Curso teórico-práctico: DIAGNÓSTICO DE PATOLOGÍAS EM MOLUSCOS BIVALVES. IFAPA Centro Agua del Pino de Junho, 2012

Curso teórico-práctico:

DIAGNÓSTICO DE PATOLOGÍAS

EM MOLUSCOS BIVALVES

IFAPA Centro Agua del Pino

25-29 de Junho, 2012

Teórica:

Principais patologias de moluscos bivalves com

relevância no Algarve e Andaluzia

Curso Teórico-Práctico:

IFAPA Centro Agua del Pino 25 e 29 de Junho, 2012

DIAGNÓSTICO DE PATOLOGIAS EM MOLUSCOS BIVALVES

Entende-se por patologia qualquer desvio negativo ao estado normal (saúde) de um organismo (Kinne, 1980). Trata-se de um conceito relativo e dinâmico e que representa a perda do equilíbrio ou homeostase de um organismo.

Patologia de moluscos bivalves

Noções básicas:

E

São numerosas as causas de uma patologia (ambientais, nutricionais, infecciosas, genéticas, etc.) e podem apresentar-se de forma individual ou em conjunto actuando em sinergia

As patologias infecciosas são, quer pela sua capacidade de dispersão quer pelos efeitos económicos, as que causam maior preocupação na aquicultura marinha actual

È necessário não confundir infecção com patologia

Os agentes infecciosos fazem parte da biocenose e tem um papel essencial no equilíbrio das populações

As principais patologias descritas foram em condições de cultivo

PECULIARIDADES DA PATOLOGÍA EM AQUACULTURA

O meio aquático facilita a dispersão de contaminantes e agentes infecciosos e dificulta o isolamento dos sistemas de cultivo. A aquacultura é provavelmente a actividade produtiva mais sensível á contaminação ambiental

A alimentação natural (completa em moluscos e nas primeiras fases em crustáceos e peixes) dificulta o controlo microbiológico do cultivo

A alta densidade de cultivo, em particular nas fases larvares e pós-larvares, facilita a rápida propagação das infecções.

A associação do cultivo com o meio natural e populações selvagens (em especial nos moluscos) dificulta os programas clássicos de erradicação e exige outras técnicas de prevenção e luta contra as patologias

PRINCIPAIS PATOLOGIAS CAUSADAS POR VIRUS

IRIDOVIRUS

Patologia vírica do velo da ostra (OVVD): C. gigas

Patologia das brânquias: C.

angulata y C. gigas

Virose hemocitária: C. gigas e C. angulata

HERPESVIRUS

Herpesvirus em larvas, pós-larvas e semente de C. gigas OsHV1- µvar

PRINCIPAIS PATOLOGIAS CAUSADAS POR BACTERIAS

Infecções por Rickettsias,

Chlamydias e Micoplasmas

Bolas bacterianas

Anel castanho (Vibrio tapetis)

Necrose muscular por vibriosis

Vibriose em larvas (necrose

bacilar)

Bacteremia inflamatoria da ostra,

necrosis bacilar

PRINCIPAIS PATOLOGIAS CAUSADAS POR FUNGOS

Micose larvar: Sirolpidium zoophthorum

Patologia da concha = patologia do pé

= patologia da charneira= patologia

das pústulas amarelas: Ostracobable

implexa

Necrose do músculo adutor associada

a infecções por fungos

PRINCIPAIS PATOLOGIAS CAUSADAS POR FUNGOS

Micose larvar: Sirolpidium zoophthorum

Patologia da concha = patologia do pé

= patologia da charneira= patologia

das pústulas amarelas: Ostracobable

implexa

Necrose do músculo adutor associada

a infecções por fungos

PRINCIPAIS PATOLOGIAS CAUSADAS POR PROTOZOÁRIOS

• FLAGELADOS (Hexamita nelsoni em ostras)

• RIZÓPODOS (amibas, Hartmannella, Acanthamoeba sp. em ostras)

CILIOPHORA (CILIADOS): numerosas espécies, p.e: SARCOMASTIGOPHORA (geralmente saprófitos)

LABYRINTHOMORPHA Labyrinthula e Labyrinthomyxa spp. Quahog Parasita Unknown (QPX) (LABYRINTHULOMYCOTA)

Trichodina spp.

Ancistrocoma spp.

PRINCIPAIS PATOLOGIASCAUSADAS POR PROTOZOÁRIOS

DO PHYLUM PARAMYXEA

MARTEILIASIS (Marteilia spp.): parasita do epitélio

digestivo,

em

especial

da

glândula

digestiva.

M.

refringens

é

a

espécie

mais

conhecida

pelas

mortalidades causadas em França nos anos 70 e que

afecta Ostrea edulis, Mytilus edulis e M. galloprovincialis

(excepcionalmente outras espécies). Outros géneros de

interesse são Paramarteilia, Marteiloides e Paramyxa

HAPLOSPORIDIOSIS (Haplosporidium spp.): As mais

conhecidas são MSX (H. nelsoni)

SSO (H. costale)

que afectam Crassostrea virginica e C. gigas,

H.

armoricanum em Ostrea edulis, Minchinia tapetis é

conhecido em Ruditapes decussatus.

PRINCIPAIS PATOLOGIAS CAUSADAS POR PROTOZOÁRIOS

DO PHYLUM HAPLOSPORIDIA

Bonamia ostreae

: parasita dos hemócitos de Ostrea

edulis e responsável por mortalidades em toda

Europa desde 1980

PRINCIPAIS PATOLOGIAS CAUSADAS POR PROTOZOÁRIOS

DO PHYLUM HAPLOSPORIDIA

Outras espécies: Mikrocytos mackini, Bonamia exitiosa,

Os mais conhecidos parasitam os ovócitos de Ostrea edulis

(Steinhausia ovicola) e de Mytilus galloprovincialis (S.

mytilovum). Existem espécies ainda sem serem identificadas:

Microspora-like

PRINCIPAIS PATOLOGIAS CAUSADAS POR PROTOZOÁRIOS

DO PHYLUM MICROSPORA

PRINCIPAIS PATOLOGIAS CAUSADAS POR PROTOZOÁRIOS

DO PHYLUM APICOMPLEXA

COCCIDIOS E GREGARINAS

PRINCIPAIS PATOLOGIAS CAUSADAS POR PROTOZOÁRIOS

DO GÉNERO PERKINSUS (Phylum Perkinsozoa)

Presente em todas as águas temperadas do mundo

Actualmente conhecem-se 9 espécies que afectam pelo

menos 65 espécies de bivalves e 5 de gastrópodes

Inicialmente foi descrito como um fungo, posteriormente

como um aplicomplexa e finalmente foi proposto um

Phylum novo próximo dos dinoflagelados

Afecta o tecido conectivo de diferentes órgãos

-principalmente brânquia, manto e palpos provocando

uma intensa reacção hemocitária.

De especial interesse são Perkinsus marinus que afecta

a Crassostrea virginica e é responsável por mortalidades

históricas em EUA e P. olseni que afecta Ruditapes

decussatus, R. philippinarum, Venerupis pullastra e V.

aurea nas nossas costas.

PRINCIPAIS PATOLOGIAS CAUSADAS POR PROTOZOÁRIOS

DO GÉNERO PERKINSUS (Phylum Perkinsozoa)

PRINCIPAIS PATOLOGIAS: TUMORES E NEOPLASIAS

Descritos em numerosas espécies. A sua causa é

desconhecida, no entanto, em alguns casos, foram

associados a uma possível origem vírica

Exemplos:

Neoplasia disseminada de

Mya arenaria (retrovirus)

Neoplasia em Mytilus edulis

Hemocitosarcomas em

Cerastoderma edule e

Ruditapes decussatus

PRINCIPAIS PATOLOGIAS CAUSADAS POR

METAZOOÁRIOS

EXEMPLOS:

Porifera (Chiona spp.)

Cnidaria (Obelia spp.)

Turbelaria (Paravortex spp. Urastomia spp.)

Digenea (Bucephalus spp., Gymnophalus

spp., Bacciger spp., Himasthla spp.)

Cestoda (Tylocephalum spp.)

Nematoda ( Urosporidium spp.)

Gastropoda (Hinia spp.)

Polichaeta (Polydora, spp.)

Copepoda (Mytilicola spp.)

Patologias de especial interesse para o Algarve e Andaluzia

Moluscos bivalves. Amêijoa fina e japonesa

Perkinsus olseni

OsHV-1 µvar

Patologías de especial interesse para o Algarve e Andaluzia

Moluscos:

Ostra (Crassostrea gigas/angulata): Herpesvirus

Ostra plana (Ostrea edulis) e Mexilhão (Mytilus galloprovincialis):

José Ignacio Navas Triano IFAPA, Centro Agua del Pino

Crta. El Rompido – Punta Umbría, Km 3,8 21459 Cartaya, Huelva

Curso Teórico-Práctico:

IFAPA Centro Agua del Pino 25 e 29 de Junho, 2012

DIAGNÓSTICO DE PATOLOGIAS EM MOLUSCOS BIVALVES

Teoria:

O exame a olho nu no diagnóstico de doenças de

moluscos bivalves. O diagnóstico de Perkinsus,

Marteilia e Bonamia

O EXAME A OLHO NU DE UM MOLUSCO BIVALVE

É essencial conhecer as estruturas anatómicas para se poder detetar alterações.

Uma observação cuidadosa in vivo de alterações na anatomia dos moluscos bivalves pode dar informação essencial relativamente ao seu estado de saúde.

Amêijoa

Elemento a observar Alterações Possíveis causas

(requerem confirmação histológica)

Aspecto geral da polpa Escassa, pálida, glándula

digestiva claramente visível Fora do período de postura são sinais evidentes de doença Bordo da concha Alteração na calcificação.

Depósitos de conquiolina Doença do anel castanho (Infecção por Vibrio tapetis) Interior da concha Alterações na calcificação,

pontos escuros Infecçoes por metacercarias de tremátodos Brânquias Pústulas/nódulos

esbranquiçados Infecção por Perkinsus sp.

Brânquias Lesões no bordo Danos causados pela presença de

Pinnotheres sp.

Manto e base dos sifões Pústulas/nódulos

esbranquiçados Infecção por Perkinsus/ Infecção por metacercarias de tremátodos (Gymnophallus spp.)

Gónada Ausência de gónada na

época de reprodução Debilidade extrema / castração parasitária por esporocistos de tremátodos

Inserção dos músculos

Anel castanho Lesões por Gymnophallus sp.

Pinnotheres sp. Lesões por Pinnotheres sp.

Ostra

Elemento a observar Alterações Possíveis causas (requerem confirmação histológica) Aspecto geral da polpa Escassa, pálida, glândula

digestiva claramente visível

Fora do período de postura são sinais evidentes de doença

Interior da concha Presença de câmaras de

gel de cheiro sulfuroso Cultivo em presença de TBT. Brânquias Pústulas/nódulos

esbranquiçados Possível infecção por Perkinsus sp. Brânquias, manto e músculo

adutor Lesões na superfície. Pústulas esverdeadas ou amareladas

Possível infecção por Bonamia sp. Possível infecção por iridovirus en

C. angulata

Possível infecção por Nocardia (nocardiasis) em C. gigas

Gónada Ausência de gónada durante a época de maturação

Debilidade extrema / castração parasitária por esporocistos de tremátodes (Bucephallus)

Glândula digestiva Pálida e mole Possível infecção por Marteilia em

O. edulis

Mexilhão

observar Alterações Causas possíveis(requerem confirmação histológica)

Aspecto geral da polpa Escassa, pálida, glândula

digestiva claramente visível Fora do período de postura são sinais evidentes de doença

Manto Coloração vermelha intensa, a aposição revela a presença de metacercarias avermelhadas

Parasitismo por Proctoeces

maculatus

Glândula digestiva Pálida e mole Possível infecção por Marteilia sp.

Tubo digestivo Pequenos vermes

avermelhados e longos Infecção pelo copépode Mytilicolasp.

Perkinsosis

A infecção por Perkinsus spp. constitui uma das mais importantes doenças conhecidas dos moluscos bivalves. Trata-se de um protozoário que causa uma reacção hemocitária intensa que altera a estrutura dos tecidos e afecta a funcionalidade de órgãos essenciais como a brânquia.

Perkinsus olseni(=atlanticus) é, pela sua distribuição e prevalência, um

dos principais agentes patogénicos das amêijoas do litoral Sul-Atlântico da Península Ibérica (Ruditapes decussatus, R. philippinarum, Venerupis

aurea e Venerupis pullastra)

Marteliasis

Marteilia spp. é um protozoário parasita do epitélio digestivo, em especial

da glândula digestiva. Tem a particularidade de apresentar uma divisão endógena. A espécie mais conhecida pelas mortalidades causadas em França nos anos 70 é M. refringens que afecta Ostrea edulis, Mytilus

edulis e M.galloprovincialis entre outras espécies.

Bonamiasis

Bonamia spp. é um protozoário parasita das células sanguíneas, que também pode ser encontrado livre. Estas células, de dimensões pequenas, são uni-nucleadas e denominam-se micro-células. É responsável por mortalidades de ostra plana em toda a Europa desde 1980. Existem diferentes espécies de Bonamia e Mikrocytos que afectam outras espécies de ostras.

Três doenças relevantes para a nossa aquacultura que podem ser diagnosticadas com procedimento simples:

DIAGNÓSTICO DE PERKINSUS

Incubação das duas hemibrânquias em 1 mL de meio líquido com tioglicolato (5g/l de extracto de levedura, 15 g/l de caseína digerida com enzimas pancreáticas, 5’5 g/l de cloreto de sódio, 0.5 g/l de L-cisteina, 0.5 g/l de tioglicolato sódico, 1 mg/l de resazurina e 0.75 g/l de agar bacteriológico) enriquecido com 20 g/l de NaCl e 20 U/ml de penicilina G sódica e 40 µg/ml de sulfato de estreptomicina.

Após incubação durante 5 dias na obscuridade a 20-27ºC as brânquias são retiradas com ansas estéreis, estendidas sobre lâmina de vidro e coradas com lugol. Nestas condições, os trofozoítos de Perkinsus aumentam

até 10 vezes o seu tamanho, transformando-se em pre-zooesporângios (= hipnosporos) que possuem uma parede celular muito grossa que se cora de azul-escuro com lugol (Ray, 1952).

DIAGNÓSTICO DE PERKINSUS: Escala de Mackin (graus de infecção) 0 2 ₃ 4 1 5

DIAGNÓSTICO DE MARTEILIA EM MEXILHÃO E OSTRA PLANA

1. Squash da glândula digestiva e coloração com V.O.E. 2. Aposição da glândula digestiva e coloração com V.O.E.

ou May Grünwald (HEMACOLOR)

Coloração do squash com VOE:

1. Recolher uma porção de glândula digestiva e esmagar sobre lâmina de vidro

2. Adicionar VOE, misturara bem e achatar com uma lamela

Coloração de Aposições com VOE : 1. Fixar 10 x 1seg. em metanol

2. 3 min. no Corante V.O.E (Gutierrez 1997: Dissolver 0.2 g Verde Luz SF amarelado, 0.25 g Orange G e 0.3g Eosina em 50 ml H2Od quente, juntar 1g de ácido fosfotungstico, 2 ml de ácido acético glacial e 100 ml de etanol absoluto)

3. 1 min. em tampão fosfato pH 7.2

4. 10x 1 seg. en H2Od

5. Deixar secar ou desidratar em etanol, isoparafina e montar

DIAGNÓSTICO DE MARTEILIA em MEXILHÃO Squash e VOE Aposição Hemacolor

DIAGNÓSTICO DE MARTEILIA EM OSTRA PLANA USANDO APOSIÇÃO DA GLÂDULA DIGESTIVA

DIAGNÓSTICO DE MARTEILIA

Squash + VOE Aposição + HEMACOLOR

DIAGNÓSTICO DE BONAMIA EM OSTRA

PLANA POR CITOCENTRIFUGAÇÃO DA

HEMOLINFA

1. Extracção de hemolinfa por punção cardíaca ou sucção directa sobre o pericárdio,

2. Fixação em solução de Alsever com 3% de formaldeído,

3. Citocentrifugação e coloração com May

Grünwald-Giemsa.

Bonamia pode-se diagnosticar também com

esfregaços de hemolinfa ou aposições de

DIAGNÓSTICO DE BONAMIA EM OSTRA PLANA POR CITOCENTRIFUGAÇÃO DA HEMOLINFA

Bonamia em hemócitos

(Citocentrifugação + Hemacolor)

Bonamia em hemócitos

José Ignacio Navas Triano IFAPA, Centro Agua del Pino

Crta. El Rompido – Punta Umbría, Km 3,8 21459 Cartaya, Huelva

Curso Teórico-Práctico:

IFAPA Centro Agua del Pino 25 e 29 de Junho, 2012

DIAGNÓSTICO DE PATOLOGIAS EM MOLUSCOS BIVALVES

Teoria:

Introdução ao diagnóstico histológico em moluscos

bivalves.

Amostragem de moluscos bivalves para o diagnóstico

de Patologias

Histórico (Anamnese) :

1. Dados ambientais

2. Dados sobre o cultivo (origem, datas, dados morfométricos, alimentação)

3. Sintomatologia e mortalidade

Recolha de amostras:

1. O número de exemplares e tipo de amostragem (aleatória simples, estratificada ou acumulada) depende dos objectivos

2. Análise de comportamento: desenterrados, moribundos, etc.

3. Exame visual (aspecto externo)

4. Aposições, esfregaço ou squash para diagnóstico de Marteliose

5. Esfregaço ou citocentrifugações de hemolinfa para diagnóstico de Bonamiose

6. Recolha de amostras de brânquias e incubação em FTM para diagnóstico de Perkinsiose

7. Recolha acética de amostras para análise microbiológica

8. Recolha de amostras para análise histopatológica

Processado Histológico:

1.

Fixação

Objectivo: evitar a decomposição e putrefacção do tecido

e conservar a estrutura celular e histológica Fixar sempre tecido vivo

Tamanho da peça: grossura máxima 5 mm

Tempo de fixação: min 24h, máx. 48h. Passar para ETOH 70%

Eleger o fixador de acordo com os procedimentos posteriores

Processado Histológico:

1.

Fixação. Principais soluções fixadoras

•

Fixador Davidson

´´´´

s (Shaw & Battle, 1957

formaldehído a 35-40% tamponado pH 7 + 300 ml de ETOH 100% + 300 ml de água de mar filtrada. Antes de usar

adicionar 1mL de ácido acético glacial por cada 9 ml de fixador. (o ácido acético pode ser eliminado se, futuramente, se

desejar extrair DNA do bloco de parafina. Neste caso, adicionar a quantidade equivalente em água do mar)

•

Fixador Carson (1990)

dihidrógenio fosfato dihidrato + 5 g de hidróxido de sódio em 900 ml de água destilada e adicionar 100 ml de formaldeído a 35-40% tamponado pH 7

Procedimento Histológico:

Objectivo: Passo obrigatório, apenas quando se deseja observar a concha do

moluscos, a carapaça em crustáceos ou o osso em peixes. É muito importante controlar o tratamento para não degradar o resto dos tecidos. Vários procedimentos:

Usando EDTA:

1.Adicionar 10 g EDTA Na por cada 100 ml de fixador durante 1- 5 dias. Comprovar a descalcificação com uma pinça.

2.Lavar com água corrente

3.ETOH 70%

Usando ácido nítrico:

1.Fixar 24h e lavar com água corrente.

2.2- 5% ácido nítrico em formol a 4%: 1-24h. Comprovar a descalcificação com uma pinça

3.Lavar com água corrente.

4.ETOH 70%

Usando soluções comerciais (HISTOSEC): 1.Fixar 24h e lavar com água corrente.

2.Submergir a amostra na solução descalcificadora o tempo necessário para amolecer as conchas (de 1 a 48h)

3.Lavar com água corrente.

Procedimento Histológico:

3. Inclusão em parafina:

Objectivo: Desidratar o tecido e embebê-lo em

parafina para ter consistência no corte.

Diferentes protocolos e solventes. Os tempos dependem da grossura da amostra e do uso ou não do vácuo.

1.Etanol 70º (conservada em)

2.Etanol 100º 2-4h

3.Etanol 100º 2-4h

4.Etanol 100º 2-4h

5.Isoparafina H (substituto do xileno/tolueno) 2-4h

6.Isoparafina H 2-4h

7.Isoparafina H 2-4h

8.Isoparafina H : Parafina (com DMSO) (8:2): 2-4h

9.Parafina (com DMSO) 65ºC 4-8 h

10.Parafina (com DMSO) 65ºC 4-8 h

11.Montagem em placa quente (evitar aquecer demasiado a amostra) ORIENTAR CORRECTAMENTE A AMOSTRA

Procedimento Histológico:

1.

Corte no micrótomo:

Objectivo: obter secções suficientemente finas que

permitam uma boa definição da estrutura celular e

do tecido após a coloração

1. Arrefecer os blocos de parafina a 4ºC

2. Protelar até chegar à zona de interesse

3. Cortar secções entre 2-5 micras

4. Estender as secções em água destilada quente (37ºC)

5. Recolher com lâminas os cortes orientados

6. Se se deseja realizar vários tipos de colorações é conveniente recolher várias séries de cortes em lâminas numeradas

Processamento Histológico:

2. Coloração

Objectivo: corar o corte histológica com corantes de

acordo com o que se desejar:

Hematoxilina-Eosina: geral

P.A.S.: glucógenio e mucopolisacáridos

Feulgen: ADN

Coloração Hematoxilina-Eosina. Procedimento geral

(adaptado de Howard y Smith 1983)

1. Desparafinar: Isoparafina H 10 min x 3 vezes. 2. Hidratar: ETOH 100º 10 min x 3 vezes.

ETOH 70º 10 min x 3 vezes

Água destilada 10 min x 2 vezes. 3. Corar: Hematoxilina de Harris o Mayer 30 min. 4. Lavar: Água corrente 5 min.

5. Diferenciar: ETOH ácido (0,04% HCl em etanol 70º) 1 min. 6. Lavar: Água corrente 5 min.

7. Azular: Na HCO3, uma colher em 250 mL H2O 1min 8. Lavar: Água corrente 5 min.

Água destilada 5 min. 9. ETOH 90º 10 min.

10. Corar: Eosina amarelada 10 min.

11. Desidratar: ETOH 100º 10 min x 3 vezes 12. Aclarar: Isoparafina H 10 min x 3 vezes.

4. Exame histopatológico

1.

Conhecimento profundo da anatomia do molusco

2.

Secção adequada e orientação correcta do corte

Plano sagital Plano coronal

José Ignacio Navas Triano IFAPA, Centro Agua del Pino

Crta. El Rompido – Punta Umbría, Km 3,8 21459 Cartaya, Huelva

Curso Teórico-Práctico:

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DIAGNÓSTICO DE PATOLOGIAS EM MOLUSCOS BIVALVES

Teoria:

Técnicas básicas de amostragem. A amostragem na estimação da prevalência de uma patologia

A amostragem é a peça chave que

permite (ou não) extrapolar resultados

População

(inacessível)

Amostra

Análise

Resultado

(x)

Estimação

(x

±

y)

Confiança

(x

±

y)

p<0.05

Que funções deve cumprir uma boa amostragem?

Deve ser adequada ao nosso objetivo. Por exemplo:

- Estudar a prevalência de uma doença numa população compreendida entre determinados tamanhos

- Estudar a associação entre a mortalidade e a presença de um parasita

Deve ser suficientemente representativa da população objeto.

(População objeto: grupo de indivíduos de que se deseja obter informação - não confundir com a população total)

Duas perguntas chave quando se define uma

amostragem

Que indivíduos se devem incluir na amostra?

(A amostragem deve ser aleatória dentro da população

objeto)

Que indivíduos devo incluir na amostragem?

A amostragem deve ser aleatória dentro da população objeto

Tipos de Amostragens Aleatórias:

Aleatória simples: TODOS os indivíduos da População

OBJECTO têm as mesmas possibilidades de serem amostrados.

Como decidir sobre quais os exemplares? Estabelecer uma ordem e utilizar uma tabela de números aleatórios

Aleatório estratificado (simples ou composto): Primeiro

estratifica-se a população total segundo um determinado critério (distribuição de tamanhos, sexo…) em várias

populações objeto e depois faz-se em cada uma delas uma amostragem aleatória simples.

Aleatório por grupos (conglomerados): primeiro divide-se a

população em subgrupos similares e depois amostra-se totalmente alguns dos subgrupos escolhidos ao acaso (retículos)

Como se deverá fazer a amostragem para se estudar a

prevalência de uma ocorrência em populações de moluscos?

Populações em cultura (tamanhos definidos e localizados): amostragem aleatória

estratificada simples

Populações naturais (dispersão espacial não homogénea e dispersão de

tamanhos)

• Na amostragem de populações naturais de moluscos é difícil que todos os indivíduos tenham a mesma probabilidade de serem amostrados (discriminação por tamanhos das artes de captura).

• Quando é necessário um número significativo de amostras, as amostragens por grupos (conglomerados) usando retículos não são viáveis

• Recorre-se a amostragens aleatórias em sub-populações capturadas no meio natural. Estas estão sempre estratificadas segundo os critérios da primeira amostragem (p.e. tamanhos mínimos de captura da arte utilizada) • Para além disso estas amostragens iniciais com artes são do tipo grupo

(conglomerado) (percurso do arrasto) mas não são escolhidos ao acaso devido à distribuição não homogénea das populações.

Quantos indivíduos devo amostrar para saber

se uma população está livre ou não de um

parasita?

Como calcular o tamanho da amostra “n”?

Para isso é necessário ter o método de diagnóstico

validado, isto é, conhecer a sua Sensibilidade e

Especificidade

•Sensibilidade diagnostica (Se):

é a probabilidade de que um exemplar verdadeiramente

infetado seja diagnosticado como tal = 1- probabilidade de

um falso negativo

•Especificidade diagnostica (Sp):

é a probabilidade de que um exemplar são seja

diagnosticado como tal = 1- probabilidade de um falso

positivo

Um teste perfeito (Gold Standard) é aquele que:

Se = Es = 1

A probabilidade Se e Sp de um método calcula-se comparando com o GoldStandard

Se = a / (a+c) = 1-[c/a+c)]

Sp = d / (b+d) = 1 – [b / ( b+d)]

Quando não há provas diagnosticas de referência perfeitas a estimação de Se e Sp fazem-se mediante métodos de Classes Latentes: Máxima verosimilhança e análise Bayesiana

Resultado do teste

Estado real dos indivíduos

Infetados Não infetados

+ A b

Validação de um método diagnóstico

Prevalência é = nº de infetados/nº total

Nós medimos sempre uma Prevalência “aparente” (Pa) =

nº de infetados corretamente diagnosticados + nº de são erroneamente diagnosticados como infetados

Pa = (P x Se) + [(1-P)x(1-Sp)]

em que Se = Sensibilidade diagnóstica e

Sp = Especificidade diagnóstica

APrevalência real (P) é =

O tamanho da amostra “n” para detetar uma doença segundo Thorburn (1999) depende:

• Do tamanho real da população “N”

• Da prevalência real da doença “P”

• De Sensibilidade “Se” e da Especificidade “Sp” do método de diagnóstico

• Do Erro (tipo alfa) que estejamos dispostos a aceitar (α

=0.05), quer dizer, da probabilidade de não detetar nenhum positivo na amostra “n” para uma dada prevalência

• Para populações suficientemente grandes:

n = ln (

α

) / ln (1- Pa)

em que

Caso prático:

Como calcular o número de exemplares a amostrar

para se saber até que ponto uma zona pode estar livre

de uma doença ?

Sabemos que o Método de Diagnóstico que vamos usar tem uma Sensibilidade (Se) de 0.70 e uma Especificidade (Sp) de 0.99

e

Desejamos saber o tamanho da amostra “n” que deveríamos recolher numa população de tamanho considerável (N>1000), para poder afirmar, com uma certeza de 95% (α=0.05), que, no caso de não detectar nenhum infectado, a população tem uma Prevalência real (P) inferior a 5 % dos indivíduos,

ou, o quer dizer o mesmo:

Quantos exemplares devo amostrar para detetar pelo menos um exemplar infetado (com 95% de possibilidade de acertar), numa população de tamanho considerável (>1000) que tenha uma prevalência real da doença igual ou superior a 5%?

Se = 0.70; Sp = 0.99; P= 0.05; α = 0.05

Determina-se primeiro a Prevalência aparente, Pa=(P x Se)+[(1-P)x(1-Sp)]= 0.0445

José Ignacio Navas Triano IFAPA, Centro Agua del Pino

Crta. El Rompido – Punta Umbría, Km 3,8 21459 Cartaya, Huelva

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DIAGNÓSTICO DE PATOLOGIAS EM MOLUSCOS BIVALVES

Teoria:

Introdução ao diagnóstico microbiológico em

patología de moluscos bivalves

Patologia de Moluscos Bivalves: Diagnóstico microbiológico

Infecções bacterianas em larvas (Vibrio spp., Pseudomonas spp. e Aeromonas spp.)

Isolamento e caracterização de vibrios em infecções em concha (Vibrio tapetis)

Nocardiosis (nódulos em conectivo de bactérias filamentosas Gram+, Acido resistente, PAS positivo)

Esquema básico para o diagnóstico microbiológico clássico:

Provas complementares: - Catalase

- Utilização de vários acúcares (Sacarose, Lactose, Manitol, etc)

- Descarboxilação de vários aminoácidos (Arginina, Lisina, Ornitina)

- Voges proskauer - Vermelho de metilo

- Crescimento a temperaturas diferentes - Necessidades de sais

- Degradação do amido, lípidos, gelatina, etc. - Crescimento em TCBS

- Sensibiliadade a antibióticos (Antibiogramas) - Hemolisinas

Sementeira em meios gerais ou selectivos (AM, TSA, TCBS, FMM) RECOLHA DE AMOSTRAS EM CONDIÇÕES ASSÉPTICAS Isolamento de colónias Identificação comparativa com estirpes de referência

Conservação de estirpes (Liofilizadas ou em Glicerol a -80 ºC)

Kits comerciais (API 20 E e API 20NE) Provas básicas: - Gram - Morfologia - Mobilidade - Oxidase - Glucose O/F

- Renibacterium spp. - Lactobacillus spp. O/F glucose: O - Micrococcus spp. O/F glucose: F Catalase + - Staphylococcus spp. Bactérias não móveis Bactérias filamentosas - Mycobacterium spp. - Nocardia spp. Cocos Bacilos Bactérias filamentosas O/F glucose: O/NC Movimento deslizante - Flavobacterium spp. - Fexibacter spp. - Tenacibaculum spp. Sensível a O129 Necessita de sais - Vibrio spp. (V. splendidus, V. pelagicus, V. alginolyticus, V. harveyi, etc.) - Photobacterium damselae subs. damselae - Listonella anguillarum Resistente a O129 Não necessita de sais

- Aeromonas spp.

O/F glucose: O/NC

- Pseudomonas spp.

O/F glucose: F

O/F glucose: F

- Aeromonas salmonicida - Photobacterium

damselae subs. piscicida

O/F glucose: O/NC

- Flavobacterium spp. Bacilos Oxidase + _{oxidase –} Bactérias móveis _{- Edwardsiella} spp. - Yersinia spp. Catalase – - Streptococcus spp.

Bactérias aeróbicas e/ou anaeróbicas facultativas

Gram –

Gram +

José Ignacio Navas Triano IFAPA, Centro Agua del Pino

Crta. El Rompido – Punta Umbría, Km 3,8 21459 Cartaya, Huelva

Curso Teórico-Práctico:

IFAPA Centro Agua del Pino 25 e 29 de Junho, 2012

DIAGNÓSTICO DE PATOLOGIAS EM MOLUSCOS BIVALVES

Teoria:

Introdução ao diagnóstico molecular por PCR e

PCR-RFLP

OBJETIVOS

1.

Extração de DNA Técnicas

2.

Quantificação

3.

PCR e PCR-RFLP

4.

Breve descrição do procedimento para o

Diagnóstico de Perkinsus, Bonamia, Marteilia,

OsHV-1

OBJETIVOS

1.

Extração de DNA Técnicas

2.

Quantificação

3.

PCR e PCR-RFLP

4.

Breve descrição do procedimento para o

Diagnóstico de Perkinsus, Bonamia, Marteilia,

OsHV-1

1º Toma da mostra

Extrair a parafina

Lyse Ligação do DNA para

a matriz da coluna

Lave DNA

Lave DNA Eluir

OBJETIVOS

1.

Extração de DNA Técnicas

2.

Quantificação

3.

PCR e PCR-RFLP

4.

Breve descrição do procedimento para o

Diagnóstico de Perkinsus, Bonamia, Marteilia,

OsHV-1

2.- Quantificação

1.5µl DNA

AJUSTAR CONCENTRAÇÃO DNA PARA PCR Folha de resultados

•Concentração de DNA em ng/ul

OBJETIVOS

1.

Extração de DNA Técnicas

2.

Quantificação

3.

PCR e PCR-RFLP

4.

Breve descrição do procedimento para o

Diagnóstico de Perkinsus, Bonamia, Marteilia,

OsHV-1

Mostra - DNA

PRIMERS - Forward & Reverse:

- Oligo de _≈ 20ntd - TM similares

- %GC _≈ 60%

- não secuencias palindrómicas.

- não annealing entre eles.

- O Reverse tem que seoel Reverso Complementario da secuencia do DNA molde.

DNApol – Taq polymerase

dNTPs -ATGC

Buffer MgCl2

H2O destilada estéril

3.- PCR (Polymerase Chain Reaction) e RFLP (Restriction fragment length polymorphism) Qué e PCR?

3.- PCR (Polymerase Chain Reaction) e RFLP (Restriction fragment length polymorphism)

3.- PCR (Polymerase Chain Reaction) e RFLP (Restriction fragment length polymorphism)

Qué e PCR?

•Polymerase Chain Reaction

3.- PCR (Polymerase Chain Reaction) e RFLP (Restriction fragment length polymorphism)

Mostra - DNA

PRIMERS - Forward & Reverse:

- Oligo de _≈ 20ntd - TM similares

- %GC _≈ 60%

- não secuencias palindrómicas.

- não annealing entre eles.

- O Reverse tem que seoel Reverso Complementario da secuencia do DNA molde.

DNApol – Taq polymerase

dNTPs -ATGC

Buffer MgCl2

Patógeno TM Primer Secuencia 5´´´´- 3´´´´ Producto PCR Bibliografía Perkinsus 67ºC PK1 PK2 ACCAGTCACCACAGGGCGTAAT GTAGCGTGCTCTGATGATCACT 554bp De La Herrán et al, 2000 Marteilia 55ºC MT1 MT2 GCCAAAGACACGCCTCTAC AGCCTTGATCACACGCTTT 525bp

Inmaculada López, et al, 2004 Bonamia 55ºC BO BOAS CATTTAATTGGTCGGGCCGC CTGATCGTCTTCGATCCCCC 300bp 304bp Cochennec-Laureau et al., 2003 OsHV-1 58ºC C2 C6 CTCTTTACCATGAAGATACCCACC GTGCACGGCTTACCATTTTT 709bp_698bp Arzul et al., 2001

3.- PCR e RFLP (Restriction fragment length polymorphism)

3.- PCR e PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 35 ciclos Protocolo Taq-pol desnaturação Annealing amplificação 95ºC 15s TM 15s 72ºC 30s 95ºC 1min Desnatur-inicial 72ºC 2min Amplificação final

3.- PCR e PCR-RFLP

Gel de agarose

Fonte de electroforese

3.- PCR e PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism) (Polimorfismos de longitude de fragmentos de restrição)

Precissa para RFLP: Produto da PCR

ER – Enzima de amplificação

3.- PCR e PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism)

OBJETIVOS

1.

Extração de DNA Técnicas

2.

Quantificação

3.

PCR e PCR-RFLP

4.

Breve descrição do procedimento para o

Diagnóstico de Perkinsus, Bonamia, Marteilia,

OsHV-1

4. Breve descrição do procedimento para o Diagnóstico de Perkinsus, Bonamia, Marteilia, OsHV-1

1º Toma da muestra

2º Extraçãon do DNA

4º PCR

3º Quantifiçãon o DNA 5º Gel de Agarose

6º RFLP

7º Ver o produto RFLP em Gel de Agarose e obter um diagnóstico

Monserrat López Sanmartín IFAPA, Centro Agua del Pino

Crta. El Rompido – Punta Umbría, Km 3,8 21459 Cartaya, Huelva

Curso Teórico-Práctico:

IFAPA Centro Agua del Pino 25 e 29 de Junho, 2012

DIAGNÓSTICO DE PATOLOGIAS EM MOLUSCOS BIVALVES

Teoria:

Introdução ao diagnóstico mediante hibridação in

situ (ISH)

94

Hibridação in situ

(ISH)

•

Fundamentos: utilizar a especificidade de um

fragmento de DNA/RNA para localizar o parasita nos

tecidos do hospedeiro

•

Aplicações:

– Confirmação visual da especificidade da sonda.

– Diagnóstico confirmativo

– Seguimento da progressão do parasita nos

tecidos

Navas, J.I.; López-Flores, I.; de la Herrán, R.; Garrido-Ramos, M.A.; Ruiz-Rejón, C. y Ruiz-Rejón, M. Feb/2004

95

Estratégias para desenhar sondas

moleculares de diagnóstico

•

Requisito: sequências específicas e repetidas

•

Candidato: DNA repetitivo (DNA satélite o ribossómico)

•

Procedimentos:

– Isolamento do parasita, extracção do DNA, digestão

com enzimas de restrição, clonagem e sequenciação

– Aplicação de “primers” universais para a sequenciação

96

Passos da Hibridação in situ (ISH)

Fixação e processamento histológico do tecido.

Obtenção de cortes histológicos seriados fortemente

aderidas

às

lâminas

(sinalizadas):

controlo

histológico (H&E), controlo cego e amostra.

Desenvolver também controlos positivos e negativos

com amostras sãs e infectadas

Síntese e marcação da sonda: diversos métodos

associados a uma reacção de PCR e incorporação

de marcadores não radiactivos (dDIG,

UTP-Biotina o dUTP-Fluorescência para FISH directa)

5. Protocolo de ISH:

1.

Permeabilização do tecido:

1.

Desparafinação,

2.

Hidratação

3.

Desproteinização

2.

Pré-hibridação: tampão de hibridação: (H

Odd estéril +

Formamida desionizada + ARNt Levedura + Esp. Salmão

+ SSC + Solução de Denhard)

3.

Hibridação (tampão mais sonda marcada)

1.

Desnaturação a 94ºC

2.

Arrefecer rapidamente

3.

Hibridação a 42ºC ou Tª próxima à Tm da sonda

4.

Lavagem com SSC (tampão salino de citrato de sódio):

juntamente com a temperatura e a sequência da sonda

controla a adstringência da hibridação

Passos na ISH (cont.):

Bloqueio prévio na detecção imunológica do marcador da

sonda (DIG, BIOTINA, etc..

Detecção imunológica com anticorpos conjugados com

enzimas:

Anti DIG - POS (peroxidase de rábano)

Anti DIG - PA (fosfatase alcalina)

Revelação mediante a detecção da atividade enzimática:

PA com NBT-BCIP; POS com Vector Nova-Red

Coloração de contraste:

PA com Birsmarck Brown Y e montagem em meio

aquoso

Exemplo 1: Diagnóstico de Perkinsus spp.

e P. olseni mediante ISH

A N TI -DI G AP A N TI -DI G POD DIG DIG DIG DIG

Perkinsus spp.

Perkinsus olseni

18S 5S 28S 18S 5,8S IGS PK1 PK2 ITS2 ITS1

ISH Perkinsus olseni

Hematoxilina & Eosina Sonda IGS-DIG Controlo sem Sonda

10 µm 10 µm

10 µm 10 µm

Perkinsus olseni

40 µm

160 µm 15 µm

160 µm

Perkinsus olseni

Navas, J.I.; López-Flores, I.; de la Herrán, R.; Garrido-Ramos, M.A.; Ruiz-Rejón, C. y Ruiz-Rejón, M. Feb/2004

Exemplo 2: Diagnóstico de Marteilia refringens

Duas sondas:

Genérica: Marteilia spp. sobre o 18S (SAS1-SS2)

Específica: Marteilia refringens sobre o IGS

ISH Marteilia refringens em Ostrea edulis

Hematoxilina & Eosina Control sem Sonda

Sonda 18S-DIG Sonda IGS-DIG

Desenho da região C de 3

sondas: OsHV-1 OsHV-1 µvar OsHV-var

Sonda 1: Sonda C2-C6-DIG SIM SIM SIM

Sonda 2 SIM SIM NÃO

Sonda 3 NÃO NÃO SIM

C2-C6 PCR-DIG SONDA S1 Control Cego

H&E

ISH

OsHV-1

José Ignacio Navas Triano IFAPA, Centro Agua del Pino

Crta. El Rompido – Punta Umbría, Km 3,8 21459 Cartaya, Huelva