Alterações fisiológicas e oxidativas durante o armazenamento em sementes de Moringa oleifera Lam.

Texto

(1)MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO UNIDADE ACADÊMICA ESPECIALIZADA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS - UAECIA. PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FLORESTAIS. Alterações fisiológicas e oxidativas durante o armazenamento em sementes de Moringa oleifera Lam.. Saniely Maria Bezerra de Melo. MACAÍBA/RN FEVEREIRO DE 2017.

(2) II. SANIELY MARIA BEZERRA DE MELO. Alterações fisiológicas e oxidativas durante o armazenamento em sementes de Moringa oleifera Lam.. Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação. em. Ciências. Florestais. da. Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Florestais.. Orientador: Prof. Dr. Eduardo Luiz Voigt. MACAÍBA/RN FEVEREIRO DE 2017.

(3) III.

(4) IV. Divisão de Serviços Técnicos Catalogação da Publicação na Fonte. Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias Campus Macaíba Biblioteca Setorial Professor Rodolfo Helinski. Melo, Saniely Maria Bezerra de Alterações fisiológicas e oxidativas durante o armazenamento em sementes de Moringa oleifera Lam. / Saniely Maria Bezerra de Melo. – Macaíba, RN, 2017. 53 f. -. Orientador (a): Prof. Prof. Dr. Eduardo Luiz Voigt Dissertação (Mestrado). Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias Campus Macaíba. Programa de PósGraduação em Ciências Florestais.. 1. Ascorbato – Dissertação. 2. Carbonilação de proteínas – Dissertação. 3. Deterioração de sementes – Dissertação. 4. Enzimas antioxidantes – Dissertação. 5. Peróxido de hidrogênio – Dissertação. I. Voigt. Eduardo Luiz. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias Campus Macaíba. IV. Título.. RN/UFRN/BSPRH. CDU: 631.528.2.

(5) V. À minha Mãe e meu Pai OFEREÇO.. À minha irmã Sandra Maria (In memorian). DEDICO.. “Os ventos que às vezes Levam para longe o que amamos São os mesmos Que trazem algo mais para ser amado. Nós não podemos chorar pelo Que nos foi tirado Nós não iremos... / Nós não iremos... Nós amaremos o que nos foi dado Pois tudo que é realmente nosso...não irá embora...”. Rafael Wissmann Monteiro.

(6) VI. AGRADECIMENTOS. A Deus por me permitir terminar este mestrado, por estar sempre ao meu lado nas horas de dificuldades, mas principalmente por me manter feliz a maior parte do tempo! Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Florestais, pela oportunidade de realizar mais um sonho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro, possibilitando a realização deste estudo. Agradeço eternamente ao meu orientador prof. Dr. Eduardo Voigt pelo carinho, confiança e incentivo, tão fundamentais para mim. Agradeço por me acolher entre seus orientados. Tenho grande orgulho de poder ter sido orientada por uma pessoa tão grandiosa, profissionalmente e pessoalmente. Aos Professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Florestais, Sidney Praxedes, Mauro Pacheco, Fábio Vieira, Paulo Marinho e Cristiane Macêdo. Aos colegas do LEBV, que me ajudaram e colaboraram no decorrer do meu experimento, os quais foram muito importantes nessa caminhada. Meu muito obrigada a Danilo Flademir, Ana Paula Avelino, Hanieri Alves, Willianne Kelle e Vitor Moreira. Aos colegas de mestrado que juntos compartilhamos momentos de tristeza e alegria, Guilherme de Pádua, Jéssica Mayara, Juliana Soares, João Antônio Vieira e Mileny Galdino. Aos meus pais, Armando e Sônia, meus irmãos, André, Sanzia e Sandra (In memorian), aos meus sobrinhos, Amanda, Felipe, Rayane e Renata, por me fazerem perceber que temos que ensinar e servir de exemplo para que eles cresçam e continuem tendo orgulho do que somos, a todos os meus familiares, pelo amor incondicional e incentivo. A Natália Cabral, amiga para todas as horas, que eu aprendi a conhecer e conviver, você foi uma companheira, conselheira. Nunca esquecerei das tuas palavras de entusiasmos e força. Aos antigos amigos os quais a vida providenciou o caminhar em outras trilhas, apesar de ausentes estão em meu coração, pois participaram das melhores épocas da minha vida, muito obrigada.. A todos vocês o meu sincero: Muito Obrigada!.

(7) VII. SUMÁRIO RESUMO.....................................................................................................................1 ABSTRACT.................................................................................................................2 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................3 1.1 Deterioração de sementes ....................................................................................3 1.2 Estresse oxidativo .................................................................................................4 1.3 Moringa oleifera Lam. ............................................................................................8 2. OBJETIVO GERAL ............................................................................................... 10 2.1 Objetivos específicos .......................................................................................... 10 3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 11 3.1 Obtenção das sementes...................................................................................... 11 3.2 Tratamentos e coletas ......................................................................................... 11 3.3 Determinação física ............................................................................................. 11 3.3.1. Teor de água das sementes ............................................................................ 11 3.4 Determinações fisiológicas ................................................................................ 12 3.4.1 Germinação ...................................................................................................... 12 3.4.2 Índice de velocidade de germinação ................................................................ 12 3.4.3 Porcentagem de plântulas anormais ................................................................ 12 3.5 Determinações bioquímicas ................................................................................ 13 3.5.1 Lixiviação de K+ ................................................................................................ 13 3.5.2 Peróxido de hidrogênio (H2O2) ......................................................................... 13 3.5.3 Peroxidação de lipídios .................................................................................... 13 3.5.4 Carbonilação de proteínas ............................................................................... 14 3.5.5 Ascorbato reduzido (AsA)................................................................................. 14 3.6 Atividades enzimáticas ........................................................................................ 15 3.6.1 Preparo dos extratos ........................................................................................ 15 3.6.2 Superóxido dismutase (SOD) – [E.C. 1.15.1.1] ................................................ 15 3.6.3 Peroxidase de ascorbato (APX) – [E.C. 1.11.1.11] .......................................... 15 3.6.4 Peroxidase de fenóis (POX) – [EC: 1.11.1.7] ................................................... 16 3.6.5 Catalase (CAT) – [E.C. 1.11.1.6] ...................................................................... 16 3.7 Desenho experimental e análise estatística ........................................................ 17 4. RESULTADOS ...................................................................................................... 17 5. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 22 6. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 26 7. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 27.

(8) VIII. LISTA DE FIGURA. Figura 1. Principais sistemas de desintoxicação celular de EROS em. 6. plantas. CAT, catalase; SOD, superóxido dismutase; APX, peroxidase. de. ascorbato;. MDHAR,. monodehidroascorbato. redutase; DHAR, dehidroascorbato redutase, GR, glutationa redutase. AsA, ascorbato; MDHA, monodehidroascorbato; DHA, dehidroascorbate; GSSG, glutationa oxidada; GSH, glutationa reduzida; α-tocH, α-tocoferol reduzido; α-toc·, radical α- tocoferol; LOOH, hidroperóxido de lipídio; LOO·, radical lipídico. (BAILLY, 2004). Figura 2. Teor de água (a) e porcentagem de germinação (b) em sementes 18 de moringa armazenadas em câmara de crescimento a 27 ± 2ºC e 65% de UR (●) e em refrigerador a 4 ± 2ºC e 25% de UR (○) por 18 meses.. Figura 3. Índice de velocidade de germinação (a), lixiviação de K + (b), 19 porcentagem de plântulas anormais (c) e aspecto morfológico de plântulas normais e anormais (d), obtidos para sementes de moringa durante o armazenamento em câmara de crescimento a 27 ± 2ºC e 65% de UR (●) e em refrigerador a 4 ± 2ºC e 25% de UR (○) por 18 meses.. Figura 4. Conteúdo de H2O2 (a), TBARS (b), carbonilação de proteínas (c) e 20 AsA (d) obtidos para embriões de sementes de moringa durante o armazenamento em câmara de crescimento 27 ± 2ºC e 65% de UR (●) e em refrigerador 4 ± 2ºC e 25% de UR (○) por 18 meses.. Figura 5. Atividade de SOD (a), APX (b), POX (c) e CAT (d) obtidos para 21 embriões de sementes de moringa durante o armazenamento em câmara de crescimento 27 ± 2ºC e 65% de UR (●) e em refrigerador 4 ± 2ºC e 25% de UR (○) por 18 meses..

(9) IX. LISTA DE ABREVIATURAS. APX AsA AsA + DHA CAT Cu/Zn-SOD DHA DNPH DTT DTNB EDTA EROs Fe-SOD GR GSH H2O2 IVG MS MF Mn-SOD NBT NADPH O2OHPOX PVP RAS SOD TBARS TBA TCA TNB Tris-HCl U UR UV %U %G. Peroxidase do Ascorbato Ascorbato reduzido Ascorbato total Catalase Superóxido dismutase dependente de cobre e zinco Ascorbato oxidado 2,4-dinitrofenilhidrazina Ditiotreitol 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoico Ácido etilenodiaminotetracético Espécies reativas de oxigênio Superóxido dismutases dependente de ferro Glutationa redutase Glutationa reduzida Peróxido de hidrogênio Índice de velocidade de germinação Massa seca Massa fresca Superóxidos dismutase dependente de mangânes Nitroazul tetrazólio Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida Ânion superóxido Radical hidroxil Peroxidase de fenóis Polivinilpirrolidona Regras para Análises de Sementes Superóxido dismutase Espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico Ácido tiobarbitúrico Ácido tricloacético Ácido 2-nitro-5-mercapto benzólico Tris-hidroximetil aminometano Unidade de atividade enzimática Umidade relativa do ar Radiação ultravioleta Porcentagem de umidade Porcentagem de germinação.

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(11) 1. RESUMO. Os danos oxidativos apresentam papel central na deterioração das sementes durante o armazenamento. Deste modo, o presente trabalho objetivou caracterizar a viabilidade e o vigor, assim como o dano e a proteção oxidativa durante o armazenamento de sementes de Moringa oleifera Lam. (moringa). Para tanto, as sementes foram acondicionadas em sacos plásticos semipermeáveis e armazenadas em câmara de crescimento (27 ± 2ºC e UR de 65%) e em refrigerador (4 ± 2ºC e UR de 25%) por 18 meses. As amostras foram coletadas após a colheita e a cada três meses durante o armazenamento, avaliando-se teor de água, porcentagem de germinação, índice de velocidade de germinação (IVG), porcentagem de plântulas anormais, lixiviação de K+, conteúdo de H2O2, peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas, conteúdo de ascorbato reduzido (AsA), além das atividades de superóxido dismutase (SOD), peroxidase de ascorbato (APX), peroxidase de fenóis (POX) e catalase (CAT). A diminuição da porcentagem de germinação e do IVG aliada ao aumento da lixiviação de K+ e da porcentagem de plântulas anormais ocorreu mais acentuadamente nas sementes armazenadas em câmara de crescimento que naquelas armazenadas sob refrigeração, ao longo de 18 meses. Independente do ambiente de armazenamento, a peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas permaneceram inalteradas, enquanto que o correu diminuição do conteúdo de H2O2 e da atividade de POX em paralelo com o aumento do conteúdo de AsA e das atividades de SOD, APX e CAT. Desta forma, a viabilidade e o vigor das sementes de moringa são melhor conservados em ambiente refrigerado com baixa UR por um prazo máximo de 15 meses. A perda da qualidade após este prazo não pode ser associada à acumulação de H2O2, à peroxidação lipídica e a oxidação de proteínas. A preservação do conteúdo de ascorbato reduzido e das atividades de superóxido dismutase, ascorbato peroxidase e catalase parece insuficiente para manter a viabilidade e o vigor das sementes de moringa a partir de 15 meses de armazenamento.. Palavras-chave: Ascorbato; Carbonilação de proteínas; Deterioração de sementes; Enzimas antioxidantes; Peróxido de hidrogênio..

(12) 2. Physiological and oxidative changes during the storage of Moringa oleifera Lam seeds. ABSTRACT. Oxidative damage plays a central role in seed deterioration during storage. In this way, the present work aimed to characterize viability and vigor as well as oxidative damage and protection during the storage of Moringa oleifera Lam. (moringa) seeds. Seeds were kept in plastic bags and stored in a growth chamber (27 ± 2°C and RH 65%) or in a refrigerator (4 ± 2°C and RH 25%) for eighteen months. Samples were collected just after harvesting and every three months during storage, evaluating water content, germination percentage, germination speed index, percentage of abnormal seedlings, K+ leakage, H2O2 content, lipid peroxidation, protein carbonylation, reduced ascorbate content, as the activity of superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, phenol peroxidase and catalase. A decrease in the percentage of abnormal seedlings occurred more sharply in the seeds stored in the growth chamber than in those stored under refrigeration for 18 months. Regardless of the storage environment, lipid peroxidation and protein carbonylation remained unchanged, whereas the content of H2O2 and POX activity decreased in parallel with an increase in the AsA content and SOD, APX and CAT activities. The viability and vigor of moringa seeds are best conserved under refrigeration and low RH for a maximum period of 15 months. Loss of quality after this time can not be associated with the accumulation of H2O2, lipid peroxidation and protein oxidation. Preservation of AsA levels and SOD, APX and CAT activities seems insufficient to maintain viability and vigor of moringa seeds after 15 months of storage.. Key words: Ascorbate; Protein carbonylation; Seed deterioration; Antioxidant enzymes; Hydrogen peroxide..

(13) 3. 1. INTRODUÇÃO 1.1 Deterioração de sementes. As sementes apresentam elevada importância ecológica e econômica, uma vez que dão continuidade ao ciclo de vida das plantas e são utilizadas como alimentos, forragens e matérias-primas para a indústria (BEWLEY et al., 2013). Neste sentido, a preservação da viabilidade e do vigor das sementes é fundamental para programas de recuperação de áreas degradadas e plantios agroflorestais, assim como a conservação das reservas nutritivas é indispensável para o consumo das sementes ou a sua utilização na fabricação de produtos (RAJJOU e DEBEAUJO, 2008). Tendo em vista que as sementes deterioram durante o armazenamento, é imperativo elucidar os mecanismos responsáveis pela deterioração para otimizar tecnologias voltadas à preservação da qualidade das sementes. O envelhecimento natural reduz progressivamente a viabilidade e o vigor das sementes, promovendo processos de deterioração durante o armazenamento (GROOT et al., 2012; BEWLEY et al., 2013). Mesmo que a deterioração seja um processo irreversível e inevitável, a perda da qualidade das sementes pode ser retardada por meio de técnicas apropriadas de colheita, secagem e armazenamento (MCDONALD, 1999; MONCALEANO-ESCANDON et al., 2013). Dentre os fatores que promovem a deterioração das sementes, destacam-se a temperatura e a umidade relativa do ar, pois o aumento de ambos e a sua ação sinérgica aceleram o metabolismo das sementes, bem como reações não enzimáticas, além do crescimento microbiano (BEWLEY et al., 2013). Em adição, a qualidade inicial do lote de sementes, o ambiente de armazenamento, a disponibilidade de oxigênio, os tipos de embalagens utilizadas e as características inerentes de cada espécie, também influenciam a cinética de deterioração (TONIN e PEREZ, 2006). A perda da viabilidade e do vigor das sementes durante o armazenamento se deve a uma serie de lesões em nível celular e molecular, especialmente a perda da integridade do DNA, das enzimas e das membranas (MCDONALD, 1999; BAILLY, 2004; SHABAN, 2013). Quando as sementes são reidratadas e o metabolismo é reativado durante a germinação, estas lesões ocasionam falhas na divisão celular, comprometem as reações de reparo, biossíntese e produção de energia, além de.

(14) 4. causarem a perda da compartimentalização intracelular (MCDONALD, 1999; KIBINZA et al., 2006; BEWLEY et al., 2013). As lesões celulares e moleculares que ocorrem nas sementes ao longo do armazenamento são propiciadas por reações de deterioração, incluindo reações hidrolíticas, oxidativas e peroxidativas. As reações hidrolíticas ocorrem em sementes armazenadas sob umidade mais elevada e envolvem principalmente a clivagem dos compostos de reserva por meio de reações não enzimáticas. Estas reações incluem a desesterificação dos triacilglicerois, a despolimerização do amido e os passos iniciais das reações Maillard (BLACK et al., 2006). As reações oxidativas envolvem a remoção de elétrons das cadeias carbônicas, sem que haja a inserção direta de átomos de oxigênio na molécula. Estas reações podem ocorrer por mecanismos não enzimáticos desencadeados por luz, calor ou metais, mas também podem ser catalisadas por enzimas, promovendo a formação de EROs (BLACK et al., 2006). Em contraponto, as reações de peroxidação envolvem a inserção de átomos de O nas moléculas devido à ação de EROs. O principal processo de peroxidação decorrente do envelhecimento em sementes corresponde à autooxidação das caudas de ácidos graxos poliinsaturados, a qual é iniciada pela formação de hidroperóxidos de lipídios e seguida pela clivagem das caudas, danificando severamente as membranas celulares (DEMIDCHIK, 2015). A extensão na qual o processo de deterioração ocorre depende da capacidade apresentada pelas sementes para resistir às reações de deterioração, devido aos mecanismos de proteção (SISMAN e DELIBAS, 2004; MOHAMMADI et al., 2011; SHABAN, 2013).. 1.2 Estresse oxidativo. Como previamente estabelecido pela “teoria dos radicais livres” o estresse oxidativo deve apresentar contribuição significativa nos mecanismos bioquímicos de deterioração das sementes (WALTERS et al., 2010) e é acompanhada praticamente por todos os estresses bióticos e abióticos em plantas superiores (DEMIDCHIK, 2015), sendo estabelecido quando há desbalanço entre a produção e a eliminação das EROs (KIM e KWAK, 2010). Nesta situação, as EROs promovem lesões em nível molecular, sobretudo em ácidos nucleicos, proteínas e lipídios, comprometendo o metabolismo e a integridade das membranas celulares (SMITH et al., 2009). As EROs são.

(15) 5. subprodutos das reações redox (KOVALCHUK, 2010), apresentando-se sob a forma de radicais livres ou moléculas. Os principais radicais livres são o ânion superóxido (O2•-), o radical hidroxila (OH•) e o radical hidroperoxila (HO2•), enquanto que o oxigênio singlete (1O2) e o peróxido de hidrogênio (H2O2) são os principais exemplos de moléculas que atuam como EROs (D’AUTRÉAUX e TOLEDANO, 2007; BHATTACHARJEE, 2010). O O2•- é produzido pela redução parcial do O2 (oxigênio molecular) e é uma ERO de vida curta, originando o H2O2 e o OH•. O H2O2 pode ser gerado a partir do O2•- por dismutação não enzimática em pH baixo ou pela ação de metais de transição, como cobre e ferro, pela reação de Haber-Weiss. Além disso, o OH• pode ser formado a partir do H2O2 pela ação do ferro na reação de Fenton (GILL e TUTEJA, 2010). Em sementes ortodoxas maduras, o baixo teor de água mantém os tecidos em estado vítreo, de modo que as EROs não devem ser produzidas por reações enzimáticas. Assim sendo, as principais fontes de EROs nestas sementes devem ser reações não enzimáticas, como a peroxidação lipídica e as reações de Maillard (BAILLY et al., 2008). Os danos oxidativos podem ser evitados ou amenizados por mecanismos detoxificantes enzimáticos e não enzimáticos. As principais enzimas antioxidantes em plantas são as superóxido dismutases (SOD), catalases (CAT), peroxidases do ascorbato (APX) e de fenóis (POX), enquanto que os antioxidantes não enzimáticos incluem o ascorbato e a glutationa (BAILLY et al., 2008). Tais antioxidantes podem evitar a formação de radicais livres, sequestrá-los ou promover a sua degradação, prevenindo a ocorrência de danos às células das plantas (SERKEDJIEVA, 2011). Os principais mecanismos envolvidos na desintoxicação celular de EROs em plantas são mostrados na Figura 1..

(16) 6. Figura 1. Principais sistemas de desintoxicação celular de EROS em plantas. CAT, catalase; SOD, superóxido dismutase; APX, peroxidase de ascorbato; MDHAR, monodehidroascorbato redutase; DHAR,. dehidroascorbato. redutase,. GR,. glutationa. redutase.. AsA,. ascorbato;. MDHA,. monodehidroascorbato; DHA, dehidroascorbate; GSSG, glutationa oxidada; GSH, glutationa reduzida; α-tocH, α-tocoferol reduzido; α-toc·, radical α- tocoferol; LOOH, hidroperóxido de lipídio; LOO·, radical lipídico. (BAILLY, 2004).. As SODs são metalo-enzimas consideradas como a primeira linha de defesa contra as EROs, catalisando a dismutação de dois O2•- a H2O2 e O2. Estas enzimas estão envolvidas na modulação do nível de H2O2 em cloroplastos, mitocôndrias, peroxissomos e no citosol (MITTLER, 2002; BHATTACHARJEE, 2010). As SODs podem ocorrer sob três isoformas, dependendo do metal associado a mesma. As plantas normalmente têm Cu/Zn-SOD no citosol, Cu/Zn e/ou Fe-SOD nos cloroplastos e Mn-SOD nas mitocôndrias (DUBEY, 2011; DINAKAR et al., 2012). As APX são heme-peroxidases que tem como grupo prostético uma protoporfirina e apresentam alta especificidade por AsA (De GARA, 2004; DABROWSKA et al., 2007), que funciona como substrato redutor. A família das APX consiste em pelo menos cinco isoformas diferentes, incluindo as do tilacóide (tAPX),.

(17) 7. do estroma (sAPX), dos glioxissomos (gmAPX), bem como a isoforma citosólica (cAPX) (NOCTOR e FOYER, 1998; GILL e TUTEJA, 2010). As POXs apresentam um caráter bifuncional no metabolismo oxidativo, pois podem utilizar o H2O2 para oxidar vários substratos por meio dos seus ciclos catalíticos peroxidativos e também podem produzir OH• a partir do H2O2 por intermédio dos seus ciclos catalíticos hidroxílicos (PASSARDI et al., 2004). As POXs preferem doadores de elétrons aromáticos, tais como o guaiacol e o pirogalol. As atividades das POXs variam consideravelmente dependendo das espécies de plantas e das condições de estresse (GILL e TUTEJA, 2010), podendo utilizar o H2O2 como oxidante e compostos de natureza fenólica como doadores de elétrons. Dessa forma, o H2O2 formado pela ação de SOD também pode ser eliminado pelas POXs, além da CAT e APX (LOCATO et al., 2010; BARBOSA et al., 2014). A CAT é uma heme-enzima peroxissomal que catalisa a redução do H2O2 em H2O e O2, sem utilizar antioxidantes não enzimáticos (ZAMOCKY et al., 2001; MAIA, 2008). A atividade da CAT é efetiva em concentrações milimolares de H2O2, sendo indispensável para a desintoxicação das EROs em condições de estresse severo (DUBEY, 2011; BARBOSA et al., 2014). Em geral, são reconhecidas três isoformas de CAT, incluído duas isoformas peroxissomais e uma isoforma glioxissomal (BAILLY et al., 2008). Além das enzimas antioxidantes, os principais metabólitos antioxidantes incluem o ácido ascórbico (AsA), a glutationa (GSH), o α-tocoferol e os carotenoides. Todos ocorrem em cloroplastos, mitocôndrias e peroxissomos (MITTLER, 2002; KIM e KWAK, 2010; DINAKAR et al., 2012; BARBOSA et al., 2014). O AsA tem sido considerado o principal antioxidante não enzimático, atuando juntamente com a GSH (tripeptídeo formado de glicina, glutamato e cisteína) no ciclo ascorbato-glutationa, também chamado ciclo de Halliwell-Asada, no qual o AsA é recuperado por meio da oxidação da GSH (SMIRNOFF, 2005). Tanto os carotenoides como os α-tocoferois (vitamina E) são moléculas lipossolúveis e o α-tocoferol atua na proteção dos ácidos graxos poli-insaturados contra a peroxidação dos lipídios de membrana pelas EROs (MAEDA e DELLAPENNA, 2007; BARBOSA et al., 2014). Observações feitas em diferentes espécies mostram que o estresse oxidativo aumenta com a idade nas sementes (BAILLY et al., 1996; KIBINZA et al., 2006), ocorrendo concomitantemente com a diminuição das defesas antioxidantes celulares (BAILLY et al., 1996; GOEL et al., 2003; KRANNER et al., 2006). Por exemplo, em.

(18) 8. sementes de girassol previamente envigoradas e submetidas ao teste de envelhecimento acelerado, a atividade de CAT se mostra crucial para o reparo dos danos oxidativos (KIBINZA et al., 2011). De forma adicional, a deterioração de sementes de girassol durante o armazenamento em condições controladas envolve a diminuição da atividade de SOD (ABREU et al., 2013). A atividade da peroxidase diminuiu em sementes envelhecidas, quando comparadas com sementes frescas de rabanete (SCIALABBA et al., 2002) e em sementes de girassol durante o envelhecimento (PALLAVI et al., 2003). Peroxidases e catalases foram detectadas em maiores proporções em sementes mais jovens de Chenopodium rubrum (MITROVIC et al., 2005). Apesar do crescente interesse nesta área de pesquisa, ainda existem diversos aspectos a serem explorados e que poderão ajudar na compreensão do papel dos mecanismos antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos no processo de deterioração das sementes em espécies florestais. Há várias evidências de que a diminuição da atividade de enzimas antioxidantes durante o armazenamento está envolvida nos mecanismos bioquímicos que acarretam a deterioração das sementes (SHABAN, 2013). Diante da relevância do estresse oxidativo, é imperativo caracterizar os danos oxidativos ocasionados durante o armazenamento em sementes de espécies florestais com apelo econômico.. 1.3 Moringa oleifera Lam.. A Moringa oleifera Lam. (moringa) é uma espécie pertencente à família Moringaceae, nativa do Noroeste Indiano (SHARMA et al., 2011), amplamente distribuída nos países da Ásia, do Oriente médio e da África, especialmente em Singapura, Índia, Sri Lanka, Malásia, Filipinas, Tailândia, Paquistão, Nigéria e Egito. Também pode ser encontrada na América Central e América do Sul, em países como Jamaica e México (RAMACHANDRAN et al., 1980; ANWAR e BHANGER, 2003; BEZERRA et al., 2004). É uma planta arbórea rústica, de rápido crescimento, resistente à seca, amplamente cultivada em regiões tropicais e subtropicais (SOUZA, 2003; RAMOS, 2010). No Brasil, a moringa tem sido cultivada desde 1950, sendo encontrada na Região Nordeste, principalmente nos Estados do Maranhão, Piauí e Ceará..

(19) 9. É cultivada como planta ornamental e medicinal, sendo conhecida como líriobranco, quiabo de quina ou simplesmente moringa (LORENZI e MATOS, 2002). Quase todas as partes da moringa, tais como cascas, folhas, sementes e raízes são ricas em vitaminas, sais minerais e são amplamente utilizadas na fitoterapia (MAHAJAN e MEHTA, 2007; ULLAH et al., 2015), como suplementos dietéticos (LEONE et al., 2015), consumidas como vegetais (ABD EL BAKY HANAA e ELGAMAL BAROTY, 2013; BHUTADA et al., 2016), utilizadas na extração de óleo comestível (AL-SAID et al., 2012) e como floculantes naturais para a purificação de água (JAHN, 1981; 1986; ULLAH et al., 2015). Mais recentemente, as sementes têm sido empregadas como floculantes para a produção industrial de etanol a partir da cana-de-açúcar (COSTA et al., 2014). As sementes de moringa são ricas em proteínas (34%) e lipídeos (37%) (MACHADO e CARNEIRO, 2000). Devido à elevada concentração de ácido oleico (78%) dos lipídios, que proporciona estabilidade contra a oxidação (RASHID et al., 2008; SILVA et al., 2010; RIVAS et al., 2013), as sementes de moringa consistem em matérias-primas adequadas para a produção de biodiesel (SILVA et al., 2010). O biocombustível derivado do óleo de moringa é de qualidade superior àqueles derivados do óleo de girassol, soja, canola e palma (RASHID et al., 2008); além disso, o rendimento do óleo de moringa é maior do que a produção de óleo de Jatropha curcas L., Aleurites moluccana L. e Pachira aquatica Aubl. (KIBAZOHI e SANGWAN, 2011). A árvore em estudo é facilmente propagada por sementes e estacas. As sementes podem ser plantadas sem tratamento prévio, podendo atingir até 3,5 m de altura em apenas nove meses. Algumas plantas já apresentam as primeiras inflorescências em apenas oito meses depois do plantio (GONÇALVEZ et al., 2009). Esta espécie apresenta potencial para exploração econômica no Nordeste Brasileiro devido à adaptação ao clima semiárido (SILVA e KERR, 1999)..

(20) 10. 2. OBJETIVO GERAL. O objetivo geral deste trabalho é investigar as alterações físicas, fisiológicas e oxidativas durante o armazenamento de sementes de moringa em refrigerador doméstico e em câmara de crescimento.. 2.1 Objetivos específicos. o Verificar alterações no teor de água das sementes durante o armazenamento; o Caracterizar a perda da viabilidade e do vigor das sementes no decorrer do tempo; o Diagnosticar a ocorrência de estresse oxidativo nas sementes armazenadas; o Estimar a proteção oxidativa proporcionada por mecanismos antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos..

(21) 11. 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Obtenção das sementes. As sementes de moringa foram coletadas de vinte árvores matrizes em diferentes localidades do Estado do Rio Grande do Norte. O beneficiamento foi realizado de forma manual, incluindo a abertura dos frutos, a retirada das sementes e a eliminação das alas. Em seguida, as sementes foram homogeneizadas.. 3.2 Tratamentos e coletas. As sementes foram acondicionadas em sacos plásticos semipermeáveis e armazenadas em câmara de crescimento a 27 ± 2ºC com umidade relativa do ar (UR) de 65% e em refrigerador doméstico a 4 ± 2ºC com UR de 25% durante 18 meses. As coletas das amostras foram realizadas logo após o beneficiamento para a avaliação da qualidade inicial do lote (tempo zero) e a cada três meses durante o armazenamento.. 3.3 Determinação física 3.3.1. Teor de água das sementes. O teor de água das sementes foi determinado pelo método da estufa a 105 °C ± 3°C durante 24 h (BRASIL, 2009). Quatro amostras de 25 sementes foram obtidas por ambiente de armazenamento em cada coleta e pesadas com precisão de 0,001 g para determinação de massa fresca (MF). Em seguida, foram acondicionadas em cápsula de alumínio e mantidas em estufa. Logo depois, cada amostra foi pesada novamente para obtenção da MS e o teor de água foi calculado a partir dos resultados obtidos para MF e MS (NAKAGAWA, 1999)..

(22) 12. 3.4 Determinações fisiológicas 3.4.1 Germinação. Os testes de germinação foram conduzidos em sistema de rolo (BRASIL, 2013). Para tanto, quatro amostras de 25 sementes foram lavadas com detergente comercial diluído na proporção de 1:500, desinfetadas com etanol 70% (v/v) por 30 s, seguido de NaClO 0,25% (m/v) por 3 min, sob agitação eventual. Logo após, as sementes foram lavadas três vezes e embebidas por 6 h em água destilada estéril. O semeio foi realizado em papel toalha (Germitest®) umedecido com água destilada estéril na proporção de duas vezes e meia a massa do papel e as sementes foram incubadas sob condições controladas (radiação fotossinteticamente ativa de 80 µmol m -2 s-1, fotoperíodo de 12 h e temperatura de 27 ± 2ºC) por dez dias. O número de sementes germinadas foi avaliado diariamente, adotando-se como critério de germinação a emergência das estruturas essenciais de uma plântula normal (BRASIL, 2013), sendo os resultados expressos em porcentagem.. 3.4.2 Índice de velocidade de germinação. O índice de velocidade de germinação (IVG) foi realizado conjuntamente com o teste de germinação, calculado a partir de contagens diárias das plântulas emersas aos dez dias após a semeadura. Os cálculos foram feitos de acordo com a fórmula proposta por MAGUIRE (1962).. 3.4.3 Porcentagem de plântulas anormais. Ao final do teste de germinação foram identificadas a porcentagem de plântulas anormais, conforme critérios estabelecidos por BRASIL (2009)..

(23) 13. 3.5 Determinações bioquímicas 3.5.1 Lixiviação de K+. Em cada coleta, quatro amostras de 25 sementes foram obtidas por ambiente de armazenamento e pesadas com precisão de 0,001g. Cada amostra foi imersa em 125 mL de água deionizada e mantida em germinador a 25 °C por 24 h. Em seguida, a concentração de K+ do lixiviado foi mensurada por fotometria de chama e expressa em µmol g-1 MS (MATTHEWS e POWELL, 2006).. 3.5.2 Peróxido de hidrogênio (H2O2). O conteúdo de H2O2 foi determinado pela formação do complexo íon férricoalaranjado de xilenol (CHEESEMAN, 2006). Para tanto, a testa das sementes foi removida manualmente e amostras de 300 mg de embriões foram pulverizadas em nitrogênio líquido e extraídas com 1,5 mL de ácido tricloroacético (TCA) 1% (m/v). Os extratos foram agitados por 15 s e centrifugados a 10.000 x g a 4°C por 20 min, coletando-se os sobrenadantes. Alíquotas de 250 μL do extrato foram reunidas com 250 μL de TCA 1% (m/v), 200 μL de FeSO4 1 mM, 50 μL (NH4)2SO4 1 mM, 200 μL H2SO4 250 mM e 850 μL de água destilada. A mistura foi agitada e pré-incubada à temperatura ambiente por 5 min. A reação foi iniciada pela adição de 200 μL de alaranjado de xilenol 1 mM, agitada novamente e incubada à temperatura ambiente por 25 min no escuro. Em seguida, a leitura foi realizada a 560 nm e o conteúdo de H2O2 foi calculado utilizando uma curva padrão de H2O2 e expresso em µmol g−1 MS.. 3.5.3 Peroxidação de lipídios. A peroxidação de lipídios foi mensurada pelo conteúdo de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (HEATH e PACKER, 1968). As quantificações foram realizadas com os extratos utilizados para a mensuração o H2O2. Em cada ensaio, foram reunidos 0,5 mL de extrato e 2,0 mL do reagente de ácido tiobarbitúrico, incubando-se a mistura a 100°C por 1 h. A reação foi interrompida em banho de gelo e a mistura foi homogeneizada e centrifugada a 10.000 x g a 4°C por 15 min. O sobrenadante foi coletado e as leituras foram feitas a 532 (TBARS) e 660 nm (turbidez.

(24) 14. inespecífica). O conteúdo de TBARS foi calculado com base no coeficiente de extinção molar (155 mM-1 cm-1) e expresso em nmol g−1 MS.. 3.5.4 Carbonilação de proteínas. A carbonilação de proteínas foi determinada após a derivatização de grupos carbonil com 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) (LEVINE et al., 1994). Amostras de 300 mg de embriões foram pulverizadas em nitrogênio líquido e extraídas com 1,5 mL de tampão fosfato de potássio 25 mM pH 7,0. Os extratos foram centrifugados a 10.000 x g a 4˚C por 5 min, coletando-se os sobrenadantes. Alíquotas de 750 µL do extrato foram reunidas com 250 μL de HCl 2 M contendo DNPH 8 mM e incubados por 60 minutos. Posteriormente, o extrato proteico foi precipitado com TCA 30% (m/v). Após centrifugação a 10.000 x g a 4˚C por 5 min, o precipitado foi lavado três vezes com acetato de etila e etanol 1:1 (v/v) e dissolvido em 1,5 mL de ureia 6 Μ pH 2,4. A leitura foi realizada a 370 nm, o conteúdo de grupos carbonil em proteínas foi estimado utilizando o coeficiente de extinção molar das hidrazonas alifáticas (22 mM −1 cm−1) e expressa em nmol mg−1 proteína.. 3.5.5 Ascorbato reduzido (AsA). O conteúdo de AsA foi quantificado pela formação do complexo íon ferroso-2,2bipiridil (KAMPFENKEL; VANMONTAGU; INZE, 1995). Para a extração do ascorbato, amostras de 300 mg de embriões foram pulverizadas em nitrogênio líquido e extraídas com 1,5 mL de TCA 6% (m/v). Os extratos foram centrifugados a 10.000 x g a 4°C por 15 min e os sobrenadantes foram utilizados na determinação do AsA. Para cada determinação, foram reunidos 500 μL de amostra, 300 μL de tampão fosfato de potássio 200 mM pH 7,4, 200 μL de TCA 20% (m/v), 400 μL de H3PO4 45% (m/v), 400 μL de bipiridina 4% (m/v) e 200 μL de FeCl3 3% (m/v). A mistura foi fortemente agitada e incubada a 40°C por 30 min. A leitura foi feita a 525 nm e o conteúdo de AsA foi calculado com base em uma curva padrão de L-ascorbato e expresso em mol g−1 MS..

(25) 15. 3.6 Atividades enzimáticas 3.6.1 Preparo dos extratos. Para a atividade das enzimas SOD, APX e POX, amostras de 300 mg de embriões foram pulverizadas em nitrogênio líquido e extraídas com 1,5 mL de tampão fosfato de potássio 100 mM pH 7,0, contendo EDTA 1 mM e ácido L-ascórbico 1 mM. Os extratos foram centrifugados a 13.000 x g por 20 min e os sobrenadantes foram utilizados como fontes de enzimas. Todos os procedimentos foram conduzidos a 4˚C. Para atividade da enzima CAT o pH do tampão foi alterado para 7,8 e o ácido Lascórbico foi substituído por polivinilpirrolidona (m/v). Após a extração, o extrato foi centrifugado a 15.000 x g em temperatura de 4˚C durante 15 min, coletando-se os sobrenadantes.. 3.6.2 Superóxido dismutase (SOD) – [E.C. 1.15.1.1]. A atividade de SOD foi determinada pela inibição da fotorredução do nitroazul tetrazólio (NBT) (BEAUCHAMP e FRIDOVICH, 1971). Em tubos protegidos da luz, foram adicionados 100 μL do extrato enzimático, 1680 μL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,8 contendo EDTA 0,1 mM e L-metionina 13 mM e 200 μL de NBT 75 μM. A reação foi iniciada pela adição de 20 μL de riboflavina 2 mM e rápida transferência dos tubos para câmara iluminada por lâmpada de 30 W durante 8 min. A reação foi interrompida pelo desligamento da lâmpada, os tubos foram mantidos ao abrigo da luz e as leituras foram conduzidas a 540 nm. Uma unidade (U) de SOD foi definida como a quantidade de enzima necessária para inibir em 50% a fotorredução do NBT e expressa em U g−1 MS min−1.. 3.6.3 Peroxidase de ascorbato (APX) – [E.C. 1.11.1.11]. A atividade de APX foi estimada com base no consumo de L-ascorbato, o qual foi detectado pelo decréscimo da absorbância a 290 nm (NAKANO e ASADA, 1981). Alíquotas de 3,5 μL do extrato enzimático foram transferidas para poços em microplaca, acrescidas de 183 μL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0.

(26) 16. contendo ácido L-ascórbico 0,5 mM. A atividade foi iniciada pela adição de 13,5 μL de H2O2 30 mM ao meio de reação. A reação foi realizada a 25°C e as leituras foram realizadas a 290 nm a cada 30 s durante 5 min em espectrofotômetro para microplaca (Epoch BioTek®). A atividade foi calculada com base no coeficiente de extinção molar do L-ascorbato (2,8 mM cm-1) e expressa em μmol g−1 MS min−1.. 3.6.4 Peroxidase de fenóis (POX) – [EC: 1.11.1.7]. A atividade de POX, foi mensurada pela oxidação do ácido pirogálico (KAR e MISHRA, 1976). Alíquotas de 200 μL do extrato enzimático foram transferidos para tubos de ensaio contendo 4800 μL de tampão fosfato de potássio 25 mM pH 6,8, contendo ácido pirogálico 20 mM e H2O2 20 mM. A mistura foi incubada à temperatura ambiente por 10 min e a reação foi interrompida pela adição de 500 μL de H 2SO4 5% (v/v), seguida de agitação vigorosa por 5 s. As leituras foram realizadas a 420 nm e a atividade de POX foi calculada de acordo com o coeficiente de extinção molar da purpurogalina (2,47 mM cm-1) e expressa em nmol g-1 MS min-1.. 3.6.5 Catalase (CAT) – [E.C. 1.11.1.6]. A atividade de CAT foi determinada com base no consumo de H2O2 indicado pelo decréscimo da absorbância a 240 nm (SUDHAKAR et al., 2001). Alíquotas de 4 μL do extrato enzimático foram transferidas para poços em microplaca de quartzo, acrescidas de 149 μL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,0 contendo H2O2 59 mM. A reação foi realizada a 25°C e as leituras foram realizadas a 240 nm a cada 15 s durante 5 min em espectrofotômetro para microplaca (Epoch BioTek®). A atividade de CAT foi calculada com base no coeficiente de extinção molar do H2O2 (36 mM cm1). e expressa em nmol g−1 MS min−1..

(27) 17. 3.7 Desenho experimental e análise estatística. Durante as coletas, as amostras foram retiradas ao acaso dos lotes de sementes submetidos ao armazenamento em câmara de crescimento e em refrigerador doméstico. As determinações bioquímicas foram realizadas utilizando cinco repetições e as determinações física e fisiológicas foram conduzidas com quatro repetições de vinte e cinco sementes por tratamento em cada coleta. Os resultados obtidos foram analisados por regressão polinomial, utilizando o programa Assistat 7.7 beta.. 4. RESULTADOS. A viabilidade e o vigor das sementes de Moringa oleifera foram afetados no decorrer de 18 meses de armazenamento e as sementes mantidas em câmara de crescimento apresentaram perda mais acentuada destas qualidades em comparação com as sementes mantidas em refrigerador. Independentemente do ambiente de armazenamento, a perda da viabilidade e do vigor não foi acompanhada por um aumento do conteúdo de H2O2, peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas. Curiosamente, os níveis de AsA, bem como as atividades de SOD, APX e CAT aumentaram ao longo do armazenamento. Logo após a coleta, as sementes de moringa apresentaram teor de água de 6,8%, o qual foi diminuído para 6,1% nas sementes armazenadas em refrigerador por 18 meses e foi aumentado para 7,8% naquelas mantidas em câmara de crescimento após 15 meses e ao final de 18 meses manteve-se com 6,7% (Figura 2a). Além disso, as sementes recém coletadas apresentaram 92% de germinação (Figura 2b). Nas sementes armazenadas em refrigerador, a %G se manteve inalterada ao longo de 15 meses, diminuindo para 65% aos 18 meses. Em comparação, a %G reduziu progressivamente nas sementes armazenadas em câmara de crescimento, atingindo apenas 14% ao final de 18 meses..

(28) 18. FIGURA 2 - Teor de água (a) e porcentagem de germinação (b) em sementes de moringa armazenadas em câmara de crescimento a 27 ± 2ºC e 65% de UR (●) e em refrigerador a 4 ± 2ºC e 25% de UR (○) por 18 meses. Os pontos representam a média e as barras verticais representam o desvio padrão na análise de regressão, de acordo com o modelo polinomial ajustado para cada variável.. b 100. 8.0. 80. Germinação (%). Teor de água (%). a 10.0. 6.0. 4.0. 60. 40. 20. 2.0. ● (y = 6,75 + 9,58x + (y = 6,75 + 0,35x -. 3,99x2 +. 1,27x3. 0,24x2. 4,11x3 -. +. -. 8,31x4); R². 2,68x4. +. 6,07x5); R². = 0,99. 0.0 0. 3. 6. 9. 12. (y = 92,38 - 0,92x - 0,22x2); R² = 0,95 (y = 92,38 - 6,43x + 1,07x2 - 0,04x3); R² = 0,87. = 0,93. 15. Tempo de armazenamento (meses). 18. 0 0. 3. 6. 9. 12. 15. 18. Tempo de armazenamento (meses). Nas sementes de moringa armazenadas em refrigerador e em câmara de crescimento, os resultados obtidos para o IVG seguiram a tendência observada para a %G. O IVG foi equivalente a 6,2 no início do experimento, diminuído para 5,1 nas sementes mantidas sob refrigeração e para apenas 1,1 naquelas mantidas em câmara de crescimento após 18 meses (Figura 3b). Durante todo o experimento, a lixiviação de K+ se manteve praticamente inalterada nas sementes conservadas em refrigerador. No entanto, a diminuição da %G (Figura 2b) e do IVG, especialmente aos 15 e 18 meses de armazenamento, foi acompanhada pelo aumento da lixiviação de K+ nas sementes conservadas em câmara de crescimento (Figura 3c). Não foram verificadas plântulas anormais durante o teste de germinação realizado com sementes de moringa recém coletadas (Figura 3c). Depois de 3 meses de armazenamento, a porcentagem de plântulas anormais foi de aproximadamente 5% para ambos os ambientes testados. A porcentagem de plântulas anormais não sofreu alterações drásticas até 15 meses de armazenamento em refrigerador, aumentando para 18% aos 18 meses. De forma contrastante, a porcentagem de plântulas anormais aumentou significativamente após 12 meses de armazenamento em câmara de crescimento, alcançando 34% aos 15 meses e 21% ao final de 18.

(29) 19. meses. Dentre as anormalidades verificadas durante o experimento, destacou-se a atrofia da raiz primária (Figura 3d). FIGURA 3 – Índice de velocidade de germinação (a), lixiviação de K+ (b), porcentagem de plântulas anormais (c) e aspecto morfológico de plântulas normais e anormais, obtidos para sementes de moringa durante o armazenamento em câmara de crescimento a 27 ± 2ºC e 65% de UR (●) e em refrigerador a 4 ± 2ºC e 25% de UR (○) por 18 meses. Em (a), (b) e (c), os pontos representam a média e as barras verticais representam o desvio padrão na análise de regressão, de acordo com o modelo polinomial. a. 12. b. (y= 6,21 + 1,62x – 0,69x2 + 0,10x3 – 6,83x4 + 1,5x5); R² = 0,95. 10. (y= 22,73 – 9,87x + 4,11x2 – 0,61x3 + 3,7x4 – 8,0x5); R² = 0,99. 50. (y= 6,105 + 0,412x – 2,48x2); R² = 0,61. (y= 22,92 – 3,11x + 0,69x2 - 5,94x3 + 1,67x4); R² = 0,57. 8. Lixiviado K+ (µmol g-1 MS). Índice de Velocidade de Germinação. ajustado para cada variável. Em (d), a barra vertical representa 10 mm.. 6. 4 2. 40 30. 20 10. 0 0. 3. 6 9 12 15 Tempo de armazenamento (meses). 18. 0 0. 3. 6 9 12 15 Tempo de armazenamento (meses). 18. Plântulas anormais (%). c (y= 6,78 + 1,41x – 0,45x2 + 5,04x3 – 1,59x4); R² = 0,98. 50. (y= 2,67 + 0,86x – 0,13x2 + 5,78x3); R² = 0,98 40. 30 20 10 0. 0. 3. 6 9 12 15 Tempo de armazenamento (meses). 18. Plântulas normais. Plântulas anormais. Considerando as variáveis relacionadas a danos oxidativos, não houve acumulação de H2O2 , peroxidação lipidica e nem da carbonilação de proteínas durante o armazenamento das sementes de moringa em refrigerador e em câmara de crescimento. Em sementes recém coletadas, o conteúdo de H2O2 foi de 1,2 μmol g-1 MS (Figura 4a). Durante o armazenamento em ambos os ambientes, houve variação do conteúdo de H2O2, tendendo à diminuição. Ao final de 18 meses, o conteúdo de H2O2 foi de 0,9 μmol g-1 MS nas sementes armazenadas em refrigerador e de 0,5 μmol g-1 MS naquelas armazenadas em câmara de crescimento. De forma adicional, o conteúdo de TBARS foi de 6,3 nmol g-1 MS no início do experimento (Figura 4b ) e de.

(30) 20. proteínas carboniladas foi de 1,7 nmol mg-1 proteína (Figura 4c), permanecendo praticamante inalterados durante o período avaliado. Nas sementes de moringa recém coletadas, o conteúdo de AsA foi equivalente a 0,70 μmol g-1 MS, aumentando progressivamente ao longo do armazenamento (Figura 4d). De fato, o conteúdo de AsA aumentou para 0,93 e 1,12 μmol g -1 MS nas sementes mantidas em refrigerador e em câmara de crescimento, respectivamente, após 18 meses. FIGURA 4 – Conteúdo de H2O2 (a), TBARS (b), carbonilação de proteínas (c) e ascorbato reduzido (d) em embriões de sementes de moringa armazenadas em câmara de crescimento a 27 ± 2ºC e 65% de UR ( ) e em refrigerador a 4 ± 2ºC e 25% de UR ( ) por 18 meses. Os pontos representam a média e as barras verticais representam o desvio padrão na análise de regressão, de acordo com o modelo polinomial ajustado para cada variável.. a. 8.0. (y = 1,42 - 0,50x + 0,174x2 - 2,57x3 + 1,59x4 - 3,4x5);R² =0,72. 6.0. 2.5 (y = 1,15 + 0,659x - 0,194x2 + 1,64x3 - 4,31x4); R² = 0,94. TBARS (nmol g-1 MS). 2.0. H₂O₂ (µmol g-1 MS). b. 1.5 1.0 0.5. 4.0. 2.0 (y = 6,31 + 0,62x - 0,21x2 + 1,86x3 - 4,89x4 + 2,2x5);R² =0,86 (y = 6,080 - 0,147x + 1,204x2); R² = 0,84. 0.0. 0. 3. 6. 9. 12. 15. 18. 1.5 0. c. 2.0. 1.2. 1.5. 0.9. AsA (µmol g-1 MS). Carbonilação de proteínas (nmol mg-1 proteína). 2.5. 0.0. 1.0 0.5. (y = 1,79 - 0,059x + 0,01x2 - 0,0004x3);R² = 0,67. 6. 9. 12. 15. 18. d. 0.6 (y = 0,727 + 1,61x – 1,03x2 + 1,57x3 – 5,45x4); R² = 0,99. 0.3. (y = 0,695 - 0,159x + 9,5x2- 1,53x3 + 9,93x4 - 2,26x5);R² =0,99. (ns) 0.0 0. 3. 3. 6. 9. 12. 15. Tempo de armazenamento (meses). 18. 0.0 0. 3. 6. 9. 12. 15. Tempo de armazenamento (meses). No decorrer do armazenamento das sementes de moringa, houve incremento da atividade das enzimas antioxidantes estudadas, com exceção da atividade de POX. Nas sementes recém coletadas, a atividade de SOD foi de 6,0 U g-1 MS min-1 e aumentou 40% após 18 meses de armazenamento em refrigerador e 50% depois de 15 meses de armazenamento em câmara de crescimento (Figura 5a). De modo. 18.

(31) 21. semelhante à atividade de SOD, a atividade de APX apresentou aumento durante o período experimental (Figura 5b). Logo após a coleta, a atividade de APX foi equivalente a 0,30 μmol de ascorbato g-1 MS min-1, aumentando 3,1 e 2,7 vezes nas sementes mantidas em refrigerador e em câmara de crescimento, respectivamente, aos 18 meses. Em oposição à atividade de SOD e APX, a atividade de POX apresentou diminuição durante o armazenamento (Figura 5c). Em sementes recém coletadas, atividade de POX foi de 0,09 μmol de purpurogalina g-1 MS min-1, diminuindo 54% nas sementes armazenadas sob refrigeração e 79% naquelas conservadas em câmara de crescimento após 18 meses. Em concordância com as atividades de SOD e APX, a atividade de CAT também aumentou nas sementes com o avanço do tempo (Figura 5d). No início do experimento, a atividade de CAT foi equivalente a 64 nmol de H2O2 g-1 MS min-1 e aumentou 55 e 68% após 18 meses de armazenamento em refrigerador e em câmara de crescimento, respectivamente. FIGURA 5 – Atividades de SOD (a), APX (b), POX (c) e CAT (d) em embriões de sementes de moringa armazenadas em câmara de crescimento a 27 ± 2ºC e 65% de UR (●) e em refrigerador a 4 ± 2ºC e 25% de UR (○) por 18 meses. Os pontos representam a média e as barras verticais representam o. a. 8 6. 4 2. (y= 6,09 + 1,31x - 0,41x2 + 5,56x3 - 3,14x4 + 6,1x5);R²= 0,99 (y = 6,05 + 1,73x -. 0 Atividade de POX (μmol purpurogalina g-1 MS min-1). 0. 3. 0,50x2. 6. +. 0,06x3); R². 9. 12. 15. b. 1.00 0.80. 0.60 0.40 0.20. (y= 0,30 + 0,25x - 0,11x2 + 1,8x3 - 1,2x4 + 2,7x5);R² = 0,99 (y= 0,299 + 0,103x - 1,05x2 + 3,52x3); R² = 0,86. = 0,73. 0.00 18c. 120 0. 3. 6. 9. 12. 15. 18 d. 0.10 Atividade de CAT (nmol H2O2 g -1 MS min-1). Atividade de SOD (U g-1 MS min-1). 10. Atividade de APX (μmol ascorbato g-1 MS min-1). desvio padrão na análise de regressão, de acordo com o modelo polinomial ajustado para cada variável.. 0.08. 0.05. 0.03. (y= 9,07 - 1,59x + 0,001x2 - 3,82x3); R² = 0,99 2. 3. 0. 3. 80 60 40 20. (y= 64,2 + 7,89x + 6,65x2 - 7,73x3 + 3,54x4) R² = 0,99 (y = 63,89 + 4,79x + 0,59x2 - 0,11x3 + 3,85x4); R² = 0,99. 4. (y= 9,13 - 4,16x - 2,01x + 7,66x - 3,38x ); R² = 0,73. 0.00. 100. 6 9 12 15 Tempo de armazenamento (meses). 0 18. 0. 3 6 9 12 15 Tempo de armazenamento (meses). 18.

(32) 22. 5. DISCUSSÃO. De acordo com a “teoria dos radicais livres”, a deterioração das sementes ao longo do envelhecimento natural tem sido atribuída principalmente à lesão das biomoléculas ocasionada por EROs (WALTERS et al., 2010). No entanto, os resultados apresentados neste trabalho indicam que a perda da viabilidade e do vigor das sementes de moringa durante o armazenamento não pode ser associada ao aumento do dano oxidativo, nem poderia estar relacionado com a diminuição das defesas antioxidantes, pelo menos quando se avaliam marcadores confiáveis no embrião completo. É amplamente aceito que o aumento do teor de água durante o armazenamento está estreitamente relacionado ao decréscimo da qualidade de sementes (BLACK et al., 2006). Nas sementes de moringa, o teor de água apresenta aumento no decorrer de 15 meses de armazenamento em câmara de crescimento (27 ± 2ºC e 65% de UR), ao passo que reduz ao longo de 18 meses de armazenamento em ambiente refrigerado (4 ± 2ºC e 25% de UR) (Figura 2a). Assim sendo, o ambiente refrigerado é mais apropriado para impedir a hidratação das sementes de moringa no decorrer do tempo. Resultados similares são encontrados para as sementes de outras espécies florestais armazenadas sob condições semelhantes, como Amburana cearensis A.C. Smith (GUEDES et al., 2010), Tabebuia serratifolia Rild. (SILVA et al., 2011), Handroanthus umbellatus (Sond.) Mattos (MARTINS e PINTO, 2014), Melanoxylon brauna Schott. (BORGES et al., 2015). Tendo em vista que a %G é uma variável rotineiramente usada para expressar a viabilidade de sementes (BEWLEY et al., 2013), observa-se que as sementes de moringa preservam a viabilidade sob refrigeração por até 15 meses e apresentam diminuição gradativa desta qualidade quando são conservadas em câmara de crescimento (Figura 2b). Esta resposta é comumente encontrada para outras espécies florestais, cujas sementes são armazenadas em ambiente refrigerado e não controlado, incluindo T. serratifolia (SILVA et al., 2011), H. umbellatus (MARTINS e PINTO, 2014) e Jatropha curcas L. (MONCALEANO-ESCANDON et al., 2013; DIAS et al., 2016). Estes resultados corroboram aqueles obtidos anteriormente, segundo os quais sementes de moringa armazenadas em câmara fria (10ºC e 55% de UR) mantêm a %G durante 12 meses, enquanto que aquelas armazenadas em ambiente.

(33) 23. não controlado apresentam diminuição da %G no mesmo período (BEZERRA et al., 2004). Dentre as variáveis empregadas para avaliar o vigor das sementes, o IVG (RANAL e SANTANA, 2006) e a lixiviação de eletrólitos (MATHEWS e POWELL, 2006) têm sido amplamente utilizados. Considerando que o IVG é brandamente diminuído (Figura 3a) e a lixiviação de K+ não é alterada (Figura 3b) durante o armazenamento das sementes de moringa sob refrigeração por 18 meses, esta condição se mostra adequada para retardar a perda do vigor durante este período. De forma contrastante, a diminuição drástica do IVG é acompanhada pelo aumento da lixiviação de K+ quando as sementes de moringa são armazenadas por um período superior a 12 meses em câmara de crescimento, indicando o comprometimento do vigor. Para sementes de T. serratifolia (SILVA et al., 2011) e Acca sellowiana (O. Berg) Burret (DONAZZOLO et al., 2015), o armazenamento em câmara fria a 8ºC também é mais eficiente que aquele em ambiente não controlado para preservar o vigor, estimado pelo IVG, ao longo do tempo. Além disso, também ocorre redução do IVG em paralelo com o incremento da lixiviação de eletrólitos de acordo com o aumento da UR em sementes de M. brauna armazenadas a 20ºC por 8 meses (BORGES et al., 2015). O H2O2 é a ERO que apresenta maior meia-vida, está implicado na produção de outras EROs e é capaz de promover danos intracelulares (DEMIDCHIK, 2015). Neste sentido, a acumulação de H2O2 nas sementes tem sido relacionada ao processo de deterioração em algumas espécies florestais. Por exemplo, o conteúdo de H2O2 aumenta progressivamente nas sementes de Fagus sylvatica L. conforme o aumento da temperatura e da UR durante o envelhecimento natural (PUKACKA e RATAJCZAK, 2005), assim como nas sementes de Ulmus pumila L. submetidas ao tratamento de deterioração controlada a 37ºC e 100% de UR por 5 dias (HU et al., 2012). Apesar disso, não é possível associar a perda da qualidade das sementes de moringa à acumulação de H2O2, uma vez que o conteúdo de H2O2 diminui no decorrer de 18 meses de armazenamento em ambos os ambientes testados (Figura 4a). Em concordância com a diminuição do conteúdo de H2O2, não há variação do conteúdo de TBARS nas sementes de moringa conservadas em refrigerador e em câmara de crescimento ao longo de 18 meses (Figura 4b). A determinação de TBARS é um dos ensaios mais comuns para estimar a peroxidação lipídica (BLACK et al., 2006), a qual tem sido considerada uma das principais causas da deterioração de.

(34) 24. sementes (PARKHEY et al., 2012). De fato, o conteúdo de TBARS aumenta durante a deterioração das sementes de Vigna radiata L. mantidas a 33ºC conforme o aumento da UR (MURTHY et al., 2003), de Pyrus betulaefolia Bge. estocadas à temperatura ambiente ao longo de 12 meses (BAO et al., 2011) e de Shorea robusta Roth mantidas a 26ºC e 52% de UR durante 8 dias (PARKHEY et al., 2012). Entretanto, assim como nas sementes de moringa, o conteúdo de TBARS não está associado à perda da qualidade das sementes em diferentes espécies de Brassicaceae durante armazenamento (MIRA et al., 2011). Vale ressaltar que a perda da viabilidade (Figura 2b) e do vigor (Figura 3) nas sementes de moringa ao longo do experimento não é acompanhada por um aumento do conteúdo de grupos carbonil em proteínas (Figura 4c). Alguns trabalhos recentes demonstram que a carbonilação de proteínas é um marcador importante do estresse oxidativo associado ao envelhecimento das sementes (RAJJOU et al., 2008; NGUYEN et al., 2015). A carbonilaçao de proteínas envolve uma série de modificações oxidativas irreversíveis na estrutura das proteínas, que levam à perda de função. Em geral, as cadeias laterais de certos aminoácidos são oxidados a aldeídos ou cetonas devido ao ataque do OH• (CABISCOL et al., 2014). A carbonilação de proteínas é intensificada em sementes de F. sylvatica durante o armazenamento a -10ºC e 7-10% de UR (KALEMBA e PUKACKA, 2014) e em sementes de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NGUYEN et al., 2015) e arroz (YIN et al., 2017) submetidas a tratamentos de envelhecimento acelerado. Em sementes de moringa, no entanto, o teor de grupos carbonil em proteínas permanece praticamente inalterado durante o experimento (Figura 4c), coincidindo com à diminuição do conteúdo de H2O2 (Figura 4a) e a manutenção dos níveis de peroxidação lipidica (Figura 4b). Curiosamente, o aumento da concentração de K+ no lixiviado obtido a partir das sementes de moringa armazenadas sob refrigeração e em câmara de crescimento após 12 meses (Figura 3b) não pode ser atribuído à peroxidação lipídica (Figura 4b). A concentração de eletrólitos no lixiviado de sementes deterioradas vem sendo rotineiramente utilizada como um indicador de danos nas membranas celulares (BLACK et al., 2006). Corroborando os resultados deste trabalho, também não é encontrada relação direta entre a peroxidação lipídica e a perda da integridade das membranas em sementes de espécies selvagens de Brassicaceae expostas ao envelhecimento acelerado a 45ºC e 90% de UR por quatro dias (MIRA et al., 2011). No entanto, os danos oxidativos nas proteínas da membrana não podem ser.

(35) 25. descartados, uma vez que a carbonilção de proteínas só foi avaliada na fração das proteínas solúveis em sementes de moringa (Figura 4c). Em sementes ortodoxas, o surgimento de danos oxidativos e o reparo destes danos são processos separados temporalmente. Devido ao baixo teor de água, os danos oxidativos geralmente são promovidos por reações não enzimáticas durante o armazenamento e são suprimidos por sistemas de reparo ativados durante a germinação a partir da embebição (VESELOVSKY e VESELOVA, 2012). As enzimas antioxidantes e os antioxidantes não enzimáticos cumprem papel fundamental nos sistemas de reparo e proteção contras danos oxidativos (RAJJOU e DEBEAUJON, 2008). Espera-se que, estas defesas antoxidantes diminuam à medida que as sementes envelhecam (KIBINZA et al., 2011). Dentre os antioxidantes não enzimáticos, o ascorbato é abundante nos tecidos vegetais, agindo diretamente na remoção de EROs ou como substrato da APX no ciclo Halliwell-Asada (GILL e TUTEJA, 2010). O conteúdo de AsA diminui nas sementes de café após 20 dias de conservação a 25ºC e 81% de UR (DUSSERT et al., 2006), bem como nas sementes de arroz (YIN et al., 2014) e soja (XIN et al., 2014) ao longo do envelhecimento acelerado. Contrariamente, o conteúdo deste antioxidante aumenta de forma progressiva enquanto a viabilidade (Figura 2b) e o vigor (Figura 3) decaem nas sementes de moringa durante o armazenamento (Figura 4d). Alguns autores sugerem que, além das suas propriedades antioxidantes, o AsA pode apresentar efeitos negativos em sementes desidratadas, promovendo a formação de OH• pela reação de Fenton (DE TULIO e ARRIGONI, 2003). Além dos antioxidantes não enzimáticos, diversas enzimas antioxidantes atuam de forma coordenada para proteger as células vegetais contra a ação nociva das EROs (DEMIDCHIK, 2015). Em sementes de moringa, as atividades de SOD, APX e CAT aumentam e apenas a atividade de POX diminui no decorrer do experimento, em ambos os ambientes testados (Figura 5). Em contraponto, a atividade de enzimas antioxidantes diminui durante o armazenamento em outras espécies florestais. Por exemplo, as atividades de SOD e CAT são reduzidas em sementes de P. betulifolia armazenadas à temperatura ambiente durante 12 meses (BAO et al., 2011) e em sementes de M. brauna conservadas a 20ºC e 55% de UR por 8 meses (BORGES et al., 2015). De forma adicional, as atividades de CAT e POX diminuem em sementes de T. roseoalba mantidas a 5ºC por 24 meses (ABBADE e TAKAKI, 2014)..

(36) 26. Segundo os resultados apresentados, parece que os mecanismos antioxidantes são preservados nas sementes de moringa ao longo do armazenamento, pelo menos em relação ao conteúdo de AsA (Figura 4d) e às atividades de SOD, APX e CAT (Figura 5a, b e d). Em sementes de F. sylvatica conservadas sob diferentes condições de temperatura e UR por nove meses, também não há redução do conteúdo de AsA e das atividades de SOD, APX e CAT (PUKACKA e RATAJCZAK, 2005). A diminuição da capacidade germinativa durante o armazenamento das sementes de F. sylvatica é atribuída ao aumento da produção de O2•- e H2O2 associado à ineficiência dos mecanismos antioxidantes. Neste sentido, a preservação do conteúdo de AsA e das atividades de SOD, APX e CAT não parece suficiente para retardar a perda da viabilidade e do vigor nas sementes de moringa após 12 meses de armazenamento. Alternativamente, a perda da viabilidade e do vigor pode estar relacionada a danos oxidativos localizados no eixo embrionário, tendo em vista que a atrofia da raiz primária foi a anormalidade mais frequentemente observada nos testes de germinação (Figura 3d). A produção de O2•- e H2O2 no meristema apical da raiz de embriões de F. sylvatica parece estar envolvida na perda de qualidade das sementes durante o envelhecimento (RATAJCZAK et al., 2015).. 6. CONCLUSÕES De acordo com os resultados apresentados, a viabilidade e o vigor das sementes de moringa são preservados pelo armazenamento em ambiente refrigerado com baixa UR por até 15 meses. A perda da qualidade após este período não pode ser atribuída à danos oxidativos, conferidos ao conteúdo de H2O2, peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas, pelo menos quando estes marcadores são avaliados no embrião completo. Além disso, a perda da viabilidade e do vigor das sementes após 15 meses durante o armazenamento não podem ser retardada pela preservação das defesas antioxidantes, especificamente o conteúdo de AsA e as atividades de SOD, APX e CAT. Estudos adicionais são necessários para elucidar se o estresse oxidativo em partes específicas do embrião pode estar relacionado com deterioração das sementes de moringa..

(37) 27. 7. REFERÊNCIAS. ABBADE, L. C.; TAKAKI, M. Biochemical and physiological changes of Tabebuia roseoalba (Ridl.) Sandwith (Bignoniaceae) seeds under storage. Journal of Seed Science, v. 36, p. 100-107, 2014.. ABD EL BAKY HANNA. H.; EL-GAMAL BAROTY, S. Characterization of Egyptian Moringa peregrine seed oil and its bioactivities. International Journal Economics and Business Research, v. 2, p. 99–108, 2013.. ABREU, L. A. S.; CARVALHO, M. L. M.; PINTO, C. A. G.; KATAOKA, V. Y.; SILVA, T. T. A. Deterioration of sunflower seeds during storage. Journal of Seed Science, v. 35, n. 2, p. 240-247, 2013.. AL-SAID, M. S.; MOTHANA, R. A.; AL-YAHYA, M. A. Edible oils for liver protection: hepatoprotective potentiality of Moringa oleifera seed oil against chemical-induced hepatitis in rats. Journal Food Science, v. 77, p. 124-130, 2012.. ANWAR, F.; BHANGER, M. I. Analytical characterization of Moringa oleifera seed oil grown in temperate regions of Pakistan. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v. 51, p. 6558-6563, 2003.. BAILLY, C. Active oxygen species and antioxidants in seed biology. Seed Science Research, v. 14, n. 2, p. 93-107, 2004.. BAILLY C.; BENAMAR A.; CORBINEAU F.; CÔME D. Changes in malondialdehyde content and in superoxide dismutase, catalase and glutathione reducrase activities in.

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