UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS - PPGCV
GEORGE CÂNDIDO NOGUEIRA
AVALIAÇÃO DO FARNESOL SOBRE O CRESCIMENTO E
FATORES DE VIRULÊNCIA EM CEPAS DO COMPLEXO
CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS IN VITRO
Fortaleza – CE 2011
GEORGE CÂNDIDO NOGUEIRA
AVALIAÇÃO DO FARNESOL SOBRE O CRESCIMENTO E FATORES
DE VIRULÊNCIA EM CEPAS DO COMPLEXO CRYPTOCOCCUS
NEOFORMANS IN VITRO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
Fortaleza – CE 2011
N778a Nogueira, George Cândido
Avaliação do farnesol sobre o crescimento e fatores de virulência em cepas do complexo cryptococcus neoforman in vitro / George Cândido Nogueira. – 2011.
74 f.: il.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Ciências Veterinárias, Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2011.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha. Co-orientação: Profª. Drª. Rossana de Aguiar Cordeiro.
1. Farnesol. 2. Complexo Cryptococcus neoforman in vitro 3. Inibição do crescimento. I. Título.
GEORGE CÂNDIDO NOGUEIRA
AVALIAÇÃO DO FARNESOL SOBRE O CRESCIMENTO E
FATORES DE VIRULÊNCIA EM CEPAS DO COMPLEXO
CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS IN VITRO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Aprovada em:__/__/__
___________________________________________ Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
Universidade Estadual do Ceará Orientador
_____________________________________________ Profa Dra. Rossana de Aguiar Cordeiro
Universidade Federal do Ceará Co-orientadora
Examinadora
_____________________________________________ Dra Ana Karoline Freire da Costa
Universidade de Fortaleza Examinadora
Dedico este trabalho a minha mãe que tem sido meu alicerce a cada dia da minha vida.
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, da Faculdade de Veterinária, da Universidade Estadual do Ceará.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro.
Ao Centro Especializado Em Micologia Médica (CEMM), da Universidade Federal do Ceará.
A Deus pela vontade a cada dia em seguir em frente.
A minha mãe, a quem devo muito pela minha vida, minha admiração, carinho e respeito pelo exemplo e infinito esforço para que eu pudesse sempre ir em frente, com dignidade.
Ao meu sobrinho, Samuel Cândido Amorim por me proporcionar momentos de alegria e serenidade quando estou ao seu lado.
Ao meu avô materno, Sr. Francisco Cândido, ―in memorian‖ guardo grande carinho pelo exemplo de respeito e humildade.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha, pelo aprendizado durante esses dois anos da minha vida, demonstrando sempre ser uma pessoa paciente e preocupada com a minha formação como pesquisador.
A minha co-orientadora, Profa Dra. Rossana de Aguiar Cordeiro, pelo exemplo de inteligência, que repassa nos seus conhecimentos e dedicação a qual conduz a pesquisa. Ao Prof. Dr. José Júlio da Costa Sidrim pela oportunidade, desde o estágio supervisionado até o mestrado, de poder realizar os meus experimentos e obter aprendizado no Centro Especializado Em Micologia Médica (CEMM/UFC).
A Profa Dra. Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante pela oportunidade de ser minha supervisora na graduação e perseverança na pesquisa.
Ao Prof. Dr. André Jalles Monteiro, pelo apoio estatístico.
Aos professores, Dr. Cláudio Cabral Campello, Dra. Adriana de Queiroz Pinheiro e Dr. Isaac Neto Góes, com os quais tive a oportunidade de aprender lições que sempre guardarei por toda minha vida como exemplos de humildade, ética, respeito, perseverança e dedicação pela carreira acadêmica.
Aos pós-graduandos do PPGCV e colegas, Eudson Maia de Queiroz Junior, Roberta Nogueira Chaves, Raphael Fernando Braga Gonçalves e Agostinho Soares de Alcântara Neto pelos momentos de amizade, companheirismo e de descontração.
Aos pós-graduandos do CEMM/UFC, em especial Carlos Eduardo Cordeiro Teixeira, Charles Ielpo Mourão, Débora Castelo Branco Maia, Lucas Pereira de Alencar, Paula Bittencourt Vago, Kylvia Rocha de Castro e Silva, Manoel Paiva de Araújo Neto, Francisca Jakelyne de Farias Marques, Joyce Fonteles Ribeiro, Lívia Gurgel do Amaral Valente e Rita Amanda Chaves de Lima, pelos bons momentos de aprendizado e diversão durante a realização do mestrado.
A todos os funcionários do CEMM/ UFC, em especial Terezinha de Jesus dos Santos Rodrigues e Daniel Teixeira Lima.
"Nunca perca a fé na humanidade, pois ela é como um oceano. Só porque existem algumas gotas de água suja nele, não quer dizer que ele esteja sujo por completo."
RESUMO
A resistência antifúngica, in vitro, em organismos do Complexo Cryptococcus neoformans, apesar de rara, tem sido observada tanto em cepas clínicas como ambientais, especialmente frente ao itraconazol e fluconazol. Diante do exposto e considerado que o sesquiterpeno farnesol é capaz de inibir o crescimento de microrganismos, incluindo alguns fungos, é importante investigar o efeito deste composto sobre Cryptococcus spp. Por conseguinte, o presente trabalho teve como objetivo investigar o efeito inibitório in vitro do farnesol em cepas do Complexo C. neoformans, por meio da análise da concentração inibitória mínima (CIM) em ensaio de microdiluição. Adicionalmente, foi investigado o efeito do farnesol (CIM/4, CIM/2 e CIM) sobre a síntese de fosfolipases e proteases – exoenzimas diretamente relacionadas à patogênese fúngica. Observou-se que o farnesol foi capaz de inibir o crescimento in vitro de C. neoformans e C. gattii em concentrações que variaram de 0,29 a 75 µM. Foi observada uma diminuição na produção de fosfolipases em 36,1% (13/36), 38,9% (14/36) e 41,7% (15/36) das cepas expostas ao farnesol nas concentrações CIM, CIM/2 e CIM/4, respectivamente. Não houve diferença significativa na síntese de proteases entre os grupos expostos ao farnesol e o controle negativo. Diante desses resultados, conclui-se que o farnesol é capaz de inibir o crescimento in vitro de C. neoformans e C. gattii, embora, não influencie significativamente a produção dos fatores de virulência estudados.
Palavras-chave: Farnesol, Complexo Cryptococcus neoformans, inibição do crescimento, fosfolipases e proteases.
ABSTRACT
In vitro resistance among organisms of the Cryptococcus neoformans Species Complex, although rare, has been observed in clinical and environmental strains, especially to itraconazole and fluconazole. Based on that and considering that the sesquiterpene farnesol is capable of inhibiting microbial growth, including some fungi, it is important o investigate the effect of this compound on Cryptococcus spp. Thus, the present study aimed at determining the in vitro minimum inhibitory concentration (MIC) of farnesol against strains of the Cryptococcus neoformans Species Complex (CNSC), as well as its effect on the synthesis of phospholipase and protease. For such, 36 strains of the CNSC were used, out of which 20 were from veterinary sources, 8 were isolated from human cases and 8 were reference strains. MICs were determined through broth microdilution, by testing farnesol at 0.29 to 150 µM. Phospholipase and protease activities were evaluated through growth on egg yolk agar spectrophotometry at 440 nm, respectively, after pre-incubating the strains at different farnesol concentrations (MIC/4, MIC/2 and MIC). Farnesol MICs ranged from 0.29 to 75 µM. Concerning phospholipase secretion, a discrete decrease was observed for 36.1% (13/36), 38.9% (14/36) and 41.7% (15/36) of the strains exposed to farnesol at the the concentrations MIC, MIC/2 and MIC/4, respectively. For protease activity, no statistically significant differences were observed, when comparing the production before and after pre-incubation at different farnesol concentrations. Based on these findings, it can be concluded that farnesol inhibits the in vitro growth of C. neoformans and C. gattii, without significantly altering the synthesis of virulence factors.
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Avaliação da atividade de fosfolipases em cepas do Complexo Cryptococcus neformans em ágar gema de ovo, (a) representa a região da placa onde a colônia de Cryptococcus sp. se apresenta positiva para a produção desta enzima...20 Figura 2 Colônias de Cryptococcus sp. produtoras de melanina, observadas
em meio ágar semente de Níger...22 Figura 3 Produção de cápsula em cepas do Complexo C. neoformans,
visualizada por microscopia óptica em 100x ...23 Figura 4 Identificação de Cryptococcus sp. através do meio CGB(a) e do meio
caldo uréia(b) ...24
Figura 5 Técnica de microdiluição em caldo para Cryptococcus sp. em placa de 96 poços ...26
Figura 6 Fórmula estrutural do composto farnesol...27 Figura 7 Efeitos biológicos do farnesol: resistência antimicrobiana; formação
de biofilmes imaturos; indutor de apoptose; bloqueio do processo de quorum sensing; supressão da atividade fagocitária das formas filamentosas de C. albicans...29
Table 1 Minimum inhibitory concentration (MIC) of farnesol against strains of the Cryptococcus neoformans Species Complex...51
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AMB Anfotericina B
ATCC American Type Culture Collection
CEMM Centro Especializado Em Micologia Médica CGB L-Canavanina Glicina Azul de Bromotimol CIM Concentração Inibitória Mínima
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
DMSO Dimetilsulfóxido
FLC Fluconazol
FNS Farnesol
RPMI Roswell Park Memorial Institute PCR Polymerase Chain Reaction
PCR-REA Restriction Enzyme Analysis of PCR Pz Atividade de fosfolipase
QS Quorum sensing
SNC Sistema Nervoso Central UE Unidade Enzimática
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 13
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 14
2.1 Complexo Cryptococcus neoformans ... 14
2.1.1 Histórico ... 14
2.1.2 Espécies e variedades ... 14
2.1.3 Aspectos Ecológicos ... 15
2.1.4 Fatores de Virulência ... 16
2.1.5 Identificação Laboratorial... 21
2.1.6 Sensibilidade antifúngica do Complexo C. neoformans... 2.2 A molécula de Farnesol... 25 27 3. JUSTIFICATIVA ... 30 4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS ... 31 5. OBJETIVOS ... 32 5.1 Objetivos Gerais ………..………. 32 5.2 Objetivos Específicos ... 32 6. CAPÍTULO I ... 33 7. CONCLUSÕES ... 53 8. PERSPECTIVAS ... 54 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 55
1. INTRODUÇÃO
O Complexo Cryptococcus neoformans é formado por duas espécies distintas, Cryptococcu neoformans e Cryptococcu gattii, as quais podem ser subclassificados em duas variedades, cinco sorotipos e pelo menos oito tipos moleculares. Embora compartilhem muitas características fenotípicas e moleculares, esses fungos se diferenciam quanto aos aspectos ecológicos e epidemiológicos, bem como na relação com os hospedeiros. Apesar dessas diferenças, essas espécies são os principais agentes etiológicos da criptococose em humanos e animais.
Atualmente, o arsenal antifúngico disponível para o tratamento da criptococose é limitado a poucas classes de drogas, dentre estas, anfotericina B e derivados azólicos. Apesar do desenvolvimento de novos derivados azólicos, especialistas acreditam que o número de drogas antifúngicas ainda seja bastante reduzido, o que tem impulsionado a busca por novos compostos com atividade antifúngica (WILLIS et al., 2007).
Além disso, as espécies do gênero Cryptococcus produzem diversas moléculas que atuam como fatores de virulência, que participam nos mecanismos de resistência antifúngica e no sucesso da patogênese do fungo, permitindo a invasão aos tecidos do hospedeiro (COSTA-DE-OLIVEIRA et al., 2008; CAMPOS e BARONI, 2010). Adicionalmente, acredita-se que a exposição de Cryptococcus spp. aos antifúngicos possibilita uma modificação estrutural dos fatores de virulência tornando a cepa mais patogênica (DOYON, 1996; MARTINEZ-PICADO, 1999; RODRIGUES et al., 2008).
Recentemente, foi observado que a levedura Candida albicans produz uma molécula chamada farnesol, a qual é importante para o fenômeno de quorum sensing, sendo, portanto, essencial para a regulação das interações microbianas. Alguns estudos têm confirmado o efeito inibitório de farnesol sobre o crescimento de várias espécies microbianas (KOO et al., 2002; JABRA-RIZK et al., 2006; SEMIGHINI; MURRAY; HARRIS, 2008; DERENGOWSKI et al., 2009). Recentemente, foi mostrado que o farnesol atua como potente agente antifúngico frente ao patógeno dimórfico Paracoccidioides brasiliensis (DERENGOWSKI et al., 2009).
O presente trabalho investigou o efeito do farnesol sobre o crescimento e atividade de fosfolipases e proteases em espécies do Complexo Cryptococcus neoforman, in vitro.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Complexo Cryptococcus neoformans 2.1.1 Histórico
O primeiro isolamento de Cryptococcus neoformans data de 1894, em uma paciente que apresentava uma lesão na tíbia, sendo identificado primariamente como Saccharomyces hominis. Na mesma época, Sanfelice isolou esse organismo em suco de pêssego, demonstrando sua patogenicidade em animais de laboratório e denominando-o de S. neoformans (CASADEVALL e PERFECT, 1998). Um ano mais tarde, Sanfelice isolou o microrganismo de tecido linfóide bovino. A partir de então, casos de criptococose em animais foram registrados de forma esporádica e somente na década de 1950 foram descritos os primeiros casos em cães e gatos (JUNGERMAN e SCHWARTZMAN, 1972). Em 1970, uma cepa atípica de C. neoformans foi isolada de um paciente com leucemia, tendo sido denominada C. neoformans var. gattii (VANBREUSEGHEM e TAKASHIO, 1970).
Durante a década de 1970 foi possível determinar dois tipos sexuais de C. neoformans, mating α e mating a, que são capazes de produzir hifas verdadeiras e basidiósporos férteis, com ocorrência rara em humanos e animais. Por outro lado, a forma assexuada de blastoconídios é comum em isolados oriundos do ambiente e de amostras clínicas (KWON-CHUNG e POPKIN, 1976; LIN, 2009). Entre os anos 1940 e 1950, por meio de estudos de caracterização dos antígenos capsulares, a espécie C. neoformans foi dividido em cinco sorotipos: A, B, C, D e AD (D´SOUZA et al., 2004).
Embora os primeiros estudos de caracterização molecular de C. neoformans tenham ocorrido na década de 1990, somente em 2005 foi iniciado o seqüenciamento do genoma do organismo. Desde então, esses estudos têm permitido maior conhecimento de aspectos importantes relacionados à biologia do microrganismo (HUGHES et al., 2008; SIDRIM et al., 2010).
2.1.2 Espécies e Variedades
Os fungos do Complexo Cryptococcus neoformans são importantes microrganismos patogênicos cosmopolitas e os principais agentes causadores da criptococose, que se caracteriza principalmente por quadros de meningoencefalite em
hospedeiros imunodeprimidos, cujo maior contingente é representado por indivíduos com AIDS (RACHID e SCHECHTER, 2008).
Tais organismos são basidiomicetos pertencentes ao clado Filobasidiella, e taxonomicamente mantidos na Classe Tremellomycetes, ordem Tremellales, família Tremellaceae. As células mostram-se com formato esférico a ovóide, com diâmetro entre 2-8 µm, podendo apresentar cápsula espessa durante processo infeccioso ou ainda condições especiais de cultivo (DE HOOG et al., 2000).
Até o final da década de 1980, a espécie C. neoformans era reconhecida como o único agente etiológico da criptococose. A espécie era subdividida em duas variedades distintas, C. neoformans var. neoformans (sorotipos A e D) e C. neoformans var. gattii (sorotipos B e C), as quais se diferenciavam quanto a padrões bioquímicos, moleculares e ecológicos (MELO et al., 1993). Em 1999, Franzot et al. propuseram alterações a esse conceito, descrevendo as cepas de sorotipo A como C. neoformans var. grubii e restringindo todos os isolados de sorotipo D a variedade neoformans. Em seguida, estudos filogenéticos e moleculares propuseram a ascensão da variedade gattii ao status de espécie, sendo então denominada C. gattii (KWON-CHUNG et al., 2002).
Posteriormente, estudos baseados em marcadores moleculares mostraram que C. neoformans var.neoformans e C. neoformans var. grubii são espécies distintas, sendo esta última formada por subpopulações, agrupadas como tipos moleculares VNI, VNII e VNB (LITVINTSEVA et al., 2005; LITVINTSEVA et al., 2006; BOVERS et al., 2008). Atualmente, admite-se que C. gattii também possa ser subdividido em pelo menos em quatro espécies crípticas distintas, referidas como tipos moleculares VGI, VGII, VGIII, e VGIV (BOVERS et al., 2008). Adicionalmente, diversos estudos têm comprovado a existência de organismos híbridos, principalmente C. neoformans sorotipo A/D, com padrão molecular tipo VNIII, mas já foram descritos sorotipos AB e BD e o tipo molecular VNI/VGII (BOVERS et al., 2008; MEYER et al., 2003; XU et al., 2002).
2.1.3 Aspectos Ecológicos
Os organismos do Complexo C. neoformans têm sido isolados de uma ampla variedade de hospedeiros, incluindo mamíferos, insetos, aves e seus excrementos, além de fontes ambientais, como amebas, solo, árvores e ar. A interação entre hospedeiro, reservatório e os fungos do Complexo C. neoformans possibilita a seleção destes
microrganismos, no que se refere a uma melhor adaptação ao meio onde vivem (CASADEVALL e PERFECT, 1998).
Nas aves, devido à sua elevada temperatura corpórea (40-42ºC), esses fungos geralmente não ocasionam doença. Dados da literatura mostram que, embora C. neoformans já tenha sido isolado no papo de aves, o microrganismo não foi encontrado no trato intestinal inferior, sugerindo o papel desses animais como portadores transitórios do patógeno (KWON-CHUNG, 1998). Solos contaminados com excretas desidratadas de aves mantêm propágulos de C. neoformans, uma vez que esses microrganismos são capazes de se manter viáveis em diferentes substratos, principalmente aqueles com alto teor de nitrogênio, como creatinina, uréia e xantina. Assim, relata-se uma estreita relação entre esses fungos e o habitat de aves, caracterizando microfocos importantes, que podem atuar como fontes de infecção (NILSEN et al., 2007; KWON-CHUNG e BENNETT, 1992).
C. neoformans var. neoformans é considerada uma espécie cosmopolita, embora ocorra com maior freqüência na Europa. O microrganismo costuma ser isolado de diversos locais, principalmente, ambientes ricos em substratos orgânicos, tais como, excretas de aves, morcegos e baratas, além de construções antigas, igrejas, porões e sucos de frutas (CASADEVALL e PERFECT, 1998; LUGARINI, 2007). C. neoformans var. grubii corresponde ao microrganismo do Complexo C. neoformans mais comumente isolado em fontes clínicas e ambientais em todo o mundo, incluindo regiões temperadas e tropicais. Em contraste, C. gattii é endêmico em regiões tropicais e subtropicais, com isolamento associado a material vegetal em decomposição (LIN e HEITMAN, 2006). A despeito das diferenças ecológicas, acredita-se que os organismos do Complexo C. neoformans possam coexistir em um mesmo ambiente, muito embora C. gattii apresente menor taxa de crescimento em guano de pombo (MITCHELL e PERFECT, 1995; LIN, 2009).
2.1.4 Fatores de Virulência
Para que o fungo tenha sua patogênese bem sucedida é necessário que ocorra a expressão de fatores de virulência, o que permite a invasão com êxito de tecidos e de células, além de possibilitar a evasão aos mecanismos de defesa do hospedeiro em resposta a infecções fúngicas. A expressão desses fatores é cepa-dependente, pois pode variar tanto em freqüência como em intensidade, fenômeno este visto tanto em isolados de C. neoformans como em C. gattii (MA e MAY, 2009).
Fatores de virulência são componentes estruturais ou moléculas que contribuem para o estabelecimento e/ou manutenção do processo infeccioso em um hospedeiro suscetível (BUCHANAN e MURPHY, 1998). Alguns desses elementos possuem um papel duplo, contribuindo também para o fitness do microrganismo na natureza (RODRIGUES et al., 2008). Os principais fatores de virulência produzidos pelas espécies do Complexo C. neoformans são: a termotolerância, a cápsula e a síntese de várias enzimas, principalmente como a fenoloxidase (produção de melanina), a urease, a fosfolipase e a protease (COX et al., 2000; ZARAGOZA e CASADEVALL, 2004; BOVERS et al., 2008).
Um dos fatores de virulência principais é a capacidade de crescimento na temperatura corpórea dos mamíferos (KRONSTAD et al., 2011). Contudo, algumas cepas de C. neoformans sorotipo D e C. gattii são consideradas hipovirulentas por não crescerem bem a 37 C ocorrendo inibição do crescimento e morte após exposição a temperaturas elevadas (CASADEVALL et al., 2003).
A cápsula de C. neoformans e C. gattii é formada principalmente por polissacarídeos, a glucuronoxilomana e a galactoxilomana, e, em menor quantidade, por manoproteína. A estrutura representa um dos principais fatores de virulência dos fungos do Complexo Cryptococcus neoformans (ZARAGOZA e CASADEVALL, 2004), uma vez que exerce efeitos sobre a ativação do sistema de complemento do hospedeiro, inibe o processo de fagocitose e proporciona a repulsão eletrostática entre o agente e as células de defesa do hospedeiro (GARCIA-RODAS et al., 2011; ZARAGOZA e CASADEVALL, 2004).
A fenoloxidase catalisa a síntese de melanina nas espécies do Complexo C. neoformans e oferece proteção contra espécies reativas de oxigênio, luz ultravioleta, temperaturas elevadas e antioxidantes, além de aumentar a resistência à fagocitose e aos antifúngicos. Vale ressaltar que a síntese de melanina que ocorre in vivo se dá principalmente na presença de catecolaminas (BOVERS et al., 2008) e que mutantes que não sintetizam essa molécula apresentam menor virulência em modelos experimentais (SALAS et al., 1996).
A urease é definida como uma metaloenzima que tem como função catalisar a conversão da uréia em amônia e carbamato, sendo considerado um importante fator de virulência, por contribuir para a invasão do sistema nervoso central (SNC), uma vez que aumenta a permeabilidade dos capilares cerebrais (OLSZEWSKI et al., 2004; TORRES-RODRIGUES et al., 2008).
As fosfolipases são um grupo heterogêneo de enzimas que hidrolisam uma ou mais ligações éster nos glicerofosfolipídios e são consideradas importantes fatores de virulência para várias espécies fúngicas. Apesar de todas essas enzimas possuírem os fosfolipídios como substrato, cada uma pode clivar uma ligação éster específica. Portanto, letras são utilizadas para diferenciar as fosfolipases, indicando a ligação alvo específica na molécula de fosfolipídio (GHANNOUM, 2000).
Enzimas capazes de hidrolisar os fosfolipídios, como as fosfolipases e as proteinases, estão provavelmente envolvidas nos processos de ruptura de membrana, durante a invasão da célula hospedeira (GHANNOUM, 2000). Adicionalmente, as fosfolipases A2 e C podem remover antígenos processados da superfície das células apresentadoras de antígenos (IBRAHIM et al., 1995). As fosfolipases extracelulares já foram implicadas como fatores de virulência de vários organismos, como Clostridium perfringens, Rickettsia spp., Staphylococcus aureus, Toxoplasma gondii, dentre outros. O tipo de fosfolipase implicada na virulência varia de acordo com o organismo. C. perfringens, por exemplo, secreta fosfolipase C, enquanto que T. gondii secreta fosfolipase A2 (IBRAHIM et al., 1995; GHANNOUM, 2000).
Este grupo de enzimas tem como função principal desestabilização da membrana citoplasmática, ocasionando a lise da membrana celular do hospedeiro ou alterações na superfície da mesma, contribuindo para que ocorra aderência e posterior penetração da célula hospedeira (SAMARANAYAKE et al., 2005; SOARES et al., 2010). Em relação a cepas de Candida, a elevada atividade de fosfolipase esta relacionada ao aumento da capacidade de aderência às células epiteliais e a taxa de mortalidade, em modelos biológicos (SAMARANAYAKE et al., 2005; COSTA et al., 2009).
A secreção destas enzimas pode ser detectada de várias formas, dentre as quais pode ser citada a metodologia em que observou o crescimento de Candida albicans, em meio sólido contendo gema de ovo ou lecitina. Em 1975, Pugh e Cawson, por meio de técnicas de citoquímica, com base na utilização de lecitinas, verificaram a maior atividade de fosfolipase na porção extrema da hifa em crescimento, garantindo uma maior capacidade de invadir células e tecidos do hospedeiro (CAMPOS e BARONI, 2010; GHANNOUM, 2000).
Existe também um método de detecção da atividade em placa de Petri, inicialmente utilizado para Candida sp., podendo ser também utilizado para Cryptococcus spp. Este método consiste na semeadura das cepas em meio ágar Sabouraud dextrose com suplementação de sais (CaCl2 e NaCl) e de gema de ovo, uma
fonte rica em fosfolipídios. Após a incubação a 35 ºC, a leitura é feita em dias alternados até o 15º dia. Para os isolados positivos, observa-se a formação de uma zona de precipitação densa, ao redor da colônia, provavelmente, devido à formação de complexos de cálcio com os ácidos graxos, em decorrência da ação enzimática sobre os fosfolipídios do meio (figura 1) (GHANNOUM, 2000).
A atividade de fosfolipase (Pz) é definida como a razão entre o diâmetro da colônia e o diâmetro total, formado pela colônia e pela zona de precipitação. Quando Pz é igual a um (Pz = 1), a produção de fosfolipase é ausente, quando o Pz é menor que um (Pz <1), há produção de fosfolipase, e valores de Pz < 0,64 indicam uma elevada atividade enzimática (SIDRIM et al., 2010; VIEIRA e ACQUA-COUTINHO,2009). No entanto, esta técnica não é adequada para cepas que apresentam baixa produção dessa enzima, sendo necessária a confirmação por outros métodos, como ensaios colorimétricos e radiométricos específicos (GHANNOUM, 2000).
(Fonte: CEMM, 2011)
Figura 1. Avaliação da atividade de fosfolipases em cepas do Complexo Cryptococcus neformans em ágar gema de ovo, (a) representa a região da placa onde a colônia de Cryptococcus sp. se apresenta positiva para a produção desta enzima.
As proteases são enzimas importantes durante o processo infeccioso por degradarem tecidos e proteínas, aumentando a disponibilidade de fontes de nitrogênio para o metabolismo do fungo e, consequentemente, contribuindo para a invasão tecidual e colonização. Essas enzimas podem degradar vários substratos, como queratina, colágeno, albumina, fibronectina e hemoglobina (PICHOVÁ et al., 2001; RAMBACH et al., 2010). Na levedura C. albicans, a secreção de proteases favorece a aderência dos blastoconídios às células do hospedeiro e, conseqüentemente, uma melhor invasão dos tecidos pelas hifas através da degradação proteolítica da queratina e do colágeno, com isso, sendo observada uma correlação entre a secreção de protease e o grau de virulência das cepas (SANTOS et al., 2006; SCHEID, 2007).
De acordo com o seu sistema catalítico, as proteases podem ser divididas em serinas, cisteínas, aspárticas (SAPs) e metaloproteases (NAGLIK et al., 2004). Essas enzimas são consideradas essenciais para o crescimento microbiano em meios de cultura em que moléculas de proteínas são as únicas fontes de nitrogênio.
De forma geral, C. neoformans tem baixa atividade proteolítica, mas as proteases são capazes de realizar a digestão de imunoglobulinas e de parte do sistema complemento (CASADEVALL e PERFECT, 1998). As alterações estruturais nas
proteases fúngicas e processos mutagênicos podem responsáveis pela ocorrência de resistência a terapia antifúngica, além de levar a alterações estruturais da enzima (DOYON, 1996; MARTINEZ-PICADO, 1999). Este fato foi observado em estudos in vitro com Cryptococcus spp. frente aos inibidores de protease (PINTI et al., 2007). A detecção da atividade desta enzima, pode ser por cromatografia gasosa (BIEN et al., 2009), além da técnica em que se utiliza meio de cultura contendo albumina sérica bovina, a qual é utilizada como substrato enzimático, seguida da análise por espectrofotometria (BRILHANTE et al.,2011; VIDOTTO, 2005).
Dados de pesquisa realizada pelo Centro Especializado em Micologia Médica mostram que a exposição a concentrações sub-inibitórias de farnesol não alterou a atividade proteásica em Candida spp. (TEIXEIRA, 2010). Estudos prévios realizados por Enjalbert e Whiteway (2005) mostraram que a exposição de C. albicans ao farnesol induziu a superexpressão de genes relacionados a diferentes processos celulares, dentre eles, o catabolismo protéico. Contudo, alterações do teor protéico, por meio da redução da atividade proteásica, não foram detectadas (TEIXEIRA, 2010).
2.1.5 Identificação Laboratorial
A identificação do agente consiste em técnicas laboratoriais que se baseiam em duas vertentes: os aspectos fenotípicos e os moleculares (LAZÉRA, et al., 2004; SIDRIM et al., 2010). Em relação aos aspectos fenotípicos, o agente pode ser identificado com base na macromorfologia e na micromorfologia.
Os principais meios utilizados para cultura são ágar Sabouraud glicose 2%, ágar batata e ágar extrato de malte. Vale ressaltar que, para o isolamento primário de Cryptococcus spp. a partir de espécimes clínicos, em ágar Sabouraud suplementado com cicloheximida, a concentração desta substância não deve ultrapassar 0,2%, devido a sua intensa atividade inibitória sobre o microrganismo. Após a incubação do fungo por um período de 48-72 horas, a 25-37°C, as colônias de Cryptococcus spp apresentam tamanho pequeno a médio, com coloração variando de branca a creme brilhante e textura mucóide (LAZÉRA et al., 2004). Em relação à temperatura de incubação, boa parte das cepas do Complexo C. neoformans cresce bem na faixa de 30° a 35 °C, sendo que, em situações experimentais, a maioria das cepas, em especial as do sorotipo A, tolera até 40°C (MARTINEZ et al., 2001). Quanto à capacidade de produzir melanina, uma característica indicativa de cepas do Complexo C. neoformans, existem meios de cultura que induzem a síntese dessa proteína, como o ágar semente de níger, ágar
caféico e o ágar L-DOPA, pois são ricos em compostos fenólicos, os quais servem de substrato para a síntese de melanina. Após a incubação a 37°C por 48 horas, pode-se observar o crescimento de colônias com coloração marrom, conforme ilustrado na figura 2 (PEDROSO et al., 2007).
(Fonte: CEMM, 2011)
Figura 2. Colônias de Cryptococcus sp. produtoras de melanina, observadas em meio ágar semente de Níger.
A presença de cápsula pode ser observada por meio da técnica de coloração negativa com tinta da China, seguida de observações microscópicas (DE HOOG, 2000), conforme ilustrado na figura 3. Em determinadas circunstâncias, para que cápsula seja visualizada, é necessária a estimulação da sua síntese, que pode ser obtida quando as cepas são semeadas em uma atmosfera rica em dióxido de carbono e que contem de soro fetal bovino e baixas concentrações de ferro (ZARAGOZA e CASADEVALL, 2004).
(Fonte: CEMM, 2011)
Figura 3. Produção de cápsula em cepas do Complexo C. neoformans, visualizada por microscopia óptica em 100x.
Para uma maior evidência da micromorfologia de Cryptococcus spp., após o crescimento fúngico em meios de cultura e visualização da cápsula com tinta da China, pode ser utilizada a técnica de microcultivo, em que a micromorfologia da levedura é avaliada por meio do crescimento em ágar CornMeal Tween 80 ou Agar arroz Tween 80, com incubação de cinco dias, a 30°C, sendo visualizado o crescimento de blastoconídios esféricos grandes e irregulares sem hifas ou pseudo-hifas (COSTA, et al., 2009; DE HOOG et al., 2000; LAZÉRA, et al., 2004).
As espécies do Complexo C. neoformans também podem ser identificadas por meio de testes bioquímicos (LAZÉRA et al., 2004). Assim, Cryptococcus spp. não tem a capacidade de fermentar açúcares, mas pode utilizar como única fonte de carbono, a galactose, a sacarose, a glicose, a frutose, a maltose, a trealose, a melizitose, D-xilose, L-raminose, sorbitol, manitol, dulcitol, D-manitol, α-metil-d-glucosídeo, salicina, inositol (DE HOOG et al., 2000). Quanto às fontes de nitrogênio, não assimilam nitrato e não reduzem nitrato a nitrito. São diferenciados de leveduras do gênero Candida pela capacidade de hidrolisar uréia, o que é evidenciado por meio do crescimento em ágar uréia de Christensen, alterando o pH do meio, ocasionando a mudança de cor do mesmo, após as cepas serem incubadas por um período de 24-48 horas a 30 °C. Nas reações positivas para a síntese da urease, ocorre a mudança da coloração do meio de amarelo para rosa (Figura 4b) (LAZÉRA et al., 2004). Ademais, a capacidade em utilizar o inositol como fonte de carbono permite diferenciar Cryptococcus spp. de leveduras do gênero Rhodotorula (WINN JR. et al., 2008).
A diferenciação das espécies C. gattii e C. neoformans pode ser realizada por meio do teste de crescimento em meio CGB (L-canavanina, glicina e azul de bromotimol). O princípio deste teste baseia-se que C. gattii, diferentemente do C. neoformans, é resistente a L-canavanina e utiliza como fonte de carbono e nitrogênio a glicina, sendo capaz de crescer no CGB. Portanto, com o crescimento fúngico, ocorre a produção de amônia e, conseqüente, elevação do pH, o que altera a coloração do meio da cor verde para azul (Figura 4a) (BAUTERS et al. 2001).
(Fonte: CEMM, 2011) Figura 4. (a) Identificação de Cryptococcus sp. por meio do crescimento em ágar CGB, mostrando a coloração azul, sugestiva de C. gattii e meio com coloração verde, sugestiva de C. neoformans. (b) Crescimento em caldo uréia, evidenciada pela turvação do meio e mudança da coloração de amarelo para rosa.
Existe também um teste sorológico que tem como princípio a detecção de antígenos polissacarídicos capsulares, sendo realizado por aglutinação de partículas de látex com fluidos e secreções corporais (líquor, soro, leite e urina), em que permite a identificação das espécies de C. neoformans e C. gattii. Esse teste apresenta como vantagem a obtenção rápida do resultado e a sensibilidade, mas torna-se desvantajoso pelo alto custo do reagente (MOREIRA et al., 2006; SPANAMBERG et al.,2009).
Existem também métodos modernos de identificação que, embora demandem ainda de muitos custos e necessitem de testes complementares na rotina clínica, superam muitas desvantagens dos testes presuntivos de identificação fenotípica que são laboriosos e estão sujeitos à ocorrência de variabilidade nos resultados, por erros na identificação (COSTA,2009; WENGENACK e BINNICKER,2009). No entanto,
embora os sistemas API 20C AUX e VITEK apresentem grande praticidade, são incapazes de identificar corretamente a espécie C. gattii (CORDEIRO et al., 2011)
Apesar de ainda não serem rotineiramente utilizados na prática laboratorial, devido aos custos elevados, os métodos moleculares permitem a identificação de espécies, sorotipos e tipos moleculares, com elevada sensibilidade, especificidade e
acurácia, no intuito de resolver as limitações dos métodos convencionalmente utilizados. Além disso, fornecem informações sobre a epidemiologia do agente e permitem associar o sorotipo encontrado às características clínicas como: tipos de manifestações e perfil de sensibilidade aos antifúngicos (SORRELL, 2001; HOANG et al., 2004). Dentre as técnicas empregadas, citam-se: Reação em Cadeia da Polimerase – PCR – fingerprinting, PCR seguida de tratamento com enzimas de restrição (PCR-REA) e Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), nas quais são empregadas sequências-alvo para a identificação e tipagem de Cryptococcus, sendo as mais utilizadas: URA5 (oritidina monofosforilase), CAP59 (produção de cápsula), M13 (sequências minissatélites) e ITS (18S, 5,8S e 28S). (SIDRIM et al., 2011; COSTA, 2009; ENACHE-ANGOULVANT et al., 2007).
A PCR-REA consiste na técnica molecular mais atual, rápida e confiável na identificação de espécies do Complexo C. neoformans e dos cinco sorotipos. A análise de enzima de restrição (REA) tem como região-alvo o gene CAP59 – um dos genes codificadores da cápsula – o qual é submetido à clivagem com diferentes enzimas BsmFI, HpaII e AgeI, para a análise do perfil de restrição, sendo este especifico para C. neoformans e C. gattii e seus sorotipos (ENACHE-ANGOULVANT et al., 2007; SIDRIM et al., 2010).
2.1.6 Sensibilidade antifúngica do Complexo C. neoformans
Após o surgimento da pandemia da AIDS, a ocorrência de micoses sistêmicas, como a criptococose, tem aumentado (NUCCI; COLOMBO, 2007; COSTA-DE-OLIVEIRA et al., 2008; ANTONIEWICZ et al., 2009; COLOMBO e ALVES, 2004; PRADO et al., 2009). Embora o surgimento da terapia antiretroviral tenha reduzido a incidência da criptococose, estima-se a ocorrência de aproximadamente 1 milhão de casos de meningoencefalite criptocócica no mundo (PARK et al., 2009). Portanto, torna-se importante a avaliação da sensilidade in vitro de leveduras do Complexo C. neoformans, frente a antifúngicos utilizados na terapia contra criptococose, visando
monitorar a sensibilidade de isolados clínicos e ambientais (CAPOOR et al., 2008; CHANDENIER et al., 2004; PERFECT et al., 2010).
Dentre os métodos de teste de sensibilidade antifúngica, os mais utilizados são a difusão em ágar, incluindo o E-test, e a microdiluição em caldo (CLSI, 2008; KHAN et al., 2007; COSTA et al., 2009). No E-test, utiliza-se uma fita impregnada com a droga em diferentes concentrações, a qual é posicionada sobre a superfície de um meio sólido contendo a cultura fúngica, e apresenta equivalência aceitável para os métodos pelo CLSI (COLOMBO e ALVES, 2004; COSTA, 2009). Na técnica de microdiluição em caldo, são utilizadas placas de microdiluição de 96 poços e meio de cultura RPMI 1640 livre de macromoléculas. Por meio do protocolo definido no documento M27-A3 pelo CLSI é possível ajustar as principais variáveis do teste, tais como concentração do inóculo, ao tempo de leitura da placa ou aos pontos de corte para cada droga (CLSI, 2008). Embora este protocolo não tenha sido originalmente delineado para Cryptococcus sp., vários autores têm empregado as suas diretrizes para a análise da sensibilidade in vitro.
(Fonte: CEMM, 2011)
Figura 5. Técnica de microdiluição em caldo para Cryptococcus sp. em placa de 96 poços.
Em relação à sensibilidade antifúngica, pesquisas demonstram que C. neoformans e C. gattii oriundos de amostras clínicas e ambientais são sensíveis a antifúngicos clássicos, como o itraconazol e o fluconazol (COSTA, 2009; KOBAYASHI et al., 2005; KHAN et al., 2007). No tocante ao perfil de sensibilidade dos sorotipos, a maioria é sensível aos antifúngicos com CIM de 2 a 256 μg/ml, mas
cepas do sorotipo B apresentam resistência ao fluconazol (FERNANDES et al., 2003). COSTA et al. (2010), avaliando o perfil de sensibilidade de 45 leveduras oriundas de amostras de pombos e seus excrementos, verificou que apenas uma cepa de C. neoformans era resistente a itraconazol. PFALLER et al., (2005) avaliaram a sensibilidade de isolados clínicos de C. neoformans ante a anfotericina B, flucitosina, fluconazol, voriconazol, posaconazol e ravuconazol e observaram resistência in vitro a esses antifúngicos. Recentemente, Iqbal et al (2010) mostraram que os genótipos VGI e VGIII geralmente apresentam menores valores de CIM para azólicos e anfotericina B, ao passo que o genótipo VGII apresenta maiores valores de CIM para esses compostos.A resistência in vitro em cepas clínicas e ambientais de Cryptococcus spp. é rara, sendo observada uma resistência para itraconazol e fluconazol em cepas ambientais (COSTA et al., 2009; PEDROSO et al., 2006).
2.2 A molécula de Farnesol
O farnesol foi inicialmente descrito por Hornby et al., (2001), como uma molécula quorum sensing sintetizada por C. albicans, tendo o papel de inibir ou suprimir a conversão da levedura para micélio, sem haver interferência no crescimento celular (KLEIN e TEBBETS, 2007). O farnesol é produzido pela desfosforilação do farnesil difosfato, o qual é um precursor da síntese de esteróis na via de biossíntese do ergosterol (SILVA, 2009). Na levedura C. albicans, acredita-se que o farnesol torne a cepa mais virulenta por impedir a conversão da forma de levedura para a forma micelial e por favorecer a entrada do fungo na célula do hospedeiro, em decorrência da sua propriedade lipofílica (SEMIGHINI et al., 2008).
(Fonte : www.quimicahoje.com.br) Figura 6. Fórmula estrutural do composto farnesol.
O composto farnesol - um álcool sesquiterpeno natural de planta, tais como Pluchea dioscoridis, Zea mays e Pittosporum undulatum, - formado por três unidades de isopreno, podendo está presente em muitos óleos essenciais, foi estudada em células de mamíferos pelo fato de induzir apoptose e/ou ocasionar a parada do ciclo celular em células cancerígenas, sem afetar células normais (JOO et at., 2007). O farnesol é capaz de induzir a apoptose através da indução da produção de oxigênio reativo, embora em estudos com modelo murino intefere na expressão de citocinas no caso havendo aumento de IL-5 e inibindo INF-γ (NAVARATHNA et al., 2007; SEMIGHINI et al., 2006).
Além disso, participa de vários processos biológicos, como o controle das interações microbianas, por meio da inibição do crescimento de microrganismos. Tal efeito já foi demonstrado nas bactérias Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans, no fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis e no fitopatógeno Fusarium graminearum (DERENGOWSKI et al., 2009; JABRA-RISKI et al., 2006).
O efeito do farnesol na formação de biofilmes está bem descrito em Staphylococcus epidermidis e em leveduras do gênero Candida (ZIBAFAR et al., 2009). Embora o mecanismo de ação do farnesol em fungos não esteja completamente entendido, acredita-se que ele cause danos na membrana da célula fúngica, prejudicando a síntese de ergosterol (DERENGOWSKI et al., 2009).
O mecanismo de ação do farnesol pode estar associado à inibição da incorporação da colina, na síntese de fosfatidilcolina, pela inibição da ação do pool de diacilglicerol (DAG), sendo que esta inibição pode estar atribuída a uma transdução de sinal via fosfolipase D reduzindo o que ativaria um alvo antiapoptotico (Figura 7). Ademais, o farnesol pode aumentar a degradação de 3-hidroxi-2-metilglutaril (HMG-CoA) redutase, que se encontra aderida ao reticulo endoplasmático por 8 domínios da transmebrana, participando das sínteses de esteróis nas suas primeiras fase e ativação de um receptor farnesóide, integrante da superfamília de receptores nuclear de hormônios (DERENGOWSKI et al., 2009; SILVA, 2009; TAYLOR et al., 2005).
Pesquisas recentes têm demonstrado que a molécula de farnesol pode potencializar o efeito de agentes antimicrobianos, como já foi descrito em Staphylococcus aureus e Escherichia coli (BREHM-STECHER et al.,2003; JIN et al., 2010; KURODA et al., 2007). Pois tem a capacidade de inibir as reações de oxidação-redução na bomba de efluxo da célula microbiana ocasionando um aumento da susceptibilidade. Ademais por culminar em um efluxo de K+ no citoplasma em células
humanas, com isso possibilitando o uso do mesmo como um coadjuvante na terapia antifúngica (JABRA-RISKI et al., 2006).
Apoptose Quorum sensing
Morfogênese Resistência antifúngica
Biofilme
Farnesol
Figura 7. Efeitos biológicos do farnesol: resistência antimicrobiana; formação de biofilmes imaturos; indutor de apoptose; bloqueio do processo de quorum sensing; supressão da atividade fagocitária das formas filamentosas de C. albicans (Teixeira 2010).
3. JUSTIFICATIVA
O farnesol tem sido o foco de pesquisas, visando avaliar seu efeito sobre o crescimento de microrganismos. Desta forma, este trabalho se justifica pela ausência de estudos que demonstrem o efeito do farnesol sobre fungos do gênero Cryptococcus. Logo, a presente pesquisa avaliou o papel biológico deste composto sobre o crescimento fúngico e a produção de fosfolipases e proteases nas espécies do Complexo C. neoformans.
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS
4.1. O farnesol é capaz de inibir o crescimento de isolados do Complexo C. neoformans;
4.2. O farnesol interfere na síntese de fosfolipases e proteases em cepas do Complexo C. neoformans.
5. OBJETIVOS
5.1. Objetivo Geral
Avaliar o efeito do farnesol sobre o crescimento e síntese de fatores de virulência de cepas do Complexo C. neoformans.
5.2 Objetivos Específicos
1. Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) do farnesol ante cepas do Complexo C. neoformans;
2. Investigar o efeito do farnesol sobre a síntese de fosfolipases por cepas do Complexo C. neoformans;
3. Investigar o efeito do farnesol sobre a síntese de proteases por cepas do Complexo C. neoformans.
6. CAPÍTULO 1
O FARNESOL INIBE O CRESCIMENTO IN VITRO DE ESPÉCIES
DO COMPLEXO CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS, SEM
QUALQUER ALTERAÇÃO RELEVANTE NA ATIVIDADE DE
EXOENZIMAS
Periódico: Veterinary Microbiology (submetido em novembro de 2011) Fator de Impacto: 3,256
Veterinary Microbiology 1
2 3
Farnesol inhibits in vitro growth of the Cryptococcus neoformans Species Complex with 4
no relevant change in exoenzyme activity 5
6
Rossana de Aguiar Cordeiro1,2, George Cândido Nogueira1,3, Raimunda Sâmia Nogueira 7
Brilhante1,2, Carlos Eduardo Cordeiro Teixeira1,2, Charles Ielpo Mourão1, Débora de Souza 8
Collares Maia Castelo-Branco1,2, Manoel de Araújo Neto Paiva1,3, Joyce Fonteles Ribeiro1,2, 9
Rita Amanda Chaves de Lima1,2, André Jalles Monteiro1,4, José Júlio Costa Sidrim1,2, Marcos 10
Fábio Gadelha Rocha1,2,3 11
12
1
Department of Pathology and Legal Medicine, School of Medicine, Specialized Medical 13
Mycology Center, Federal University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil. 14
2
Department of Pathology and Legal Medicine, School of Medicine, Postgraduate Program in 15
Medical Microbiology, Federal University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil 16
3
School of Veterinary, Postgraduate Program in Veterinary Science, State University of 17
Ceará, Fortaleza-CE, Brazil. 18
4
Department of Statistics and Applied Mathematics, Federal University of Ceará, Fortaleza-19
CE, Brazil 20
Corresponding Author. R. S. N. Brilhante. Rua Barão de Canindé, 210; Montese. CEP: 21
60.425-540. Fortaleza, CE, Brazil. Fax: 55 85 3295-1736 E-mail: brilhante@ufc.br. 22
23 24
Abstract 25
The present study aimed at determining the effect of farnesol on the growth of strains of the 26
Cryptococcus neoformans Species Complex, through microdilution assays. In addition, the 27
effect of farnesol on the synthesis of phospholipase and protease by C. neoformans e C. gattii 28
was also investigated. A total of 36 strains were studied, out of which 20 were from veterinary 29
sources, 8 were from human cases and 8 were from a reference collection. The minimum 30
inhibitory concentrations (MICs) were determined in accordance with the M27-A3 protocol as 31
described by CLSI and farnesol was tested at a concentration range of 0.29 to 150 µM. 32
Phospholipase and protease activities were evaluated through growth on egg yolk agar and 33
spectrophotometry, respectively, after pre-incubating the strains at different farnesol 34
concentrations (MIC/4, MIC/2 and MIC). It was observed that farnesol has substantial 35
antifungal activity against C. neoformans (MIC geometric mean 6.29 µM) and C. gattii (MIC 36
geometric mean 4.67 µM). Although farnesol did not significantly alter phospholipase 37
activity, a tendency to decrease this activity was observed. Concerning protease, no 38
statistically significant differences were observed when comparing the production before and 39
after pre-incubation at different farnesol concentrations. Based on these findings, it can be 40
concluded that farnesol presents in vitro inhibitory activity against C. neoformans and C. 41
gattii, but has little impact on the production of the analyzed virulence factors. 42
Keywords: Farnesol, Cryptococcus neoformans Species Complex, growth inhibition, 43 phospholipases, proteases. 44 45 46 47
Introduction 48
The Cryptococcus neoformans Species Complex is formed by two distinct 49
microorganisms, Cryptococcus neoformans and C. gattii, which are sub-classified in at least 50
two varieties, five serotypes and eight molecular types (Kwon-Chung & Varma, 2006; Bovers 51
et al., 2008; Byrnes et al., 2011). In spite of sharing several phenotypical and molecular 52
characteristics, these species differ from each other, concerning ecological and 53
epidemiological aspects (Lin e Heitman, 2006; Costa et al., 2010). They are the major 54
causative agents of cryptococcal meningoencephalitis, the most frequent clinical 55
manifestation of cryptococcosis, which has a high mortality rate in developing countries 56
(Rachid & Schechter, 2008; Huston & Mody, 2009; Park et al. 2009; Kronstad et al., 2011; 57
Perfect et al., 2010). 58
To succeed in the host environment, Cryptococcus spp. produce a large amount of 59
virulence factors, which directly influence the infectivity of an individual strain (Ma e May, 60
2009). Among these main virulence factors, hydrolytic enzymes able to degrade lipids and 61
proteins have gained attention in the last years (Bien et al., 2009; Chrisman et al., 2011; 62
Chayakulkeeree et al., 2011). Phospholipases are directly related to the destabilization of host 63
cell membranes (Ghannoun et al., 2000; Ma e May, 2009) and proteases have been shown to 64
degrade several host molecules, such as collagen, elastin, complement (Chen et al., 1996), 65
hemoglobin, beta-casein and gamma globulin (Yoo et al., 2004). 66
The antifungal therapy for meningeal cryptococcosis is limited to amphotericin B plus 67
5-flourocytocin and azoles (Pappalardo e Melhem, 2003). Although antifungal resistance in 68
Cryptococcus is not considered a major problem worldwide (Pfaller et al., 2005), some 69
studies have shown that resistance may be a problem in developing countries (Bii et al., 2007; 70
Varma e Kwon-Chung, 2010). This scenario has motivated the search of new compounds that 71
present inhibitory effect against Cryptococcus (Steverding et al., 2011, Nguyen et al., 2011; 72
Spitzer et al., 2011). 73
The present study aimed at evaluating the antifungal potential of farnesol against C. 74
neoformans and C. gattii. In addition, the effect of farnesol on phospholipase and protease 75
activities was also investigated. 76
77
Material and Methods 78
Fungal Strains 79
A total of 36 strains from the culture collection of the Specialized Medical Mycology 80
Center of the Federal University of Ceará were included in this study, out of which 20 were 81
from veterinary sources (2 from animal clinical cases and 18 from pigeon excreta) and 8 from 82
human clinical cases. In addition, Candida parapsilosis ATCC 22019 and eight Cryptococcus 83
sp. reference strains obtained from Evandro Chagas Clinical Research Institute, Brazil 84
(IPEC/FIOCRUZ) were used as controls: C. neoformans var. grubii WM 148 (serotype A, 85
VNI/AFLP1), C. neoformans var. grubii WM 626 (serotype A, VNII/AFLP1A), C. 86
neoformans WM 628 (serotype AD, VNIII/AFLP2), C. neoformans var. neoformans WM 629 87
(serotype D, VNIV/ AFLP3), C. gattii WM 179 (serotype B, VGI/AFLP4), C. gattii WM 178 88
(serotype B, VGII/AFLP6), C. gattii WM 175 (serotype B, VGIII/AFLP5), and C. gattii WM 89
779 (serotype C, VGIV/AFLP7), as described by Meyer et al., 2003. All isolates were stored 90
on 2% potato dextrose agar supplemented with glycerol, at -20 oC, and were recovered 91
through growth on 2% potato dextrose agar at 35 oC, for 2 days (Cordeiro et al., 2011). 92
93 94 95
Dilution of Farnesol, Amphotericin B and Fluconazole 96
The strains were tested against farnesol diluted with 30% dimethyl sulfoxide (DMSO) 97
at the moment of use, in order to obtain a stock solution at a concentration of 1892 μM. 98
Afterwards, the stock solution was diluted with RPMI1640 to a concentration of 600 μM, in 99
which DMSO was at a concentration of 5%. The tested concentration range was from 0.29 to 100
150 μM. 101
Amphotericin B (Sigma Chemical Corporation, Germany) and fluconazole (Pfizer 102
Pharmaceuticals, USA) were tested against C. parapsilosis 22019 and Cryptococcus reference 103
strains, as quality controls. These drugs were diluted with sterile destilled water, as described 104
by the document M27-A3 of the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008). The 105
tested concentration ranged from 0.03125 to 16 µg/mL and from 0.125 to 64 µg/ml, for 106
amphotericin B and fluconazole, respectively. Additionally, the effect of DMSO on the 107
viability of Cryptococcus spp. was evaluated, at concentrations that ranged from 0.05 to 30%. 108
The highest DMSO concentration used in microdilution plates was of 1.25%, which presented 109
no antifungal activity. 110
111
Testing in vitro susceptibility to farnesol 112
Fungal inocula were prepared from cultures grown on potato dextrose agar at 28 oC, 113
for 48 hours. Sterile 0.9% saline (5 mL) was added to sterile glass slants and a sample of the 114
colony was added to the saline solution, adjusting its turbidity to 0.5 McFarland scale (CLSI, 115
2008). Afterwards, inocula were diluted to 1:100 and 1:20 with RPMI 1640 medium 116
supplemented with L-glutamine (HiMedia, Mumbai, India), and buffered to pH 7 with 117
0.165M morpholinepropanesulfonic acid (MOPS). The final inoculum concentration was 0.5 - 118
2.5 x 103 cells/mL(CLSI, 2008; Costa et al., 2010, Sidrim et al., 2010). 119
The minimum inhibitory concentrations (MICs) of farnesol and the tested drugs 120
against C. neformans and C. gattii strains were determined through broth microdilution 121
method, in 96-well microdilution trays, with a capacity of 200 μL/well. These trays were 122
properly prepared and incubated at 35 oC for 48 hours, when they were visually read. MIC for 123
farnesol was defined as the lowest drug concentration able to inhibit 80% of fungal growth, 124
when compared to the farnesol-free control wells. Concerning amphotericin B and 125
fluconazole, MICs were defined as the lowest concentrations capable of inhibiting 100% and 126
50% of fungal growth, respectively (CLSI, 2008). 127
128
Effects of farnesol on phospholipase and protease activities 129
In this step, all strains were grown on 2% Sabouraud Dextrose agar and incubated at 130
37 oC, for 48 hours. Afterwards, the strains were cultured in RPMI 1640 medium, containing 131
three decreasing concentrations of farnesol (MIC, MIC/2 and MIC/4), at 37°C, for 48 hours. 132
A farnesol-free control for each strain was also included. 133
Phospholipase production was evaluated according to Sidrim et al., 2010. Initially, the 134
fungal suspensions in RPMI medium containing different farnesol concentrations were 135
centrifuged at 805 g. Then, from the fungal pellets, yeast inocula were prepared in 0.9% 136
saline, reaching turbidity equivalent to 4.0 McFarland scale. The medium used was 2% 137
Sabouraud dextrose agar, supplemented with 1 mol/L of sodium chloride, 0.05 mol/L of 138
calcium chloride and 8% sterile egg yolk emulsion at 30%. The emulsion was heated to 40 oC 139
and incorporated into the sterile Sabouraud medium after it reached a temperature of 40 oC. A 140
volume of 5 µL of each inoculum was applied onto a 5-mm sterilized filter paper disk, which 141
was placed on the agar surface. The plates were incubated at 35 oC for seven days (Sidrim et 142
al., 2010). 143
Phospholipase activity (Pz) was determined by calculating the ratio between the 144
diameter of the fungal colony and the total diameter, including the colony and the 145
precipitation zone. When Pz = 1, the isolate is phospholipase negative; when 1 > Pz ≥ 0.64 the 146
isolate is positive for phospholipase activity; and when Pz < 0.64, the isolate is strongly 147
positive for this enzyme (Price et al., 1982; Vidotto et al., 2005). 148
For protease production, the analyses were performed according to Cenci, 2004, with 149
modifications (Brilhante et al., 2011). Briefly, the strains were incubated in RPMI containing 150
different decreasing farnesol concentrations, under slow agitation of 150 g, for 48 hours, at 28 151
o
C. Afterwards, the material was centrifuged for 15 minutes at 805 g to separate the enzymatic 152
extract from the cells. Then, 2 mL of the enzymatic extract was incubated at 37 oC with 2 mL 153
of 0.3% azoalbumine, for 48 hours. After this procedure, the reaction was stopped by the 154
addition of 10% trichloroacetic acid. To the reactional mixture, 2 mL of 0.5 M KOH were 155
added for posterior spectrophotometric analysis at 440 nm. 156
157
Statistical Analysis 158
In order to analyze the effects of farnesol on the growth of strains and the production 159
of virulence factors, the data were analyzed through univariate analysis of variance. Farnesol 160
MICs were evaluated considering species and source of each strain, whereas phospholipase 161
and protease values were analyzed before and after exposure to farnesol. In this analysis, 162
species and source of strains were also considered. P-values lower than 0.05 indicated statistic 163 differences. 164 165 166 167 Results 168
Farnesol presented in vitro inhibitory effects against the tested strains, with MICs 169
varying from 0.29 to 75 µM (p<0.05) for both C. neoformans and C. gattii, with geometric 170
means (GM) of 6.29 and 4.67 µM, respectively. Considering the source of the strains, the 171
obtained GMs for C. neoformans were 10.91, 5.56 and 2.33 µM for veterinary, human and 172
reference strains, respectively, while for C. gatti, GMs were 5.30 and 3.30 µM, for veterinary 173
and reference strains, respectively. Additionally, it was observed that the control drugs 174
presented MICs ranging from 0.0625 to 1 µg/mL for amphotericin B and from 4 to 32 µg/mL 175
for fluconazole, against the control strains (Table 1) 176
It was observed that 18 (50%) out of the 36 tested strains secreted phospholipases 177
without being exposed to farnesol (control) (p<0.05). When the 36 strains were pre-incubated 178
at three different concentrations of this compound, it was observed that 11 (30.56%), 13 179
(36.12%) and 15 (41.67%) strains did not exhibit any alteration in phospholipase secretion, 180
after the exposure to farnesol concentrations of MIC/4, MIC/2 and MIC, respectively (Table 181
2) (p<0.05). However, it is interesting to state that under these experimental conditions a 182
tendency to the reduction of the enzymatic activity was observed, once 15 (41.67%), 14 183
(38.89%) and 13 (36.12%) strains presented a reduction in phospholipase secretion, after pre-184
incubated at MIC/4, MIC/2 and MIC of farnesol, respectively (p<0.05). 185
Concerning protease activity, 18 strains (50%) secreted these enzymes without being 186
exposed to farnesol (control). After pre-incubation at different concentrations of this 187
sesquiterpene, no significant differences were observed between control and the tested 188
farnesol concentrations (MIC/4, MIC/2 and MIC), with a mean value of 0.010, 0.011, 0.010 189
and 0.015 EU, respectively (p<0.05). 190
191
Discussion 192
Farnesol is a sesquiterpene alcohol found in plant extracts and also produced by C. 193
albicans as a quorum sensing molecule (Hornby et al., 2001, Derengowski et al., 2009). This 194
autoregulatory compound alters C. albicans morphology and also has a dramatic impact on 195
fungal growth and survival (Shirtliff et al., 2009; Weber et al., 2010). Several studies have 196
shown that this molecule also has inhibitory effects against other pathogens, including non-197
albicans Candida species (Weber et al., 2010), Paracoccidioides brasiliensis (Derengowski et 198
al., 2009) and bacteria (Pammi et al., 2011). 199
The mechanisms through which farnesol acts on fungal cells is still unknown 200
(Derengowski et al., 2009; Langford et al., 2010), however, it is believed that it damages the 201
fungal cell membrane and impairs ergosterol synthesis (Jabra-Rizk et al., 2006), considering 202
that farnesol and ergosterol share many precursors in the sterol biosynthetic pathway (Hornby 203
& Nickerson, 2004; Navarathna et al., 2005). In addition, as possible efflux pump inhibitor, 204
farnesol may affect membrane permeability through the disruption of cytoplasmic membranes 205
(Jin et al., 2010). 206
The present article showed that farnesol can also inhibit C. neoformans and C. gattii 207
obtained from veterinary sources. MIC values for both species (GM=6.29 and 4.67 µM for C. 208
neoformans and C. gattii, respectively) were lower than those observed for other fungal 209
pathogens, such as P. brasiliensis, for which inhibition was achieved at 25 µM (Derengowski 210
et al., 2009), and C. parapsilosis, which was inhibited by 50 µM farnesol (Rossignol et al., 211
2007). 212
Even though it has been described that C. gattii is less susceptible to classical 213
antifungal drugs (Trilles et al., 2004; Khan et al., 2007), the farnesol MICs for C. neoformans, 214
serotypes A, D and AD, (GM=6.29 µM) were higher than those for C. gattii, serotypes B and 215
C (GM=4.67 µM). Additionally, it was observed that veterinary strains of C. neoformans and 216
C. gattii presented higher MIC values (GM=10.91 and 5.30 µM, respectively), when 217
compared to those of human C. neoformans (GM=5.56 µM) and C. neoformans and C. gattii 218
reference strains (GM=2.33 and 3.30 µM, respectively). It has been reported that farnesol 219
inhibits efflux pumps of C. albicans (Sharma & Prasad, 2011) and Mycobacterium smegmatis 220
(Jin et al., 2010), thus, the difference in farnesol susceptibility, concerning the source of the 221
