DEFINIÇÃO DE PARÂMETROS EM ESPECTROMETRIA
DE MASSAS SEQUENCIAL PARA DETECÇÃO
DE FRAUDES EM CAFÉ
Víctor de Carvalho Martins Mestrando em Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), Seropédica, RJ, Brasil Ronoel Luiz de Oliveira Godoy Doutor em Química pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro, RJ, Brasil Camila Menezes Laudeauzer Graduanda em Química pelo Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), Nilópolis, RJ, Brasil Bolsista de Iniciação Científica do CNPq Ana Cristina Miranda Senna Gouvêa Doutor em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), Seropédica, RJ, Brasil Manuela Cristina Pessanha de Araujo Santiago Doutor em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos pela Universidade
Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro, RJ, Brasil Renata Galhardo Borguini Doutora em Saúde Pública pela Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil Sidney Pacheco Doutor em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), Seropédica, RJ, Brasil Luzimar da Silva de Mattos do Nascimento Mestranda em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Elaine Cristina de Oliveira Braga Mestrado em Alimentos e Nutrição pela Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Rio de Janeiro, RJ, Brasil
RESUMO
A qualidade do café é um fator muito importante para a industria cafeeira e sobretudo para o Brasil, que é atualmente considerado o principal produtor e exportador do produto. Destaca-se a ocorrência de adulterações no café pela adição de milho, cevada, soja e centeio. Visando desenvolver um método de detecção com alta sensibilidade e seletividade, o objetivo do trabalho foi determinar o perfil de fragmentação de cinco açúcares potencialmente marcadores químicos de adulteração e otimizar os parâmetros operacionais pela técnica de espectrometria de massas (EM). Foram utilizados padrões analíticos da maltose, rafinose, estaquiose, kestose e nistose e, através destes experimentos, definiu-se inicialmente os parâmetros operacionais no modo positivo e
observados os padrões de fragmentação de cada carboidrato isoladamente por Espectrometria de Massas Sequencial (EM-EM). Posteriormente, procedeu-se ainda a otimização dos parâmetros que apresentam maior influência na detecção dos íons. Por injeção direta de cada analito, foi observada a presença dos íons de massa/carga (m/z) referentes aos adutos dos carboidratos com acréscimo de um átomo de sódio [M + Na]+ nos espectros de massas de íons totais. Já quanto aos testes de
otimização, foram observados maiores valores de resposta quando empregados temperatura e fluxo do gás de dessolvatação em 300°C e 500 L/h e voltagem do cone de amostragem de 25 V e do de extração de 3 V. O estudo demonstrou o potencial da utilização da técnica de espectrometria de massas para detecção de fraudes em café, sendo necessário ainda a realização de testes com extratos obtidos a partir dos grãos de café torrado e moído.
Palavras-chave: Carboidratos. Adulteração. Fragmentação. EM-EM.
DEFINITION OF PARAMETERS IN MASS SPECTROMETRY TANDEM
FOR COFFEE FRAUD DETECTION
ABSTRACT
The coffee quality is a very important factor in the coffee industry and especially Brazil, which is currently considered the main producer and exporter of the product. It is noteworthy the occurrence of coffee adulteration by the addition of corn, barley, soybean and rye. Aiming to develop a detection method with high sensitivity and selectivity, the objective of the work was to determine the shred profile of five sugars, potentially chemical adulteration markers, and to optimize the operating parameters by mass spectrometry (MS). It were used analytical standards of maltose, raffinose, stachyose, kestose and nystose and, through these experiments, we defined initially operating parameters in a positive ionization mode and observed the each carbohydrate fragmentation patterns by spectrometry mass tandem (MS-MS). Posteriorly, it were proceeded still the optimization of parameters that present higher influence on the ions detection. By direct injection, each analyte was observed through the ions of mass/charge presence (m/z), which is relative to carbohydrate adducts with sodium atom addition [M + Na]+ in the total ion mass spectrum. As for the optimization tests, it were showed
higher response values when used temperature and desolvation gas flow at 300 °C and 500 L/h and voltage of sampling cone 25 V and extraction cone 3 V. The study demonstrated the potential of mass spectrometry application for coffee fraud detection, that it is still necessary to conduct tests with roasted and ground coffee extract.
Keywords: Carbohydrates. Adulteration. Fragmentation. MS-MS. 1 INTRODUÇÃO
Os frutos do cafeeiro, pertencente à família Rubiaceae, são responsáveis por prover uma das bebidas mais apreciadas em todo o mundo. Através do beneficiamento dos frutos das espécies Coffea arábica L. e Coffea canephora, mais empregados na cafeicultura, para a obtenção do grão verde e do processo de torrefação, são obtidos grãos de composição química, atividade biológica e propriedade sensorial diferenciados (GONZALEZ-RIOS et al., 2007; PARRAS et al., 2007). Atualmente o Brasil apresenta destaque na cadeia produtiva de café, sendo considerado principal produtor e exportador, responsável por mais de um terço da produção mundial.
teores de cafeína, alcaloide responsável pelo amargor da bebida e propriedades estimulantes; e de ácidos clorogênicos, responsáveis por inúmeras atividades biológicas e cuja principal fonte na dieta humana está no consumo de café. Porém, a torrefação contribui para a presença de melanoidinas, de substâncias orgânicas volatilizáveis e de compostos sulfurados, resultantes das reações de Maillard, de pirólise e de caramelização e que conferem características sensoriais e funcionais ao produto final (FRANCA; MENDONÇA; OLIVEIRA, 2005; GONZALEZ-RIOS et al., 2007; ESQUIVEL; JIMÉNEZ, 2012; HALL et al., 2015).
A qualidade do café é um dos aspectos mais importantes para a indústria cafeeira e o café brasileiro sofre adulterações pela adição de milho, soja, cevada, centeio, açúcar caramelizado e cascas de café (FRANCA, et al., 2005; TAVARES et al., 2012; AQUINO et al., 2014). Portanto, este trabalho tem como objetivo a determinação do perfil de fragmentação de açúcares e dos parâmetros operacionais pela técnica de espectrometria de massas (EM), visando o desenvolvimento de uma metodologia para detecção de fraudes em café.
2 METODOLOGIA
Para o procedimento experimental, foram utilizados padrões analíticos de cinco carboidratos da marca Sigma-Aldrich® (Alemanha): maltose (indicador de adição de milho); rafinose e estaquiose (indicador de adição de soja); kestose e nistose (indicador de adição de cevada). Foi empregado um espectrômetro de massas de alta resolução Synapt® modelo G1 com ionização por eletronebulização e analisadores do tipo quadrupolo e tempo de voo (QTD), da empresa Waters® (EUA). Os solventes acetonitrila e ácido fórmico utilizados são da Merck® (Alemanha), de elevado grau de pureza. Toda água purificada empregada nas análises foi obtida pelo sistema de purificação de água Milli-Q ® Gradient 10A Millipore® e Elix® /RiOs™ 5 (EUA).
Inicialmente foram inseridas por injeção direta no espectrômetro de massas soluções de padrões de cada carboidrato em solvente acetonitrila: solução aquosa de ácido fórmico a 0,1% (1:1 v/v). Através destes experimentos, foram definidos inicialmentes os parâmetros operacionais no modo positivo (Tabela 1) e observados os padrões de fragmentação dos carboidratos isoladamente por Espectrometria de Massas Sequencial (EM-EM).
Tabela 1: Parâmetros Operacionais do Espectrômetro de Massas
Polaridade Positiva Fluxo (μL) 5,00 Capilar (kV) 3,0 Cone de Amostragem (V) 25 Cone de Extração (V) 4,0 Fluxo do Gás do Cone (L/h) 25 Temperatura da Amostra (°C) 80 Temperatura de Dessolvatação (°C) 150 Fluxo do Gás de Dessolvatação (L/h) 300
Energia de Colisão Trap (V) 15,0
Energia de Colisão Transfer (V) 15,0
Analisador Modo V
Foram realizados ainda a otimização dos parâmetros que apresentam maior influência na detecção dos íons a partir dos analitos. O primeiro teste consistiu em um estudo com diferentes valores de temperatura e fluxo do gás de dessolvatação, variando respectivamente, em 150°C e 300°C e em 300 L/h, 500 L/h, 750 L/h, 900 L/h e 1000 L/h, e avaliando as razões entre o número de íons do analito e de íons totais.
Como estratégia para favorecer a protonação dos analitos em detrimento da coordenação com sódio, foram aplicados diferentes valores de voltagem aos cones de amostragem (25 V, 40 V e 50 V) e de extração (2 V, 3 V e 4 V) e definidos os melhores parâmetros pela razão entre o número de íons protonados e de íons sodiados.
3 RESULTADOS
A partir da injeção direta de cada analito em modo positivo, foi observada a presença dos íons de massa/carga (m/z) referentes aos adutos dos carboidratos com acréscimo de um átomo de sódio [M + Na]+ nos espectros de massas de íons totais.
Foram observados, por EM-EM, as rotas de fragmentação de cada carboidrato, sendo obtida diferenciação entre os isômeros de massas rafinose e kestose, e estaquiose e nistose. Enquanto os carboidratos maltose, rafinose e estaquiose apresentam somente fragmentos a partir da perda de 162 Da, kestose e nistose fragmentam-se também pela perda de 180 Da. Foram obtidos espectros de massa, por EM-EM, com baixo erro de identificação (em torno de 5ppm de erro), o que segundo MILMAN (2015) indica um resultado de maior exatidão e confiabilidade. Estes resultados estão dispostos na Tabela 2 e os espectros nas Figuras 1-5.
Tabela 2: Resultados obtidos por EM-EM para os diferentes analitos
Carboidrato Massa Molar(g/mol) Massa Exata
[M + Na]+(Da)
Massa Acurada [M + Na]+ (Da)
Erro
(ppm) Fragmentos por EM-EM
Maltose 342,1162 365,1059 365,1034 6,85 203 Rafinose 504,1690 527,1587 527,1560 5,12 365, 203 Estaquiose 666,2218 689,2115 689,2131 2,32 527, 365, 203 Kestose 504,1690 527,1587 527,1560 5,12 365, 347, 203, 185 Nistose 666,2218 689,2115 689,2123 1,16 527, 509, 365, 347, 203, 185 Fonte: Os autores.
Figura 1: Espectro de massas, por EM-EM, da maltose, com energia de colisão de 15,0 V
Fonte: Os autores.
Figura 2: Espectro de massas, por EM-EM, da rafinose, com energia de colisão de 15,0 V
Fonte: Os autores.
Figura 3: Espectro de massas, por EM-EM, da estaquiose, com energia de colisão de 20,0 V
Figura 4: Espectro de massas, por EM-EM, da kestose, com energia de colisão de 20,0 V
Fonte: Os autores.
Figura 5: Espectro de massas, por EM-EM, da nistose, com energia de colisão de 25,0 V
Fonte: Os autores.
Quanto aos testes de otimização, foram observados maiores valores de resposta quando empregados temperatura e fluxo do gás de dessolvatação em 300°C e 500 L/h e voltagem do cone de amostragem de 25 V e do de extração de 3 V. Este último resultado difere da informação apresentada por CROTTI et al. (2006), que relaciona um aumento de diferencial de potencial entre os cones com o favorecimento da formação dos íons protonados [M+H]+ em detrimento
dos íons sodiados [M+Na]+.
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A partir da injeção dos analitos pela técnica de espectrometria de massas e da determinação dos melhores parâmetros a serem utilizados, foi possível aumentar a detecção de cada marcador químico e diferenciar os analitos pela massa molecular e pelo perfil de fragmentação do íon sodiado, sobretudo para os isômeros.
REFERÊNCIAS
AQUINO, F. J. T. et al. Direct infusion electrospray ionization mass spectrometry applied to the detection of forgeries: roasted coffees adulterated with their husks. Microchemical Journal, Louisiana, v. 117, p. 127-132, 2014.
CROTTI, A. E. M. et al. Espectrometria de massas com ionização por “electrospray”: processos químicos envolvidos na formação de íons de substâncias orgânicas de baixo peso molecular. Química Nova, São Paulo, v. 29, n. 2, p. 287-292, 2006.
ESQUIVEL, P.; JIMÉNEZ, V. M. Functional properties of coffee and coffee by-products. Food Research International, Campinas, v. 46, n. 2, p. 488-495, 2012.
FRANCA, A. S.; MENDONÇA, J. C. F.; OLIVEIRA, S. D. Composition of green and roasted coffees of different cup qualities. LWT: Food Science and Technology, New York, v. 38, n. 7, p. 709-715, 2005. GONZALEZ-RIOS, O. et al. Impact of “ecological” post-harvest processing on coffee aroma: II. roasted coffee. Journal of Food Composition and Analysis, Campinas, v. 20, n. 3/4, p. 297- 307, 2007. HALL, S. et al. A review of the bioactivity of coffee, caffeine and key coffee constituents on inflammatory responses linked to depression. Food Research International, New York, v. 76, n. 3, p. 626-636, Oct. 2015.
MILMAN, B. L. General principles of identification by mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry, Waterloo, v. 69, p. 24-33, 2015.
PARRAS, P. et al. Antioxidant capacity of coffees of several origins brewed following three different procedures. Food Chemistry, Norwich, v. 102, n. 3, p. 582-592, 2007.
TAVARES, K. M. et al. Espectroscopia no infravermelho médio e análise sensorial aplicada à detecção de adulteração de café torrado por adição de cascas de café. Química Nova, São Paulo, v. 35, n. 6, p. 1164-1168, 2012.
Recebido em: 9 mar. 2016. Aprovado em: 9 mar. 2016.
