8. Anexos
34 Figura 3. Animal anestesiado, colocado em banho-maria suspenso por elástico preso aos dentes incisivos do animal. A temperatura interna era mensurada continuamente por termômetro esofágico.
Figura 4. Curva de concentração representativa de HSP70 no miocárdio de ratos controle, 24 horas após hipertermia, 48 horas após hipertermia e 72 horas após hipertermia. Notar maior concentração da proteína com 48 horas, seguida de queda brusca após 72 horas, com concentração similar a dos controles.
HSP70
24 horas 48 horas 72 horas Controle
8. Anexos
35 Figura 5. Instrumental customizado para a técnica de ablação em pequenos roedores. A) Cateter unipolar de 4,5mm de diametro. B) Pinça/eletrodo que, além de elevar o coração, serve como placa neutra.
Figura 6. Protocolo de ablação. De a) a d), processo sequencial de
abertura do tórax à aplicação da RF.
8. Anexos
36 Figura 7. Ilustração da mensuração das lesões em corte transversal de coração corado com C.T.Tetrazólio. A) Análise da profundidade da lesão, em mm. B) Análise da área segmentar da lesão, mensurada pelo programa Image Tool em mm². C) Determinação das regiões a serem analisadas.
Figura 8. Inspeção macroscópica das lesões agudas dos animais submetidos ao choque térmico. Todas eram de cor branca, de morfologia circular com bordos definidos, muito similares em todos os animais de ambos os grupos.
8. Anexos
37 Figura 9. Morfologia das lesões crônicas. Notar margens nítidas e bem delimitadas, de aparência muito semelhante em todos os grupos. Esquerda, coração de grupo controle. À direita, tratado.
Figura 10. Remodelamento ventricular pós-ablação. Notar dilatação da cavidade e adelgaçamento da parede do ventrículo esquerdo dos corações. A) Controle agudo; B) Controle crônico; C) Tratado agudo; D) Tratado crônico. A área segmentar da lesão foi mensurada pelo programa Image Tool® e utilizada para comparação entre os grupos.
8. Anexos
38 11. Aspecto histológico da área de transição das lesões agudas (A: Controle; B: Tratado) por radiofreqüência no músculo cardíaco de ratos. Nota-se presença de necrose coagulativa, hemorragia e edema intersticial na área de transição entre tecido ablacionado e tecido viável. Abaixo, imagens de lesões crônicas (C: Controle; D: Tratado). Nota-se formação cicatricial similar entre os grupos, com necrose e fibroblastos ativos na periferia da lesão, sem a presença de infiltrado inflamatório.
8. Anexos
39 Figura 12. Achados microscópicos de lesões por radiofreqüência; (A) TUNEL (aumento de 400x) mostrando marcações positivas de núcleos com DNA exposto na região 2; (B) Imunohistoquímica anti-BAD (aumento de 400x), notar ausência de núcleos em coloração marrom, descartando a presença da proteína nesta amostra; (C) Coloração H.E, zona de transição situada à região 2 (aumento de 400x), notar visível delimitação da área ablacionada da área preservada; (D) observar morfologia dos núcleos íntegros na região 2, coloração H.E, 1000x.
Figura 13. Revelação de Western Blotting. Notar à esquerda apenas a presença do marcador do peso molecular (25 kD) sem o aparecimento da proteína BAD nas bandas seguintes, nesta revelação representadas por animais sacrificados nos intervalos cronológicos 2, 24, 48 e 72 horas pós-ablação. Todas as revelações mantiveram a mesma marcação, sem aparecimento de marcação nos diferentes animais avaliados.
Marcador 2h 24h 48h 72h
8. Anexos
40
Anexo 3. Carta de aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa –
UNIFESP.
São Paulo, 26 de setembro de 2008.
CEP 1507/08
IImo(a). Sr(a).
Pesquisador(a) LUIS FELIPE NEVES DOS SANTOS
Co-Investigadores: Guilherme Drummond Fenelon Costa (orientador), Mieko Okada
Disciplina/Departamento: Cardiologia/Medicina da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo Patrocinador: Recursos Próprios.
PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA INSTITUCIONAL
Ref: Projeto de pesquisa intitulado: “Efeitos na indução de termotolerância celular na cicatrização resultante de lesões por energia de radiofreqüência no miocárdio de ratos”.
CARACTERÍSTICA PRINCIPAL DO ESTUDO: Experimental, categoria C - estudo agudo e crônico. RISCOS ADICIONAIS PARA O PACIENTE: Não se aplica.
OBJETIVOS: Avaliar se a indução de termotolerância celular reduz o tamanho das lesões causadas por energia de radiofreqüência na parede livre do ventrículo esquerdo de ratos.
RESUMO: Estudo com ratos Wistar. Anestésico: cetamina e xilazina. Analgésico: tramadol. Eutanásia: overdose de barbitúrico. A pesquisa será realizada no Laboratório de Eletrofisiologia Experimental da UNIFESP. Os animais serão divididos em 2 grupos, sendo um controle e outro tratado. A termotolerância será induzida segundo a técnica de imersão em banho-maria. Os animais do grupo controle serão submetidos a banho em 36,5ºC, enquanto os animais do grupo tratado ficarão em banho a 42ºC. Ambos os grupos ficarão submersos por 20 minutos. Após 72 horas do banho, os animais serão submetidos à ablação por RF. Após 6 horas ou 30 dias da ablação, 10 animais de cada grupo serão sacrificados, o coração retirado e submetido às seguintes avaliações: análise macroscópica para identificar acometimento intra ou transmural. Os corações dos animais do período agudo serão avaliados pela coloração com cloreto de trifenil tetrazólio. Os corações serão fixados em formaldeído e realizados cortes histológicos e colorações de HE, trocrômio de Masson, e realizada análise quantitativa por método de análise de imagens. Será realiada análise da proteína HSP70, por western blot e imunohistoquímica.
FUNDAMENTOS E RACIONAL: A ablação por radiofreqüência é o tratamento de escolha para muitas arritmias. Entretanto, efeitos tardios deletérios, como bloqueio atrioventricular, têm sido relatados após o procedimento e parecem estar relacionados á extensão da lesão. Como a lesão por RF é térmica, o aumento da resistência celular a elevações de temperatura poderia prevenir a extensão tardia da lesão. Espera-se demonstrar que a lesão induzida nos corações de ratos previamente tratados com hipertermia seja significantemente menor comparada à lesão dos ratos não tratados.
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Rua Botucatu, 572 - 1º andar – conj. 14 - CEP 04023-062 - São Paulo / Brasil Tel.: (011) 5571-1062 - 5539.7162
8. Anexos
41
MATERIAL E MÉTODO: Estão descritos os procedimentos experimentais que serão realizados por equipe especializada composta por uma veterinária.
DETALHAMENTO FINANCEIRO: Sem financiamento externo. CRONOGRAMA: 22 meses.
OBJETIVO ACADÊMICO: Mestrado.
ENTREGA DE RELATÓRIOS PARCIAIS AO CEP PREVISTOS PARA: 21/9/2009 e 21/9/2010.
O Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo ANALISOU e APROVOU o projeto de pesquisa referenciado.
1. Comunicar toda e qualquer alteração do projeto.
2. Comunicar imediatamente ao Comitê qualquer evento adverso ocorrido durante o desenvolvimento do estudo. 3. Os dados individuais de todas as etapas da pesquisa devem ser mantidos em local seguro por 5 anos para possível auditoria dos órgãos competentes.
Atenciosamente,
Prof. Dr. José Osmar Medina Pestana
Coordenador do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo/ Hospital São Paulo
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10. Abstract
48 10. Abstract
The delayed effects of radiofrequency (RF) seem to be related to the extent of
the lesion. We evaluated the effects of thermotolerance on the dimensions and
remodeling of RF lesions in the rat myocardium and whether RF promotes apoptosis
in the region surrounding acute ablation lesions in a rat model. Methods: Two groups
were evaluated: treated (TG, n=22), subjected to thermal shock (a bath at 42oC for
10 min.), and control (CG, n=22, bath at a 37ºC for 10 min.). After 48 hours, an RF
lesion (customized catheter, tip 4.5 mm in diameter; 12 Watts; 10 seconds) was
performed on the free wall of the left ventricle (LV). The rats were sacrificed 2 hours
(n=10 per group) and 4 weeks (n=12 per group) after RF for macroscopic and
histological analysis of the lesions and echocardiogram was obtained at 4 weeks to
assess ventricular remodeling. Additional animals (n=30) were killed after 2 hours for
apoptosis evaluation using histological (H.E. - hematoxylin and eosin, TdT-mediated
dUTP Nick End-Labeling [TUNEL] assay), immunohistochemical (BAD and
anti-caspase 3 antibodies) analysis (n = 18) and anti-BAD Western Blotting analysis.
Results: There was no difference between groups regarding the size of acute (CG
27± 2 mm2 vs. TG 27±3 mm2) and chronic lesions (CG 17 ± 1 mm2 vs. TG 19 ± 1
mm2). Histology revealed coagulative necrosis in the acute lesions and
well-demarcated fibrosis, with no difference between groups. The echocardiogram
revealed dilation of the cavities and moderate systolic dysfunction. The diameters of
the left atrium and of the left ventricle (LV) (diastolic, TG 9.8±0.9 mm vs. CG 9.6±1.1
10. Abstract
49 of the LV (TG 45±3% vs. CG 39±3%. p=NS) did not differ between groups. TUNEL
assay revealed positive luminescent reaction cells suggesting apoptosis, however
IHQ, Western Blotting and histology were negative. Conclusion: Thermotolerance
does not reduce the size and remodeling of RF lesion in the rat myocardium and RF
11. Apêndice
11. Apêndice – artigo publicado
11. Apêndice – artigo publicado
11. Apêndice – artigo publicado
