Avaliação da influência da diabetes Mellitus tipo II na eficácia da terapia periodontal básica sobre os parâmetros clínicos e microbiológicos da doença periodontal

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIENCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA. MARIANA LINHARES ALMEIDA. AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA DIABETES MELLITUS TIPO II NA EFICÁCIA DA TERAPIA PERIODONTAL BÁSICA SOBRE OS PARAMETROS CLÍNICOS E MICROBIOLÓGICOS DA SALIVA NA DOENÇA PERIODONTAL. NATAL 2017.

(2) MARIANA LINHARES ALMEIDA. AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA DIABETES MELLITUS TIPO II NA EFICÁCIA DA TERAPIA PERIODONTAL BÁSICA SOBRE OS PARAMETROS CLÍNICOS E MICROBIOLÓGICOS DA DOENÇA PERIODONTAL. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Saúde Coletiva do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do Título de Mestre em Saúde Coletiva, área de concentração em Odontologia. ORIENTADOR: Profº. Dr. Bruno César De Vasconcelos Gurgel. NATAL 2017.

(3) Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”. Almeida, Mariana Linhares Avaliação da Influência da Diabetes Mellitus Tipo II Na Eficácia da Terapia Periodontal Básica Sobre os Parâmetros Clínicos e Microbiológicos da Doença Periodontal / Mariana Linhares Almeida. – 2017. 61 f. : il. Orientador: Prof. Dr. Bruno César De Vasconcelos Gurgel Dissertação (Mestrado em Saúde Coletiva) – Universidade Federal do rio Grande Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa da Pós Graduação em Saúde Coletiva. Natal, 2017. 1. Doenças periodontais – Dissertação. 2. – Dissertação. 3. Diabetes Mellitus – Dissertação. 4. Reação em cadeia da polimerase. – Dissertação I. Gurgel, Bruno César de Vasconcelos. II. Título. RN/UF/BSO. Black D64.

(4) DEDICATÓRIA. Dedico essa conquista aos meus pais, os principais responsáveis por eu ter chegado até aqui, que não mediram e não medem esforços para que eu consiga realizar meus sonhos!.

(5) AGRADECIMENTOS. Agradeço a Deus por sempre criar as melhores oportunidades na minha vida.. Aos meus pais, por todo amor, carinho e confiança depositados em mim, espero sempre deixá-los orgulhosos.. Aos meus irmãos, Marina e Dayvid, e por sempre me acompanhar. A minha sobrinha, Lara, por ser a única capaz de não me deixar com peso na consciência por passar algum tempo com ela quando não precisava fazer alguma coisa do Mestrado. E a todos da minha família por sempre torcerem por mim.. Ao meu namorado Bemvenuto Júnior por estar sempre presente e ser um dos meus maiores torcedores. Pela compreensão, carinho e incentivo de sempre. Os últimos cinco anos com certeza foram mais simples por ter você, e espero que nos próximos anos você continue ao meu lado. Desejo que a sua paciência e empatia continuem pelos próximos anos. Você foi a pessoa que compartilhou comigo os momentos de tristezas e alegrias, e a quem confio e compartilho todos os meus sonhos.. Ao meu orientador Bruno César de Vasconcelos Gurgel pela paciência e parceria. Grande parte das minhas conquistas e realizações profissionais aconteceram sob sua orientação, iniciada em 2013 ainda como aluna de iniciação científica. Com certeza, eu não estaria vivendo esse momento se não fosse pela confiança depositada ao longo desses anos. Peço desculpas pelos prazos perdidos e espero cumprir com todas as minhas pendências.. As minhas amigas Luísa Brasil e Thereza Raquel, por terem participado de toda caminhada, mesmo longe ou seguindo caminhos diferentes sempre estiveram presentes.. A Eduardo e Janaína que ajudaram na construção desse trabalho, principalmente nos atendimentos clínicos, e foram também responsáveis por manter esse trabalho vivo até esta pesquisa..

(6) A Professora Poliana Mendes Duarte e Tamires Szeremeske de Miranda por disponibilizarem as dependências do Laboratório de Pesquisa em Odontologia II, da Universidade de Guarulhos e me auxiliarem na etapa laboratorial desse estudo.. Aos alunos da graduação que participaram do projeto de atendimento a pacientes diabéticos, especialmente Priscilla, Éric, Guilherme, Carol, por ajudarem nos atendimentos e tornarem as quartas-feiras a noite mais divertidas.. A todos os pacientes que se disponibilizaram a participar do estudo, sem vocês nada seria possível.. Aos meus companheiros de Mestrado, Lorena, Yriu, Israel, Angélica, Lidya, Samuel, Karyna e Anderson por compartilharem as agonias e estresses, mas também os melhores momentos das disciplinas.. Aos funcionários do Departamento de Odontologia por sempre se receberem com carinho, e abriam as clínicas para que pudessem realizar os atendimentos, mesmo nas férias. Ao Programa de Pós-graduação em Saúde Coletiva – UFRN e Mestres que integram o programa, por ter disciplinas que me proporcionaram momentos de reflexão e mudanças de paradigmas, que contribuíram não só para o crescimento profissional, como também o pessoal.. A CAPES por oferecer a oportunidade de me dedicar verdadeiramente ao mestrado.. Aos membros da banca, tanto de qualificação, como de defesa, por aceitarem o convite de participar.. A todos que direta ou indiretamente fizeram parte da minha formação..

(7) RESUMO. A relação entre a doença periodontal (DP) e a diabetes mellitus (DM) é bidirecional, porém, existe a necessidade de maiores evidências em relação ao tratamento periodontal básico sobre os aspectos clínicos e a presença de bactérias em pacientes com e sem diabetes. Dessa forma, portanto, o presente estudo teve por objetivo avaliar a influência da diabetes mellitus tipo II na eficácia do tratamento periodontal básico através dos parâmetros clínicos e microbiológicos da saliva. Foram tratados 51 pacientes entre 30 e 65 anos através da técnica “Full Mouth Disinfection” (FMD), sendo 17 do grupo diabético (GD) e grupo não diabético (GND). Esses pacientes foram avaliados antes do início do tratamento periodontal, aos 6 e 12 meses após a sua conclusão. No exame periodontal foram avaliados o Índice de Sangramento a Sondagem (ISS), Índice de Placa Visível (IPV), Profundidade de Sondagem (PS), Recessão Gengival (RG) e Nível Clínico de Inserção (NCI). Os parâmetros sanguíneos avaliados foram glicose em jejum e hemoglobina glicada (HbA1C) apenas para o GD. As amostras de saliva foram coletadas antes da realização de cada exame periodontal. Foi realizada a quantificação das espécies bacterianas Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, e Tannerella forsythia através da técnica Reação em cadeia da polímeras em tempo real (PCR real-time). Os resultados mostraram quanto aos parâmetros clínicos que houve uma melhora significativa para ISS, IPV e PS para ambos os grupos, enquanto que para o NCI apenas para o GD (p=0,023). Em relação aos parâmetros microbiológicos, não houve diferenças entre o grupo com diabetes e sem diabetes nos períodos avaliados, apenas a espécie Tanerella forsythia apresentou diferença estatística significativa no período de 12 meses (p=0,004), com maior mediana para o grupo GND. Na análise intragrupo, apenas o GD apresentou diferença estatística para todas as espécies avaliadas (p<0,05), na qual houve redução após o tratamento, mas aumento após a avaliação de 6 meses. A espécie Porphyromonas gingivalis aumentou significativamente após 12 meses, nesse período de avaliação obteve mediana maior que o baseline. A diabetes não influenciou na resposta do tratamento periodontal, ambos os grupos apresentaram melhora dos parâmetros clínicos avaliados. Palavras-chave: Doenças periodontais. Diabetes Mellitus. Reação em cadeia da polimerase..

(8) ABSTRACT. The relationship between periodontal disease (PD) and diabetes mellitus (DM) is bidirectional, however, there is a need for more evidence regarding basic periodontal treatment on clinical aspects and the presence of bacteria in patients with and without diabetes. Thus, the present study aimed to evaluate the influence of type II diabetes mellitus (DM) on the efficacy of basic periodontal treatment through the clinical and microbiological parameters of saliva. Fifty-one patients were treated between 30 and 65 years of age using the "Full Mouth Disinfection" (FMD) technique, 17 in the diabetic group (DG) and non-diabetic group (NDG). These patients were evaluated before the beginning of the periodontal treatment, at 6 and 12 months after its conclusion. In the periodontal examination, the Bleeding on Probing (BOP), Visible Plaque Index (VPI), Probing Depth (PD), Gingival Recession (RG) and Clinical Attachment Level (CAL) were evaluated. The blood parameters evaluated were fasting glucose and glycated hemoglobin (HbA1C) only for DG. Saliva samples were collected before each periodontal examination. Quantification of the bacterial species Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, and Tannerella forsythia through the real-time polymer chain reaction (PCR) technique was performed. The results showed that the clinical parameters showed a significant improvement for ISS, IPV and PS for both groups, whereas for NCI only for GD (p = 0.023). Regarding the microbiological parameters, there were no differences between the group with diabetes and no diabetes in the evaluated periods, only Tanerella forsythia presented a statistically significant difference in the 12-month period (p = 0.004), with a higher median for the NDD group. In the intragroup analysis, only the DG presented statistical difference for all species evaluated (p <0.05), in which there was reduction after treatment, but increase after the evaluation of 6 months. The species Porphyromonas gingivalis increased significantly after 12 months, in this period of evaluation it obtained median higher than baseline.. Keywords: Periodontal diseases. Diabetes Mellitus. Polymerase chain reaction..

(9) LISTA DE ILUSTRAÇÕES. Figura 1. Cronograma das avaliações ..................................................... 27. Figura 2. Fluxograma da perda de pacientes no período de 12 meses... 33. Figura 3. Fluxograma das amostrar de saliva no período de 12 meses... Quadro 1. Descrição dos estudos com objetivo de verificar o efeito da. 39. terapia periodontal não cirúrgica em pacientes com diabetes tipo............................................................................................. 20. Quadro 2. Variáveis independentes do estudo........................................... 31. Quadro 3. Variáveis dependentes do estudo.............................................. 31.

(10) LISTA DE TABELA Tabela 1. Sequência. de. Primers,. perfil. de. amplificação. e. comprimento estimado do produto final da Reação em Cadeia de Polimerase para espécies bacterianas............... Tabela 2. 31. Parâmetros periodontais de todos os sítios [mediana (Q25–Q75)] para os grupos no baseline, com 6 e 12 meses pós terapia................................................................. 35. Tabela 3. Porcentagem de sítios com profundidade de sondagem até 3 mm, maior que 3 e menor que 6mm e maior que 6 mm [mediana (Q25–Q75)] para os grupos no baseline e com 6 e 12 meses pós terapia......................................................... 36. Tabela 4. Parâmetros periodontais dos sítios doentes [mediana (Q25–Q75)] para os grupos no baseline, com 6 e 12 meses pós terapia................................................................. 37. Tabela 5. Quantidade de bactérias das espécies do complexo vermelho na saliva [mediana (Q25–Q75)] para os grupos no baseline e com 6, e 12 meses pós terapia....................... 40.

(11) LISTA DE ABREVIATURAS µl – Microlitros AGEs – Produtos Finais de Glicação Avançada DM – Diabetes Mellitus DP – Doença Periodontal FMD – Full Mouth Desinfection GD – Grupo Diabético GND – Grupo Não Diabético HbA1c – Hemoglobina Glicada HUOL – Hospital Universitário Onofre Lopes IFNγ – Interferon gama IL– Interleucina IPV – Índice de Placa Visível ISS – Índice de Sangramento a Sondagem mm – Milímetros NCI – Nível Clínico de Inserção ng – Nano grama ºC – Graus Celsius OPG – Osteoprogerina PS – Profundidade de Sondagem RACR – Raspagem e Alisamento Corono-Radicular RANK – Receptor ativador do fator Kappa-β RANKL – Ligante de RANK real-time PCR – Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real RG – Recessão Gengival TNF-α – Fator de Necrose Tumoral alfa.

(12) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO................................................................................... 11. 2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................. 13. 2.1. DIABETES MELLITUS....................................................................... 13. 2.2. DOENÇA PERIODONTAL................................................................. 14. 2.3. RELAÇÃO ENTRE AS DOENÇAS PERIODONTAIS E A DIABETES MELLITUS....................................................................... 15. 2.4. EFEITO DO TRATAMENTO PERIODONTAL NÃO CIRÚRGICO..... 15. 2.5. ALTERAÇÕES DAS ESPÉCIES MICROBRIANAS DA SALIVA........ 16. 3. OBJETIVOS...................................................................................... 24. 3.1. GERAL............................................................................................... 24. 3.2. ESPECIFICOS.................................................................................. 24. 4. METODOLOGIA............................................................................... 25. 4.1. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS............................................................ 25. 4.2. POPULAÇÃO E AMOSTRA............................................................... 25. 4.2.1. Critérios de Inclusão e exclusão............................................................. 26. 4.2.1.1. Critérios de Inclusão e exclusão dos pacientes................................. 26. 4.2.2. Cálculo do tamanho da amostra.............................................................. 26. 4.3. COLETA DE DADOS........................................................................ 27. 4.3.1. Exame Clínico Periodontal..................................................................... 27. 4.3.2. Coleta da Saliva....................................................................................... 28. 4.3.3. Tratamento Periodontal Básico pelo Full Mouth Disinfection (FMD).... 28. 4.3.4. Purificação e Extração do DNA bacteriano.............................................. 29. 4.3.5. Avaliação Microbiológica por meio do real-time PCR............................ 30. 4.4. QUADRO DE VARIÁVEIS ................................................................ 31. 4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................... 32. 5. RESULTADOS................................................................................. 33. 5.1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA................................................. 33. 5.2. PARÂMETROS CLÍNICOS................................................................ 34. 5.3. ANÁLISE MICROBIOLÓGICA............................................................ 39. 6. DISCUSSÃO...................................................................................... 41. 7. CONCLUSÃO................................................................................... 47. REFERÂNCIAS................................................................................. 48. ANEXOS............................................................................................ 58.

(13) 11. 1 INTRODUÇÃO Uma das doenças que mais cresce na população mundial é a DM. Atualmente, ela atinge mais de 400 milhões de adultos e é uma das principais causas de morte no mundo (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). Essa doença causa complicações em diversas partes do corpo, como a neuropatia e a retinopatia. O ambiente bucal também não está excluído e a DP é tida como a sexta complicação da Diabetes (LÖE, 1993). Essa relação entre a doença periodontal e a diabetes é bidirecional, e determinados mecanismos associados a etiopatogenia das duas condições têm sido propostos para explicar como uma doença pode afetar a outra (TAYLOR; PRESHAW; LALLA, 2013). Os mecanismos celulares e moleculares relacionados à destruição periodontal são comuns a outras complicações diabéticas e estão associados a resposta inflamatória alterada dos pacientes com DM (MESIA et al., 2016; VELEA et al., 2013). Os estudos tentam mostrar essa relação através de alterações na microbiota, mudanças nos níveis de mediadores pró-inflamatórios e o estresse celular. causado. pelos. produtos. finais. de. glicação. avançada. (AGEs). (KUDIYIRICKAL; PAPPACHAN, 2015; TAYLOR; PRESHAW; LALLA, 2013). Na DM, a resposta imune é prejudicada que pode retardar a cicatrização, e ocorre um aumento exacerbado da produção de citocinas pró-inflamatórias frente o estímulo bacteriano, na qual que leva a destruição tecidual mais intensa, e a simples presença da DP já pode alterar os níveis dessas citocinas em níveis locais e sistêmicos (MESIA et al., 2016). Dessa maneira, pacientes com DM parecem ser mais susceptíveis à inflamação gengival do que pacientes sem diabetes, mesmo apresentando os mesmos níveis de biofilme (KARJALAINEN; KNUUTTILA, 1996). Já foi demonstrado que o tratamento periodontal convencional é capaz de reduzir consideravelmente a quantidade de periodontopatógenos subgengivais (PEDRAZZOLI et al., 1991; ALI; LIE; SKAU, 1992; HAFFAJEE et al., 1997; COLOMBO et al., 2005). Entretanto, as diferenças específicas da microbiota da doença periodontal de pacientes diabéticos e não diabéticos não são bem estabelecidas (EBERSOLE et al., 2008). Existem métodos de biologia molecular que auxiliam na identificação de periodontopatógenos e mostram vantagens em relação aos métodos de cultura..

(14) 12. Uma das técnicas é real-time PCR, que é uma técnica sensível e específica que permite detectar e quantificar DNA em uma única etapa, e garante maior precisão em relação a outras técnicas de biologia molecular. É possível identificar espécies bacterianas, vírus e pontos de mutações gênicas em diferentes tipos e quantidades de amostras, no entanto, etapas prévias são necessárias (ZHANG et al., 2016; HEID et al., 1996). Muitos estudos utilizam real-time PCR na identificação de patógenos periodontais em amostras do biofilme subgengival em pacientes com DM e DP (HINCAPIÉ et al., 2014; MIRANDA et al., 2014; Al-NOWAISER et al., 2014; MIRANDA et al., 2017). Outros estudos observaram a presença das bactérias periodontopatogênicas na saliva, e mostraram correlação positiva com a DP (UMEDA et al., 2004; KÖNÖNEN et al., 2007; PAJU et al., 2009; SAYGUN et al., 2011). Porém não se sabe qual o comportamento dessas bactérias na saliva após o tratamento periodontal. Com isso, existem ainda lacunas na literatura que estabelecem essa relação entre a DM e a doença periodontal, tanto em relação aos aspectos clínicos como microbiológicos relacionados ao tratamento. Por essa razão, é necessário conhecer a influência da DM na resposta do tratamento periodontal básico, por meio da desinfecção de boca completa, sem o uso de antibióticos sistêmicos, sobre os parâmetros clínicos periodontais e microbiológicos da saliva..

(15) 13. 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 DIABETES MELLITUS A Diabetes Mellitus é uma desordem endócrina na qual há um defeito na produção ou na ação do hormônio insulina secretado pelo pâncreas. Defeitos nesse metabolismo causam níveis elevados de glicose no sangue, que traz diversas consequências ao organismo ( AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 20017). A hiperglicemia crônica gera AGEs que provocam problemas macro e microvasculares (QUADROS et al., 2007). A consequência disto está relacionada com as cinco complicações mais comuns da DM que são: as doenças cardiovasculares, nefropatias, retinopatias, neuropatias e problemas na cicatrização, todas essas doenças são oriundas das alterações macro e microvasculares. (LITWAK et al., 2013; PATALONE et al., 2015) Esta doença é classificada em quatro tipos: diabetes tipo I e II, diabetes gestacional e outros tipos de diabetes. A tipo I é aquela na qual o organismo produz pouca ou nenhuma insulina, enquanto na diabetes tipo II pode ser ocasionada por um defeito progressivo na produção e secreção da insulina, e/ou por um problema no receptor que dificulta a sua utilização e pode causar resistência à insulina. Já a diabetes gestacional é diagnosticada durante a gestação, e outros tipos de diabetes que. é. causada. por. defeitos. genéticos. ou. por. uso. de. medicamentos. (imunossupressores, por exemplo) (AAD, 2015). A diabetes tipo 2 é a mais comum, e está associada a fatores de risco como obesidade, sedentarismo e dieta inapropriada. No entanto, isso a torna o tipo mais fácil de ser prevenido. Intervenções com dieta saudável e exercícios regulares tornam o controle glicêmico mais eficiente do que o uso de medicamentos para as pessoas com alto risco de desenvolver a doença (WHO, 2016). Para ser estabelecido o diagnóstico da DM, o exame sanguíneo de glicose em jejum deve apresentar valores ≥126 mg/dL, e a hemoglobina glicada (HbA1c) deve ser ≥6,5% (AAD, 2017). Porém, para pacientes adultos que já estão em tratamento da doença, os valores da HbA1c devem permanecer <7,0%, enquanto a glicose em jejum não deve ser >130mg/dL. Para estabelecer a severidade da doença a partir desses exames sanguíneos, outros fatores devem ser levados em consideração. É importante analisar a idade do paciente, presença de outras.

(16) 14. morbidades, duração da doença desde o seu diagnóstico e estabelecimento de complicações vasculares. (AAD, 2015; PANTALONE et al., 2015).. 2.2 DOENÇA PERIODONTAL A doença periodontal é uma doença inflamatória de caráter infeccioso, na qual o fator etiológico primário é o biofilme dentário, composto por bactérias especificas que invadem o ambiente subgengival e promovem a destruição do tecido de proteção e sustentação do dente (LÖE, 1965; SOCRANSKY, 1977). As doenças periodontais mais comuns são a gengivite e periodontite. Nesta última ocorre a formação de bolsa, perda do ligamento periodontal e reabsorção óssea que leva a perda de inserção do dente, e é uma das principais causas de perda dentária em adultos (PAGE; SCHROEDER, 1976). O biofilme periodontopatogênico é uma comunidade de microrganismos complexa, que se desenvolve em ambientes anaeróbios, e é predominantemente composto por bactérias Gram-negativas. Socransky (1998) analisou o biofilme subgengival e demonstrou que as bactérias se organizam em complexos microbianos que interagem. A presença do complexo vermelho e algumas espécies do complexo laranja foram associadas a maior profundidade de sondagem, e estão presentes no complexo vermelho as espécies Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola e Tanerella forshytia (SOCRANSKY et al., 1998; GROSSI et al., 1994). A presença dessas bactérias é importante para o estabelecimento da doença, mas a destruição tecidual é causada tanto pelos produtos bacterianos produzidos, como pela resposta imune do hospedeiro frente a essa agressão (DESHMUKH; JAWALI; KULKARNI, 2011; SOCRANSKY et al., 1984).. Nesse. contexto, nem todos os indivíduos são susceptíveis ao desenvolvimento da doença, é necessário que os microrganismos driblem o sistema de defesa inicial, para que uma grande resposta inflamatória seja gerada e cause a destruição dos tecidos (YETKIN et al., 2009). A. doença. periodontal. pode. ser. influenciada. por. diversos. fatores. modificadores locais e sistêmicos, que intensificam a progressão da doença (MEALEY; OATES, 2006; SOSKOLNE; KLINGER, 2001). Um exemplo é a diabetes, em que pacientes com essa condição sistêmica tem mais chances de ter problemas periodontais do que pacientes saudáveis. Por essa razão, a doença periodontal é.

(17) 15. dita como a sexta complicação mais comum ocasionada pela diabetes (LÖE, 1993; SOSKOLNE; KLINGER, 2001). Ao longo dos anos, muitas mudanças ocorreram na forma de diagnosticar a doença periodontal (DYE, 2011). Para a gengivite é necessário utilizar índices que mensurem a inflamação gengival, enquanto na periodontite, é preciso avaliar a PS e o NCI (HAFFAJEE; SOCRANSKY; GOODSON, 1983). Contudo, independente disto, a doença periodontal precisa ser tratada, e a remoção do biofilme patogênico é necessária para que não ocorra a recolonização da superfície dentária por este (LINDHE et al., 1984). O tratamento periodontal não cirúrgico é realizado através da raspagem e alisamento corono-radicular (RACR) e, associado a orientação de higiene, é capaz de diminuir a inflamação, melhorar os parâmetros clínicos promovendo o ganho de inserção (LLAMBES et al., 2005; STANKOA; HOLLA, 2014). Também é necessário monitorar os fatores que podem interferir na doença periodontal, para isso, pacientes com fatores de risco devem ter controles periódicos mais frequentes (WILSON JR et al., 1984).. 2.3 RELAÇÃO ENTRE AS DOENÇAS PERIODONTAIS E A DIABETES MELLITUS A relação entre a DP e a DM revela uma doença sistêmica modificando uma doença bucal, e está relação tem sido descrita como bidirecional. No entanto, os mecanismos pelos quais essas interações ocorrem ainda não estão definidos (TAYLOR; PRESHAW; LALLA, 2013; DA CRUZ et al., 2008). Estudos com grandes amostras mostram a diabetes como um fator de risco para a doença periodontal (COHEN; ROSE; MINSK, 1998). Pacientes com controle glicêmico alterado têm maior susceptibilidade em desenvolver a DP, e esta progride mais rápido nesses pacientes (MENG, 2007; NISHIMURA et al., 2005; STEGEMAN, 2005; DESHPANDE et al., 2010). Os estudos tentam mostrar essa relação através de alterações na microbiota, mudanças nos níveis de mediadores pró-inflamatórios, e o estresse celular causado pelos AGEs (KUDIYIRICKAL; PAPPACHAN, 2015; TAYLOR; PRESHAW; LALLA, 2013). Porém, diferenças metodológicas nos estudos impedem conclusões definitivas. Nesse contexto, Ebersole et al. (2008) avaliaram espécies bacterianas presentes em amostra de biofilme subgengival de pacientes com e sem diabetes tipo II, encontraram uma possível influência da diabetes na microbiota.

(18) 16. periodontal, já que patógenos como P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans eram mais frequentes em pacientes com diabetes. Miranda et al. (2017) mostraram níveis mais elevados das bactérias periodontopatogênicas no biofilme subgengival em pacientes com pobre controle glicêmico (HbA1C≥8%). Entretanto, outros estudos não encontram esse tipo de associação (CRUZ et al., 2008; LALLA et al., 2006). Muitos estudos com mediadores inflamatórios, como Interleucina (IL) -1β, IL-6, Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e Interferon gama (IFNγ), apresentaram-se mais elevados em pacientes com diabetes quando comparados com aqueles que só tinha a doença periodontal (DUARTE et al., 2007; COLE et al., 2008; ANDRIANKAJA et al., 2009; MESIA et al., 2016). O TNF-α está associado a perda de inserção periodontal quando se apresenta em níveis elevados (BOYCE et al., 2005), e ainda pode induzir uma resistência à insulina, que dificulta o controle glicêmico (FERNANDEZ-REAL; RICART, 2003), porém não foi encontrado diferenças nos níveis de TNF-α entre pacientes diabéticos e não diabéticos (TAKEDA et al., 2006; NAVARRO-SANCHEZ; FARIA-ALMEIDA; BASCONES-MARTINEZ et al., 2007; MESIA et al., 2016). Nesse cenário em que níveis alterados de mediadores inflamatórios afetam diretamente a resposta do hospedeiro, um dos principais sistemas do metabolismo ósseo relacionado a doença periodontal é o Receptor ativador do fator Kappa-β (RANK), o ligante de RANK (RANKL) e a Osteoprogerina (OPG) (REINHARTDT et al., 2010; BUDUNELI; BUDUNELI; KÜTÜKÇÜLER, 2009). Em uma situação de saúde, a OPG funciona com um receptor para RANKL, para que este não se ligue a RANK e ative a osteoclastogenese, dessa forma não há reabsorção óssea. Na periodontite é visto níveis elevados de RANKL e diminuição nos níveis de OPG (TANAKA et al., 2005). Dessa maneira, Ribeiro et al. (2011) avaliaram os níveis de citocinas (TNF-α, INFγ, IL-4, IL-23, IL-17) e fatores relacionados metabolismo ósseo (RANKL e OPG) do fluido gengival de pacientes com periodontite crônica e com o diagnostico ou não de diabetes tipo II. Esses autores encontraram que os pacientes que tinham diabetes e DP, principalmente os com pobre controle glicêmico, tinham níveis mais elevados dos fatores estudados. (RIBEIRO et al., 2011) Outro mecanismo que pode estar associado as interações entre DM e DP são os AGEs (GROSSI; GENCO, 1998; PERRINO, 2007). Os AGEs estão relacionados a formação de trombos, que causam complicações microvasculares, por se depositarem nas paredes dos vasos quando ligadas ao colágeno (SCHMIDT.

(19) 17. et al., 1999). Além disso, podem se ligar as células fagocitárias diminuindo tal função, isso torna a resposta imune deficiente e facilita a multiplicação dos patógenos periodontais (SCHMIDT et al., 1996). Foi observado também que os fibroblastos possuem receptores de membranas para AGEs (RAGEs), e quando os AGEs estão ligados a essas células podem dificultar a formação do colágeno, que diminuem a resistência do periodonto, tornando-o mais susceptível a infecção por periodontopatógenos (BASCONES-MARTINEZ et al., 2011; TAYLOR; PRESHAW; LALLA, 2013). Portanto, no paciente com diabetes, a patogenicidade do biofilme também irá causar uma resposta inflamatória no hospedeiro, mas esta será mais intensa, e dessa forma os níveis sistêmicos elevados de citocinas podem dificultar o controle glicêmico (TAYLOR; PRESHAW; LALLA, 2013; PERRINO, 2007; MEALEY; OATES, 2006). Nesse contexto, Demmer et al. (2013) avaliou por cinco anos pacientes sem diabetes, mas com doença periodontal, e relacionou o aumento progressivo dos níveis de HbAc1 com a doença periodontal. No entanto, o controle da doença periodontal parece não fazer parte da rotina de pacientes com a DM (DUNNING, 2009).. 2.4 EFEITO DO TRATAMENTO PERIODONTAL NÃO CIRÚRGICO O quadro 1 mostra a síntese dos estudos nos últimos 10 anos que têm como objetivo verificar o efeito do tratamento periodontal não cirúrgico nos parâmetros clínicos periodontais, parâmetros glicêmicos e parâmetros microbiológicos em pacientes com Diabetes tipo II. A maioria dos estudos apresentados nesse quadro não apresenta diferenças significativas para os parâmetros clínicos entre os grupos quando comparados os diabéticos e não diabéticos. Entretanto, quando analisado os níveis de Glicose em Jejum e Hemoglobina glicada, após o tratamento periodontal, os estudos não apresentam conclusões semelhantes. A remoção mecânica do cálculo e biofilme é essencial para a melhora dos parâmetros periodontais, independente da condição sistêmica que o paciente apresenta. Entretanto, como a DM e a DP estão intimamente ligadas, o tratamento dos pacientes que apresentam essas condições é indispensável, além de que existem diferenças na resposta do tratamento periodontal se o paciente apresenta bom ou pobre controle glicêmico (GROSSI et al., 1997; KNOWLES et al., 1979)..

(20) 18. Quirynen et al. (1995) descreveram o tratamento periodontal através da técnica “Full Mouth Disinfection”, que consiste em raspagem e alisamento radicular em uma única sessão associado ao uso da clorexidina, dessa maneira diminuiria a reinfecção dos sítios periodontais antes da finalização do tratamento. Esses autores encontraram melhora nos parâmetros clínicos e menores proporções de bactérias patogênicas no grupo teste (QUIRYNEN et al. 1995). Outros estudos, que utilizaram pacientes diabéticos, também compararam essa técnica e obtiveram melhora clínica dos. parâmetros. avaliados. (CRUZ. et. al.,. 2008;. SANTOS. et. al.,. 2009;. MOEINTAGHAV et al., 2012; RAMAM et al., 2014) Nesse sentido, Ramam et al. (2014) trataram pacientes diabéticos com FMD ou apenas com instrução de higiene oral. Os autores mostraram melhora dos parâmetros clínicos dos pacientes que receberam essa a FMD, e ainda observaram redução estatística significativa nos níveis de HbAc1 nos pacientes da terapia não cirúrgica. Eles concluíram que a utilização do FMD em pacientes com diabetes com alto risco de infecção, alterações vasculares e resposta inflamatória deficiente é benéfica porque ajuda a minimizar o risco de reinfecção dos sítios tratados (RAMAN et al., 2014). Em indivíduos com a doença com bom controle, a resposta clínica e microbiológica ao tratamento periodontal parece ser semelhante à de indivíduos saudáveis (TSALIKIS et al., 2014; OLIVER; TERVONEN, 1994). Tsakilis e colaboradores. (2014). utilizaram. metodologia. semelhante. a. Nowaiser. e. colaboradores (2014), contudo, estes não avaliaram o controle glicêmico dos pacientes, mas observaram diferença entre os grupos tratados quando em um deles foi utilizado a doxiciclina sistêmica (AL-NOWAISER et al., 2014). De outro modo, quando havia um bom controle da DM no baseline, diferenças entre os grupos não foram encontradas nos parâmetros clínicos e microbiológicos, mesmo com o uso do antibiótico sistêmico. (TSALIKIS et al., 2014). Já Miranda et al. (2014) utilizaram o tratamento não cirúrgico associado ao uso de amoxicilina e metronidazol, e além de avaliar o controle glicêmico e parâmetros periodontais, avaliaram também os níveis bacterianos de sete espécies associadas a doença periodontal. Foi observado que os parâmetros clínicos melhoram para os grupos com ou sem uso dos antibióticos, mas o grupo teste obteve os melhores resultados, inclusive para as espécies bacterianas (MIRANDA et.

(21) 19. al., 2014). Contudo é importante avaliar o efeito microbiológico sem o uso de antibióticos, para analisar o real efeito do tratamento periodontal.. 2.5 ALTERAÇÕES DAS ESPÉCIES MICROBIANAS DA SALIVA Dentro das mais diversas funções, a saliva faz parte do sistema imune por apresentar lisoenzimas e íons de tiocianato, tornando-a bactericida. Além disso, a saliva apresenta diversos biomarcadores que podem auxiliar no diagnóstico precoce de algumas doenças (ZHANG et al., 2016). Nesse contexto, é possível identificar microrganismos presentes no ambiente bucal, que já são em torno de 700 microrganismos, alguns ainda não cultiváveis. Porém, ao utilizar métodos biomoleculares, é possível identificar até novas espécies (PEREIRA et al., 2012; TANNER; IZARD, 2005). Uma dessas técnicas é o real-time PCR (Reação em cadeia da polmerase em tempo real, em inglês Polymerase Chain Reaction), que facilita a quantificação da expressão gênica em diversos tipos de amostras (HEID et al., 1996). Através dessa técnica, Yasunaga et al. (2016) avaliaram o microbioma salivar, em pacientes saudáveis, para identificar espécies que em altas quantidades estão relacionadas a baixa susceptibilidade a cárie. Existem relatos na literatura sobre a presença das bactérias típicas do ambiente subgengival na saliva (UMEDA et al., 2004; KÖNÖNEN et al., 2007; PAJU et al., 2009; SAYGUN et al., 2011). Alguns estudos transversais de base populacional mostram associação da presença das bactérias do complexo vermelho com níveis avançados de perda de inserção (KÖNÖNEN et al., 2007; PAJU et al., 2009). Em 2005, Sakamoto e colaboradores correlacionaram a presença de bactérias na saliva com profundidade de sondagem aumentada, e observaram maior quantidade de Porphyromonas gingivalis e Tanerella forsythia em pacientes com periodontite crôninca. Porém, pouco se sabe a respeito da presença de bactérias típicas do ambiente subgengival na saliva de pacientes diabéticos após o tratamento periodontal..

(22) 20 Quadro 1 - Descrição dos estudos com objetivo de verificar o efeito da terapia periodontal não cirúrgica em pacientes com diabetes tipo II. Autor. Objetivo. Amostra. Métodos. Variáveis. Resultados (Parâmetros Clínicos Periodontais). Cruz et al. 2008. Avaliar as mudanças clínica e metabólicas após 3 meses de FMD em pacientes com e sem DM.. GT:10 pacientes com DM GC: 10 pacientes sem DM. OHO e FMSRP; (Quirynen et al.) Avaliação: 3 meses.. IPV; ISS; PS; NCI; RG.. Avaliar as mudanças clínicas e metabólicas após terapia periodontal não cirúrgica em pacientes com e sem DM tipo II. Comparar os efeitos clínicos e metabólicos do FMD com o PMSRP em pacientes com DM tipo II e DP. Avaliar o efeito da terapia periodontal não cirúrgica sobre o controle glicêmico de pacientes com DM tipo II e DP moderada e severa. GT:15 pacientes com DM GC: 15 pacientes sem DM. FMSRP; Avaliação: 3 meses.. IPV; ISS; PS.. Não houve diferença significativa entre os grupos em nenhum parâmetro analisado. Mas a PS, a RG e o NCI tiveram melhoras significativas dentro do mesmo grupo para ambos os grupos Todos os parâmetros clínicos melhoraram após as terapias, havendo diferença significativa intragrupo, mas sem diferença significativa intergrupo.. 36 pacientes com diabetes: GC: 18 (FMD) GT: 18 (PMSRP). FMSRP (24h) e PMSRP (em até 21 dias); Avaliação: 3 e 6 meses.. IPV; ISS; PS; NCI.. 60 pacientes: GT: 30 pacientes RACR em 2 sessões GC: 30 pacientes Apenas Raspagem supragengival e Profilaxia. RACR; Raspagem supragengival ; Profilaxia. Avaliação: baseline, 1, 3 e 6 meses. PS; NCI; ISS; IG. Kudva et al. 2010. Santos et al. 2009. Koromantzo s et al. 2011. HbA1c e Glicose em Jejum.. HbA1c.. HbA1c.. HbA1c. Resultados (hemoglobina glicada (HbA1c) e glicose em jejum) Não houve melhoras quanto ao nível de HbA1c e da glicose em jejum (p ≥ 0.05; ANOVA).. Resultados (Bactérias no biofilme). Redução significativa nos níveis de HbA1c nos pacientes com diabetes tipo II.. Não avaliado. Todos os parâmetros clínicos melhoraram após as terapias, havendo diferença significativa intragrupo, mas sem diferença significativa intergrupo.. Não houve alterações quanto ao nível de HbA1c após as terapias.. Não avaliado. Todos os parâmetros melhoraram depois de 6 meses do tratamento no GT quando comparado a GC;. Houve redução significativa nos níveis de HbA1c para o GT.. Não avaliado. Não avaliado.

(23) 21 Chen et al. 2012. Avaliar as mudanças clínicas e metabólicas após terapia periodontal não cirúrgica em pacientes com DM tipo II.. Cirano et al. 2012. Avaliar o potencial do FMUD (Onestage, Full mouth, ultrassonic debridement) como tratamento para pacientes com diabetes tipo II e periodontite crônica e severa. Comparar a condição periodontal em pacientes com diabetes tipo II bem controlados e mal controlados com indivíduos sem DM. Avaliar as mudanças clínicas e metabólicas após terapia periodontal não cirúrgica em pacientes com DM tipo II.. Haseeb et al. 2012. Moeintaghav i et al. 2012. 134 pacientes com diabetes: GT1: RACR em 4 sessões + raspagem subgengival GT2: RACR em 4 sessões + profilaxia supragengival GC: Nenhum tratamento periodontal. GT: 16 pacientes com DM GC: 15 pacientes sem DM. GT1: 40 pacientes com diabetes bem controlados; GT2: 40 pacientes com diabetes pobremente controlados; GC: 40 indivíduos sem diabetes. GT: 22 (FMD) GC: 18 (sem tratamento periodontal).. RACR em 4 sessões; raspagem subgengival; profilaxia supragengival ; Avaliação: 1.5, 3 e 6 meses.. HbA1c e Glicose em Jejum.. Todos os parâmetros clínicos melhoraram após as terapias, havendo diferença significativa intragrupo, mas sem diferença significativa intergrupo.. FMUD (única sessão de 45 minutos); Avaliação: 3 e 6 meses.. IPV; ISS; PS; NCI.. Não houve diferença entre os grupos em nenhum parâmetro clínico. Pacientes com diabetes tiveram resposta clínica similar aos não com diabetes.. HbA1c e Glicose em Jejum.. Observaciona l, transversal, sem intervenções.. PS; NCI; RG.. FMD e nenhum tratamento periodontal (durante o estudo) Avaliação: 3 meses.. IPV; ISS; PS; NCI.. HbA1c.. HbA1c e Glicose em Jejum.. Redução significativa nos níveis de HbA1c nos pacientes que receberam a terapia periodontal não cirúrgica. Apesar de haver melhoras nos níveis glicêmicos em ambos os grupos, não houve diferença significativa entre eles. Não houve alterações quanto ao nível de HbA1c e dos níveis de glicose em jejum após as terapias.. Não avaliado. PS e NCI significativamente maior em pacientes com diabetes pobremente controlados em comparação aos outros grupos.. Sem alterações significativas entre os grupos.. Não avaliado. Todos os parâmetros clínicos melhoraram após as terapias, havendo diferença significativa intragrupo e intergrupo. IPV; ISS; PS; NCI pioraram significativamente no grupo sem tratamento.. Os níveis de HbA1c diminuíram significativamente apenas no grupo que recebeu o FMD.. Não avaliado. Não avaliado.

(24) 22 Engebretson et al. 2013. Santos et al. 2013. Raman et al. 2014. Miranda et al. 2014. Avaliar o efeito da terapia periodontal não cirúrgica nos níveis de HbA1c em pacientes com diabetes tipo II.. 514 pacientes com diabetes: GT: 257 (RACR em 4 sessões + clorexidina) GC: 257 (Nenhum tratamento durante o estudo) 38 pacientes com DM e DP: GC: 19 (FMSRP + clx 0.12%) GT: 19 (FMSRP + placebo). RACR em 4 sessões + clorexidina . Avaliação: 3 e 6 meses. Comparar os efeitos clínicos e metabólicos da terapia periodontal não cirúrgica com a instrução de higiene oral (IHO) em pacientes com e sem DM tipo II.. 40 pacientes com diabetes tipo II: GT: 20 (FMD) GC: 20 (IH0). IHO e FMD; (Quirynen et al.) Avaliação: 2 e 3 meses.. IPV; ISS; PS; NCI.. Avaliar o efeito clinico e microbiológico do uso de MTZ e AMX como adjuntos da RACR em pacientes com DP e DM tipo II. 58 pacientes com DP e DM tipo II: GT: 29 (RACR+AMX+MTZ) GC: 29 (RACR). RACR com Metronidazol e Amoxicilina / RACR Avaliação: Baseline, 3, 6, 9 e 12 meses. IPV; ISS; PS; NCI. Avaliar o efeito da clorexidina no protocolo FMD em pacientes com DM tipo 2 pobremente controlada e com DP.. FMSRP + clx 0.12% (FMD) e FMSRP + placebo Avaliação: 3,6 e 12 meses. IPV; ISS; PS; NCI. HbA1c e Glicose em Jejum.. IPV; ISS; PS; NCI. HbA1c e Glicose em Jejum.. HbA1c.. Glicose em jejum, HbA1c. 7 especies: Complexo vermelho e 4 do laranja. Todos os parâmetros clínicos melhoraram após a terapia no grupo que recebeu o tratamento, havendo diferença significativa entre os grupos.. Não houve melhoras após seis meses nos níveis de HbA1c no grupo que recebeu tratamento periodontal.. Não avaliado. Todos os parâmetros clínicos melhoraram após as terapias, havendo diferença significativa intragrupo, mas sem diferença significativa intergrupo.. Houve melhora após 12 meses, mas sem significância estatística.. Não avaliado. Houve diferença significativa entre os grupos para o IPV após 2 meses, sendo melhor no grupo que recebeu a terapia periodontal não cirúrgica. Após 3 meses, todos os parâmetros clínicos melhoraram, havendo diferença significativa intragrupo, mas sem diferença significativa intergrupo. Houve melhora dos parâmetros para ambos os grupos nos períodos avaliados, mas o GT apresentou médias menores quando comparados ao GC nos períodos após a terapia.. Houve redução nos níveis de HbA1c nos pacientes de ambos os grupos, mas foi significativa apenas no grupo que recebeu a terapia periodontal não cirúrgica.. Não avaliado. Não houve diferenças estatísticas entre os grupos, e nem em cada grupo após o tratamento.. Ambas terapias mostraram redução em todas as espécies com 3 e 12 meses em comparação ao baseline. As espécies do complexo vermelho e P. intermedia reduziram mais no GT..

(25) 23 Tsalikis et al. 2014. Nowaiser et al. 2014. Hincapié et al. 2014. Avaliar o uso sistêmico de doxiciclina nos parâmetros clínicos, e microbiológicos de pacientes com DP e DM tipo II com bom controle glicêmico. 66 pacientes com DP e DM tipo II: GT: 33 (DOX) GC: 33 (PLA). RACR com uso ou não de doxiciclina Avaliação: baseline, 3 e 6 meses. Avaliar o uso sistêmico de doxiciclina nos parâmetros clínicos e microbiológicos de pacientes com DP e DM tipo II. 68 pacientes com DP e DM tipo II: GT: 35 (DOX) GC: 33 (PLA). RACR com uso ou não de doxiciclina Avaliação: baseline, 45 dias, 3 e 6 meses. Avaliar as mudanças na frequência de periodontopatóge nos em pacientes com DM tipo II com o uso do tratamento não cirúrgico e azitromicina.. 90 pacientes com DP e DM tipo II: AZRACR: 28 PLARACR: 31 AZPROF: 31. RACR com azitromicina; RACR com placebo; Profilaxia com azitromicina. Avaliação: baseline, 3, 6 e 9 meses.. PS; NCI; RG; ISS HbA1c. Houve melhora da PS, ISS, NCI para amos os grupos, mas sem diferença entre eles.. Não houve alterações nos níveis HbAc1 para amobos os grupos e nem diferença entre eles.. P. gingivalis T. forsythia T. denticola P. intermedia A. actinomycetemc omitans IP; IG; ISS; PS; NCI.. Não foi encontrada diferença entre os grupos, mas houve redução dos níveis dessas bactérias com 3 ou 6 meses.. O IG do GT melhorou mais após 6 meses do que o GC.. Não avaliado. Redução da população de P. gingivalis, T. forsythia e P. intermedia foi melhor no GT na avaliação de 3 meses.. Houve melhora do NCI dos grupos AZRACR e PLRACR, não foi visto alteração do grupo que só recebeu a profilaxia e a azitromicina.. Houve redução de HbAc1 apenas no grupo que recebeu tratamento completo (AZRACR). Houve redução de P. gingivalis, T. denticola e A. actinomycetemcomitan após 3 meses, mas aumento progressive até 9 meses. T. forsythia aumentou após 3 meses em todos os grupos, mas o grupo placebo teve a maior frequência nos 9 meses.. P. gingivalis T. forsythia P. intermedia A. actinomycetemc omitans IP; ISS; PS; NCI. HbAc1. P. gingivalis T. forsythia T. denticola A. actinomycetemc omitans. IPV: Índice de Placa Visível; ISS: Índice de Sangramento à Sondagem; PS: Profundidade de Sondagem; NCI: Nível Clínico de Inserção; RG: Recessão Gengival; HbA1c: Hemoglobina glicada. Fonte: Dados da Pesquisa. Natal/RN, 2017..

(26) 24. 3 OBJETIVOS 3.1 GERAL Avaliar a influência da Diabetes Mellitus tipo II na eficácia do tratamento periodontal básico pela técnica do “Full Mouth Disinfection” através dos parâmetros clínicos periodontais e microbiológicos da saliva em pacientes com Periodontite Crônica.. 3.2 ESPECÍFICOS Comparar os parâmetros clínicos e a quantidade de bactérias presentes na saliva entre os pacientes que tem ou não diabetes mellitus tipo II. Avaliar o efeito da terapia sobre os aspectos clínicos periodontais e sobre as espécies bacterianas encontradas na saliva ao longo de 12 meses..

(27) 25. 4 METODOLOGIA 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS Esta pesquisa tem características de uma coorte, por se tratar de um estudo longitudinal, e de ensaio clínico não randomizado, por ter realizado o tratamento periodontal, contudo ambos os grupos receberam o mesmo tipo de tratamento. Este estudo originou-se da pesquisa intitulada “Resposta Clínica Periodontal e Controle Glicêmico em pacientes com diabetes tipo II portadores de Periodontite Crônica ao tratamento periodontal ‘Full Mouth Desinfection’”, que teve como objetivo avaliar a efetividade da resposta clínica periodontal e o controle glicêmico em pacientes com DM tipo II portadores de periodontite crônica com a realização do tratamento periodontal não cirúrgico (FMD), e comparar esses resultados com pacientes não diabéticos. Esta pesquisa foi submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP/UFRN), sendo aprovada com o protocolo 403/2011, CAAE: 0151.0.051.000-11 (Anexo A). Os pacientes foram incluídos nesse estudo após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice A).. 4.2 POPULAÇÃO E AMOSTRA Foram considerados para participar da pesquisa pacientes com mais de 18 anos. Para o grupo de pacientes com diabetes, buscou-se pacientes que já tinham diagnóstico médico de diabetes. Essa busca foi feita no próprio Departamento de Odontologia da UFRN e em centros de saúde como o Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL) e o Centro Clínico da Ribeira da cidade de Natal. Todos estes são centros de referências no atendimento odontológico ou no tratamento e acompanhamento de pacientes com Diabetes..

(28) 26. 4.2.1 Critérios de Inclusão e exclusão 4.2.1.1 Critérios de Inclusão e exclusão dos pacientes Grupo Diabético (GD): . Possuir o diagnóstico médico de diabetes mellitus tipo II de acordo com a Associação Americana de Diabetes (AAD);. . Possuir o diagnóstico clínico de periodontite crônica de acordo com a Academia Americana de Periodontia (1999), e segundo Lopez; Smith; Gutierrez, (2002): presença de quatro ou mais dentes com no mínimo um sítio com profundidade de sondagem (PS) maior ou igual a 4mm e nível clínico de inserção (NCI) maior ou igual a 3 mm em cada dente;. Grupo Não Diabético (GND): . Possuir o diagnóstico clínico de periodontite crônica de acordo com a Academia Americana de Periodontia (1999) e segundo Lopez; Smith; Gutierrez, (2002) e: presença de quatro ou mais dentes com no mínimo um sítio com profundidade de sondagem (PS) maior ou igual a 4mm e nível clínico de inserção (NCI) maior ou igual a 3 mm em cada dente;. Foram excluídos os pacientes que apresentaram maiores complicações sistêmicas, como doença cardiovascular, Alzheimer, doenças pulmonares ou cerebrais e outras síndromes metabólicas. Também foram excluídos aqueles que utilizavam anti-inflamatórios, antibióticos ou imunossupressores nos últimos seis meses anteriores ao início da pesquisa; fumantes durante os últimos 05 anos; que estavam grávidas ou amamentando e que utilizavam aparelho ortodôntico.. 4.2.2 Cálculo do tamanho da amostra O cálculo amostral determinou que 18 indivíduos em cada grupo seriam suficientes para avaliar uma diferença mínima de 1mm na alteração do NCI dos sítios doentes entre o grupo GD e GND em 12 meses, tendo o cálculo poder de 80%, intervalo de confiança de 95% e desvio padrão de 1. Entretanto, o processo.

(29) 27. de amostragem foi não probabilístico, utilizando uma amostra por conveniência, delimitada através dos critérios de inclusão e exclusão. 4.3 COLETA DE DADOS Os pacientes participaram de uma primeira consulta a fim de verificar os critérios de inclusão e exclusão. Quando o mesmo foi inserido na pesquisa, foi realizada a anamnese e solicitado o primeiro exame sanguíneo para confirmar o diagnóstico da Diabetes. Durante a anamnese, perguntava-se ao paciente diabético como ele controlava seus níveis glicêmicos, questionando o uso de medicamentos. O exame sanguíneo foi realizado para verificar o hemograma, glicose em jejum e Hemoglobina Glicada e confirmar o diagnóstico de DM nos dois grupos, os exames foram entregues antes da realização de cada consulta do baseline, e para o GD a cada retorno era solicitado novos exames. Em seguida, foram realizados o exame periodontal e o tratamento necessário no baseline, seis e 12 meses após o exame inicial para ambos os grupos, e duas sessões de manutenção com 3 e 9 meses. A figura 1 mostra o cronograma das avaliações e o que foi realizado em cada etapa do estudo. Figura 1 - Cronograma das avaliações Baseline. T0. 3 meses. Manutenção. 6 meses. T1. 9 meses. Manutenção. 12 meses. T2. T0: Anamnese + Coleta de material biológico + Exame Periodontal + Protocolo Full mouth Desinfection (FMD) + Apresentação do primeiro exame sanguíneo + Solicitação de novo exame sanguíneo, apenas para pacientes do grupo teste. T1, T2: Coleta de material biológico + Exame Periodontal + Terapia de manutenção, quando necessária + Apresentação do exame anterior + Solicitação de novo exame sanguíneo (apenas para pacientes do grupo teste).. 4.3.1 Exame Clínico Periodontal Em relação ao exame clínico periodontal, os dados foram anotados numa ficha clínica (Apêndice B) e as variáveis examinadas estão discriminadas abaixo: 1) Índice de sangramento à sondagem (ISS) (MUHLEMAN; SON, 1971): é registrada a presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de sangramento até 30 segundos transcorridos da sondagem realizada até o fundo do sulco/bolsa.

(30) 28. periodontal, verificado com a utilização da sonda Carolina do Norte. Esses escores foram transformados em porcentagem para futura análise estatística. Considerou-se 100% quando o todos os sítios do paciente apresentavam escore 1, sendo feita uma regra de três simples para as demais associações. 2) Índice de placa visível (IPV) (AINAMO; BAY, 1975): quantidade de biofilme na região adjacente ao tecido gengival. Foi registrado através de análise visual a presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de biofilme após secagem da superfície dental com ar comprimido. O mesmo procedimento de transformação para porcentagem utilizado para o ISS foi feito para o IPV. 3) Profundidade de sondagem (PS): distância em milímetros (mm) da margem gengival ao fundo da bolsa periodontal, verificada com a sonda Carolina do Norte; 4) Recessão gengival (RG): distância em milímetros (mm) da junção cemento-esmalte ou da cervical do dente à margem gengival/mucosa (COX; ZARB, 1987). 5) Nível clínico de inserção (NCI): distância em milímetros (mm) da junção cemento-esmalte ao fundo da bolsa ou sulco periodontal, verificada com a sonda Carolina do Norte. Foi calculado através da somatória da profundidade de sondagem e a recessão gengival. 4.3.2 Coleta da Saliva As amostras de saliva foram colhidas antes dos exames periodontais nos períodos avaliados. Uma amostra de saliva por paciente foi coletada em microtubos estéreis vazios, tipo eppenddorf. De acordo com a metodologia descrita por Sakai et al. (2007), os pacientes depositaram a saliva, de forma não estimulada, diretamente em microtubos estéreis dentro de um período de 1 a 5 minutos. Em seguida, os microtubos foram armazenados a -20ºC sem adição de outras substâncias até o momento da extração do DNA bacteriano.. 4.3.3 Tratamento Periodontal Básico pelo Full Mouth Disinfection (FMD) Segundo o protocolo proposto por Quirynen et al. (1995), a abordagem terapêutica é realizada em até 24 horas, realizando a raspagem ultrassônica.

(31) 29. associada à raspagem e ao alisamento com instrumentos manuais, com o tempo aproximado de 1 hora por quadrante. Imediatamente após a instrumentação, a desinfecção foi realizada seguindo a ordem: escovação da língua por 1 minuto com gel de clorexidina a 1%; irrigação subgengival dos sítios periodontalmente comprometidos (PS > 3mm) com gel de clorexidina a 1% com auxílio de uma seringa sem ponta ativa; bochecho com solução de clorexidina a 0,12% por 1 minuto (sendo 10. segundos de. gargarejo,. numa. tentativa de alcançar as tonsilas) e,. adicionalmente, os pacientes foram instruídos a fazer esse mesmo bochecho de 12 em 12 horas, durante 14 dias. Nos retornos a cada três meses, foi realizada a terapia de manutenção, em que os pacientes recebiam uma nova orientação de higiene oral e, se necessário, nova raspagem e alisamento radicular, sem o uso da clorexidina. Contudo, a coleta de dados só foi realizada nos períodos de avaliação do baseline, 6 e 12 meses após a terapia.. 4.3.4 Purificação e Extração do DNA bacteriano Foram utilizados 150µl da amostra saliva para a extração do DNA bacteriano. Para realizar o protocolo, foi utilizado o kit de purificação de DNA e RNA completo da MasterPureTM (Epicentre, Madison, WI, EUA). Após a obtenção dos 150 µl da saliva em microtubo tipo eppendorfs estéril, foi adicionado 150 µl de Tissue&Cell concentrado e 1 µl de Proteinase K. Em seguida as amostras foram levadas ao banho maria na temperatura de 63ºC, onde permaneceram por 20 minutos, e a cada 5 minutos era feito a agitação da amostra utilizando o vórtex. Depois de resfriar as amostras no gelo por 5 minutos, foi adicionado 1 µl RNAse, feito um vórtex, e levado a estufa por 30 minutos para ativação da enzima. Logo, foi adicionado 100 µl de MPC Protein e levado a centrífuga refrigerada a 4ºC, na rotação de 14 mil rpm por 10 minutos. Após a centrífuga, o DNA não bacteriano foi decantado no fundo do microtubo, e o sobrenadante era removido e colocado em um novo microtubo com 500 ml de Isopropanol e levado a centrífuga nas mesmas configurações. Esse processo formou o “pellet” contendo o DNA bacteriano. O isopropanol foi descartado e foi colocada a mesma quantidade de Etanol absoluto para iniciar o processo de lavagem e purificação do DNA bacteriano. Em seguida, a amostra foi novamente.

(32) 30. levada a centrífuga nas mesmas configurações por 2 min. Após esse processo, o etanol absoluto foi descartado e o etanol 70% adicionado e centrifugado também por 2 min. Depois do processo de lavagem com os álcoois, o último foi descartado e as amostras foram levadas para a estufa para que qualquer resquício de álcool fosse evaporado. As amostras foram então diluídas em 10 µl de Água DEPC e foi realizada a quantificação do DNA através do espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA). Para a amostra final ser considerada viável foi necessário ter a concentração mínima 20 ng/µl. Após a finalização desta etapa, as amostras foram armazenadas a -20ºC até o momento da realização do real-time PCR.. 4.3.5 Avaliação Microbiológica por meio do real-time PCR As espécies de bactérias que foram analisadas foram as do complexo vermelho: Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis e Tannerella forsythia através da técnica PCR real-time utilizando o LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). As reações de amplificação de cada amostra foram feitas em um volume final de 10 µl, e tinham que ter pelo menos 2,5 µl de DNA bacteriano isolado (20 ng/µl). Foi realizada também uma reação de mistura contendo os iniciadores, o FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics GmbH), e o DNA isolado. A quantificação absoluta da espécie-alvo em cada amostra foi verificada por meio de curvas-padrões preparadas com as estirpes de referência descritas na Tabela 1. A determinação do teor de DNA nos controles foi baseada no tamanho do genoma de cada uma das espécies e o peso médio de um par de nucleotídeos (Dolezel et al., 2003). Com base nas curvas padrões, a pontuação obtida das amostras individuais foi convertida no número de células bacterianas. O nível de detecção foi definido como 105 bactérias. Todo o protocolo microbiológico foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Odontologia II, da Universidade de Guarulhos.. Tabela 1 - Sequência de Primers, perfil de amplificação e comprimento estimado do produto final da Reação em Cadeia de Polimerase para espécies bacterianas. Espécie/ estirpe. Sequência. Perfil de Amplificação. Compriment o do Produto.

(33) 31. [temperatura(º C)/tempo(s)]. de referência P. gingivalis/ ATCC 33277. 5’ TGCAACTTGCCTTACAGAGGG. Nonnenmacher et al. (2004). 3’ ACTCGTATCGCCCGTTATTC. T. forsythia/ ATCC 43037. 5’ GATAGGCTTAACACATGCAAGTC. Al-Hebshi et al. (2010) T. denticola/ ATCC 35405. 3’ GTTGCGGGCAGGTTACATAC 5’ GACGCAAACGCATTAAGTG 3’ GACGCAAACGATTAAGTG. da PCR (bp). 95/10, 57/10, 72/14. 344. 95/10, 57/10, 72/4. 99. 95/10, 56/10, 72/7. 174. 4.4 QUADRO DE VARIÁVEIS Os quadros 2 e 3 apresentam a relação de variáveis dependentes e independentes do estudo, respectivamente, de acordo com a sua classificação e categorização. Quadro 2 - Variáveis independentes do estudo Variáveis. Classificação. Categorização. Diabetes Mellitus tipo II. Qualitativa Nominal Mutuamente Exclusiva. 0 – Ausência 1 – Presença. Periodontite Crônica. Qualitativa Nominal Mutuamente Exclusiva. 0 – Ausência 1 – Presença. Descrição Condição Crônica que afeta o modo como o corpo processa o açúcar no sangue (glicose). Doença inflamatória de caráter infeccioso que atinge o periodonto de proteção e sustentação.. Quadro 3. Variáveis dependentes do estudo. Variáveis Sexo Idade. Classificação Qualitativa Nominal Mutuamente Exclusiva Quantitativa discreta. Categorização. Descrição. 0 – Feminino 1 – Masculino. Diferença física e constitutiva do homem e da mulher.. Não categorizada T0 – baseline T1 – 6 meses T2 – 12 meses. Tempo transcorrido desde o nascimento.. Período. Qualitativa Ordinal. Quantidade de bactérias presente na saliva. Quantitativa Contínua. Não categorizada. Profundidade de Sondagem. Quantitativa Contínua. Não categorizada. Recessão Gengival. Quantitativa. Não. Períodos de avaliação periodontal Quantidade de bactérias verificadas através do método de PCR Distância, em milímetros (mm), da margem da gengiva/mucosa ao fundo da bolsa ou sulco periodontal. Distância em milímetros (mm) da.

(34) 32. Contínua. categorizada. Nível Clínico de Inserção. Quantitativa Contínua. Não categorizada. Índice de Sangramento a Sondagem. Quantitativa Contínua. Não categorizada. Índice de Placa Visível. Quantitativa Contínua. Não categorizada. Porcentagem de Sítios. Quantitativa contínua. Não categorizada. Número de dentes perdidos. Quantitativa discreta. Não categorizada. Número de sítios afetados. Quantitativa discreta. Não categorizada. Parâmetros Sanguíneos. Quantitativa discreta. Não categorizada. junção cemento-esmalte ou da cervical do dente à margem gengival/mucosa Em milímetros (mm), será obtida pela distância da junção cementoesmalte ao fundo do sulco ou bolsa periodontal. Presença de sangramento após a sondagem periodontal transformado em porcentagem Verificar a presença de biofilme em todas as faces dos dentes adjacentes a gengiva transformado em porcentagem. Porcentagem de sítios com profundidade de sondagem ≤3mm e >3 mm Número de dentes perdidos ao final do tratamento Quantidade de sítios com profundidade de sondagem ≥4 mm no baseline Exames sanguíneos de Glicose em jejum e Hemoglobina glicada para verificar níveis de glicose no sangue. 4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultados foram armazenados em um programa Estatístico SPSS 17.0 (Statistical Package for Social Science). Inicialmente, uma análise descritiva dos dados foi realizada para uma avaliação da distribuição da normalidade dos dados. Foram realizados testes não paramétricos diante da ausência de normalidade dos dados. A análise foi dividida entre os parâmetros clínicos e microbiológicos. Para parâmetros clínicos, foi realizada uma análise de todos os sítios e outra apenas com os sítios doentes (PS ≥ 4mm e NCI ≥ 3mm) (LOPEZ; SMITH; GUTIERREZ, 2002). Foram aplicados o teste de Mann-Whitney para análise inter-grupo em cada tempo, e o teste de Friedman para análise intra-grupo entre todos os períodos estudados, caso este obtivesse diferença significativa, o teste de Wilcoxon era realizado para identificar entre quais os períodos existiu a diferença, com penalização do “p” valor multiplicado pelo número de comparações. Além disso, também foi avaliado se havia diferença estatisticamente significativa durante todo o período do estudo e o baseline. Para isso, criou-se uma nova variável “delta (∆) ” para cada variável analisada indicando a diferença entre o inicial (baseline) e o final (12 meses), por exemplo ∆PS = PS12meses – PSbaseline,.

(35) 33. sendo estas comparadas entre GD e GND. Para todos os testes foi pré-estabelecido um nível de significância de 5% (alpha=0,05).. 5 RESULTADOS 5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA. Para este estudo foram tratados 70 pacientes que preencheram os critérios de inclusão, sendo 29 pertencentes ao GD e 41 ao GND. Ao longo do tempo houve perdas de pacientes, finalizando com 18 pacientes no GD e 36 pacientes no GND, após 12 meses de acompanhamento. O quantitativo em relação às perdas pode ser acompanhado no fluxograma presente na Figura 2. Os motivos para essas perdas consistiram de causas financeiras, motivos pessoais, resolução do “problema principal” nas primeiras consultas e também o próprio descaso com o tratamento empregado.. Figura 2 - Fluxograma da perda de pacientes no período de 12 meses.. . Inicialmente, havia 18 mulheres e 08 homens no GD, e 27 mulheres e 12 homens no GND. Ao final do período de 12 meses, o GD constituiu-se por 12 mulheres e 06 homens, enquanto que o GND possuía 25 mulheres e 11 homens. Não foi encontrada associação significativa entre os grupos com relação ao sexo (p=0,536). GND apresentou uma mediana de 11 dentes perdidos, enquanto que GD apresentou mediana de 16, não havendo diferença entre os grupos quanto a esta característica (p=0,159)..