UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ALICE BARROS CÂMARA
ESTUDO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE A DEFICIÊNCIA DA VITAMINA D, DOENÇAS RELACIONADAS E O ESTRESSE OXIDATIVO CELULAR
Natal Julho/2018
ESTUDO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE A DEFICIÊNCIA DA VITAMINA D, DOENÇAS RELACIONADAS E O ESTRESSE OXIDATIVO CELULAR
por
Alice Barros Câmara
Orientador: Profa. Dra. Janeusa Trindade de Souto
Natal Julho/2018
Dissertação Apresentada à Coordenação do programa de Pós-Graduação de Ciências biológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como Requisito Parcial à Obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
A Dissertação
ESTUDO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE A DEFICIÊNCIA DA VITAMINA D, DOENÇAS RELACIONADAS E O ESTRESSE OXIDATIVO CELULAR
elaborada por ALICE BARROS CÂMARA e aprovada por todos os membros da Banca examinadora, foi aceita pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial à obtenção do título de MESTRE EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS.
Natal, 10 de Julho de 2018
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________ Janeusa Trindade Souto – DMP/CB/UFRN
_________________________________________ Jonas Ivan Nobre Oliveira – DBF/CB/UFRN
_________________________________________ Celina Maria Pinto Guerra Dore - UNINASSAU
Dedico este trabalho ao meu pai, Albérico Barros Câmara.
AGRADECIMENTOS
A Deus por me guiar em minha jornada acadêmica. Agradeço a todas as oportunidades que surgiram e a todos os obstáculos que foram vencidos. Não foi uma etapa fácil, mas a fé e a força espiritual fizeram com que eu pudesse lidar com todos os problemas.
Aos meus pais, por participarem diretamente da minha formação, me ensinando valores que serão importantes durante toda a minha vida. Agradeço especialmente a meu Pai e melhor amigo, Albérico Barros Câmara, por sempre ter me incentivado a seguir a carreira acadêmica, e que, infelizmente não pode mais estar presente para continuar a guiar meus passos e compartilhar futuras conquistas.
A minha orientadora Janeusa Trindade de Souto. Agradeço às sugestões, elogios e críticas construtivas. Agradeço aos conhecimentos obtidos e ao desenvolvimento intelectual que me pode ser proporcionado.
Aos professores Elizeu Antunes da Silva e Hugo Alexandre Rocha pela doação de alguns dos reagentes utilizados na pesquisa. Agradeço especialmente ao professor Elizeu por ter me permitido o uso do seu laboratório.
Ao Hospital do Coração por ter permitido a realização da pesquisa e a coleta das amostras e a todos os pacientes que participaram da pesquisa.
Ao meu noivo, Igor Brandão, programador e desenvolvedor renomado. Esteve sempre presente em todas as etapas deste trabalho, desenvolveu junto a mim, as análises estatísticas e auxiliou na discussão dos resultados.
À minha família, por todo incentivo e por acreditarem sempre no meu sucesso.
Aos meus amigos, Maria Vitória, Laíse Jales, Laís Luz. Pelos momentos de descontração proporcionados, por toda afetividade e bondade, por toda atenção, carinho e reciprocidade.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte e aos meus colegas de turma, com os quais mantive uma relação bastante amigável e saudável durante um ano e meio de mestrado. Finalmente, agradeço a CAPES pela bolsa de estudos e a todos os demais que me motivaram e colaboraram para que eu chegasse até este momento, meus sinceros agradecimentos.
“Science is far from a perfect instrument of knowledge. It's just the best we have. In this respect, as in many others, it's like democracy. Science by itself cannot advocate courses of human action, but it can certainly illuminate the possible consequences of alternative courses of action.”
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS PTH = Paratormônio
MDA = Malondialdeídeo GC = Grupo Carbonila
HCOR = Hospital do Coração
NASA = Agência de administração aeroespacial e aeronáutica dos EUA FGF = Fator de crescimento dos fibroblastos
VDR = Receptor de vitamina D RXR = Receptor retinoide X
ER0 = Espécies reativas de oxigênio CAT = Catalase.
SOD = Súper Oxido Desmutase PRX = Peroxirredoxina.
Trxrd = Tireodoxina Redutase
GGT = Gama Glutamil Transpeptidade G6PD = Glicose 6 fosfato desidrogenase. CGL = Cisteína Glutamato Ligase
GSH = Glutationa Reduzida
ERA = Elemento responsivo a antioxidantes GPX = Glutationa peroxidase
GR = Glutationa Redutase Nfr2 = Fator eritróide nuclear 2
RAGE = Receptor para os produtos finais de glicação enzimática D. da tireoide = Doenças da tireoide
EM = esclerose múltipla
RESUMO
Estima-se que mais de 1 bilhão de pessoas no mundo apresentam insuficiência ou deficiência da vitamina D. A forma ativa da vitamina D atua através de um receptor nuclear para exercer suas diversas funções no metabolismo celular. Além de participar diretamente na homeostase do cálcio, essa vitamina desempenha funções regulatórias no sistema imune, sistema nervoso, pressão sanguínea, secreção de insulina, entre outras. Sendo assim, a deficiência desse metabólito pode estar associada a inúmeros distúrbios metabólicos e à uma elevação nos danos oxidativos celulares. O presente trabalho teve como objetivo investigar as relações entre a deficiência de vitamina D, a peroxidação lipídica e a oxidação proteica, assim como correlacionar concentrações de vitamina D e o estresse oxidativo com a exposição solar, alimentação, idade e condições/doenças relacionadas à deficiência da vitamina D. Para isso, os pacientes do Hospital do Coração (Natal/RN/Brasil) foram convidados a participar do estudo. As concentrações de vitamina D foram dosadas no laboratório Álvaro (Belo Horizonte) e consultadas a partir do banco de dados do Hospital do Coração. Foram realizadas as avaliações da peroxidação lipídica e da oxidação proteica. Além disso, foi verificada a relação entre incidência solar e taxa de óbitos por doenças relacionadas a deficiência da vitamina D. Os dados referentes mortalidade foram extraídos do repositório ‘World Life Expectancy’ e os dados referentes às incidências solares foram obtidos a partir do projeto ‘Surface Meteorology and Solar Energy - versão 6.0’ da NASA. Observou-se que, independentemente da idade, os pacientes com deficiência de vitamina D apresentaram concentrações de Malondialdeídeo e proteínas carboniladas significativamente maiores quando comparados aos indivíduos suficientes em vitamina D. Adicionalmente, a exposição solar e uma dieta rica nessa vitamina estiveram associadas com menores níveis de peroxidação lipídica e oxidação proteica. Pacientes insuficientes/deficientes em vitamina D evidenciaram uma maior propensão para hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, neoplasias, doenças hepatobiliares e doenças do sistema urinário. Por fim, dados relacionados à incidência solar mostraram que os países com elevada exposição solar anual apresentam uma menor taxa de mortalidade por esclerose múltipla e por câncer.
Palavras chaves: Vitamina D. Estresse oxidativo. Peroxidação lipídica. Oxidação protéica. Incidência solar.
ABSTRACT
It is estimated that more than 1 billion people worldwide have vitamin D insufficiency or deficiency. The active vitamin D acts through a nuclear receptor to perform several functions in cellular metabolism. In addition to participating directly in calcium homeostasis, this vitamin plays regulatory roles in the immune system, nervous system, blood pressure, insulin secretion, among others. Therefore, the vitamin D deficiency may be associated with diseases, metabolic disorders and with cellular oxidative damage. This study aimed to investigate the relationship between vitamin D deficiency, lipid peroxidation and protein oxidation, as well as correlate vitamin D concentrations and oxidative stress with sun exposure, diet, age and conditions/diseases related to disability of vitamin D. For this, patients from the Heart Hospital (Natal/RN/Brazil) were invited to participate in the study. The vitamin D concentrations were consulted from the Heart Hospital database. Evaluations of lipid peroxidation and protein oxidation were carried out. In addition, the relationship between solar incidence and death rate for vitamin D deficiency related diseases was verified. Death rate data were extracted from the 'World Life Expectancy' repository and data about solar incidences were obtained from of NASA's Surface Meteorology and Solar Energy project - version 6.0. It was observed that patients with vitamin D deficiency had significantly higher concentrations of Malondialdehyde and carbonylated proteins when compared to sufficient vitamin D patients, regardless of age. In addition, sun exposure and a diet rich in vitamin D were associated with lower levels of lipid peroxidation and protein oxidation. Insufficient/deficient vitamin D patients showed significantly more hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, neoplasms, hepatobiliary diseases and diseases of the urinary system. Finally, data related to sunlight showed that countries with high annual solar incidence have a lower rate of death due to multiple sclerosis and cancer.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 12
1.1 Vitamina D ... 12
1.2 Funções da vitamina D ... 15
1.3 A deficiência da vitamina D... 19
1.4 A vitamina D e suas propriedades antioxidantes ... 23
2 OBJETIVOS ... 28
2.1 Objetivo Geral ... 28
2.2 Objetivos Específicos... 28
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 29
4 RESULTADOS ... 34
4.1 Concentrações da Vitamina D e a Peroxidação lipídica ... 34
4.2 Concentrações da Vitamina D e a Oxidação proteica ... 35
4.3 Exposição solar, alimentação, vitamina D e dano oxidativo ... 36
4.4 Relação idade e peroxidação Lipídica ... 39
4.5 Relação idade e oxidação Proteica ... 40
4.6 Influência da idade na concentração de vitamina D ... 41
4.7 Influência da idade na concentração de MDA... 42
4.8 Influência da idade na concentração de GC ... 43
4.9 Relação da deficiência da vitamina D com desordens metabólicas e doenças específicas ... 44
4.10Relação da incidência solar na taxa de mortalidade por doenças extraósseas ... 46
5 DISCUSSÃO ... 49 6 CONCLUSÕES ... 57 REFERÊNCIAS ... 58 APÊNDICE A ... 70 APÊNDICE B ... 71 APÊNDICE C ... 76
1. INTRODUÇÃO
1.1 Vitamina D
Os estudos para descoberta da Vitamina D começaram com pesquisas sobre raquitismo que assolava a população mundial, especialmente na Europa e Estados Unidos, durante a revolução industrial nos anos de 1800. Na verdade, o primeiro tratado médico sobre essa doença data de 1650, de autoria de Francis Glisson, que reposta uma nova doença que causava fraqueza óssea, mais comum em ricos que em pobres (WOLF, 2004; RAJAKUMAR et al, 2007; MARTINS e SILVA, 2007). Em 1822, Sniadecki foi o primeiro a reconhecer e relatar a associação de raquitismo com a falta de exposição à luz solar (THACHER e CLARCK, 2011). Em 1919 o pediatra alemão Kurt Huldschinsky mostrou que crianças com raquitismo melhoravam após exposição à luz solar, bem como à iluminação ultravioleta artificial de lâmpadas de quartzo, descobrindo assim a importância da luz ultravioleta na cura do raquitismo. Posteriormente, Martha Eliot, pediatra americana, mostrou que crianças diagnosticadas com raquitismo melhoravam quando tratadas diariamente com óleo de fígado de bacalhau e exposição solar (MARTINS E SILVA, 2007).
Os estudos clássicos de Edward Mellanby e Elmer McCollum estabeleceram irrevogavelmente as propriedades antirraquíticas do óleo de fígado de bacalhau. Esses dois pesquisadores relacionaram a propriedade antirraquítica do óleo de fígado de bacalhau ao que eles chamaram de gordura solúvel A, já caracterizada na época como vitamina A (presente em altas concentrações nesse óleo) ou a alguma outra substância similar ali presente. Para comprovar sua hipótese, em 1922, McCollum aqueceu o óleo de fígado de bacalhau e observou que, em modelo experimental, o óleo perdia sua proteção contra a deficiência de vitamina A, especificamente contra a secura na conjuntiva e córnea (xeroftalmia) e o amolecimento da córnea (queratomalácia), mas reteve sua função antirraquítica. Sendo assim, McCollum denominou esse fator antirraquítico presente no óleo de fígado de bacalhau de vitamina D, pois era o quarto na sequência de descoberta das vitaminas (WOLF, 2004; RAJAKUMAR et al, 2007).
A partir de 1923, estudos demonstraram a importância das propriedades antirraquíticas da vitamina D, no entanto a natureza química da vitamina D ainda estava por ser determinada (RAJAKUMAR et al, 2007). Em 1925, o grupo do pesquisador Alfred Hess demonstrou que o
fitosterol obtido a partir de óleo de semente de algodão e colesterol obtido a partir do tecido cerebral de ratos podiam ter atividade antirraquítica após irradiação ultravioleta. Diante dessa descoberta, eles elaboraram a hipótese de que a irradiação ultravioleta dos raios solares e fontes artificiais ativariam o colesterol na pele para torná-lo antirraquítico.
Os estudos subsequentes mostraram que o precursor da vitamina D no colesterol, era na verdade um contaminante e não uma parte do colesterol purificado (WOLF, 2004; RAJAKUMAR et al, 2007). Em 1927, Rosenheim e Webster confirmaram que o ergosterol era uma provitamina D, depois convertida na forma ativa por irradiação. E em 1931, pesquisadores isolaram, purificaram, cristalizaram, identificaram e deduziram a estrutura do ergosterol irradiado, depois denominada vitamina D2 (ou calciferol), cuja estrutura veio a ser estabelecida em 1936 por Windaus e Thiele (WOLF, 2004; MARTINS e SILVA, 2007).
Por outro lado, acreditava-se que o fator precursor da vitamina D em animais ou seres humanos deveria ser diferente do ergosterol, porque esse esterol é distribuído apenas em plantas e fungos. De fato, em 1934, J. Waddell demonstrou que o precursor da vitamina D no óleo de fígado de bacalhau, como também o colesterol não purificado irradiado obtido do cérebro de ratos, eram diferentes do ergosterol. Windaus e F. Bock identificaram o precursor da vitamina D (7-desidrocolesterol) na pele de animais. (RAJAKUMAR et al, 2007).
Apenas na segunda metade do século 20, a forma ativa da vitamina D3 ou 1,25-di-hidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3), foi descoberta. Lawson e colaboradores (1971) relataram que a 25-hidroxivitamina D3 (25OHD3) ou vitamina D3 inativa, é hidroxilada pelo rim antes de atuar como um hormônio nos tecidos-alvo, sugerindo dessa forma a estrutura desse metabólito. (NISHII e OKANO, 2004).
Estudos moleculares posteriores definiram que na realidade essa vitamina é um pró-hormônio (ALTHOFF et al, 2009). A síntese da vitamina D ativa ou calcitriol (1,25(OH)2D3) se inicia na pele, onde ocorre a fotólise da 7-dehidrocolesterol (7-DHC) para formar a vitamina D3 inativa (Figura 2). Esta forma pode ainda ser obtida através de alimentos como ovos, fígado e peixes (BERRIDGE, 2015). Estima-se que cerca de 30 minutos de exposição ao sol no verão são necessários para a reação fotolítica na pele, essencial para a síntese da vitamina D. A vitamina D inativa possui duas formas: D2 ou ergocalciferol e D3 ou colecalciferol. As duas formas são utilizadas na suplementação vitamínica e podem ser obtidas através da alimentação, no entanto apenas a vitamina D3 pode ser obtida a partir da radiação solar (HOLICK, 2005).
Figura 1: Linha do tempo dos estudos relacionados com a vitamina D
Fonte: Próprio autor
A vitamina D inativa se liga a proteínas de transporte na pele, particularmente a proteína de ligação à vitamina D (DBP) (BANERJEE et al, 2015). Após, é transportada para o fígado e será hidroxilada pela D-25 hidroxilase, formando outra forma da vitamina D inativa, a 25(OH)D3 (calcidiol), uma vez que o grupo hidroxil é acrescentado no carbono 25. Ocorrerá subsequentemente uma segunda hidroxilação pela 1- α hidroxilase no rim e em outros tipos celulares, formando a 1,25(OH)2D3 (calcitriol)(BERRIDGE, 2015). Já estão bem descritos os benefícios que a vitamina D, obtida através de diversos alimentos e do sol, acarretam para o indivíduo, sendo as concentrações desta vitamina mais baixas nos indivíduos negros devido à maior pigmentação da pele (HOLICK, 2005).
Sabe-se que a vitamina D ativa é sintetizada em diversos tecidos, tais como mama, pele, próstata, linfonodos, cólon, pâncreas, medula da suprarenal, cérebro e placenta (HÖBAUS et al, 2013) uma vez que a enzima que a produz está presente nestes tecidos, sendo a mesma de grande importância para a função biológica local da vitamina D3. A síntese de vitamina D através da pele é bastante variável e depende da pigmentação da pele, latitude, estação do ano, vestuário, idade, uso de protetor solar e condições meteorológicas locais (HOLICK, 2005).
A síntese do calcitriol precisa ser regulada por diversos fatores devido à importância da vitamina em diversos processos celulares. O cálcio da dieta atua alterando as concentrações dos hormônios da paratireoide, regulando dessa forma, a síntese da vitamina D. Esta contribui para o aumento do cálcio e fosfato no sangue através do estímulo da atividade dos osteoclastos e da excreção do fosfato respectivamente. Além disso a 1-α-hidroxilase do rim pode ser inibida pelo fósforo, pela acidose metabólica crônica, por altas concentrações de cálcio na circulação e pelo fator 23 de crescimento dos fibroblastos, os quais são capazes de diminuir a expressão do gene da enzima e suprimir o paratormônio por meio do AMPc (INDA FILHO e MELAMED, 2013).
Conhece-se também que um excesso da proteína Klotho, a qual será abordada mais adiante, inibe a síntese da vitamina D no rim e em outros tecidos (BERRIDGE, 2015).
Além disso, CYP27B1, uma das variantes resultantes do splicing alternativo do RNA mensageiro que codifica a vitamina D, pode regular a síntese da vitamina D. Houve uma associação entre a desregulação da expressão desta variante com o desenvolvimento de neoplasias. Outro splicing alternativo, o CYP24A1-SV, também parece desempenhar um papel fundamental na síntese da vitamina D, atenuando a conversão endógena de 25(OH)D3 para 1,25(OH)2D3. Neste contexto, o splicing CYP24A1-SV foi detectado em células neoplásicas, podendo o mesmo estar envolvido no metabolismo dos macrófagos (ZHOU et al, 2015).
Figura 2: Síntese e regulação da síntese da vitamina D ativa
Fonte: Próprio autor
1.2 Funções da vitamina D
Após a 1α-25-di-hidroxivitamina D3 (vitamina D ativa) ser sintetizada, a mesma será capaz de atuar através de um receptor nuclear para exercer suas diversas funções no metabolismo celular, incluindo a absorção de cálcio e de fosfato no intestino, a mobilização de
cálcio no osso e a reabsorção deste íon no rim. Além de participar diretamente na homeostase do cálcio, a vitamina D possui diversas outras funções (ver Tabela 1) (DELUCA, 2004). Tabela 1 - Funções descritas da vitamina D
Funções da Vitamina D
Participa da síntese de antioxidantes (BERRIDGE, 2015) Absorção de cálcio e de fosfato no intestino (DELUCA, 2004)
Mobilização de cálcio no osso (DELUCA, 2004) Reabsorção de cálcio no rim (DELUCA, 2004)
Regulação do sistema imune e sistema nervoso (INDA FILHO e MELAMED, 2013) Controle da diferenciação e crescimento celular (INDA FILHO e MELAMED, 2013)
Regulação da secreção de insulina (INDA FILHO e MELAMED, 2013) Controle da hipertrofia dos miócitos cardíacos (INDA FILHO e MELAMED, 2013)
Regulação da pressão sanguínea (INDA FILHO e MELAMED, 2013) Regula o eixo cálcio-fósforo-PTH (INDA FILHO e MELAMED, 2013)
Participa na remodelação vascular (SANTORO et al, 2016) Possui propriedades anti-inflamatórias (CAPOLONGO et al, 2016) Partcipa indiretamente do ciclo celular e adesão celular (BERRIDGE, 2015)
Participa indiretamente da apoptose e autofagia (BERRIDGE, 2015) Participa indiretamente da remodelação da actina (BERRIDGE, 2015)
Participa indiretamente da endocitose (BERRIDGE, 2015) Participa indiretamente da orientação axonal (BERRIDGE, 2015)
O receptor da vitamina D (VDR) interage com o receptor retinoide X (RXR) para formar um heterodímero que se liga ao elemento responsivo da vitamina D, ativando a transcrição de diversos genes e reprimindo a transcrição de alguns outros (Figura 3) (BERRIDGE, 2015).
Figura 3: Ação genômica da vitamina D e suas principais funções.
Legenda: Vit. D – Vitamina D; VDR – Receptor da Vitamina D; RXR – Receptor Retonóide X; ERVD – Elementos Responsivos da Vitamina D
Fonte: Próprio autor
O heterodímero VDR/RXR recruta acetiltransferases histonas como P300/CBP e receptores esteroidais coativadores, que abrem a estrutura da cromatina para facilitar a transcrição. Já a metilação das ilhas CpG, localizadas próximas às regiões promotoras, pode silenciar muitos genes. Tal metilação ocorre de maneira aumentada no envelhecimento, estando associada a diversas doenças. Portanto a vitamina D mantém a estabilidade de vias de sinalização da célula induzindo o recrutamento de acetiltransferases e a expressão de desmetilases (BERRIDGE, 2015).
Atualmente se sabe que a vitamina D interage com o epigenoma através da metilação do DNA, acetilação de histona e geração de micro RNAs para manter as funções biológicas normais, possuindo efeitos sobre o proteoma e transcriptoma. Além disso, modificações epigenéticas são conhecidas por desempenhar um papel fundamental na manutenção da expressão do gene VDR e a desregulação destes mecanismos pode levar a condições patológicas. (ZHOU et al, 2015)
Além disso, estudos recentes demonstraram a participação dos microRNAs no ajuste fino de respostas mediadas pela vitamina D, já que são capazes de regular a síntese e o catabolismo da vitamina em questão. Por outro lado, o VDR pode suprimir ou induzir
microRNAs por qualquer regulação transcricional direta. A vitamina D e proteínas que interagem com o VDR podem estar envolvidas na regulação do splicing alternativo, e co-ativadores e co-repressores do VDR podem funcionar como fatores de splicing do RNA da vitamina D. Tal splicing alternativo pode estar associado com a fisiologia do organismo e com doenças humanas (ZHOU et al, 2015).
Os receptores da vitamina D (VDR) e a enzima α-1-hidroxilase estão presentes em várias localizações, tais como intestino, túbulos renais, osso, pâncreas, pele, cérebro, próstata, mama, cólon, células do sistema imune, células hematopoiéticas e células musculares (HOLICK, 2007; WANG et al, 2008; MANDARINO et al, 2015). Estes receptores são essenciais para que a vitamina D exerça sua função em diferentes tecidos e regule a síntese de diferentes proteínas. A vitamina D regula a expressão de componentes que operam nos processos de ciclo celular, apoptose, autofagia, remodelamento de actina, adesão celular, endocitose e orientação axonal (ZHOU et al, 2015). Regulando desta maneira o sistema imune, o sistema nervoso, a secreção de insulina, a hipertrofia de miócitos cardíacos, a pressão sanguínea, controlando a diferenciação e crescimento celular e regulando o eixo cálcio-fósforo-PTH, entre outras funções (INDA FILHO e MELAMED, 2013)(Tabela 1).
Considera-se também a vitamina D como um importante agente antienvelhecimento devido à sinalização para a síntese de antioxidantes (BERRIDGE, 2015). Além disso, a vitamina D possui um papel na remodelação vascular, o qual é mediado pela ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona, proliferação celular e vias celulares anti-apoptóticas. A vitamina D diminui a expressão do receptor de angiotensina 2 na superfície das células endoteliais, resultando na síntese de vasodilatadores (SANTORO et al, 2016), como também apresenta propriedade anti-inflamatória (CAPOLONGO et al, 2016).
Figura 4: Funções da vitamina D
Fonte: Próprio autor
1.3 A deficiência da vitamina D
Levando em consideração que a vitamina D exerce importantes funções em nosso organismo, é importante ressaltar alguns aspectos sobre a deficiência deste metabólito. Estima-se que mais de 50% dos idosos do mundo não possuem concentrações satisfatórias da vitamina D (MITHAL et al, 2009) e mais de 1 bilhão de pessoas no mundo apresentam insuficiência ou deficiência desta vitamina (NAEEM, 2010). Aproximadamente 50% dos participantes de um estudo realizado por um grupo de pesquisadores americanos possuíam baixas concentrações da vitamina e esta deficiência foi observada em 30 a 50% das crianças e adultos na Arábia Saudita, Austrália, Turquia, Índia e Líbano (ALFAWAZ et al, 2014). Estudos realizados em outros países, incluindo o Brasil, envolvendo pacientes de diferentes idades e incluindo também pacientes grávidas, revelaram que as concentrações da vitamina estavam abaixo de 30 ng/ml (75 nmol/L) em muitos dos pacientes (VAN SCHOOR e LIPS, 2011). Denotando um quadro
de insuficiência/deficiência, já que as concentrações adequadas são de 75/80 a 125 nmol/L (MARQUES et al, 2010).
Nos laboratórios brasileiros há divergências em relação a concentração normal da vitamina D. Alguns laboratórios por exemplo, consideram os valores normais entre 30 a 60 ng/ml (75 a 180 nmol/L), enquanto outros, entre 30 a 100 ng/ml (75 a 190 nmol/L). No entanto a maioria deles consideram um indivíduo deficiente de vitamina D quando as concentrações são inferiores a 30 ng/ml (75nmol/L). Alguns laboratórios ainda determinam um estado de insuficiência (mais brando que a deficiência), um estado limítrofe e um estado elevado do calcitriol. De acordo com o Ministério da Saúde, o valor de referência varia conforme a técnica utilizada para a medida, mas valores superiores à 75 nmol/L ou 30 ng/mL são considerados como necessários para maximizar os efeitos benéficos da vitamina D na saúde (MAEDA et al, 2014). De acordo com o ministério da saúde, as necessidades diárias de vitamina D são de 600 UI/dia para indivíduos até 70 anos e 800 UI/dia para indivíduos acima de 70 anos.
Fatores ambientais, hormonais, genéticos e nutricionais influenciam a concentração sérica da vitamina D (ALVES et al, 2013). De acordo com o Ministério da Saúde, 80% da necessidade diária pode ser adquirida pela exposição habitual ao sol. O Ministério da Saúde recomenda, além de consumir alimentos como leite, fígado e peixe, garantir a exposição solar de quinze a vinte minutos pelo menos três vezes por semana, sem protetor solar, até às dez horas da manhã ou após as quatro da tarde, para que as concentrações de vitamina D sejam satisfatórias (HOLICK, 2005).
É importante ressaltar a participação da vitamina D na mineralização óssea, e, portanto, na prevenção da osteoporose, osteomalácia e raquitismo. Porém a deficiência do calcitriol está associada com diversas outras patologias (Tabela 2) tais como doenças cardiovasculares, hipertensão, neoplasias, diabetes, esclerose múltipla, demência, artrite reumatoide e doenças infeciosas (HOLICK, 2005). Além disso, pelo fato da vitamina D atuar na homeostase do Cálcio, a deficiência da mesma está relacionada diretamente com a diminuição da cognição em pacientes idosos, perda da memória e diversas outras doenças ósseas e não ósseas (BERRIDGE, 2015). Por exemplo, a sinalização alterada do receptor da vitamina D têm sido demonstrada em pacientes com distúrbios cardíacos e com doença renal crônica (SANTORO et al, 2016). A presença do VDR nas células imunes pode justificar a prevalência de doenças autoimunes associadas com a deficiência da vitamina D e a suplementação com esta vitamina no controle dessas doenças. O VDR regula diversos genes de células mielóides, assim como está envolvido em vias moleculares importantes na manutenção da tolerância celular (BOOTH et al, 2016). Os
efeitos que podem resultar da deficiência do calcitriol podem variar de acordo com o sexo, idade, população e grau de deficiência desta vitamina (HOOSHMAND et al 2014).
Tabela 2 - Algumas doenças/grupo de doenças relacionadas à deficiência da vitamina D
Deficiência da vitamina D Referências
Doenças ósseas Evidência experimental – Humanos (TAHIR et al, 2016; SAFER et al, 2016; BALIOGLU et al, 2016; GOZDZIALSKA et al, 2016) Evidência experimental – Ratos (HASHEMIAN et al, 2015)
Evidência experimental – Cultura de células (WEGLER et al, 2016) Neoplasias Evidência experimental – Humanos (AHMAD et al, 2016;
DINIOTIS et al, 2015)
Evidência experimental – Cultura de células (WIERZBICKA et al, 2015; ABDELBASET-ISMAIL et al, 2016; PENG et al, 2016) Esclerose Múltipla Evidência experimental – Humanos (BROLA et al, 2016;
KARAMPOOR et al, 2016; MURIS et al, 2015;FITZGERALD et al, 2015)
Evidência experimental – Camundongos (GU et al, 2015)
Cardiomiopatias Evidência experimental – Humanos (WITTE et al, 2016; SKULADOTTIR et al, 2016;KRAUSE et al, 2016; BELEN et al, 2015)
Evidência experimental – Macacos (MCCURDY et al, 2016) Evidência experimental – Ratos (FAN et al, 2015)
Diabetes mellitus Evidência experimental – Humanos (SENTINELLI et al, 2016; ANYANWU et al, 2016; BASIT et al, 2016)
Evidência experimental – Ratos (PARK et al, 2016; JAYANARAYANAN et al, 2015)
Alzheimer Evidência experimental – Humanos (YEŞİL et al, 2015; CHAVES et al, 2013)
Evidência experimental – Ratos (TAGHIZADEH et al, 2014; TAGHIZADEH et al, 2011)
Evidência experimental – Camundongos (DURK et al, 2014) Parkison Evidência experimental- Humanos (WANG, Juan et al, 2016;
WANG, Liyong et al, 2016; MOGHADDASI et al, 2013; WANG et al, 2015)
Evidência experimental – Camundongo (KIM et al, 2006)
Artrite Reumatóide Evidência experimental – Humanos (YANG et al, 2015; CHANDRASHEKARA e PATTED, 2015;GULLO et al, 2015). Evidência experimental – Cultura de células, humanos (WEN H et al, 2015)
Doenças renais Evidência experimental – Humanos (KO et al, 2016;KENDRICK et al, 2012; NAVANEETHAN et al, 2011; MEHROTRA et al, 2009; TENG et al, 2005)
Doenças infecciosas Evidência experimental – Humanos (LAAKSI et al, 2007; MANASEKI‐HOLLAND et al, 2010; GINDE et al, 2009; AVENELL et al, 2007;TRAN et al, 2014)
Evidência epidemiológica (GRANT e GIOVANNUCCI, 2009) Doenças hepáticas Evidência experimental- Humanos (CHUNG et al, 2016;
FINKELMEIER et al, 2014; FEDIRKO et al, 2014) Evidência experimental – Ratos (VUICA et al, 2015)
Evidência experimental – Cultura de células (HUANG et al, 2016) Doenças da tireóide Evidência experimental – Humanos (BARCHETTA et al, 2015;
MA et al, 2015; METWALLEY et al, 2016; KRYSIAK et al, 2016; YASUDA et al, 2012).
Em indivíduos idosos há uma diminuição na conversão de 25 hidroxicolecalciferol (25(OH)D3) em 1,25 di-hidroxicolecalciferol (1,25(OH)2D3) especialmente em mulheres pós menopausa, tendo em vista a deficiência de estrógeno (RIBEIRO et al, 2003). Além disso, reduz-se a quantidade dos receptores da vitamina D no intestino, (RIBEIRO et al, 2003) diminuindo as concentrações plasmáticas de cálcio e de fosfato uma vez que o VDR no intestino é importante para a absorção destes íons.
De fato, o envelhecimento pode ser associado a vários processos regulados pela vitamina D. Entre eles, modificações nas transcrições dos genes, declínio na manutenção do metabolismo energético mitocondrial e nas defesas antioxidantes, desestabilização nas vias de sinalização de cálcio, redox e mTORC1 (com aumento da atividade desta proteína), formação de espécies reativas de oxigênio, além da diminuição da capacidade da pele humana de sintetizar vitamina D (ver Tabela 3). Além disso, a deficiência da vitamina D resulta na desregulação da homeostase do cálcio, repercutindo nos potenciais de ação, os quais são encerrados mais cedo, característica do envelhecimento. Por fim, o aumento do cálcio intracelular estimula a calcineurina, indutora da perda de memória. Sendo assim, segundo BERRIDGE (2015), o tratamento com a vitamina D poderia reverter a desregulação de cálcio neuronal comum nos idosos (BERRIDGE, 2015).
Tabela 3 - Características do envelhecimento associadas à deficiência da vitamina D
Características do envelhecimento associadas à deficiência da vitamina D Diminuição na função renal
Alterações do metabolismo energético mitocondrial Redução nas defesas antioxidantes
Desestabilização nas vias de sinalização de cálcio, redox e mTORC1 Potenciais de ação encerrados mais cedo
Aumento do Cálcio intracelular Modificações nas transcrições dos genes
Redução na quantidade de receptores da vitamina D no intestino Diminuição das funções celulares
Aumento da metilação das ilhas CpG Fonte: Adaptado de BERRIDGE, 2015
1.4 A vitamina D e suas propriedades antioxidantes
Nesse contexto, a deficiência da vitamina D deve ser levada em consideração devido à sua relação com o estresse oxidativo celular, uma vez que esta vitamina é capaz de exercer algumas propriedades antioxidantes. O ambiente interno das células é normalmente muito reduzido, o que é fundamental para a função celular normal e sua sobrevivência. Qualquer mudança a um estado oxidado pode levar a um dano por estresse oxidativo e assim, à disfunção de vários processos celulares, uma vez que há um grande número de proteínas que são sensíveis à oxidação (BHATTACHARYYA et al, 2014). O efeito neuroprotetor desempenhado pela vitamina D por exemplo, pode ser explicado por diferentes mecanismos, entre eles, mecanismos antioxidantes e desintoxicantes (GARCION et al, 1997). A vitamina D exerce efeitos protetores contra espécies reativas de oxigênio e de óxido nítrico, podendo impedir danos oxidativos(LIN et al, 2005).
A presença suficiente de vitamina D pode impedir lesões oxidativas induzidas pelo zinco através de mecanismos antioxidantes (GARCION et al, 1997). Além disso, essa vitamina é responsável pela regulação da expressão da gama-glutamil transpeptidase (g–GT), o que
contribui para a síntese da glutationa reduzida (GSH) (LIN et al, 2005), que é essencial para a atividade da glutationa peroxidase (Gpx), a qual faz parte do sistema de defesa antioxidante enzimático celular (Figura 5). A vitamina D também aumenta a atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), cisteína glutamato ligase e glutationa redutase; aumentando, pois, a formação do grande tampão redox GSH(BAO et al, 2008; JAIN e MICINSKI, 2013)
A vitamina D também atua indiretamente na síntese de antioxidantes regulando a expressão das proteínas Klotho e Nfr2 (fator nuclear eritroide 2), que por sua vez são importantes para a função normal da via de sinalização das espécies reativas de oxigênio (ver Figura 3). A vitamina D, agindo em conjunto com Klotho e Nfr2, regula a expressão de muitos dos sistemas antioxidantes, os quais impedem o estresse oxidativo através da remoção das espécies reativas de oxigênio e da reversão das mudanças oxidativas que ocorrem normalmente (BHATTACHARYYA et al, 2014).
Nfr2 é um fator de transcrição sensível a estresse, que responde as espécies reativas de oxigênio, ativando muitos genes que codificam enzimas antioxidantes e detoxificantes (BOBILEV et al, 2011; HAYES e DINKOVA-KOSTOVA, 2014). Quando os níveis de espécies reativas de oxigênio sobem em resposta ao estresse celular, Nfr2 entra para o núcleo e se liga ao elemento de resposta antioxidante. Isto resulta em um aumento da expressão de diferentes genes e na síntese de antioxidantes e enzimas detoxificantes, especificamente Catalase, Glicose-6-Fosfato desidrogenase, Glutationa reduzida, Glutationa peroxidasse, Superóxido Desmutase 1 e 2 (antioxidantes), Álcool desidrogenase, carbonil desidrogenase, citocromo P450, prostaglandina redutase e NADPH (desintoxicantes) (Figura 5). Na ausência de estresse celular e espécies reativas de oxigênio, a atividade de Nfr2 é reprimida (LEE et al, 2012;TSAI et al, 2011). Nesse contexto, Nfr2 permanece ligada à proteína Keap 1, não entra no núcleo e é marcada para degradação (MITSUISHI et al, 2012).
Figura 5: Propriedades antioxidantes da vitamina D
Legenda: ER0 – Espécies reativas de oxigênio. Zn – Zinco. DO – Dano oxidativo. CAT- Catalase. SOD – Súper. óxido desmutase. PRX – Peroxirredoxina. Trxrd – Tireodoxina Redutase. GGT – Gama Glutamil Transpeptidade. G6PD – Glicose 6 fosfato desidrogenase. GR – Glutationa Redutase. CGL – Cisteína Glutamato Ligase. GSH – Glutationa Reduzida. ERA – Elemento responsivo a antioxidantes. Pol II – Polimerase 2. GPX – Glutationa peroxidase
Fonte: Próprio autor
A habilidade de Klotho de prevenir o envelhecimento e o estresse oxidativo pode depender da inibição da via insulina/IGF1 (fator de crescimento semelhante a insulina), resultando na ativação do FOXO, que regula a expressão de enzimas antioxidantes, tais como a Catalase e a Superóxido Desmutase mitocondrial (KUROSU et al, 2005; YAMAMOTO et al, 2005; URAKAWA et al, 2006). Klotho também pode suprimir o envelhecimento e estresse oxidativo aumentando a expressão de peroxirredoxinas (PRX-2 e PRX-3) e tiredoxina redutase 1 (TRXRD 1), que atuam em conjunto para reduzir as espécies reativas de oxigênio (ZELDICH et al, 2014). A deficiência da vitamina D pode ativar o receptor RAGE (receptor para os produtos finais de glicação avançada). O receptor RAGE aumenta o estresse oxidativo pela ativação da NADPH oxidase, o que induz a formação de espécies reativas de oxigênio. (BHATTACHARYYA et al, 2014).
A vitamina D pode ter propriedades antioxidantes através da modificação de algumas das enzimas antioxidantes. A suplementação com a vitamina D pode melhorar o controle
glicêmico e o estresse oxidativo na diabetes mellitus tipo 2 (SAIF-ELNASR et al, 2017). Outro estudo sugere que o efeito benéfico do calcitriol ocorre diretamente através de mecanismos antioxidantes e não através da expressão gênica. Neste, é demostrado que a homocisteína prejudica a função mitocondrial e induz mudanças no estado redox no tecido cardíaco, as quais foram revertidas pelo calcitriol (LONGONI et al, 2017). Halicka e colaboradores (2012) relataram uma série de experiências que demostram que vitamina D ativada é tanto um antioxidante natural quanto ajuda a reparar o DNA danificado.
Por fim, a vitamina D é atribuída à prevenção de doenças crônicas, como a doença renal crônica, através da regulação do estresse oxidativo, da supressão da NADPH oxidase e da indução da expressão de moléculas envolvidas no sistema de defesa antioxidante, especificamente glutationa reduzida, glutationa peroxidase, superóxido dismutase. A 25-di-hidroxi-colecalciferol pode ser semelhante a um antioxidante da membrana, no entanto, há poucos estudos in vivo que examinaram esta hipótese (MOKHTARI et al, 2017). As várias propriedades antioxidantes da vitamina D são mostradas na tabela 4 abaixo.
Tabela 4 – Possíveis propriedades antioxidantes da vitamina D
Propriedades antioxidantes da vitamina D
Impede lesões oxidativas induzidas pelo zinco (GARCION et al, 1997) Regula a expressão da gama-glutamil transpeptidase (LIN et al, 2005)
Aumenta a atividade da glicose-6-fosfato desidrogenasse, cisteína glutamato ligase e glutationa redutase (BAO et al, 2008; JAIN e MICINSKI, 2013)
Contribui indiretamente para a síntese da glutationa reduzida (LIN et al, 2005; BAO et al, 2008; JAIN e MICINSKI, 2013)
Regula a expressão das proteínas Klotho e Nfr2 oxidação (BHATTACHARYYA et al, 2014) Importante para a função normal da via de sinalização das espécies reativas de oxigênio oxidação
(BHATTACHARYYA et al, 2014)
Regula indiretamente a expressão de enzimas antioxidantes e detoxificantes (BHATTACHARYYA et al, 2014; LEE et al, 2012;TSAI et al, 2011; ZELDICH et al, 2014)
Suprime a expressão de NADPH oxidase (MOKHTARI et al, 2017)
A deficiência da vitamina D é um problema epidemiológico crescente, pois acomete um grande número de indivíduos no mundo, tornando-os susceptíveis a uma série de distúrbios funcionais e metabólicos, tais como a insuficiência renal, diabetes do tipo I, cardiomiopatias e doença de Alzheimer (BERRIDGE, 2015; HOLICK, 2005; MITHAL et al, 2009). Diferentemente do observado para as vitaminas A, C e E, por exemplo, poucos trabalhos correlacionam a vitamina D com o dano oxidativo celular, de forma a sugerir uma teórica propriedade antioxidante. Na verdade, apesar dos estudos pré-clínicos sobre esse tema serem bastante encorajadores, até o presente momento há uma quantidade demasiada de informações conflitantes na literatura científica. Nessa perspectiva, esse trabalho contribuirá com evidências adicionais a respeito da participação da vitamina D e da incidência solar no estresse oxidativo e doenças conhecidas.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
O objetivo deste trabalho é avaliar a relação entre a deficiência da vitamina D, o dano oxidativo celular e as doenças apresentadas por pacientes do Hospital do Coração (Natal/RN).
2.2 Objetivos Específicos
1 Determinar a concentração da vitamina D dos pacientes recrutados no Hospital do Coração;
2 Quantificar a peroxidação lipídica e a oxidação proteica e correlacionar com os níveis de vitamina D dos pacientes participantes;
3 Avaliar as relações ente os níveis de vitamina D, exposição solar, alimentação e idade dos pacientes participantes;
4 Relacionar os níveis de vitamina D com a presença de doenças específicas em cada paciente participante;
5 Averiguar a influência da incidência solar anual na taxa de mortalidade por doenças extra ósseas em 172 países, para os quais os dados estavam disponíveis em repositórios online.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
Ácido tricloroacético P.A-ACS, ácido clorídrico P.A-ACS (Dinâmica, química contemporânea Ltda.), dodecilsulfato de sódio (Reagen, Quimibrás Industrias Químicas S.A), ácido fosfórico P.A-ACS, 2,4-dinitrofenilhidrazina, ácido 2-tiobarbitúrico, butil hidroxitolueno (Sigma-Aldrich), acetato de etila (Synth) e Hidrocloreto de Guanidina (Uniscience).
Triagem dos participantes
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) com Seres Humanos da UFRN (No. 67240817.3.0000.5537). Os pacientes convidados a participar do projeto foram os que se submeteram a dosagem da vitamina D no Hospital do Coração (HCOR/Natal/RN/Brasil). Foi necessário que os pacientes que aderiram a participação na pesquisa, assinassem um termo de consentimento livre e esclarecido, assim como preenchessem um questionário (APÊNDICE A), o qual inclui as informações a respeito da: idade, exposição solar, alimentação e presença de doenças,. No total, 212 pacientes não internados participaram do estudo, sendo 157 mulheres e 55 homens. As idades dos pacientes variaram entre 13 e 97 anos. Para a quantidade de pacientes recrutados para a pesquisa, a força da amostra foi de 99%, de acordo com o G power.
Coleta das amostras
As amostras de sangue periférico foram coletadas por venopunção após o consentimento dos pacientes pelos profissionais do Hospital do Coração durante a realização dos exames de rotina. Amostras de 4 ml de sangue foram colhidas em tubos sem anticoagulante para a dosagem da vitamina D e os outros 4 ml em tubos contendo o anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para a medição dos danos oxidativos celulares.
Dosagem da vitamina D
O sangue colhido para os tubos sem EDTA foi enviado ao laboratório Álvaro (Belo Horizonte/MG) para dosagem da vitamina D. Neste laboratório, a dosagem foi realizada através
do Imunoensaio Quimioluminescente de Micropartículas - CMIA, utilizando os soros dos pacientes. Os resultados da dosagem foram fornecidos pelo Hospital do Coração (Natal/RN).
Na pesquisa foi considerado o metabólito 25-hidroxivitamina D3 (25OHD3) por ser o mais abundante e mais estável, seus níveis circulantes refletem diretamente a Vitamina D ingerida e/ou sintetizada na pele. Foram considerados deficientes/insuficientes da Vitamina D, os pacientes que apresentaram concentrações inferiores a 29,9 ng/mL (grupo experimental). Entre 30 a 100 ng/mL, são concentrações consideradas suficientes (grupo controle) (HOLICK et al, 2011). Não foi considerada a 1,25(OH)2D, pois esta tem concentração no sangue 1.000 vezes menor do que o seu precursor, a 25 Hidroxi vitamina D (25OHD) e meia vida curta, não sendo indicada na avaliação de suficiência de vitamina D (BROOKS et al, 1978).
Armazenamento e transporte das amostras
Logo após a coleta, os tubos com EDTA contendo as amostras dos participantes da pesquisa foram transportados em caixa térmica, sob refrigeração (2°- 6º C), seguindo as normas de biossegurança, até o Laboratório de Química e Função de Proteínas Bioativas do Prof. Dr. Elizeu Antunes da Silva, no Departamento de Bioquímica do Centro de Biociências da UFRN, onde foram, então, armazenados em geladeira até o momento da centrifugação. As amostras não permaneceram armazenadas durante mais do que duas horas.
Medição dos marcadores de estresse oxidativo celular
A peroxidação lipídica mediada por espécies reativas de oxigênio é um dos principais contribuintes para o estresse oxidativo (HUUN et al, 2017). O malondialdeído (MDA) é um dos produtos finais da peroxidação de ácidos graxos poliinsaturados nas células, de forma que um aumento nos radicais livres causa superprodução de MDA no organismo. O nível de malondialdeído é comumente conhecido como marcador de dano oxidativo nas células e tecidos (GAWEŁ et al, 2004). Diante disto, a medição do MDA foi realizada utilizando o método TBARS (GROTTO et al 2008). A medição do grupo carbonila de proteínas após sua derivatização com Dinitrofenilhidrazina (DNPH) é a medida mais amplamente utilizada de oxidação protéica. Grupos carbonilas como biomarcadores de estresse oxidativo tem algumas vantagens em comparação com a medição de outros produtos de oxidação devido à estabilidade relativa das proteínas carboniladas (DALLE-DONNE et al, 2003). Comumente, inclusive no presente trabalho, o conteúdo de proteínas modificadas oxidativamente (carboniladas) foi
determinado, espectrofotometricamente, pela formação de derivados proteínas-hidrazonas, usando a 2,4-dinitrofenilhidrazina, conforme protocolo descrito por Quinlan e Gutteridge (2000) (QUINLAN e GUTTERIDGE, 2000).
a) Medição do malondialdeído:
Inicialmente as amostras de sangue foram centrifugadas a 1500 x g (raio do rotor – 9,5 cm), por 10 minutos, a 4ºC. A um volume de 200µL do plasma foi adicionado 18,11 µL de ácido fosfórico (H3PO4) 85% diluído em um volume total de 1100 µL de solução, 0,4 mg do antioxidante butil hidroxitolueno (BHT) dissolvido em 20 µL de etanol 80% e 2,94 mg de ácido 2-tiobarbitúrico (TBA) 98% dissolvido em 500 µL de água destilada. As amostras foram incubadas durante 45 minutos à 90°C e nestas foi adicionado 17,4 mg de dodecilsulfato de sódio 90% dissolvido em 200 µL de água destilada. Posteriormente as amostras foram homogeneizadas e centrifugadas a 3000 x g por 10 minutos. Após a centrifugação foi realizada a leitura da absorbância a 532 nm no espectrofotômetro Ultrospec 2100 pro. A quantidade de lipídeos que reagem com o TBA foi calculada utilizando a fórmula: A532nm = ε b c. O valor do coeficiente de extinção molar (ε) utilizado foi 1,56.105M-1cm-1 e o caminho óptico da cubeta (b) foi de 1 cm. O valor obtido em mol/L foi convertido em µmol/L.
b) Medição do grupo carbonila em proteínas
Inicialmente, a um volume de 100 µL do plasma, foi adicionado 1 mg de dinitrofenilhidrazina 4,89 M dissolvido em uma solução de: 0,08 ml de ácido clorídrico 12 M e 0,42 ml de água destilada. Os tubos foram incubados a 37°C durante 90 minutos e nestes foi adicionado 0,14 ml de ácido tricloroacético 100%, diluído em 0,36 ml de água destilada. As amostras foram então agitadas durante 3 minutos e centrifugadas 3 minutos a 3830 x g. O sobrenadante foi descartado, o precipitado foi ressuspendido em 0,5 mL de acetato de etila 1:1 e centrifugado novamente por 6 minutos a 3830 x g. O sobrenadante foi novamente descartado e o precipitado foi ressuspendido em 0,5 ml de uma solução com 280 mg de hidrocloreto de guanidina 10,36 M. As amostras foram centrifugadas a 3830 x g durante 3 minutos e a absorbância foi lida na faixa dos 360 nm no espectrofotômetro Ultrospec 2100 pro. A concentração de proteínas carboniladas foi determinada utilizando a fórmula: A360nm = ε b c. O valor do coeficiente de extinção molar (ε) utilizado foi 21000 M-1cm-1 e o caminho óptico da cubeta (b) foi de 1 cm. O valor obtido em mol/L foi convertido em µmol/L.
Análises dos dados referentes à exposição solar e alimentação
Para esta análise, utilizou-se a escala de Likert. A escala de Likert é utilizada para avaliar os resultados provenientes de um questionário realizado, consistindo-se de um método capaz de medir fielmente atitudes e comportamentos das pessoas. Uma vez completado o questionário, cada elemento pode ser analisado separadamente ou, em certos casos, as respostas a um conjunto de itens de Likert podem ser somadas e obter um valor total. O valor atribuído a cada posição é aleatório e determinado pelo próprio pesquisador. Através desse resultado, podemos calcular a média, mediana ou moda, no entanto, a mediana e a moda são as métricas mais adequadas para tal análise (LIKERT, 1932).
Como mencionado, foi realizado um questionário entre os participantes da pesquisa (APÊNDICE A), incluindo informações a respeito da exposição solar e alimentação. Foi atribuída uma escala de zero a quatro que variava entre uma rara exposição solar e uma exposição ao sol diária (durante 20 minutos ou mais), respectivamente. Foi também atribuída uma escala entre 0 a 4 em relação ao consumo de alimentos ricos em vitamina D. De forma que os pacientes que consumiam qualquer um destes alimentos diariamente: Fígado, Peixe, Leite e/ou Ovos, foi lhes atribuído 4 pontos por exemplo. Em oposição aos pacientes que raramente consumiam estes alimentos, para os quais não foi lhes atribuído nenhum ponto. Os valores de ambas as escalas (os pontos) foram somados (escala geral) para se obter um valor que representasse a concentração da Vitamina D.
Seleção de dados para avaliação da relação entre a taxa de mortalidade por doenças específicas e incidência solar anual
a) Taxa de mortalidade por doenças extra ósseas
Os dados sobre as taxas de mortalidade por doença cardíaca coronariana, diabetes mellitus, doença hepática, doença renal, doença de Parkinson, câncer, esclerose múltipla e hipertensão (número de óbitos por 100.000 habitantes) foram obtidos no repositório "World Life Expectancy" (www.worldlifeexpectancy.com). "World Life Expectancy" contém dados relacionados à taxa de mortalidade por várias doenças em muitos países ao redor do mundo, o repositório possui dados de 172 países (APÊNDICE C), os quais foram utilizados na análise. Para verificar se a taxa de mortalidade por doenças específicas está relacionada com uma baixa incidência solar anual, utilizamos também dados referentes a incidência solar.
b) Incidência solar
Os dados referentes à incidência solar foram obtidos do projeto da NASA “Surface Meteorology and Solar Energy” (https://eosweb.larc.nasa.gov/cgibin/sse/grid.cgi). As coordenadas geográficas das cinco cidades mais populosas de cada país foram obtidas e a incidência solar foi pesquisada para cada cidade. A incidência solar anual de um país foi obtida pela incidência solar anual média das cinco cidades mais populosas do país. Este valor final foi relacionado com a taxa de mortalidade por determinada doença em cada país.
Análises estatísticas
O teste de Mann-Whitney foi utilizado para verificar diferenças estatísticas entre as variáveis: estresse oxidativo e concentração de vitamina D, doenças e concentrações de vitamina D, idade e estresse oxidativo, idade e concentrações de vitamina D, incidência solar /alimentação e estresse oxidativo, incidência solar e taxa de óbitos por doenças extra ósseas. O coeficiente de Spearman foi utilizado para verificar o grau de correlação entre as variáveis – estresse oxidativo, vitamina D e idade. O teste de Mann-Whitney foi aplicado devido as variáveis analisadas (não paramétricas) não possuírem distribuição normal. Dessa forma utilizamos a mediana para agrupar as variáveis estudadas. As plataformas Phyton e IBM SPSS 23.0 (Windows) foram utilizadas para estas análises e a biblioteca Bokeh (Phyton) foi utilizada para elaboração de gráficos. Um p valor menor do que 0.05 foi considerado como significante.
4. RESULTADOS
4.1 Concentrações da Vitamina D e a Peroxidação lipídica
Inicialmente investigamos a relação entre a peroxidação lipídica e as concentrações da Vitamina D de 212 pacientes. Para efetuar a análise, os pacientes foram divididos em dois grupos: aqueles que apresentaram concentrações da vitamina D suficientes, ou seja, acima ou igual à 30 ng/mL (High) e aqueles que apresentaram deficiência/insuficiência da Vitamina D, ou seja, concentrações abaixo de 30 ng/mL (Low) (Figura 6A). Dos 212 pacientes envolvidos na pesquisa, 143 pessoas apresentaram suficiência da vitamina D, enquanto que 69 apresentaram insuficiência/deficiência da Vitamina D. Ou seja, 33% dos pacientes que participaram da pesquisa não apresentaram níveis satisfatórios da vitamina D. Adicionalmente, a média da concentração da vitamina D no grupo suficiente foi de 42,14 ng/mL, enquanto que no grupo deficiente foi de 24,20 ng/mL. A média da concentração de MDA no grupo de pacientes com suficiência de vitamina D foi de 0,45 µmol/L, esta média no grupo de pacientes com deficiência/insuficiência de Vitamina D foi de 1,57 µmol/L.
Posteriormente foi calculada a mediana das concentrações do Malondialdeídeo. O valor calculado foi de 0,627 µmol/L. Os pacientes que apresentaram concentrações de MDA acima da mediana foram inseridos no grupo ‘High’, enquanto que os pacientes que apresentaram concentrações de MDA abaixo da mediana foram inseridos no grupo ‘Low’ (Figura 6B). A média da concentração de Vitamina D no grupo de pacientes com elevada concentração de MDA foi de 28,62, esta média no grupo de pacientes com baixa concentração de MDA foi de 43,97. De acordo com a Figura 6, os pacientes com elevada peroxidação lipídica, apresentaram uma concentração de Vitamina D significativamente menor do que os pacientes com baixos níveis de peroxidação lipídica.
Figura 6: A) Distribuição das concentrações do MDA (µmol/L) de pacientes com concentrações de Vitamina D superior ou igual (High, n=143) e inferior (Low, n=69) a 30 ng/mL. B) Distribuição das concentrações de Vitamina D (ng/mL) de pacientes com concentrações do MDA maior (High, n=106) e menor ou igual (Low, n=106) a 0.627 µmol/L. As caixas representam o IQR, a linha dentro representa a mediana e as linhas de baixo e de cima da caixa são o primeiro e o terceiro quartis, respectivamente. Os limites das linhas são a menor e a mais alta observação dentro de 1,5 do IQR dos quartis inferior e superior. Os pontos pretos representam os outliers. *p < 0,001 quando comparado ao grupo suficiente de vitamina D (teste de Mann-Whitney). Estatísticas e gráficos foram gerados utilizando SPSS e Bokeh (Python), respectivamente. IQR, intervalo interquartil; MDA, Malondialdeídeo.
4.2 Concentrações da Vitamina D e a Oxidação proteica
Em seguida foi investigada a relação entre as concentrações de Vitamina D e de proteínas carboniladas. Para isto, os 212 pacientes também foram divididos nos grupos suficiente e deficiente de vitamina D. A média da concentração de proteínas carboniladas no grupo de pacientes com suficiência de vitamina D foi de 23,87 µmol/L, esta média em relação aos pacientes deficientes/insuficientes de vitamina D foi de 43,74 µmol/L. Em seguida, foi calculado a mediana das concentrações de proteínas carboniladas, este valor foi de 29,37 µmol/L. Os pacientes foram novamente divididos em dois grupos: os que apresentaram concentrações de proteínas carboniladas acima da mediana (High) e aqueles que apresentaram valores abaixo ou igual a mediana (Low). A média da concentração de Vitamina D no grupo de pacientes com elevada concentração de grupo carbonila (GC) foi de 29,60 µmol/L, já no grupo com baixa concentração de GC foi de 42,99 µmol/L. Na figura 7 é
mostrado que os pacientes com elevados níveis de proteínas carboniladas apresentam uma concentração de Vitamina D significativamente menor do que os pacientes com baixos níveis de proteínas carboniladas.
Figura 7: A) Distribuição das concentrações de proteínas carboniladas (µmol/L) de pacientes com concentrações de Vitamina D superior ou igual (High) e inferior (Low) a 30 ng/mL. B) Distribuição das concentrações de Vitamina D (ng/mL) de pacientes com concentrações de GC maior (High) e menor ou igual (Low) a 29.37 µmol/L. As caixas representam o IQR, a linha dentro representa a mediana e as linhas de baixo e de cima da caixa são o primeiro e o terceiro quartis, respectivamente. Os limites das linhas são a menor e a mais alta observação dentro de 1,5 do IQR dos quartis inferior e superior. Os pontos pretos representam os outliers. *p < 0,001 001 quando comparado ao grupo deficiente de vitamina D (teste de Mann-Whitney). Estatísticas e gráficos foram gerados utilizando SPSS e Bokeh (Python), respectivamente. IQR, intervalo interquartil; GC, grupo carbonila.
4.3 Exposição solar, alimentação, vitamina D e dano oxidativo
A - Relação entre a exposição solar/alimentação e concentração de vitamina D: Uma análise da relação entre a exposição solar/alimentação e concentração de vitamina D foi realizada para sugerir evidências adicionais que a deficiência da vitamina D pode estar associada com o dano oxidativo celular. Foi calculada a mediana dos valores da escala geral (exposição solar e alimentação), o valor encontrado foi 5 (escala de Likert). Os pacientes foram divididos em dois grupos: os que apresentaram valores da escala acima da mediana (High) e abaixo (Low). Dos 212 pacientes, 132 apresentaram valores acima da mediana e 80, abaixo da
mediana. A média da concentração da vitamina D no grupo ‘High’ foi 42,13 ng/mL, enquanto que no grupo ‘Low’, 26,67 ng/mL. De acordo com a figura 8, os pacientes com elevadas concentrações de vitamina D apresentaram maior exposição solar/dieta rica em vitamina D quando comparado aos pacientes com baixos níveis de vitamina D.
Figura 8: Distribuição das concentrações de Vitamina D (ngl/mL) de pacientes com valores da escala geral (soma das escalas de exposição solar e alimentação rica em vitamina D) superior ou igual (High, n=132) e inferior (Low, n=80) a 5. As caixas representam o IQR, a linha dentro representa a mediana e as linhas de baixo e de cima da caixa são o primeiro e o terceiro quartis, respectivamente. Os limites das linhas são a menor e a mais alta observação dentro de 1,5 do IQR dos quartis inferior e superior. Os pontos pretos representam os outliers. *p < 0,001 quando comparado ao grupo ‘Low’ (teste de Mann-Whitney). Estatísticas e gráficos foram gerados utilizando SPSS e Bokeh (Python), respectivamente. IQR, intervalo interquartil;
B - Relação entre a exposição solar/alimentação e peroxidação lipídica:
Para avaliar a relação entre a exposição solar/alimentação e a peroxidação lipídica, utilizou-se a mediana dos valores da escala geral (5). A média da concentração de MDA no grupo ‘High’ foi de 0,44 µmol/L, já no grupo ‘Low’, foi de 1,44 µmol/L. De acordo com a Figura 9, os pacientes com elevada peroxidação lipídica apresentam uma exposição solar/alimentação rica em vitamina D significativamente menor do que os pacientes com baixos níveis de peroxidação lipídica.
Figura 9: Distribuição das concentrações de Malondialdeídeo (µmol/L) de pacientes com valores da escala geral (soma das escalas de exposição solar e alimentação rica em vitamina D) superior ou igual (High, n=132) e inferior (Low, n=80) a 5. As caixas representam o IQR, a linha dentro representa a mediana e as linhas de baixo e de cima da caixa são o primeiro e o terceiro quartis, respectivamente. Os limites das linhas são a menor e a mais alta observação dentro de 1,5 do IQR dos quartis inferior e superior. Os pontos pretos representam os outliers. *p < 0,001 quando comparado ao grupo ‘Low’ (teste de Mann-Whitney). Estatísticas e gráficos foram gerados utilizando SPSS e Bokeh (Python), respectivamente. IQR, intervalo interquartil.
C- Relação entre exposição solar/alimentação e oxidação proteica:
Para avaliar a relação entre exposição solar/alimentação e a oxidação proteica, também foi utilizada a mediana dos valores da escala geral. A média da concentração de GC no grupo ‘High’ foi de 24,25 µmol/L, já no grupo ‘Low’, foi de 40,37 µmol/L. De acordo com a figura 10, os pacientes com elevada oxidação proteica apresentaram exposição solar/alimentação rica em vitamina D significativamente menor do que os pacientes com baixos níveis de oxidação proteica.
Figura 10: Distribuição das concentrações de proteínas carboniladas (µmol/L) de pacientes com valores da escala geral (soma das escalas de exposição solar e alimentação rica em vitamina D) superior (High, n=132) e inferior ou igual (Low, n=80) a 5. As caixas representam o IQR, a linha dentro representa a mediana e as linhas de baixo e de cima da caixa são o primeiro e o terceiro quartis, respectivamente. Os limites das linhas são a menor e a mais alta observação dentro de 1,5 do IQR dos quartis inferior e superior. Os pontos pretos representam os outliers. *p < 0,001 quando comparado ao grupo ‘Low’ (teste de Mann-Whitney). Estatísticas e gráficos foram gerados utilizando SPSS e Bokeh (Python), respectivamente. IQR, intervalo interquartil.
4.4 Relação idade e peroxidação Lipídica
Para avaliar a relação entre a idade e a peroxidação lipídica, inicialmente foi calculada a mediana das idades dos pacientes; o valor encontrado foi de 64 anos. Posteriormente, os pacientes foram divididos em dois grupos: os que apresentaram idade acima dos 64 anos (High) e abaixo (Low). Dos 212 pacientes, 110 possuíam idade acima da mediana e 102, abaixo. A média da concentração de MDA no grupo ‘High’ foi de 0,77 µmol/L, já no grupo ‘Low’, foi de 0,86 µmol/L. De acordo com a Figura 11, não foi observada diferença estatística entre os grupos.
Figura 11: Distribuição das concentrações de Malondialdeídeo (µM/L) de pacientes com idades superior ou igual (High) e inferior (Low) a 64 anos. As caixas representam o IQR, a linha dentro representa a mediana e as linhas de baixo e de cima da caixa são o primeiro e o terceiro quartis, respectivamente. Os limites das linhas são a menor e a mais alta observação dentro de 1,5 do IQR dos quartis inferior e superior. Os pontos pretos representam os outliers. p=0,819 (teste de Mann-Whitney). Estatísticas e gráficos foram gerados utilizando SPSS e Bokeh (Python), respectivamente. IQR, intervalo interquartil.
4.5 Relação idade e oxidação Proteica
Em relação a idade e a oxidação proteica, a média da concentração de GC no grupo ‘High’ (idades acima de 64 anos) foi de 29,82 µmol/L, já no grupo ‘Low’ (idades abaixo de 64 anos), foi de 30,89 µmol/L. De acordo com a Figura 12, não houve diferença estatística entre os grupos.
Figura 12: Distribuição das concentrações de proteínas carboniladas (µM/L) de pacientes com idades superior ou igual (High) e inferior (Low) a 64 anos. As caixas representam o IQR, a linha dentro representa a mediana e as linhas de baixo e de cima da caixa são o primeiro e o terceiro quartis, respectivamente. Os limites das linhas são a menor e a mais alta observação dentro de 1,5 do IQR dos quartis inferior e superior. Os pontos pretos representam os outliers. p=0,388 (teste de Mann-Whitney). Estatísticas e gráficos foram gerados utilizando SPSS e Bokeh (Python), respectivamente. IQR, intervalo interquartil.
4.6 Influência da idade na concentração de vitamina D
Avaliando a idade e a concentração da Vitamina D, a média da concentração de Vitamina D no grupo ‘High’ (idades acima da mediana) foi de 37,62 ng/mL, já no grupo ‘Low’ (idades abaixo da média), foi de 34,87 ng/mL. De acordo com a Figura 13, os pacientes com elevada concentração de Vitamina D apresentam idades mais elevadas em relação aos pacientes com baixas concentrações da Vitamina D. No entanto, mais uma vez, não foi observada diferença estatística entre os grupos.
Figura 13: Distribuição das concentrações de Vitamina D (ng/mL) de pacientes com idades superior ou igual (High) e inferior (Low) a 64 anos. As caixas representam o IQR, a linha dentro representa a mediana e as linhas de baixo e de cima da caixa são o primeiro e o terceiro quartis, respectivamente. Os limites das linhas são a menor e a mais alta observação dentro de 1,5 do IQR dos quartis inferior e superior. Os pontos pretos representam os outliers. p=0,171 (teste de Mann-Whitney). Estatísticas e gráficos foram gerados utilizando SPSS e Bokeh (Python), respectivamente. IQR, intervalo interquartil.
As análises acima (idade e peroxidação lipídica, idade e oxidação proteica e idade e Vitamina D) sugerem que a idade não possui influência nas análises da relação entre a deficiência da Vitamina D e os danos oxidativos (peroxidação lipídica e oxidação proteica). Os gráficos seguintes dão evidências a este achado (Figuras 14 e 15).
4.7 Influência da idade na concentração de MDA
A figura 14 sugere que a idade não está correlacionada com a concentração do MDA, entretanto os níveis de vitamina D estão correlacionados com os níveis do MDA. Isto se deve ao fato de que pacientes com elevadas concentrações de Vitamina D possuem idades variadas e apresentam concentrações de MDA somente abaixo ou igual a 1 µM/L, enquanto que pacientes com baixa concentração de Vitamina D também possuem idades dispersas, entretanto
estes apresentam concentrações de MDA mais elevadas. De fato, a correlação entre MDA e vitamina D é inversamente proporcional e forte (rho: -0.828), e a correlação entre a idade e MDA é quase inexistente (rho: - 0.057).
Figura 14: Distribuição dos valores das idades e concentrações de malondialdeídeo de pacientes com concentrações de vitamina D menor do que 30 ng/mL (Low, n=69) e igual ou maior do que 30 ng/mL (High, n=143).
Correlação MDA-Vitamina D: -0.828; correlação idade-MDA: -0.057 (coeficiente de correlação de Spearman). Estatísticas e gráficos foram gerados utilizando SPSS e Bokeh (Python), respectivamente
4.8 Influência da idade na concentração de GC
A figura 15 por sua vez mostra que a concentração de Vitamina D, mas não a idade, esta correlacionada com a concentraçao de proteínas carboniladas. Pacientes com elevadas concentrações de Vitamina D possuem idades variadas e apresentam concentrações de GC mais baixas do que pacientes com baixa concentração de Vitamina D, os quais também possuem idades variadas. A correlação entre GC e vitamina D é inversamente proporcional e forte (rho: -0.731), e a correlação entre a idade e MDA é fraca (rho: - 0.075).
