Gene é um segmento de DNA que contém informações para codificar uma ou mais funções

Gene é um segmento de DNA

que contém informações para

codificar uma ou mais funções

Espécie

Biodiversidade

• 10.000.000 espécies

• Ecossistema – várias espécies vivendo em

um mesmo lugar

• Energia flui de um ecossistema para outro

• Há uma perda de 30.000 a 40.00 sp/ano

• Muitos de nossos medicamentos provém de

ecossistemas

Engenharia genética

• Tecnologia do DNA recombinante produzindo novos

organismos, ou seja, organismos geneticamente

modificados

• Pode sre realizada de várias maneiras como

• Inserindo um gene de uma espécie em outra,

criando-se um organismo transgênico

• Alterando um gene existente

Descoberta da estrutura química

do DNA

DNA

• Se todos ACGT substituíssem números e

nomes de listas telefônicas de SP teríamos

140

Zigoto Blastocisto Gástrula Ectoderma (Camada externa) Céls. germinativas Mesoderma (Camada média) Endoderma (Camada interna)

Músculo

liso _Estômago

Tecido conjuntivo

Tecido

Transcrição Transcrição

Passos da engenharia genética

1. Isolar o gene

2. Inserir o gene em um hospedeiro - vetor

3. Produzir o máximo de cópias possíveis

4. Separar e purificar o produto do gene

Cuidados

• Cuidados comparáveis aos utilizados no

trabalho com patógenos.

• Risco é a contaminação do DNA (amostra) e

não do operador (pesquisador).

Área física:

1) Preparação das amostras

(extração RNA e DNA)

2) Sala de pré-PCR (preparação

do “mix” da reação)

Descontaminação de superfícies (luz

ultravioleta-UV)

Ação limitada.

Não destrói todos os contaminantes

(ação reduzida se o DNA for menor que

300 pb).

Material

- 1 banana

- 2 copos

- Banho-maria (60ºC)

- Água destilada

- Sal de cozinha

- Detergente para louça

- Álcool etílico a 95% gelado (-10ºC)

- Bastão fino de vidro

- Filtro de papel e gelo moído

Procedimento

•Corte e amasse a banana.

•Coloque 4 colheres (sopa) de detergente e 1 (chá) de sal em meio copo de água.

•Mexa até a total dissolução, depois adicione a banana e leve em banho-maria por cerca de 15 minutos.

•Retire a mistura do banho-maria e resfrie-a rapidamente, colocando o copo no gelo durante cerca de 5 minutos.

•Coe a mistura, adicione ao filtrado cerca de meio copo de álcool gelado, deixando-o escorrer vagarosamente pela borda. Observe o que ocorre até aqui e anote.

•Em seguida, com o bastão de vidro, faça movimentos circulares misturando as fases.

DNA Genômico

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Técnica que permite a amplificação da

quantidade de DNA específico utilizando

a enzima Taq DNA polimerase,

sequências iniciadoras específicas

(primers) e variações de temperatura

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes

dATP dCTP dGTP dTTP (nucleotideos)

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes DNA

Taq polimerase Primers Tampão Água

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes DNA dATP dCTP dGTP dTTP (nucleotideos)

Taq DNA polimerase

O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a

qual é uma bactéria encontrada

sobrevivendo a altas temperaturas em

geisers no Yellow Stone National Park.

Taq DNA polimerase

Termoestabilidade limitada

Temperatura

T

_1/2

(minuto)

92,5

o

_C

₁₃₀

95,0

o

_C

₄₀

97,5

o

C

5

 Trata-se de uma enzima cuja atividade é mantida durante 45 minutos a 95°C.

• Sua quantificação é dada em Unidades (U), sendo que cada U

é definida como a quantidade de enzima capaz de incorporar 10 nM de dNTP em cerca de 30 min a 72°C.

• Na maioria dos protocolos são utilizadas 2,0 a 2,5 U

(0,5 l) de enzima em volume final de 100 l.

• É importante deixar claro que o excesso de enzima também

pode prejudicar a eficiência da reação, podendo inclusive inibi-la.

• Os primers (forward e reverse) devem ser construídos

de acordo com a conveniência do investigador, de modo

que

esses

possuam

seqüências

complementares

a

determinadas regiões do DNA

que limitam os

segmentos a serem amplificados.

Problemas comuns no

Desenho de

Primers

• Auto-complementariedade

Auto Complementariedade

• Formação de alça

GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT

HOTGACTTC Tm = 71oC

Complementariedade entre

Primers

• Formação de “

primer dimer

”

5‟ GAACTACCATAGACACACTGAAGG_OH3‟

5 „ CTTCAGGTCAAGAACTTCCTTCAGT_OH3‟

3‟_OHTGACTTCCTCAAGAACTGGACTTC

•

São as

bases nitrogenadas

que constituirão as

novas cadeias de DNA.

•

Sua concentração numa reação pode variar de

20 a 200 uM sendo importante que as quatro

devam variar em

concentrações equivalentes

.

•

Quando estão em excesso (um nucleotídeo ou

todos) podem ocorrer erros de incorporação de

bases, gerando cópias alteradas

• O íon magnésio (Mg++_{) é um co-fator enzimático que}

desempenha um papel de extrema importância na atividade da enzima Taq DNA polimerase.

• Sua concentração em torno de 1,5 mM é aplicável a maioria das necessidades.

- Se a concentração de Mg2+ é muito baixa, temos pouco ou nenhum produto

- Se a concentração de Mg2+ é muito elevada, a PCR tem baixa especificidade. Observa-se muitas bandas ou

“smear”.

PCR “Requerimentos”

• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM

• Tampão: pH 8.3-8.8

• dNTPs: 20-200µM

• Primers: 0.1-0.5µM

• DNA Polimerase: 1-2.5 units

• DNA Alvo:



1 µg

Taq polimerase Primers Tampão Água

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes DNA dATP dCTP dGTP dTTP (nucleotideos)

Taq polimerase Primers Tampão Água 94ºC DENATURAÇÃO

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes 2. Alternância de temperaturas (Termociclador) DNA dATP dCTP dGTP dTTP (nucleotideos)

Taq polimerase Primers Tampão Água 94ºC DENATURAÇÃO 57ºC ANELAMENTO

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes 2. Alternância de temperaturas (Termociclador) DNA dATP dCTP dGTP dTTP (nucleotideos)

Taq polimerase Primers Tampão Água 94ºC DENATURAÇÃO 72ºC EXTENSÃO 57ºC ANELAMENTO

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes 2. Alternância de temperaturas (Termociclador) 25-40 (35) CICLOS DNA dATP dCTP dGTP dTTP (nucleotideos) http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/

Enzimas de restrição

• Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima;

Função Natural: proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno

94ºC

57ºC

ANELAMENTO

72ºC EXTENSÃO

Taq

 Essa temperatura está relacionada, por exemplo, com a quantidade das bases C e G, de modo que quanto maior for o número dessas bases, a temperatura de hibridização tende a aumentar.

• Normalmente primers de 18 a 25 nucleotídios contendo 50 a 60% de G + C são adequados. • Para se calcular a TM (temperatura média de

hibridização) de primers com até 20 nucleotídios aplica-se a aplica-seguinte formula:

4 x (C + G) +2 x (A + T) = TM

Temperatura média (Tm) de Anelamento

Ponte de Hidrogênio fosfato pentose Citosina Guanina Timidina Adenina Ponte de Hidrogênio fosfato pentose Citosina Guanina Timidina Adenina

•

Esse fator depende do

comprimento

do

segmento a ser amplificado e da

concentração

do

DNA molde utilizado na reação.

•

A temperatura ótima de extensão dos primers é

de

72°C (temperatura ótima de atividade da

polimerase)

e o

tempo de extensão de 1 minuto é considerado suficiente

para estender

produtos de aproximadamente 1.250 pb

(em condições ideais).

•

As condições de desnaturação utilizadas

normalmente são de 95°C por 5 minutos

(

desnaturação inicial

) e por 30 segundos

(

desnaturação na ciclagem

), sendo que

temperaturas mais altas podem ser utilizadas

quando se trabalha com seqüências moldes

ricas em G+C.

•

Temperaturas muito altas e tempos longos de

desnaturação levam a perda de atividade da enzima

Amplificação de DNA

(exponencial)

Log [DNA] X ciclos

Geométrica

Plateau

Linear

Gel EtBr

y = 2

X

Amplificação de DNA

(Platô)

CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA 0 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1,024 11 2,048 12 4,096 13 8,192 14 16,384 15 32,768 16 65,536 17 131,072 18 262,144 19 524,288 20 1,048,576 21 2,097,152 22 4,194,304 23 8,388,608 24 16,777,216 25 33,554,432 26 67,108,864 27 134,217,728 28 268,435,456 29 536,870,912 30 1,073,741,824 31 1,400,000,000 32 1,500,000,000 33 1,550,000,000 34 1,580,000,000

Análise

dos dados

Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água

Análise

dos dados

Termociclador Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água

Análise

dos dados

Termociclador Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Reação de PCR + Tampão Corado (Loading Buffer)

Análise

dos dados

Eletroforese em gel de agarose + Brometo de Etídeo Termociclador Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Reação de PCR + Tampão Corado (Loading Buffer)

Análise

dos dados

Luz Ultravioleta Fotodocumentação Termociclador Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Eletroforese em gel de agarose + Brometo de Etídeo Reação de PCR + Tampão Corado (Loading Buffer)

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 2% REVELAÇÃO DO BROMETO DE ETÍDEO

Visualização do DNA em luz

ultravioleta

Marcador de pares de base (pb) 300 200 100 400 500 600 1400 1300

FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2% UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb

Marcador de pares de base (pb) 300 200 100 400 500 600 1400 1300 400 400 400 600 600 100 100 100 100

FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2% UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb

TAMANHO ESTIMADO DOS FRAGMENTOS DE DNA AMPLIFICADOS

- Reverse Transcriptase -PCR (RT-PCR): amplifica RNAm, construindo cópias complementares de DNA (cDNA).

- Real Time-PCR: PCR quantitativo utilizado para determinação de carga viral.

- Nested-PCR: amplifica seqüências de DNA de baixa frequência (exemplo: diagnóstico de parasitoses).

• A alta sensibilidade do método de PCR, bem como a sua especificidade, nos permite amplificar uma seqüência-alvo mesmo a partir de amostras com baixo grau de pureza e de

quantidades mínimas de DNA, o que torna o método viável não só para a pesquisa básica mas também para a pesquisa

aplicada.

Os produtos amplificados por PCR podem ter as seguintes utilidades/ aplicações:

1. Detecção de deleções / inserções determinadas pela geração de produtos amplificados que apresentam alterações em seu tamanho.

2. Detecção de mutacões pontuais (substituição de bases), conhecidas ou não, que geram polimorfismos genéticos

podem ser determinadas pela ação das enzimas de restrição ou através do seqüenciamento.

3. No diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional (particularmente para doenças herdadas).

4. Na tipagem para transplantes de órgãos e

susceptibilidade para doenças auto-imunes específicas (detecção de polimorfismo para HLA).

5. No diagnóstico e prognóstico de doenças de ordem

genética, como o câncer, através do estudo dos genes relacionados a essas doenças.

6. Na medicina forense (DNA fingerprint).

7. No diagnóstico de doenças infecciosas por agentes patogênicos diversos

Transciptase reversa

• Transcriptase reversa

• mRNA - cDNA

• Banda complementar utilizando DNA

polimerase

SEQUENCIAMENTO DO

GACAACGGTTTC TGCTCACCCAAGATA CTCCGATGTGCTCCT GAACCAGATGCTTTT

AATCCCTGTGAAGAT ATTATGGGCTATAA CTTCCTTAGGGTACT GATTTGGCTGATTAA TATCCTAGCCATCGT GGGAAATGTGACTGT TCTCTTTGTTCTCCT GACTAGTCGTTATAA ACTGACAGTACCCCG TTTTCTCATGTGCAA TCTCTCTTTTGCAGA CTTTTGCATGGGGCT CTATCTGCTGCTCAT TGCCTCAGTTGATTC CCAAACCAAAGGCCA GTATTATAACCATGC CATAGACTGGCAGAC AGGGAGTGGGTGTAG TGCAGCTGGCTTTTT CACTGTATTTTCAAG TGAGCTTTCTGTCTA CACCCTCACAGTCAT CACACTAGAAAGATG GCACACCATCACCTA TGCTCTTCAGCTGGA CCAAAAGCTGCGTTT AAGACATGCCATTCC AATTATGCTTGGGGG ATGGCTCTTTTCCAC TCTTATCGCCATGTT GCCCCTTGTGGGTGT CAGCAATTACATGAA AGTCAGCATTTGCCT CCCCATGGATGTAGA AACCACTCTCTCACA AGTATACATATTAAC CATCCTGATACTCAA TGTGGTGGCCTTCAT CATCATTTGTGCTTG CTACATTAAAATTTA TTTTGCAGTTCAAAA TCCAGAGCTGATGGC TACCAACAAAGATAC AAAGATTGCTAAGAA AATGGCGGTCCTTAT CTTCACTGATTTCAC CTGCATGGCACCAAT CTCTTTTTTTGCCAT CTCAGCTGCCTTCAA AATGCCCCTCATCA CAGTAACCAACTCT AAAGTTTTACTGGTT CTTTTTTATCCTGTC AATTCTTGTGCCAAT CCATTTCTGTATGCT

Enzimas de restrição

• Escaneiam o DNA

• Encontram sequência de nucleotídeos

• Fazem um corte específico

A enzima BamHI reconhece a seqüência dupla

fita:

- reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA, atuando como verdadeiras tesouras moleculares

•

Bam

HI -

Bacillus amyloliquefaciens

H

5’ G/GATCC 3’

•

Eco

RI -

Escherichia coli

R

5’ G/AATTC 3’

•

Hae

III -

Haemophilus aegyptius

5’ GG/CC 3’

•

Pst

I -

Providencia stuartii

5’ CTGCA/G 3’

5’ TGACGGGTTCGA

GGCC

AG 3’

3’ ACTGCCCAAGGT

CCGG

TC 5’

5’ TGACGGGTTCGA

GG

CC

AG 3’

3’ ACTGCCCAAGGT

CC

GG

TC 5’

5’ GAATTC 3’

3’ CTTAAG 5’

5’

GA

ATTC 3’

3’ CTTA

AG

5’

5’

G

A

ATTC 3’

3’ CTTA

A

G

5’

Inserir o gene em um vetor

• Vetor

• Molécula de

DNA que é

utilizada para

carrear o gene na

célula hospedeira

Multiplicação das células

hospedeiras

• Larga escala

• São todas geneticamente iguais por causa da

reprodução assexuada

Técnica do DNA Recombinante

• Manipulação do genoma para produção de

uma característica desejável

1. DNA recombinante

2. Enzimas de restrição

3. Vetores de clonagem

- Plasmídios

- Bacteriófagos

- Cosmídeos

4. Etapas de clonagem molecular

5. Aplicações

TIPOS DE VETORES

Vetores

Hospedeiros

Plasmídeos

Cosmídeos

Bactérias / leveduras clonagem

Bacteriófagos

Plasmídios

• Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita

dupla, extracromossomais, que ocorrem

naturalmente

em

bactérias

e

algumas

leveduras

– pUC18 – pBR322 – pUP310

Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de até 9 kb

VETORES PLASMIDIAIS

pUS974

4039 pb rCa na m ic ina MT19 oriM hs p6 0 RBS oriE HindIII XbaI Vetor de Expressão em Procarioto

pTarget

5670 bp

rNe om ic ina rAm pic ilina

Intron P oly A P rom otor CM V BamHI (1257) EcoRI (1251) EcoRI (1319) HindIII (1326)

VETORES PLASMIDIAIS

Vetor de Expressão em Eucariotos

pUS973

3984 bp

rCa na m ic ina

oriM P rom otor hs p6 0

RBS oriE _HindIII XbaI

Vacina Vetorizada (rBCG)

pUS974 4039 pb rCa na m ic ina MT19 oriM hs p6 0 RBS oriE HindIII XbaI pUS977 3984 bp rCa na m ic ina

oriM P rom otor pAN

RBS oriE _HindIII XbaI pUS2000_3759pb Kan(R) OriM p18kDa oriC XbaI HindI I I

Vetor de Expressão em Eucariotos

-

Vírus que infectam bactérias;

- Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a

25 kb

BACTERIÓFAGO

Ciclo Lítico

Ciclo Lisogênico

- São

híbridos

entre

plasmídios

e

bacteriófagos;

- Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35

kb;

COSMÍDEOS

Características essenciais

• Replicação autônoma

• Marcador de seleção (antibiótico)

• Sítio único de clonagem

• Necessitam de um promotor forte, de

um RBS e de ATG

• Promotores induzíveis

• Sinais de secreção

• Fusão com proteínas carreadoras

• É o isolamento e a

propagação

em

um

organismo de moléculas

idênticas de DNA

• Digestão • Purificação

3.Preparação do vetor

Plasmídeo Circular

Plasmídeo linear

Digestão com Enzimas de

Extremidades coesivas Fragmento de DNA -inserto DNA plasmidial -vetor LIGASE

4. Ligação

5.Transformação da bactéria

ELET

ROP

ORAÇ

Construção do DNA Recombinante

Molécula de DNA de um plasmídeo circular Clivagem com enzima de restrição

Molécula de DNA de um plasmídeo

linear com extremidades coesivas

anelamento

Ligação covalente pela DNA ligase

Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto Inserção em uma célula hospedeira

Figure 3 – Chromosomal G-bands were identified (A).

FISH - Canine LHCGR was located on chromossome CFA 10 (B).

A

Extração de DNA de L. interrogans

Leptospira interrogans _{meio EMJH Extração de DNA}

PCR 94ºC – 5 min 94ºC – 1 min 50ºC – 1 min 72ºC – 1 min 72ºC – 7 min 30 ciclos lipL32 768 pb Primer R Primer F

PCR Clonagem em Vetores de expressão

Transformação E. coli

Seleção dos Clones recombinantes

768 pb

Triagem Digestão

Construção dos Vetores

lipL32 768 pb

Expressão de Proteínas Recombinantes

Purificação da Proteína Cultura de Células Transformação da E. coli pAE 2831 bp

rAm pic ilina 6 X His f1 ori oriE P rom otor T7 BamHI (137) HindIII (178) XbaI (59)

Purificação de proteínas recombinantes

Ligação Transformação por Eletroporação E. Coli DH5 Extração de DNA plasmidial pLysS codon pluss SI DE3 Transformação por Choque

Térmico

Cepas de E. coli para expressão de proteínas pAE /LipL3 2 3547 bp AmpR LipL32 6x His f1 ori pUC ori pT 7 Bam H I (468) Eco R I (887) Hin d III (894) Xba I (59) Xho I (131) E. coli (BL21)

SDS-PAGE

Expressão em diferentes cepas de E.coli

1 2 3

4

30kDa

1. BENCHMARKTM _{Protein Ladder em}

kDa

2, 3 e 4. LipL32 purificada (eluições). Gel de poliacrilamida 15%.

Purificação de Proteínas Recombinantes

VACINAS RECOMBINANTES

1. PCR 2. Clonagens 3. Multiplicação Proteína Recombinante 4. Vacinação lipL32 768 bp LipL32 0906 Primer R PRIMER F B am HI (342) Hin dIII (761) Xba I (4) Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial L. interrogans pAE Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al pTARGET pUS973 pUS974 pUS977

E.coli (BL21) E.coli TOP10 _{E.coli TOP10}

Vacina de DNA BCGr

Enzyme Organism Recognition Sequence

Blunt or Sticky End

EcoRI Escherichia Coli GAATTC Sticky

BamHI Bacillus amyloliquefaciens GFATCC Sticky

BglII Bacillus globigii AGATCT Sticky

PvuI Proteus vulgaris CGATCG Sticky

PvuII Proteus vulgaris CAGCTG Blunt

HindIII Haemophilus

influenzae Rd AAGCTT Sticky

Hinfl Haemophilus influenzae Rf GANTC Sticky

Sau3A Staphylococcus aureus GATC Sticky

AluI Arthrobacter luteus AGCT Blunt

TaqI Thermus aquaticus TCGA Sticky

HaeIII Haemophilus aegyptius GGCC Blunt