protozoário podem causar Leishmaniose em humanos, apresentando diferentes manifestações: visceral, cutânea e mucocutânea. Entre estes existem a
L. chagasi, L. donovani e a L. (V.) braziliensis. A Leishmaniose Visceral (LV) ou Leishmaniose
Visceral Americana (LVA), é letal se deixada sem tratamento sendo a Leishmaniose Cutânea a forma mais comum da doença. Os chamados vetores da LVA são mosquitos denominados de flebotomíneos, que compreendem o gênero Lutzomyia e Phlebotomus, conhecidos comumente no Brasil como mosquito palha, birigui, asa dura, tatuquira entre outros (REY, 2008; MOHAMED AHMED AL-KAMEL, 2017)
É importante destacar também que pode ocorrer transmissão da doença por meio de transfusões sanguíneas, uma vez que nenhum teste de triagem para Leishmania no sangue de doadores de sangue é realizado como rotina. Ademais, a transmissão da doença pode ser aumentada pelo uso compartilhado de seringas, como ocorre em parte dos usuários de drogas injetáveis (FIGUEIRÓ FILHO et al., 2005).
A LV, em sua forma clássica, pode causar hepatoesplenomegalia, febre, assim como um grave comprometimento da saúde geral. Estes sintomas podem progredir para náuseas, diarreia, vômitos, tosse, entre outros. À medida que a doença progride e fica mais grave, o indivíduo pode sentir dores de cabeça, sofrer de desnutrição, icterícia, hemorragias e outros sintomas. Caso o paciente não seja tratado, a doença pode evoluir para óbito no período de dois anos (COSTA et al., 2011; DRUMOND; COSTA, 2011; JERONIMO et al., 2004).
A LV é a forma mais severa da Leishmaniose, chegando a ser fatal em 95% dos casos quando os mesmos são deixados sem tratamento. Cerca de 200.000 a 400.000 novos casos por ano da LV são estimados ocorrer globalmente (ALVAR et al., 2012; PAHO, 2015; WHO, 2016). Não obstante, a mesma é autóctone em 12 países da América, com um total de 45.490 casos registrados entre 2011 e 2013, com uma média de 3499 casos por ano. Em 2013, a maior taxa de incidência em humanos (4,35 novos casos por 100.000 habitantes) foi reportado no
Brasil dentre 8 países da América dentro da zona de transmissão da LV (PAHO, 2015). O Brasil se enquadra entre os seis países no mundo que contabilizam até 90% dos casos de LV, como mostra a distribuição da doença na Figura 1 (WHO, 2015). Além disso, a LV inicialmente era uma doença endêmica em zonas rurais e ganhou espaço a partir da década de 1980. Atualmente, está presente em 21 dos 27 estados do Brasil com mais de 70% dos casos ocorrendo em municípios com mais de 100.000 habitantes (LEAL et al., 2018; WERNECK, 2016).
Figura 1: Mapa da distribuição de casos reportados da Leishmaniose Visceral no mundo em 2013. Adaptado (WHO, 2015).
Além de sua grande distribuição e elevada incidência no Brasil, a LV pode ser fatal quando associada a quadros de má nutrição e outras comorbidades, uma vez que dificulta a recuperação e a qualidade de vida do paciente. Com enfoque na região Nordeste do Brasil, a Leishmaniose Visceral tem uma ampla abrangência e incidência, chegando a aproximadamente duas mil pessoas por ano. Devido ao ciclo de vida variado que este parasita possui, novos modos de combate à doença são discutidos ao passo da crescente urbanização das cidades. O hospedeiro em que o protozoário se encontra é um fator que difere a zona de risco que a doença pode se proliferar. As condições climáticas e geográficas podem favorecer a reprodução dos vetores, tornando a região com alta incidência da doença (JERONIMO et al., 2004; SELVAPANDIYAN et al., 2012).
Apesar dos avanços no assunto e de existirem diferentes técnicas para o diagnóstico da Leishmaniose, não existe ainda um teste que tenha uma sensibilidade de 100% para a detecção
da doença. O que existe é uma análise complexa, identificando o parasita por meio de testes parasitológicos, uma vez que o quadro de sintomas se confunde também com outras patologias como malária, doença de chagas, tuberculose, entre outros (GONTIJO, CÉLIA MARIA FERREIRA; MELO, 2004).
Sendo, geralmente, efetiva, a quimioterapia é o tratamento principal de todas as três formas da Leishmaniose. Entretanto, fatores como custo elevado, toxicidade e regimes complicados e longos prejudicam a maioria das opções quimioterapêuticas (GILLESPIE et al., 2016). Dessa forma, a prevenção à doença é a melhor escolha.
O desenvolvimento de uma vacina poderia representar um dos melhores meios em relação ao custo benefício de controlar ou eliminar a LVA. Até mesmo uma vacina que promovesse a proteção por 5 anos a 50% de eficácia ainda sim seria economicamente viável quando comparado aos tratamentos atuais. Uma vez que o antígeno tem o potencial de desencadear uma resposta imunológica, além do possível desenvolvimento da vacina, pode-se utilizar o antígeno na tentativa de desenvolver kits para a identificação da doença por meio de testes de diagnósticos na ausência de sintomas que possam reconhecer a doença (GILLESPIE et al., 2016; MARTINS et al., 2006).
3.1.1. Antígeno 503
Anteriormente descrita por Cañavate et al., (2002), o antígeno 503 é uma proteína de aproximadamente 56 kDa que possui 100% de identidade com o fator de alongamento 1- (Figura 2) de L. infantum. O mesmo foi posteriormente identificado por Martins et al., (2006) por meio de comparações com bibliotecas de cDNA da Leishmania i. chagasi.
1 mtykllaplh pesaraqkim vaaayanvdv elkvcqygqe netpefarnc spcmrfpsmq 61 teegylfesn aimrhiarve ksgaklygat pfessqvdmw ldfasselda hnmpylmetf 121 agipaaesam atleeslagl elwletrtfl vgermtvadi svafalqwvy rmnvkhgeel 181 tkkyrnayrl yntvmqqpkt vevlkqwgat fgpakapkka aeakpkaekk pkeavgdeee 241 qsakeekkan pldalppssf vldaykreys ntdtrtvaap yffehydteg ytcfwaryky 301 nednkkqfmt anlvrgwfqr mehvrkyafg valiigedaa helvsfwvfr gkgmpeivse 361 vvdtelfewe eikdvqaeke kitdylcweg ptiprpvleg rcfk
Figura 2: Esquema do fator de alongamento 1- de L. infantum mostrando sua sequência de aminoácidos. Fonte: GenBank número CAC35543.1
Este fator de alongamento, por sua vez, é uma subdivisão do fator de alongamento 1 (EF-1), que desempenha sua função na tradução de proteínas em células eucarióticas, a proteína G. Esta, exibe uma semelhança estrutural com os genes que codificam o fator de alongamento 1, descrito em vários eucariotas: 32% com o EF 1- de Homo sapiens (CAÑAVATE et al., 2002). O antígeno 503 foi expresso na E. coli e, em seguida, avaliado frente a soros de pacientes infectados com Leishmania i. chagasi. A avaliação mostrou que grande parte dos indivíduos com LV testados apresentaram anticorpos contra o antígeno 503, indicando que o paciente infectado com LV exibe uma resposta imune celular e humoral ao antígeno, sugerindo o seu potencial como um candidato à vacina ou teste de diagnóstico específico da enfermidade (MARTINS et al., 2006).
3.2. Tecnologia do DNA recombinante
No contexto das biomoléculas produzidas em escala industrial, o termo biotecnologia entra em cena. Processos como a produção de álcool, de proteínas, hormônios, enzimas e outras biomoléculas estão englobadas neste contexto, que se alavancou com o desenvolvimento da engenharia genética, no que se chamou de tecnologia do DNA recombinante. Essa tecnologia surgiu dentre os anos de 1971 e 1973, causando um grande enfoque para esta área na comunidade cientifica. Sendo assim, esta tecnologia, hoje, é a base para as transformações biotecnológicas. A técnica dá subsídio para que possam produzir cópias de parte de um DNA em cerca de duas horas (COMBETTES-SOUVERAIN; ISSAD, 1998; LUBINIECKI, 1997; SALOMAA; STINSON; KARK, 1995; WALSH, 2000).
A produção de proteínas recombinantes é um importante processo biotecnológico, uma vez que provê os meios necessários para produzir um produto específico em quantidades desejadas. Aplicações deste processo variam desde a produção de catalisadores industriais, como enzimas, até diversos tipos de biofarmacêuticos, como hormônios e antígenos. Uma condição para tal processo é que a proteína recombinante seja produzida em um hospedeiro recombinante. Existem vários hospedeiros eucarióticos e procarióticos, como bactérias, fungos, plantas, insetos, entre outros. Devido ao cruzamento de espécies, a sequência genética original, que contém a informação do produto de interesse, precisa ser modificada de modo a se obter uma expressão satisfatória (HABIBI et al., 2014).
O DNA recombinante é o termo aplicado às moléculas híbridas de DNA que são construídas in vitro, em seguida, propagadas em uma célula ou organismo hospedeiro. O DNA recombinante básico consiste em dois segmentos de DNA: um vetor e o segmento de inserção.
O vetor é uma região do DNA que se duplica como uma unidade individual, capaz de se propagar nas células de escolha. O mesmo é dotado de uma fonte de replicação funcional sendo tipicamente projetado para acomodar as inserções convenientemente. Os vetores mais usados são plasmídeos bacterianos e vírus. As inserções podem ser de qualquer tipo - segmentos longos ou curtos de DNA, de fontes naturais ou sintéticas. Os DNAs recombinantes são isolados em clones celulares ou virais. O processo de produção desses recombinantes é frequentemente chamado de “clonagem de DNA” ou “clonagem de genes” (CARROLL, 2013).
Adicionalmente, a implantação das tecnologias da biologia molecular de DNA recombinante permitiu formação de compostos integrados pela combinação de genes codificadores dos produtos de interesses, assim, a produção de produtos de interesse ligados a outros compostos se tornaram possíveis. Uma destas possibilidades é a introdução de caudas (tags) em proteínas que inicialmente não as continham, tal como na fusão de histidinas na porção C ou N-terminal do produto de interesse, o que confere a tal a possibilidade da utilização de purificações antes não possíveis, como a cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) (BRESOLIN; MIRANDA; BUENO, 2009).
3.3. Proteínas recombinantes expressas em Escherichia coli
A escolha do microrganismo hospedeiro do plasmídeo, contendo o gene que após a transcrição e tradução produzirá o composto de interesse, é de fundamental importância quando se objetiva a produção em larga escala. Além de bactérias, fungos, vírus, entre outros podem ser utilizados. Não obstante, cada um tem suas vantagens e desvantagens levando em consideração, também, a molécula heteróloga de interesse. Por exemplo, se são necessárias mudanças após a produção do componente desejado, no âmbito de uma modificação pós-traducional eucariótica, não se escolheria um sistema procarioto como hospedeiro para tal, uma vez que esta não tem a capacidade de fazer tais alterações necessárias (ADRIO; DEMAIN, 2010; DEMAIN; VAISHNAV, 2011; SAHDEV; KHATTAR; SAINI, 2008).
A partir da década dos anos 70, logo após o desenvolvimento da técnica do DNA recombinante, a comunidade científica se voltou para a bactéria Escherichia coli. Isso ocorreu pelo fato de que esta bactéria passou a ser estudada como microrganismo hospedeiro para a produção de compostos heterólogos (LIMA, 2004).
Por várias razões a E. coli ainda é a escolha preferida como sistema hospedeiro para a produção de proteínas. Com custos relativamente baixos pode-se atingir altos níveis de biomassa e rendimento de produtos de interesse em curtos tempos de cultivo. Assim, a E. coli
é extremamente bem estudada em suas características bioquímicas e fisiológicas. Destaca-se que a mesma também pode ser facilmente manipulada geneticamente (KRAUSE; NEUBAUER; NEUBAUER, 2016)
Mesmo com todas as vantagens da utilização da E. coli como hospedeiro, existem vários pontos a serem melhor investigados para a otimização dos processos envolvendo esta bactéria dentre suas limitações. Dessa forma, a maior parte dos cultivos se dá em condições aeróbicas, uma vez que situações anaeróbicas fornecem menos energia para o metabolismo de crescimento e produção de proteínas, estimulando a produção de acetato, sendo este um inibidor para a célula (AHAMED; VERMETTE, 2010).
Embora exista considerável conhecimento acerca desta bactéria e de seus mecanismos de reprodução, ainda são encontradas barreiras e limitações na utilização da mesma na expressão de proteínas heterólogas. Como por exemplo, utilizando meios de cultivo complexos a densidade celular alcançada chega a menos de 0,1% do limite teórico obtido da literatura (SEZONOV; JOSELEAU-PETIT; D’ARI, 2007). Desse modo, existe a necessidade de adicionar um processo de rompimento da célula para a liberação do produto de interesse, caso o mesmo se encontre intracelularmente, uma vez que a E. coli não possui em seu maquinário um meio de liberação da proteína (TOMAZETTO et al., 2007).
Após a duplicação de uma célula contendo o plasmídeo, existe a possibilidade do mesmo não ser repassado para ambas as células sucessoras da célula original. Chamado de instabilidade segregativa, a má distribuição do plasmídeo tem como consequência células improdutivas que diminuem o rendimento do processo. Dessa forma, com o objetivo de minimizar esta ação, explora-se a utilização de antibióticos no meio de cultura. Assim, células que não possuem o plasmídeo, que contém um gene resistente a antibiótico, morrem e dão lugar somente as células com plasmídeo (LIMA, 2004; TOMAZETTO et al., 2007; VIDAL et al., 2005).
Ter o plasmídeo inserido na célula não significa que a proteína de interesse será produzida. A célula possui várias funções metabólicas, dessa forma, para a produção da proteína heteróloga é necessária a expressão da mesma. Obter altos níveis de expressão significa que a bactéria está desviando seu metabolismo para a produção da proteína e, portanto, esta é uma etapa crucial para a otimização e a viabilidade do processo. Apesar disto, não existe um passo a passo correto que funcione para todos os tipos de expressão para se obter a máxima expressão. Diversos fatores têm seu peso e influência sobre as rotas metabólicas escolhidas pelo organismo hospedeiro como, por exemplo, o tipo do indutor e sua concentração durante o cultivo, o momento da indução e sua frequência, a composição do meio de cultivo, os níveis de inibidores presente e até mesmo as condições operacionais do processo. Isto denota que cada sistema é
único, do modo que cada variável tem que ser cuidadosamente ponderada e analisada para identificar sua influência no processo como um todo (BERRY; PATON, 2000; CARVALHO et al., 2012; LARENTIS et al., 2011).
3.4. Operon lac
A expressão da proteína se dá a partir da utilização de um componente que induz a bactéria a fazer a leitura do plasmídeo inserido no vetor. Este processo foi melhor compreendido a partir do estudo dos promotores e repressores existentes no genoma de E. coli, o que permitiu o desenvolvimento para a produção de proteínas heterólogas a partir do operon lac (ETTINGER et al., 2009). O operon lac é um mecanismo de regulação gênica, o qual é formado pelo conjunto de genes que codificam a expressão de enzimas que são necessárias para o metabolismo da lactose. Dessa forma, na presença de lactose, uma bactéria contendo o operon lac em seu código genético, inicia uma resposta ao metabolismo da mesma, como ilustra a Figura 3. Por meio da engenharia genética, é inserido no plasmídeo contendo o operon lac o código genético de uma proteína de interesse. Consequentemente, atrelado ao metabolismo da lactose, o microrganismo modificado também irá produzir a proteína alvo (TIAN et al., 2011).
Os genes compreendidos no operon lac são os chamados lacZ, lacY e lacA. O lacZ corresponde a β-galactosidase, enzima responsável pela quebra da lactose em glucose e galactose, além de ser responsável pela produção a alolactose, o indutor natural do operon lac (MARBACH; BETTENBROCK, 2012). O lacY codifica a enzima permease da lactose, sendo responsável então pelo transporte da lactose para dentro da célula (LIN; LYNCH, 1996), e por último, o lacA codifica a transacetilase, que aparenta ter a função de detoxificação (RODERICK, 2005).
Pela a necessidade que alguns microrganismos possuem em apresentar uma rápida resposta ao meio em que se encontram, é de se esperar que genes que atuam sobre um determinado composto sejam co-traduzidos. Dessa forma, conforme mostrado na Figura 3, em se tratando do chamado operon lac, o modo de transcrição é realizado pela seqüência operadora
o, que está próximo ao sítio que dá início a transcrição e ao sítio em que a RNA polimerase se
conecta (região promotora p). Desse modo, a transcrição do operon lac é dependente da repressão do produto gênico do gene lacI, uma vez que regula a sequência operadora (DEUTSCHER; FRANCKE; POSTMA, 2006). O repressor I, em presença de um tipo de composto específico, também chamado de indutor, muda a sua estrutura ao ligar-se ao mesmo, não podendo se ligar mais ao operador, permitindo assim que a RNA polimerase faça a transcrição do operon lac. Dessa forma, na presença de lactose, ou de um análogo estrutural da lactose não metabolizável tal como o isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG), o operon ficará ativo, de forma que os três genes (lacZ, lacY e lacA) serão traduzidos. De forma análoga, na ausência de uma molécula que se ligue ao repressor I, esta conseguirá se conectar a parte do operador e, desse modo, impedir a transcrição do operon lac (VAZ, 2011).
3.5. Estratégias de indução e produção de ácido acético
No biorreator, as células em condições propícias estão se reproduzindo continuamente e para a produção de algum composto de interesse é necessário o desvio de seu metabolismo, para que as mesmas possam produzir a proteína heteróloga. Caso esse desvio do metabolismo ocorra de forma muito intensa, o crescimento celular é então prejudicado. Processo esse conhecido como carga metabólica (metabolic burden). Esta perda no crescimento pode ser minimizada utilizando um controle na expressão da proteína alvo, ao se escolher o tipo de indutor (HADDADIN; HARCUM, 2005). Este indutor pode ser um composto químico ou algum fator físico, como a temperatura, desde que seja capaz de iniciar uma resposta no código genético atribuído a proteína de interesse. A intensidade desde indutor e a estratégia utilizada
de indução pode influenciar no rendimento dos produtos heterólogos de interesse (SHIN et al., 1997).
A quantidade de indutor a ser utilizada de forma a obter a melhor resposta de expressão depende de uma série fatores, entre eles a força que o gene promotor tem, se existe ou não uma carga genética de repressão encontrada no código genético inserido no microrganismo, o local onde o produto de interesse será encontrado com relação à célula, a resposta dessa célula quando em contato com um componente indutor, e fatores específicos da proteína de interesse como sua solubilidade e características individuais. Desse modo, esta quantidade deve ser suficiente para que possa romper as barreiras de repressão que possam existir, em função da densidade celular e também da concentração da molécula indutora utilizada. Assim, se faz necessário avaliar a condição de indução a fim de se elevar ao máximo a formação da proteína heteróloga alvo (CSERJAN-PUSCHMANN et al., 2002; DONOVAN; ROBINSON; CLICK, 1996).
No que se refere ao cultivo celular utilizando a bactéria E. coli como hospedeira para a produção de compostos heterólogos, as condições de cultivo para a obtenção dos mesmos e as estratégias empregadas no cultivo são de extrema importância para maximizar o rendimento do produto de interesse (GOMBERT; KILIKIAN, 1997; LULI; STROHL, 1990; RIESENBERG et al., 1990; WANG et al., 2010).
A E. coli, com sua alta velocidade de duplicação, em se tratando de sistemas recombinantes de expressão, pode ser induzida a sofrer um desvio do metabolismo (nos sistemas que exigem indução para expressão do produto heterólogo), uma vez que estando em crescimento existiria a necessidade da mudança de metabolismo para a expressão do componente de interesse. Esta transição do metabolismo pode ocorrer de forma a gerar um estresse metabólico na célula, acarretando na diminuição de sua reprodução (BENTLEY et al., 1990). Devido a este fenômeno, os meios de cultivo de alta densidade são planejados de forma a melhor aproveitar a produção da proteína de interesse (CHOI; KEUM; LEE, 2006).
Como os nutrientes oferecidos à E. coli influenciam diretamente na sua produtividade, condições de grande estresse metabólico levam a um menor rendimento. Não obstante, em situações de grande densidade celular, também existe a possibilidade do aumento rápido de subprodutos indesejáveis do ciclo metabólico da bactéria, como o ácido acético, que agem como inibidores da produção da mesma (HOFFMANN et al., 2004; KILIKIAN et al., 2000; VALDEZ-CRUZ et al., 2010). Destaca-se que esta liberação de ácido acético durante os cultivos de E. coli pode ser acatada como uma limitação para a utilização desse organismo uma vez que este composto, mesmo sendo liberado por sua via metabólica, é uma substância
inibidora à produção de proteína heterólogas (EITEMAN; ALTMAN, 2006; KILIKIAN et al., 2000; XUE et al., 2010).
3.5.1. IPTG e lactose
Em se tratando de sistemas recombinantes em E. coli com controle promovido pela indução do operon lac, o repressor do mesmo regula o acesso ao gene recombinante. Assim, a indução da expressão da proteína heteróloga é impulsionada pela adição ao meio cultivo do indutor IPTG (BRIAND et al., 2016).
Com o intuito de alcançar o máximo rendimento de produtos heterólogos de interesse, diversas variáveis são monitoradas e controladas durante o cultivo. Entre estas se destaca a qualidade e a quantidade das moléculas indutoras que irão promover a expressão dos sistemas. Principalmente em larga escala, a escolha do indutor e os fatores que giram ao redor do processo de indução durante o cultivo de sistemas recombinantes tem alto impacto no rendimento final do produto e nos custos do processo, podendo até mesmo se apresentar com um impacto negativo na rentabilidade celular, devido à influência tóxica para os microrganismos hospedeiros (EINSFELDT et al., 2011).
Várias estratégias são desenvolvidas para melhorar a expressão destes sistemas. Atualmente a adição de IPTG é o método mais utilizado para induzir a expressão da proteína recombinante, entretanto, sua eficácia é contraposta com diversas limitações: não tem boa compatibilidade com aumento de escala industrial, apresenta limitações toxicológicas e tem baixa relação custo-benefício. Como alternativa ao IPTG, a lactose pode ser utilizada como molécula indutora. E, apesar de superar seu competidor em termos de toxicidade e custo, seu uso também possui limitações como a necessidade da avaliação das condições adequadas para sua indução, pois também é fonte de carbono e energia para a célula (BRIAND et al., 2016; MESGARI-SHADI; SARRAFZADEH, 2017).
Após a indução, as características de crescimento e atividade metabólica da célula hospedeira são frequentemente influenciadas pela expressão do produto recombinante. Por esta razão é interessante analisar se possíveis efeitos positivos podem aparecer, decorrentes da indução da cultura celular a diferentes densidades celulares - que se refletem em diferentes tempos de cultivo - , com tipos distintos indutores e suas diferentes concentrações (MESGARI-SHADI; SARRAFZADEH, 2017; NORSYAHIDA; RAHMAH; AHMAD, 2009).
Capítulo 4
Material e métodos
4. Material e métodos
4.1. Microrganismo
Para a realização dos experimentos, foi utilizada a cepa da Escherichia coli M15 geneticamente modificada que abriga o plasmídeo pQE-30 (Qiagen, Califórnia/Estados Unidos) o qual contém em seu código genético o gene para expressão do antígeno 503 de
Leishmania i. chagasi. Este antígeno possui em sua extremidade terminal seis resíduos de
histidina e massa molecular de aproximadamente 56 kDa (MARTINS et al., 2006). Esta cepa recombinante foi gentilmente cedida pela Dra. Mary Wilson (Universidade de Iowa, Estados Unidos).
4.2. Meio de cultivo
O meio de cultivo 2xTY com pH 7,0, e com composição apresentada na Tabela 1, foi utilizado para os ensaios em shaker (incubadora com agitador orbital) (SOUSA JUNIOR, 2015). Deste meio foram pesados os componentes que posteriormente foram solubilizados em água destilada e, em seguida, esterilizados utilizando o equipamento autoclave, juntamente com seus recipientes, pelo tempo de 20 minutos sob 1,0 atm de pressão, previamente ao seu uso.
Tabela 1 - Composição do meio de cultivo 2xTY (VAZ, 2011). Nutrientes Concentração (g/L)
NaCl 5,0
Extrato de levedura 10,0
Triptona 16,0
4.2.1. Antibióticos
De forma a se assegurar a reprodutibilidade somente dos microrganismos contendo o plasmídeo, foram adicionados ao meio os dois antibióticos: a ampicilina (100µg/mL) e a canamicina (25µg/mL) (Sigma-Aldrich). Estes foram armazenados a -20 ºC e, previamente ao uso, foram preparados em condições de assepsia e esterilizados utilizando um filtro de 22 µm de poro (SOUSA JUNIOR, 2015).
4.3. Inóculo
Para a produção do inóculo, efetuou-se a ativação do microrganismo que estava armazenado em glicerol 50% a -80 ºC no laboratório de imunogenética da UFRN. Assim, 200 µL da solução da cepa foram colocados em Erlenmeyers de 250 mL juntamente com 50 mL da solução 2xTY com antibióticos. A ativação foi realizada em ambiente asséptico em shaker durante 12 horas a 200 rpm e 37 ºC. O inóculo, então, foi preparado com 5 mL da solução da ativação juntamente com 45 mL de solução do meio 2xTY durante 6 horas a 200 rpm e 37 ºC (LEITÃO, 2016).
4.4. Ensaios em shaker
Os experimentos foram realizados em shaker, conforme planejamento mostrado na Tabela 2, utilizando 5 mL do inóculo juntamente com 45 mL de meio 2xTY em Erlenmeyers de 250 mL. Estes foram realizados com os seguintes parâmetros: 10 horas de cultivo a 200 rpm e 37 ºC. Tais parâmetros já otimizados em trabalhos anteriores, por Vaz (2011).
Tabela 2 – Planejamento experimental para avaliação da influência do instante de indução e dos indutores IPTG e lactose na expressão do antígeno 503.
Ensaios Instante de indução (DO600) Concentração do Indutor IPTG (μM) Lactose (g/L) I 0,5 20 - II 1 20 - III 0,5 100 - IV 1 100 - V 0,5 500 - VI 1 500 - VII 0,5 1000 - VIII 1 1000 - IX 0,5 - 0,1 X 0,5 - 1 XI 1 - 1 XII 0,5 - 10
4.4.1 Avaliação da influência dos indutores na expressão do antígeno 503
No presente estudo foram realizados 12 ensaios com o objetivo de se encontrar a melhor condição para expressão do antígeno, conforme Tabela 2. Estes ensaios foram divididos entre 4 diferentes concentrações de IPTG (20 M, 100 M, 500 M e 1000 M) e 3 concentrações diferentes de lactose (0,1 g/L, 1 g/L e 10 g/L) a 2 diferentes concentrações celulares (DO600) (0,5 e 1,0), ensaios esses que foram realizados em shaker (TE-421, Tecnal, Brasil). Para isto amostras foram coletadas, na qual se analisou a concentração celular (X), a concentração de ácido acético e a expressão do antígeno 503. Todos os cultivos ocorreram por um período de 10 h e tiveram 6 alíquotas de 2 mL retiradas no tempo zero, no instante da indução e a cada hora de cultivo.
Trabalhos anteriores realizados pelo nosso grupo, utilizaram a indução com IPTG na
concentração de 1000 M (Vaz et al., 2015), bem como Leitão (2016) e Sousa Júnior (2015) com a lactose a 10 g/L. Uma vez que o objetivo do trabalho é maximizar a produção do antígeno de forma a viabilizar o produto, a escolha das concentrações de IPTG e lactose foram feitas de modo a avaliar se uma indução com menor utilização de indutores ainda sim seria suficiente ou até mesmo melhor para a expressão máxima do antígeno.
Por isso, foram escolhidas as concentrações duas vezes, dez vezes e cinquenta vezes menor do que a de 1000 M já utilizadas para o IPTG; bem como concentrações dez vezes e cem vezes menor do que a 10 g/L já utilizadas para a lactose. Estas ordens de grandeza foram exploradas de forma a contemplar um pico na produção do antígeno quando utilizado uma concentração dentro dos parâmetros estabelecidos.
4.4.2. Indução em shaker
A lactose e o IPTG foram adicionados no meio reacional durante os experimentos. A lactose de concentração final a depender do experimento (conforme Tabela 2) foi manipulada a partir de uma solução estoque de 200 g/L, e o IPTG a partir de uma solução de 100 mg/mL, previamente esterilizados com filtro de 22 µm de poro (SOUSA JUNIOR, 2015).
4.5. Estratégia experimental
Em cada um dos 12 ensaios, as alíquotas coletadas para posterior análise de composição foram inicialmente centrifugadas a 13.400 g durante 30 minutos de forma a separar o sobrenadante das células cultivadas (VAZ, 2011). As células foram quantificadas em massa, e a proteína de interesse determinada por método qualitativo (eletroforese) e quantitativo (Lowry). Do sobrenadante, por sua vez, foram analisados os níveis de ácido acético (inibidor), como mostra o esquema da Figura 4 a seguir:
Figura 4: Estratégia experimental do estudo. Fonte: Autor.
4.5.1. Determinação da biomassa
A determinação da densidade celular ocorreu com a realização da leitura da solução contendo as células diluídas em espectrofotômetro modelo Genesys 10 uv (Thermo Spectronic, EUA) a 600 nm. A diluição foi feita com o meio 2xTY estéril. O resultado obtido pela leitura fora então comparado com os valores de uma curva padrão pré-estabelecida a partir da massa seca do microrganismo em questão, conforme a metodologia de Rodrigues et al (2003).
4.5.2. Determinação do ácido acético
O sobrenadante foi filtrado utilizando uma membrana de 0,22 µm e, em seguida, o ácido acético foi quantificado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) empregando o cromatógrafo modelo Acella (Thermo Scientific, EUA). Para isto utilizou-se de uma coluna Shim-Pack SCR-101H (Shimadzu Co., Japão) a temperatura de 65 ºC. Para a fase móvel foi utilizada uma solução de ácido sulfúrico 0,005 M com um fluxo de 0,6 mL/min (LU et al., 2009; XIE et al., 2011). O volume de injeção foi de 20 µL e o valor de resposta foi comparado com uma curva padrão obtida previamente (LU et al., 2009).
4.5.3. Avaliação do rompimento celular
De modo a quantificar as proteínas de interesse, as células foram armazenadas em banho de gelo por 15 minutos. Após isso foram ressuspendidas e rompidas, uma vez que a proteína é intracelular, utilizando-se um tampão de rompimento celular a base de ureia. O tampão utilizado apresenta composição formada por NaH2PO4 (100 mM), uréia (8 M), Tris-Cl (10 mM) e pH de 8.0, que então foi homogeneizado em agitador de tubos tipo vórtex (AP56, Phoenix, Brasil) a temperatura ambiente (25 ± 2 °C) por 15 minutos. Por fim, realizou-se uma centrifugação com o objetivo de remover resíduos celulares a 13.400 g durante 30 minutos (VAZ, 2011).
4.5.4. Recuperação do antígeno 503
A recuperação do antígeno foi realizada utilizando a cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC) com uma resina de Níquel Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Suécia). Tal metodologia foi utilizada diante da possibilidade da utilização do IMAC devido a incorporação de uma calda de histidina ao antígeno de interesse, o que possibilita a afinidade deste aminoácido com a resina utilizada. Para isto, 2,0 mL da solução do sobrenadante foi adicionada a 0,5 mL da resina a 50% v/v e, em seguida, agitada em shaker durante 30 minutos, a 200 rpm e temperatura ambiente. Logo depois, o conteúdo foi despejado na coluna vazia com sua parte inferior vedada, de modo a permitir a passagem da solução e não da resina. A parte inferior foi aberta de forma a coletar as amostras sob fluxo contínuo. Em seguida, o eluído fora lavado com duas rodadas de 4 mL de Tampão C - composto por NaH2PO4 (100 mM), ureia (8 M), Tris-Cl (10 mM) a um pH de 6,3 - e então a proteína foi eluída duas vezes com Tampão D
- composto por NaH2PO4 (100 mM), ureia (8 M), Tris-Cl (10 mM) a um pH de 4,5 – utilizando 1 mL do mesmo e colhidos para posterior análise de concentração (VAZ, 2011).
4.5.4.1. Eletroforese de proteínas sob condições desnaturantes (SDS-PAGE)
Eletroforese em gel de poliacrilamida 12%, sob condições desnaturantes (SDS-PAGE), foi realizada conforme Laemmli (1970), empregando-se uma cuba vertical MiniVE (GE Healthcare, Suécia).
Para tal, fora utilizado um tampão de corrida de composição: Tris-HCl 25mM, glicina 192 mM e SDS 0,1% (m/v) e pH 8,3; Tampão de amostra: Tris-HCl 0,5 M, glicerol 10% (v/v), SDS 10% (m/v), 2-mercaptoetanol 5% (v/v), azul de bromofenol 5% (v/v) e pH 6,8.
O gel de separação a 15% de malha tinha como constituintes acrilamida 30%, Tris-HCl 1,5M (pH 8,8), SDS 10%, APS 10%, Temed e água deionizada. Por sua vez, o gel de concentração possuía acrilamida 30%, Tris-HCl 0,5M (pH 6,8), SDS 10%, APS 10%, Temed e água deionizada. Utilizou-se como padrão o kit de calibração de baixa massa molecular para SDS-PAGE (GE Healthcare, Estados Unidos) contendo as proteínas α-lactolbumina (14,4 kDa), inibidor de tripsina (20,1 kDa), ovalbumina (45,0 kDa), albumina (66,0 kDa) e fosforilase b (97,0 kDa).
Para revelação das bandas proteicas, os géis foram corados com prata (BLUM; BEIER; GROSS, 1987). Para isso, os géis após a corrida foram deixados com uma solução de etanol 50% por 20 minutos por 3 vezes. Em seguida, foi deixada em contato com uma solução de tiossulfato de sódio (0,2 g/L) por 1 minuto, lavado por 3 vezes com água destilada. Logo após, foi deixado em contato com uma solução de nitrato de prata (2g/L + 74 L de formaldeído) durante 20 minutos. Acabado o tempo, o gel foi lavado rapidamente por 3 vezes com água destilada e deixado em contato com a solução reveladora (60 g/L de carbonado de sódio + 50 L de formaldeído + 2 mL solução de tiossulfato de sódio) até o aparecimento das bandas, posteriormente interrompida a reação com a adição de solução de ácido acético 13% (v/v).
4.5.4.2. Análise quantitativa
Com a finalidade de determinar a quantidade de proteínas totais, utilizou-se o método descrito por Lowry et al. (1951). As concentrações de proteínas das amostras foram estimadas a partir de uma curva padrão determinada previamente, tendo como padrão a albumina de soro bovina (Sigma-Aldrich, EUA) na faixa de concentração de 20 a 420 g/L.
Para a análise do antígeno 503, este foi avaliado também por eletroforese como descrito no item 4.5.4.1. Para determinar a quantidade do antígeno, os geis foram corados com uma solução a base de prata e em seguida feita a digitalização da imagem dos géis, de forma que a mesma pudesse ser analisada pelo software ImageJ (versão 1,51. Wayne Rasband, National
Institutes of Health, Estados Unidos). Neste, as imagens das bandas de proteínas coradas foram
relacionadas de acordo com sua intensidade de coloração, gerando picos de intensidade que foram, então, transformados em valores numéricos. Assim, somando as intensidades de todas as bandas teve-se a quantidade de proteínas totais no gel, e só as bandas correspondentes a proteína de interesse, ou seja, a quantidade do antígeno (LEITÃO, 2016).
4.6. Determinação dos parâmetros cinéticos
Os parâmetros cinéticos de um cultivo são necessários de forma a comparar os diferentes comportamentos destes parâmetros frente às diferentes condições impostas aos cultivos. Assim, o cálculo destes parâmetros permite para avaliar os objetivos deste estudo. As equações foram retiradas de Borzani e colaboradores (2001).
4.6.1. Cálculo das velocidades específicas de transformação
A velocidade específica de formação de células (µx) foi estimada conforme Equação (1). Sendo, X a concentração celular (X) durante o cultivo.
μ𝑋 = 1 𝑋
𝑑𝑋
𝑑𝑡 (1)
4.6.1.1. Velocidade específica de crescimento máxima (μXm)
A velocidade específica de crescimento máxima (µxm) foi estimada conforme Equação (2):
ln𝑋𝑓 𝑋𝑖
Sendo que o Xf e Xi as concentrações de células corresponde ao tempo final e o tempo inicial, respectivamente, que fornece o maior coeficiente de regressão.
4.6.2. Cálculo da produtividade em células e de produto em células
A produtividade é analisada com respeito as células e ao produto de interesse, de forma a quantificar a produção de ambos os parâmetros com relação ao volume do meio de cultivo e ao tempo de produção deste parâmetro. A produtividade em células (PX) e a produtividade de proteínas em células foram estimadas pelas Equações (3) e (4), respectivamente (BORZANI et al., 2001). 𝑃𝑋 = 𝑋 𝑡 (3) 𝑃𝑃/𝑋= 𝑃𝑃 𝑋 (4)
4.7. Análise estatística
Para determinar se as variações nas médias dos valores dos parâmetros cinéticos de biomassa e proteínas foram significantes ou não, foi realizada a Análise de Variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey, com nível de confiança de 95% (p=0,05). Para isso, utilizou-se do
software Statistica (versão 8,0; StatSoft, Inc.; Estados Unidos) para a realização do cálculo dos
parâmetros. As tabelas geradas pelo software estão no Apêndice 5. As leituras de biomassa foram feitas em duplicata e proteínas em triplicata.
Capítulo 5
Resultados e Discussão
5. Resultados e Discussão
5.1. Influência da concentração de IPTG e do instante de indução
A concentração de IPTG e a concentração celular no instante de indução são fatores relevantes e devem ser avaliados para maximizar a expressão de uma proteína heteróloga em
E. coli. Neste contexto, a Figura 5 ilustra o perfil apresentado pela biomassa, proteínas totais e
concentração de ácido acético para o ensaio utilizando IPTG com concentração 20 M com DO600 de 0,5. Destaca-se que a escolha dos valores de concentração de IPTG e do instante de indução teve como base nos estudos anteriores que avaliaram a expressão do antígeno 503, por Sousa Júnior (2015), Vaz (2011) e Leitão (2016).
Comparando as variáveis de processo analisadas (biomassa, proteínas produzidas e ácido acético) do ensaio I ( Figura 5: IPTG 20 M eDO600 0,5) com os das Figuras 6, 7 e 8 (dos
ensaios III, V e VII de DO600 0,5 e de concentração, respectivamente, IPTG 100 M, 500 M
e 1000 M), nota-se que a concentração de IPTG influenciou o perfil das variáveis analisadas. Entretanto, embora os perfis sejam diferentes, ao se comparar os ensaios de mesma concentração de IPTG, porém com densidades ópticas diferentes, estes ficaram dentro da mesma ordem de grandeza. Devido a esta baixa influência da DO600, os gráficos dos ensaios com IPTG de DO600 1,0 estão no apêndice 4. Adicionalmente, para todos os cultivos de E. coli sob indução com IPTG não foi observada a fase de adaptação do microrganismo ao meio (fase
lag), sugerindo uma boa adaptação ao meio de cultivo durante as etapas de ativação e preparo
do inóculo.
As análises do antígeno se deram inicialmente de forma indireta, avaliando os níveis de proteína total. Assim, supondo que concentrações maiores de proteína total teriam proporcionalmente valores maiores de antígeno, a escolha e determinação de maiores níveis do produto de interesse fora visto pelos níveis de proteína total, seguido posteriormente pela comprovação do mesmo, apresentada no item 5.1.3.
Figura 5: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio I utilizando IPTG como indutor de concentração 20
M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução.
Figura 6: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio III utilizando IPTG como indutor de concentração 100
Figura 7: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio V utilizando IPTG como indutor de concentração 500
M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução.
Figura 8: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em laranja(▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio VII utilizando IPTG como indutor de concentração
1000 M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução.
Corroborando com a baixa influência da DO600 a 0,5 e a 1,0 nos parâmetros avaliados, Haq e Akram (2017) investigaram a produção da enzima CenC em E. coli com o operon lac, e observaram que a indução a DO600 a 0,5 e a 0,9 apresentava uma diferença de menos de 20%
entre os valores de atividade relativa da enzima com 6 e 8 horas após a indução. No presente estudo, a diferença entre os valores de proteína total com 6 horas após a indução entre os pares
de ensaios (DO600 de 0,5 e 1,0) I-II (IPTG 20 M), III-IV (IPTG 100 M), V-VI (IPTG 500 M) e VII-VIII (IPTG 1000 M) foram, respectivamente: 12,7%, 10,5%, 6,6% e 23,8%. Apesar do último par de ensaio ter sido maior que 20%, os outros pares mostraram que variação da DO600 de 0,5 para 1,0 não apresentou grande influência.
O trabalho de Haq e Akram (2017) também mostrou que a indução a DO600 de 0,6 foi a melhor encontrada, com uma diferença nos valores de atividade enzimática também de cerca de 20% para com os valores a DO600 de 0,5 e por volta de 40% para com a de DO600 1,0. Ou seja, quando comparado nos extremos, a diferença do parâmetro avaliado (no exemplo a atividade enzimática e aqui a concentração de proteína) não foi tão grande quanto comparado com a DO600 de melhor rendimento (para eles, 0,6). Dessa forma, não se descarta a possibilidade de que o presente trabalho possa estar neste mesmo segmento, podendo abrir espaço para uma diferença mais significativa quando testado com valores mais próximos (como por exemplo a DO600 de 0,6; 0,7; 0,8 e 0,9) de modo a sanar a abertura que a indução entre os termos de 0,5 e 1,0 da DO600 forneceu.
De certo modo, aparentemente, deve existir um balanço para alcançar a otimização da DO600 na máxima expressão do antígeno de interesse. Por um lado, a DO600 muito baixa não se tem uma quantidade celular satisfatória para a expressão. Entrando mais na faixa desejada, dependendo da oferta de carbono, com uma densidade celular um pouco maior deve-se encontrar uma biomassa que possa levar a produção máxima do produto de interesse. Entretanto, devido à repressão catabólica, a célula pode “desligar” o mecanismo regulatório de iniciação do operon lac enquanto houver glicose disponível para a mesma. Devido a esta preferência da célula, a densidade celular juntamente com o nível de depleção da fonte de carbono pode ser o ponto chave para que a célula permita ou não a ação do promotor de modo a iniciar a transcrição do gene heterólogo. Em níveis mais altos da DO600 por sua vez, pode-se haver um estresse celular caso a indução ocorra de forma intensa, diminuindo assim a eficiência da expressão (DEUTSCHER; FRANCKE; POSTMA, 2006).
Não obstante, outro fator que pode agregar a não diferença dos parâmetros com a mudança da densidade celular é a estabilidade do plasmídeo. Collins e colaboradores (2013) analisaram a influência do instante de indução utilizando IPTG em sistema de E. coli para a produção de SELPs na estabilidade do plasmídeo. Como resultado, viram que a indução durante a fase exponencial levou a queda da porcentagem de células contendo o plasmídeo de 100% para aproximadamente 45% dentro de 2 horas. Ao passo de que quando a indução foi feita ao
