UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS
LIVIA SCHELL WANDERLEY
CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO DE CUTIA
(Dasyprocta aguti Linnaeus, 1766)
FORTALEZA – CE
2010
LIVIA SCHELL WANDERLEY
CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO DE CUTIA (Dasyprocta aguti Linnaeus, 1766)
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Ciências Veterinárias do Programa de Pós-Graduação da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves.
Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo.
FORTALEZA – CE 2010
W245c Wanderley, Livia Schell
Criopreservação de tecido ovariano de cutia (Dasyprocta aguti Linnaeus, 1766 / Livia Schell Wanderley. — Fortaleza, 2010.
81 p.
Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo.
Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) – Universidade Estadual do Ceará,
1. Folículos pré-antrais. 2. Congelação. 3. Cutia. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
LIVIA SCHELL WANDERLEY
CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO DE CUTIA (Dasyprocta aguti Linnaeus, 1766)
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Ciências Veterinárias do Programa de Pós-Graduação da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Aprovada em: 15/12/2010
BANCA EXAMINADORA
____________________________________ Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo Universidade Estadual do Ceará – UECE
Orientador
____________________________________ Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues Universidade Estadual do Ceará – UECE
(Membro Efetivo)
____________________________________ Prof. Dr. Alexandre Rodrigues Silva
Universidade Federal Rural do Semi-Árido – UFERSA (Membro Externo)
Aos meus pais, Maximiliano e Iolinda, pelo apoio e amor incondicional em todos os momentos da minha vida. Dedico...
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e a Faculdade de Veterinária e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da UECE, pela contribuição em minha formação profissional.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro do projeto e pela concessão da bolsa.
Ao Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo, pelos ensinamentos, oportunidade e orientação durante toda a execução deste trabalho.
À minha co-orientadora, Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, por ter me adotado na “CRIO” junto com seus orientandos e pela atenção dispensada ao meu trabalho.
Ao professor Dr. Claudio Cabral Campello, por ter me incentivado nos caminhos da pesquisa, execução da análise estatística deste trabalho e por ser um dos maiores exemplos de caráter e dedicação que conheço.
Ao professor Dr. Alexandre Rodrigues Silva e toda a equipe do Laboratório de Manipulação de Germoplasma Animal por terem me recebido tão bem, além da ajuda na execução do experimento e também ao professor Moacir Franco de Oliveira e os funcionários do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres da UFERSA pelos animais utilizados nessa pesquisa.
À Dra. Sônia Nair Báo e a equipe do Laboratório de Microscopia Eletrônica da Universidade de Brasília (UnB) pela colaboração nos trabalhos de microscopia eletrônica de transmissão.
À grande equipe do LAMOFOPA, que ao longo desses quase dois anos me ensinou muitas lições sobre convivência e respeito ao próximo. Todos os professores, doutores, pós-graduandos, graduandos e técnicos contribuíram, de alguma forma na execução deste trabalho. À turma da “CRIO”, em especial à Luciana Faustino, que sempre estava disposta a me ajudar, independente do dia, da hora e até da cidade! Ao meu primeiro “filho”, o aluno de iniciação científica, Emmanuel Teles Sales, acredito que aprendi muito mais coisas do que pude ensinar a ele! À minha amiga, dupla de organização do estoque, Isadora Machado e minhas irmãs cajazeiras mais lindas desse Brasil, Hiédely Luz (Preta) e Ivina Brito, pela amizade, parceria, conselhos, pelos choros e sorrisos compartilhados. O que teria sido de mim sem vocês? Ao meu grande amigo Cláudio Lopes, pela amizade, paciência, por tudo que me ensinou e por ter o dom de alegrar qualquer ambiente! Seu apoio foi essencial pra mim, especialmente na reta final deste trabalho!
Aos meus amigos da graduação e da turma de mestrado mais legal que já existiu! Assistir às aulas sem a companhia de vocês não seria a mesma coisa...
Minhas amigas mais que queridas, Nicoli Amaral, Adriana Britto, Sacha Avelino, Mariana Resende e toda minha Equipe, com quem divido minhas alegrias e tristezas há tanto tempo!
Ao meu pai, por ser a maior prova de que é possível vencer na vida com muito esforço, trabalho e honestidade... Tento seguir diariamente o seu exemplo de determinação. À minha mãe, por saber que, a qualquer momento, em qualquer lugar que eu esteja, é só gritar que ela está pronta pra me ajudar. Aos meus irmãos, Glauco e a pequena Jordana, por simplesmente serem os irmãos que toda irmã gostaria de ter!
Aos membros da banca examinadora, por terem aceitado o convite, pelos comentários e correções deste trabalho.
A todos os que não foram aqui mencionados, mas que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos.
“Se as coisas são inatingíveis... ora! Não é motivo para não querê-las... Que tristes os caminhos, se não fora A presença distante das estrelas!” Mário Quintana
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo eficiente para a criopreservação de tecido ovariano de cutia (Dasyprocta aguti). Para tanto, ovários (n=10) de cutias adultas foram coletados e transportados ao laboratório em Meio Essencial Mínimo (MEM) a 4°C. Em seguida, cada ovário foi dividido em quatro fragmentos de tamanhos iguais (4 mm x 4 mm x 1 mm). Dois fragmentos de cada par ovariano foram imediatamente fixados para histologia clássica e análise ultraestrutural, constituindo o controle. Os fragmentos restantes foram somente expostos (n=3) por 10 min em solução composto por MEM, soro fetal bovino (SFB) na presença de 1,5 M de dimetilsulfóxido (DMSO), etilenoglicol (EG) ou propanodiol (PROH), os demais fragmentos (n=3) foram expostos e, em seguida, congelados em freezer programável. Após a exposição e/ou descongelação, todos os fragmentos foram fixados em Carnoy para histologia clássica e destinados à análise morfológica. Cada tratamento foi repetido 5 vezes. Decorrido o tempo de fixação, os fragmentos ovarianos foram submetidos aos procedimentos de rotina para histologia clássica, seccionados à espessura de 7 µm e corados com hematoxilina-eosina. Os folículos pré-antrais foram classificados como morfologicamente normais (FMN) ou degenerados, com base na integridade do oócito, células da granulosa e membrana basal. Para avaliação da ultraestrutura, os folículos do controle e de todos os tratamentos criopreservados foram fixados em Karnovsky e processados para análise de microscopia eletrônica (MET). Para a análise estatística, os resultados foram expressos como média ± D.P., submetidos à ANOVA e analisados pelo teste de Student-Newman-Keuls. Os valores foram considerados significativos quando P < 0,05. A análise histológica mostrou que após os procedimentos de exposição e congelação houve uma diminuição significativa no percentual de FMN em todos os tratamentos, quando comparados ao controle (92,67 ± 2,79). No entanto, não houve diferença significativa quando os procedimentos de exposição e congelação foram comparados entre si, utilizando o mesmo crioprotetor. Além disso, não foi observada diferença significativa entre os agentes crioprotetores tanto no período de exposição (DMSO: 64,67 ± 3,80; EG: 70,67 ± 11,16; PROH: 63,33 ± 8,50) quanto após a congelação (DMSO: 60,64 ± 3,64; EG: 64,00 ± 11,88; PROH: 62,00 ± 6,91). Entretanto, a análise de MET revelou que somente os folículos congelados na presença do propanodiol apresentaram ultraestrutura normal. Diante disso, pode-se concluir que
folículos pré-antrais inclusos no tecido ovariano de cutia podem ser criopreservados com sucesso utilizando 1,5 M de PROH, com manutenção satisfatória da sua morfologia e ultraestrutura.
Palavras-chave: folículos pré-antrais, congelação, cutia, ultraestrutura, morfologia
ABSTRACT
The aim of this study was to develop an efficient protocol for the cryopreservation of agouti (Dasyprocta aguti) ovarian tissue. For this purpose, ovaries (n = 10) were collected from adult agoutis and transported to the laboratory in Minimal Essential Medium (MEM) at 4°C. Then the ovaries were divided into four equal portions (approximately 4 mm x 4 mm x 1 mm). Two pieces from each pair were immediately fixed for histological and ultrastructural analysis, and these constituted the control. The other fragments were only exposed (n = 3) for 10 min in a solution containing MEM and fetal bovine serum to the presence of 1.5 M dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG) or propanediol (PROH), while the remaining fragments (n = 3) were exposed and then frozen in a programmable freezer. After exposure and/or thawing, all samples were fixed in Carnoy for histology and were destined for morphological analysis. Each treatment was repeated five times. After fixation, the ovarian fragments were subjected to routine histology procedures, sectioned at a 7-µm thickness and stained with hematoxylin-eosin. The preantral follicles were classified as morphologically normal (MNPF) or degenerated based on the integrity of the oocyte, granulosa cells and basement membrane. To evaluate the ultrastructure, the follicles from the control and all cryopreserved treatments were fixed in Karnovsky and processed for transmission electron microscopy (TEM) analysis. For statistical analysis, the results were expressed as the mean ± SD, subjected to ANOVA and analyzed by Student-Newman-Keuls test. Values were considered significant when P < 0.05. Histological analysis showed that after the procedures of exposure and freezing, there was a significant decrease in the percentage of MNPF in all treatments when compared to the control (92.67 ± 2.79). However, no significant difference was observed when the exposure and freezing procedures were compared using the same cryoprotectant. Moreover, there was no significant difference among cryoprotectants at the time of exposure (DMSO: 64.67 ± 3.80; EG: 70.67 ± 11.16, PROH: 63.33 ± 8.50) or after freezing (DMSO: 60.64 ± 3.64, EG: 64.00 ± 11.88; PROH: 62.00 ± 6.91). However, TEM analysis revealed that only follicles frozen with PROH had normal ultrastructure. Thus, it can be concluded that preantral follicles enclosed in agouti ovarian tissue can be successfully cryopreserved using 1.5 M PROH with a satisfactory maintenance of follicular morphology and ultrastructure.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Experimental design for exposure and freezing of agouti ovarian tissue. TEM = transmission electron microscopy………. 51 FIGURA 2 Histological sections of agouti preantral follicles. (A) Morphologically
normal follicle (control); (B) Degenerated follicle, cryopreserved with EG. Note retraction of the oocyte cytoplasm (arrow) and disorganized granulosa cells. Nu, oocyte nucleus; gc, granulosa
cells……….……….. 54
FIGURA 3 Percentage of morphologically normal follicles in the control and after exposure to cryoprotectants (DMSO, EG or PROH) for 10 min with or without subsequent cryopreservation. * Differs significantly from treatments (P < 0.05)……….. 55 FIGURA 4 Electron micrographs of the preantral follicles from the control group
(A, 15000x) and those freeze-thawed with 1.5 M PROH (B, 15000x), DMSO (C, 15000x) or EG (D, 12000x). In Fig. 4A and 4B, normal follicles, presenting a well-preserved ultrastructure, are displayed. In Fig. 3C, a follicle exhibiting a higher degree of vacuolization and a granulosa cell with a very large vacated area is indicated by an asterisk. In Fig. 4D, a follicle displaying an ooplasm with reduced electron density and lower numbers of organelles is depicted (note the granulosa cell detachment that is indicated with an arrow). O, oocyte; GC, granulosa cell; nu, nucleus; m, mitochondria; bm, basement membrane; v, vacuole... 57
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS m - Micrômetro ~ - Aproximadamente 400x - Aumento de 400 vezes 12000x - Aumento de 12000 vezes 15000x - Aumento de 15000 vezes ACP - Agente(s) Crioprotetor(es)
ANOVA - Analysis of variance (Análise de variância) bm - Basement membrane (Membrana basal)
°C - Graus Celsius cm3 - Centímetro Cúbico µL - Microlitro µm - Micrômetro DMSO - Dimetilsulfóxido D.P. - Desvio-padrão EG - Etilenoglicol
FAVET - Faculdade de Veterinária
FBS - Fetal Bovine Serum (soro fetal bovino) Fig - Figura
FOPA - Folículo Ovariano Pré-Antral
FUNCAP - Fundação Cearense de Apoio Científico e Tecnológico g – Grama
GC – Granulosa cell (célula da granulosa) GLM - General Linear Models
h - Hora(s)
HE – Hematoxilina-Eosina
HEPES - Ácido (N-[2-Hidroximetil] Piperazina-N`-[2-Etanosulfônico] H-MEM - Meio Essencial Mínimo tamponado com HEPES
IUCN - International Union for Conservation of Nature and Natural Resources (União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais)
kV - Quilovolt
LAMOFOPA - Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré- Antrais M – Molar
MEM - Meio Essencial Mínimo
MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão
MNPF - Morphologically normal follicle (Folículo morfologicamente normal) min - Minuto(s) m – Mitochondria (mitocôndria) mL - Mililitro mm - Milímetro mM - Milimolar mOsmol - Miliosmol
MOIFOPA - Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais
Nu - Nucleus (núcleo) O - Oocyte (oócito)
pH - Potencial Hidrogeniônico PROH - Propanodiol
P < 0,05 - Probabilidade de erro menor do que 5%
PPGCV - Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias RT - Room temperature (temperature ambiente)
SAS - Statistical Analysis System SNK - Student-Newman-Keuls
S.D. - Standard Deviation (desvio-padrão)
TEM - Transmission electron microscopy (microscopia eletrônica de transmissão)
UECE - Universidade Estadual do Ceará
UFERSA - Universidade Federal Rural do Semi-Árido UnB - Universidade de Brasília
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 16
2 REVISÃO DE LITERATURA... 18
2.1 A cutia... 18
2.2 O ovário dos mamíferos... 18
2.3 População e atresia folicular... 19
2.4 Criopreservação... 20
2.4.1 Agentes crioprotetores... 20
2.4.2 Métodos de Avaliação de FOPAs criopreservados... 21
2.5 Capítulo I (Criopreservação de tecido ovariano como ferramenta para a conservação de espécies de mamíferos ameaçadas de extinção)... 23 3 JUSTIFICATIVA... 39 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA... 41 5 OBJETIVOS... 42 5.1 Objetivo Geral... 42 5.2 Objetivos Específicos... 42
6 CAPÍTULO II (Criopreservação de tecido ovariano de cutia (Dasyprocta aguti) utilizando dimetilsulfóxido, etilenoglicol e propanodiol... 43
7 CONCLUSÕES... 66
8 8 PERSPECTIVAS... 67
1 INTRODUÇÃO
O processo de extinção das espécies de mamíferos existentes na biodiversidade tem sido acelerado pela ação antrópica, especialmente nos últimos 100 anos (União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais – IUCN, 2010). Por essa razão, o desenvolvimento de biotécnicas da reprodução que possam ser aplicadas em espécies ameaçadas de extinção é de grande importância para auxiliar na conservação dessas espécies. Dentre essas biotécnicas, podemos destacar a inseminação artificial (LASLEY et al., 1994); produção in vitro e transferência de embriões (DOMINGUES et al., 2010; POPE, 2000) e a manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA) (FIGUEIREDO et al., 2007). No entanto, a aplicação dessas biotécnicas à reprodução de espécies ameaçadas ainda apresenta um sucesso limitado, uma vez que as informações acerca dos aspectos reprodutivos de grande parte dessas espécies são escassas. Assim, a criopreservação de tecido ovariano surge como uma importante alternativa para minimizar esse problema, pois permite a preservação do grande número de oócitos imaturos oriundos dos folículos pré-antrais (FOPAs), presentes no tecido ovariano, os quais correspondem a cerca de 90% de toda a população folicular (JEWGENOW & PARIS, 2006). Dessa forma, a criopreservação contribuiria para a manutenção da diversidade genética de populações por longos períodos em bancos de germoplasma, até que essas biotécnicas possam ser aplicadas de maneira prática.
É bem conhecido que o número de espécies ameaçadas de extinção disponíveis para a realização de estudos reprodutivos é pequeno. Neste sentido é de extrema importância a utilização de modelos experimentais, geralmente animais domésticos ou animais selvagens que não se encontrem em risco de extinção, para o desenvolvimento de protocolos de reprodução assistida que posteriormente possam ser aplicados em espécies ameaçadas, auxiliando na sua conservação. Um exemplo de modelo experimental é a cutia (Dasyprocta aguti), um roedor brasileiro que devido ao seu pequeno tamanho e facilidade de adaptação e reprodução em cativeiro, apresenta grande potencial para ser utilizada como modelo para outras espécies de roedores, que se encontram ameaçadas de extinção, como é o caso do ouriço-preto (Chaetomys subspinosus) e do o preá (Cavia intermédia). Além de seu potencial para a pesquisa bio
Nesse contexto, para uma melhor compreensão deste trabalho, serão abordados na revisão de literatura apresentada a seguir, tópicos referentes ao ovário dos mamíferos e população folicular, ao processo de extinção e à conservação das espécies ameaçadas; as
biotécnicas da reprodução com potencial para auxiliar na conservação dessas espécies, destacando a importância da criopreservação de tecido ovariano para a implantação de bancos de germoplasma animal; a relevância da utilização de espécies que não estejam ameaçadas de extinção, como modelos experimentais para aquelas espécies que estejam sob esse risco, além de apresentar a cutia (Dasyprocta aguti) como modelo experimental para a preservação de gametas femininos de espécies de roedores ameaçados de extinção. Parte desta revisão originou o artigo intitulado: “Criopreservação de tecido ovariano como ferramenta para a conservação de espécies de mamíferos ameaçadas de extinção”, o qual foi submetido para publicação no periódico Revista Brasileira de Reprodução Animal.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A cutia
A cutia (Dasyprocta aguti) é o terceiro maior roedor brasileiro, pertencente à família Dasyproctidae, pesando entre 1,5 a 2,8 kg e com dieta à base de folhas, raízes, flores, fungos, sementes e especialmente de frutos caídos no solo, podendo, dessa forma, colaborar na disseminação de várias espécies vegetais, sendo um importante componente da nossa fauna (CHAVES & SANTOS, 2005; LANGE & SCHMIDT, 2007). São animais de hábito diurno e crepuscular (OJASTI, 1996).
Aparentemente, os indivíduos não apresentam dimorfismo sexual (OJASTI, 1996), são monogâmicos (KORZ & HENDRICHS, 1995), o ciclo sexual é do tipo poliestro contínuo, com duração média 34,2 dias (WEIR, 1971).
O período de gestação dura de 105 a 120 dias, apresentando duas gestações, em média, ao ano, com o número de filhotes variando de um a três, não ocorrendo estro pós-parto. Os filhotes são amamentados por um período, em média, de 20 semanas (NOWAK, 1999) e alcançam a maturidade sexual entre o 6º e o 9º mês (OJASTI, 1996).
A cutia possui grande potencial para ser utilizada como modelo experimental para outras espécies de roedores e até humanos, por apresentar características como pequeno porte, baixo custo de manutenção e curto período de gestação (BJÖRKMAN et al., 1989). Além disso, esse animal representa uma fonte protéica alternativa, possuindo também potencial para exploração econômica (RODRIGUES et al., 2003). Em Trinidad e Tobago, na América Central, a carne de cutia carne é considerada uma especiaria, e por esta razão, esse animal tem sido intensivamente caçado (ROOPCHAND, 2002). A fim de se desenvolver uma cadeia produtiva sustentável para esta espécie, diversos estudos relacionados aos aspectos reprodutivos da cutia têm sido realizados como placentação (RODRIGUES et al., 2003), caracterização morfológica dos ovários (ALMEIDA et al., 2003) e tubas uterinas (FORTES et al., 2005), coleta (MOLLINEAU, ADOGWA & GARCIA, 2007;) e criopreservação de sêmen (MOLLINEAU, ADOGWA & GARCIA, 2011).
2.2 Ovário dos mamíferos
O ovário mamífero é constituído por muitos tipos de células diferenciadas, que trabalham em conjunto para promover um ambiente ideal para o desempenho de suas funções
endócrinas e gametogênica (BRISTOL-GOULD & WOODRUFF, 2006). Esse órgão é constituído por duas regiões: cortical e medular. O córtex ovariano, localizado mais externamente e circundado pelo epitélio germinal, consiste na região funcional do órgão, e é formado por tecido conectivo (fibroblastos, colágeno e fibras reticulares), folículos ovarianos e corpos lúteos em vários estádios de desenvolvimento ou em regressão (LIU et al., 2006). A região medular, localizada mais internamente, é constituída por tecido conjuntivo, células musculares lisas, nervos, vasos sanguíneos e linfáticos responsáveis pela nutrição e estruturação do ovário (HAFEZ & HAFEZ, 2004).
2.3 População e atresia folicular
O folículo ovariano é a unidade morfofuncional do ovário e pode ser classificado de acordo com o grau de evolução, em folículo pré-antral (primordial, transição, primário e secundário) e antral (terciário e pré-ovulatório) (SILVA et al., 2004). Vale ressaltar que os folículos pré-antrais (FOPAs) representam 90% da população folicular e são responsáveis pela renovação contínua de folículos antrais no ovário (KATSKA-KSIAZKIEWICZ, 2006).
Em muitos mamíferos, a população folicular ovariana é estabelecida ainda na vida intra-uterina (primatas e ruminantes – KNIGHT & GLISTER, 2006) ou em um curto período de tempo após o nascimento (roedores – OJEDA et al., 2000).
A população folicular difere entre as espécies, além de ser observada uma forte variação individual (KATSKA-KSIAZKIEWICZ, 2006), sendo de aproximadamente 1.500 na camundonga (SHAW et al., 2000); 114.000 na gata (LIMA, 2006); 160.000 na ovelha (DRIANCOURT et al., 1991); 235.000 na vaca (BETTERIDGE et al., 1989) e aproximadamente 2.000.000 na mulher (ERICKSON, 1986). Ao longo da vida do animal, ocorre uma redução ordenada no número de FOPAs (SHAW et al., 2000). Essa redução é devido a dois fenômenos que ocorrem naturalmente no ovário: (i) a ovulação e (ii) a atresia ou morte folicular. Somente uma pequena parte (0,1%) dos folículos primordiais chega à ovulação (NUTTINCK et al., 1993), pois a maioria (99,9%) torna-se atrésica durante as fases de crescimento e maturação oocitária (OTALA et al., 2002).
A atresia folicular pode ocorrer por via degenerativa (SAUMANDE, 1991) e/ou apoptótica (FIGUEIREDO et al., 1995). Na via degenerativa, a isquemia pode ser uma das principais causas do desencadeamento da morte folicular (FARBER, 1982), resultando em alterações na permeabilidade da membrana celular, aumento de água intracelular, vacuolização citoplasmática e, conseqüentemente, degeneração (BARROS et al., 2001).
No que concerne à apoptose, sabe-se que se trata de um evento geneticamente determinado, ou seja, depende da expressão de genes pró e anti-apoptóticos, e é observada nos folículos ovarianos durante toda a vida fetal e adulta. Histologicamente, a apoptose é caracterizada pela vacuolização citoplasmática, condensação da cromatina, bem como o aparecimento de corpos apoptóticos eosinófilos em torno de massas citoplasmáticas, ou ainda massas de cromatina picnótica. Os aspectos ultra-estruturais podem ser caracterizados pela: 1) condensação da cromatina nuclear, formando aglomerados circunscritos responsáveis pelo contorno do espaço nuclear; 2) fragmentação da célula e produção de corpos apoptóticos ligados à membrana, que serão fagocitados pelos macrófagos (HUSSEIN, 2005). Apesar de ser um fenômeno natural, a atresia reduz significativamente o número de oócitos que seriam ovulados, diminuindo assim o potencial reprodutivo do animal. Dessa forma, o desenvolvimento de protocolos de criopreservação de tecido ovariano poderia, através do armazenamento de gametas femininos por período indeterminado, fornecer um maior suporte às técnicas que têm como objetivo evitar ou minimizar tal perda que ocorre naturalmente. Esses folículos pré-antrais criopreservados poderão ser transplantados ou cultivados in vitro para a obtenção de oócitos maturos, aptos a serem fecundados, garantindo assim a multiplicação de animais de alto valor científico, genético, econômico e em risco de extinção.
2.4 Criopreservação
Os princípios básicos da criopreservação serão abordados adiante, no Capítulo I, do presente trabalho.
2.4.1 Agentes crioprotetores
Os agentes crioprotetores (ACP) são componentes que garantem uma maior proteção celular durante a criopreservação uma vez que eles protegem as células contra a desidratação, resfriamento e danos causados pela redução extrema de temperatura. O modo de ação dos agentes crioprotetores na célula não é plenamente conhecido, provavelmente devido aos inúmeros efeitos desses agentes sobre a célula. Em geral, esses agentes podem agir (i) penetrando nas células (crioprotetores intracelulares) e substituindo as moléculas de água da célula, (ii) reduzindo o ponto de congelação, (iii) protegendo membranas celulares (crioprotetores extracelulares) por meio da sua ligação às cabeças dos grupos fosfolipídicos, (iv) aumentando a viscosidade do meio, ou (v) reduzindo a concentração de eletrólitos durante criopreservação, diminuindo, assim, o risco de danos osmóticos. Contudo, os agentes
crioprotetores, quando utilizados em altas concentrações, podem ser tóxicos às células (MULLEN, 2007).
Os agentes crioprotetores podem ser álcoois, açúcares, dióis, amidas, grandes polímeros, que podem atuar por diferentes mecanismos (FULLER, 2004; ACKER, 2007) e de acordo com o tamanho da molécula podem ser classificados como intra ou extracelulares. Os crioprotetores intracelulares são substâncias de baixo peso molecular e agem penetrando na célula a fim de interagir e influenciar a dinâmica dos microfilamentos e microtúbulos (DOBRINSKY, 1996). Os mais empregados para a criopreservação de embriões, oócitos e tecido ovariano são o glicerol (GLI), dimetilsulfóxido (DMSO), propanodiol (PROH) e etilenoglicol (EG).
Crioprotetores extracelulares, também conhecidos como agentes de alto peso molecular, atuam aumentando a viscosidade da solução ou se ligam às cabeças dos grupos fosfolipídicos, protegendo as membranas celulares contra as crioinjúrias. Podem ser citados como exemplos de agentes crioprotetores extracelulares, o polivinil álcool e os açúcares, tais como sacarose e trealose. Outra substância comumente adicionada ao meio de criopreservação é o soro fetal bovino, devido aos efeitos benéficos para a sobrevivência das células, observados após a descongelação (CAMPBELL & BROCKBANK, 2007). Contudo, a composição do soro pode variar bastante entre amostras e seu papel durante o processo de congelação/descongelação ainda não foi esclarecido (SANTOS, 2007).
Para se avaliar a eficiência de um protocolo de criopreservação, é importante que os FOPAs criopreservados sejam submetidos à análise de morfologia e/ou viabilidade.
2.4.2 Métodos de análise de FOPAs criopreservados
A histologia clássica consiste em um método rápido para avaliar a qualidade folicular. Contudo, análise morfológica via histologia não é suficiente para avaliar o processo de criopreservação (MARTINEZ-MADRID et al., 2004). Essa análise permite apenas a identificação dos sinais primários da atresia que são caracterizados pela picnose nuclear, danos citoplasmáticos, desconexão entre as células da granulosa e o oócito, bem como irregularidades na membrana basal (DEMIRCI et al., 2002). É importante destacar que a morfologia celular nem sempre pode estar correlacionada com a integridade ultraestrutural das organelas celulares, as quais podem ser avaliadas via microscopia eletrônica de transmissão (SANTOS et al., 2006a) ou microscopia confocal (DE SANTIS et al., 2007). Além da análise das organelas, é também importante avaliar a integridade da membrana
celular, seja utilizando o corante vital azul de trypan (PINTO et al., 2008) ou marcadores fluorescentes como a calceína-AM e o etídio homodírmero (SANTOS, 2007).
O cultivo in vitro por curto período (24 h) permite uma melhor análise da qualidade folicular pós-criopreservação, uma vez que os danos foliculares causados pela criopreservação nem sempre são observados imediatamente após a descongelação, sendo necessárias algumas horas de cultivo in vitro antes da análise de viabilidade para restauração do metabolismo celular (RODRIGUES et al., 2005; SANTOS et al., 2006b, 2007).
2.5 CAPÍTULO I
Criopreservação de tecido ovariano como ferramenta para a conservação de espécies de mamíferos ameaçadas de extinção
(Ovarian tissue cryopreservation as a tool for endangered mammalian species conservation)
Criopreservação de tecido ovariano como ferramenta para a conservação de espécies de mamíferos ameaçadas de extinção
(Ovarian tissue cryopreservation as a tool for endangered mammalian species conservation)
Livia Schell Wanderley,Hiédely Kenia Machado Luz, Ivina Rocha Brito, Luciana Rocha Faustino, Ana Paula Ribeiro Rodrigues, José Ricardo de Figueiredo.
Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-Antrais – LAMOFOPA, Fortaleza, CE, Brasil.
Endereço para correspondência: livia_sch@yahoo.com.br
Resumo
O presente artigo aborda de forma resumida os aspectos básicos da criopreservação, com foco sobre a criopreservação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais no tecido ovariano de animais selvagens, para a implantação de bancos de germoplasma animal. Além disso, ressalta a importância da utilização de modelos experimentais para o desenvolvimento de protocolos de técnicas de reprodução assistida nesses animais, com o objetivo de auxiliar na conservação de espécies ameaçadas de extinção.
Palavras-chave: bancos de germoplasma, folículos pré-antrais, modelo experimental, animais
selvagens
Abstract
The present paper summarizes the basic aspects of cryopreservation, focusing on the oocytes from preantral follicles enclosed in ovarian tissue of wild animals, for the establishment of animal germplasm banks. Furthermore, it emphasizes the importance of using experimental models for the development of protocols for assisted reproduction techniques in these animals, in order to assist in the conservation of endangered species.
Introdução
A extinção de espécies de mamíferos é parte do processo natural de evolução e é irreversível. Entretanto, em animais selvagens esse processo vem ocorrendo em uma velocidade muito maior do que a especiação (processo evolutivo pelo qual as espécies se formam) em virtude do impacto negativo das atividades humanas, como destruição do habitat, caça excessiva ou competição com espécies exóticas introduzidas (Holt e Pickard, 1999). No tocante aos mamíferos domésticos, a extinção tem ocorrido devido à intensa seleção de algumas raças impostas por técnicas de manejo e demandas de mercado (Andrabi e Maxwell, 2007).
Apesar dos esforços realizados para a preservação do habitat e da vida selvagem, os cientistas têm, cada vez mais, direcionado estudos para a aplicação de técnicas de reprodução assistida (TRAs), como a fertilização in vitro, que pode auxiliar na conservação de espécies ameaçadas de extinção. No entanto, existe um fator limitante para a aplicação dessa e outras TRAs em espécies selvagens, que é o número limitado de oócitos fertilizáveis (maturos ou em metáfase II), os quais são obtidos a partir de folículos ovarianos antrais. Por outro lado, essa limitação poderia ser minimizada utilizando o grande número de oócitos imaturos oriundos dos folículos ovarianos pré-antrais, presentes no tecido ovariano, os quais correspondem a cerca de 90% de toda a população folicular (Jewgenow e Paris, 2006) presente no ovário dos mamíferos. No entanto, não é possível a manipulação in vitro de milhares de folículos pré-antrais momentos após, ou no mesmo dia em que são extraídos do ovário, sem haver comprometimento de sua viabilidade. Neste caso, a aplicação da técnica de criopreservação poderia ser uma excelente alternativa para a conservação do material genético de fêmeas de espécies ameaçadas de extinção, em bancos de germoplasma visando a sua utilização em diferentes TRA, de forma programada.
A presente revisão tem como objetivo abordar 1) tópicos referentes ao processo de extinção e à conservação das espécies ameaçadas; 2) biotécnicas da reprodução com potencial para auxiliar na conservação dessas espécies, destacando a importância da criopreservação de tecido ovariano para a implantação de bancos de germoplasma animal e 3) a relevância da utilização de espécies que não estejam ameaçadas de extinção, como modelos experimentais para aquelas espécies que estejam sob esse risco.
A extinção de uma espécie pode ser definida como o desaparecimento de seu último indivíduo, tanto em seu habitat natural, quanto em cativeiro (Diamond, 1987). Para uma espécie ser classificada como “extinta”, é necessário que pesquisas exaustivas sejam realizadas, em todos os habitats conhecidos ou prováveis para determinada espécie, em momentos apropriados durante um período estipulado especificamente para seus hábitos e ciclo natural (IUCN, 2010).
Toda a base da evolução biológica é sustentada pelo aparecimento de algumas espécies e o desaparecimento de outras, sendo, portanto, a extinção considerada um processo natural (Davidson et al., 2009).
De acordo com registros fósseis, acredita-se que somente 2 a 4% das espécies que já existiram no planeta sobrevivem até hoje. O restante foi extinto, tendo a maioria desaparecido muito antes da chegada dos seres humanos. Alguns aspectos ecológicos, tais como pequena abrangência geográfica, baixa densidade demográfica, maior longevidade, ciclo reprodutivo longo e grande tamanho corporal são fortemente correlacionados com o risco de extinção dos mamíferos, sendo a importância dessas características variável entre seus diferentes grupos (Davidson et al., 2009).
Apesar da extinção ser um processo natural e lento, recentemente, essa tem ocorrido de forma acelerada, como consequência da atividade humana (Chapin et al., 2000). Nos últimos 500 anos, a atividade humana provocou a extinção de 844 espécies em seus habitats naturais. As maiores ameaças aos ecossistemas e à biodiversidade podem ser observadas pela perda ou degradação do habitat, exploração excessiva pela caça, poluição, introdução de espécies invasoras e mudanças climáticas globais (IUCN, 2010). Dessa forma, é de fundamental importância que estratégias de conservação sejam adotadas na tentativa de reduzir o número de espécies ameaçadas de extinção pela ação antrópica.
Estratégias para a conservação de espécies ameaçadas de extinção
Com a finalidade de se evitar a extinção desenfreada, provocada pela ação do homem, estratégias de conservação devem ser aplicadas. Basicamente, existem duas maneiras de evitar a extinção de espécies animais presentes na biodiversidade; são elas, a conservação in situ e a conservação ex situ. A conservação in situ, ou seja, aquela que ocorre no próprio ambiente, envolve a preservação do habitat, protegendo desse modo as espécies que nele vivem (Hanks, 2001). Esta é uma estratégia de grande importância, pois permite a continuidade dos processos evolucionários naturais. No entanto, esse tipo de conservação, pode apresentar-se
ineficiente em casos de populações reduzidas, bem como no caso de grandes vertebrados que, para garantir sua sobrevivência, necessitam de grandes áreas (Primack e Rodrigues, 2002).
Por outro lado, a conservação ex situ, envolve as estratégias que são realizadas fora do ambiente natural, isto é, em cativeiro (Pukazhenthi e Wildt, 2004), que diz respeito às práticas de manutenção, criação e reprodução de espécies em zoológicos, oceanários e fazendas (Holt e Pickard, 1999). No tocante à reprodução, ressalte-se que além de ser exercida de forma natural também tem sido, de modo especial, impulsionada pela aplicação de biotécnicas da reprodução, conforme será abordado no tópico a seguir.
Biotécnicas da reprodução aplicadas à conservação de espécies ameaçadas de extinção
As estratégias de conservação in situ e ex situ de espécies ameaçadas ainda são insuficientes para a propagação de pequenas populações e manutenção da diversidade genética adequada. Diante disto, novas estratégias de conservação ex situ vêm sendo desenvolvidas no campo da biologia reprodutiva. Dentre estas, podemos destacar as técnicas de inseminação artificial (Lasley et al., 1994); maturação e fertilização de oócitos in vitro; produção in vitro e transferência de embriões (Domingues et al., 2010; Pope, 2000); implantação de bancos e utilização de germoplasma criopreservado (Pukazenthi e Wildt, 2004); clonagem (Holt et al., 2004); e a manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais – MOIFOPA (Figueiredo et al., 2007).
Muitos pesquisadores acreditam que as TRAs, quando aplicadas às espécies de mamíferos ameaçadas de extinção, permitirão que mais crias sejam obtidas, a partir dos animais selecionados e, dessa forma, poderão assegurar a diversidade genética, além de reduzir o intervalo entre gerações (Andrabi e Maxwell, 2007). De fato, alguns estudos em animais silvestres relataram a obtenção de crias vivas após fertilização in vitro e transferência de embriões como babuínos (Papio sp.), macacos rhesus (Macaca mulata), sagüis (Callithrix jacchus), gorilas (Gorilla gorilla), gatos-do-deserto-indiano (Felis silvestris ornata), jaguatiricas (Leopardus pardalis), tigres (Panthera tigris), ovelhas-vermelhas-da-Armênia (Ovis orientalis), búfalos (Bubalus bubalis), gauros (Bos gaurus), cervos-nobres (Cervus elaphus), lhamas (Llama glama) e linces-do-deserto (Caracal caracal) (Pope, 2000; Pope et al., 2000; Loskutoff, 2003). No entanto, embora seja inquestionável o potencial das biotecnologias reprodutivas, os esforços práticos estão associados a um sucesso ainda limitado no que diz respeito à proteção de espécies selvagens ameaçadas (Jewgenow e Paris,
2006). Estes resultados demonstram o potencial das TRAs para a conservação e manutenção de espécies ameaçadas, embora atualmente nenhuma espécie esteja sendo sistematicamente propagada por meio dessas técnicas (Pukazhenthi et al., 2006). Um dos entraves para a aplicação rotineira das TRAs em animais selvagens é a falta de conhecimento a respeito da fisiologia reprodutiva de grande parte dessas espécies. Portanto, a criopreservação de gametas representa uma alternativa importante a curto prazo para a preservação do material genético de animais ameaçados, incluindo os que vêm a óbito. Dessa forma, essa técnica poderá flexibilizar a utilização futura desse material em programas de reprodução assistida.
A preservação desses gametas pode ser realizada através da formação de bancos de germoplasma, os quais são unidades de conservação de material genético para uso imediato ou com potencial de utilização futura. Assim, os bancos de germoplasma têm como objetivo estabelecer uma determinada população por meio da criopreservação de recursos genéticos, como gametas, embriões, DNA, dentre outros (Andrabi e Maxwell, 2007). Além disso, aliado às biotecnologias da reprodução, esses bancos têm potencial para prevenir ou pelo menos amenizar a degradação da biodiversidade (Leibo e Songsassen, 2002). Outra vantagem do armazenamento de germoplasma é o fato de que os programas de melhoramento genético podem recorrer ao uso de gametas e embriões de animais que já não estão vivos ou que podem estar geograficamente separados por longas distâncias. Por esta razão, a implantação de bancos de recursos genéticos através da criopreservação tem sido proposta como um meio prático de apoio a programas de manejo genético de animais em cativeiro e pequenas populações (Holt e Lloyd, 2009). Neste sentido, a fundamentação do processo de criopreservação é apresentada a seguir.
Criopreservação
A criopreservação é uma técnica utilizada para preservar células em baixas temperaturas, geralmente em nitrogênio líquido (-196°C). Uma vez atingida esta temperatura, as reações químicas, processos biológicos e físicos, bem como atividades intra e extracelulares estão suspensas, podendo, teoricamente, o material criopreservado ser mantido por tempo indefinido (Bakhach, 2009).
A capacidade do material biológico de sobreviver ao processo de criopreservação depende de alguns fatores, como por exemplo, a tolerância à desidratação; o resfriamento e re-aquecimento (Gosden et al., 2002), como também exige a utilização de componentes que
confiram proteção às células sob baixas temperaturas, os quais são conhecidos como agentes crioprotetores (Tsai et al, 2008).
O processo de criopreservação de células e/ou tecidos, em geral, pode ser realizado por dois métodos: congelação lenta, também denominada convencional, e vitrificação. A congelação lenta é caracterizada pela exposição das células ou tecidos a baixas concentrações de agente crioprotetor, geralmente 1,5 M (Paynter et al., 2000), por um período que pode variar de 5 (Pinto et al., 2008) a 60 min (Candy et al., 1997). Nesse método, é utilizado um freezer programável, no qual o material é resfriado lentamente a uma velocidade de 2ºC/min até -4 a -9ºC, mantendo-se nesta temperatura por um curto período (10 a 15 min) para a estabilização térmica e realização da indução da formação do gelo extracelular ou seeding, o qual previne o super-resfriamento e a extrema desidratação celular (Oktay et al., 2001). Em seguida, a amostra passa a ser resfriada a taxas ainda mais baixas, geralmente 0,3ºC/min e, uma vez que a desidratação celular é suficientemente atingida (entre -30 a -140ºC), o material é imerso e estocado em nitrogênio líquido (-196°C). Facultativamente, entre as temperaturas de -30 a -80ºC, a velocidade de resfriamento poderá ser mais rápida, em torno de 10°C/min até atingir temperaturas muito abaixo de -100°C, para então, o material ser estocado em nitrogênio líquido. Após a estocagem, deve ser realizada a descongelação das amostras, seguida da remoção do agente crioprotetor, por uma ou sucessivas lavagens (Santos et al., 2008) do material biológico.
Apesar de a congelação lenta conservar a estrutura e função celular em baixas temperaturas, dois importantes fatores podem levar à morte das células quando não tratadas apropriadamente durante esse procedimento. Esses fatores são a formação de gelo intracelular e o choque osmótico (Stachecki e Cohen, 2004), os quais podem ser minimizados ou evitados pelo uso da vitrificação. Esse método utiliza uma taxa de resfriamento extremamente rápida, aliada à alta concentração de agentes crioprotetores, que ocasionam a formação de um estado vítreo do material criopreservado, evitando a indesejável formação de cristais de gelo (Huang et al., 2008), além de não necessitar da utilização de equipamentos sofisticados e de alto custo. No entanto, a alta concentração de crioprotetor utilizada, geralmente entre 4,0 a 6,0 M, aumenta a toxicidade, naturalmente observada, dessas substâncias (Stachecki e Cohen, 2004), podendo causar diminuição nas taxas de sobrevivência celular. Estudos comparando as técnicas de congelação lenta e vitrificação de tecido ovariano apresentam resultados controversos (Keros et al., 2009, Isachenko et al., 2009, Rahimi et al., 2010), não sendo possível, ainda, determinar qual método é mais eficiente para a criopreservação desse tecido.
Diante da importância de se preservar o material genético das espécies, além da criopreservação de sêmen, oócitos provenientes de folículos antrais e embriões, nos últimos anos, tem se destacado a criopreservação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais presentes em fragmentos de tecido ovariano. Oócitos maturos são mais sensíveis aos procedimentos de criopreservação, pois o resfriamento pode causar danos aos elementos do citoesqueleto, grânulos corticais, zona pelúcida (Vincent et al., 1990), membrana plasmática (Ruppert-Lingham, 2003), e ao núcleo, uma vez que esse se encontra em metáfase II e o fuso meiótico é facilmente danificado pela formação de gelo intracelular (Mandelbaum et al., 2004). Devido a essas dificuldades, verifica-se a importância da preservação do tecido ovariano, e consequentemente dos folículos contendo oócitos imaturos inclusos nesse tecido para posterior aplicação em programas de reprodução (Santos et al., 2008). Esses oócitos podem ser mais resistentes à criopreservação, por não possuírem ainda o fuso meiótico, já que se encontram na fase de prófase I, além de sua membrana ser mais permeável (Amorim et al., 2003). Os oócitos imaturos são encontrados envoltos por células foliculares constituindo os folículos pré-antrais, os quais representam a maior reserva de gametas femininos (Figueiredo et al., 2007).
Criopreservação de tecido ovariano
A congelação lenta é o método mais utilizado para a criopreservação de tecido ovariano (Amorim et al., 2003) em diferentes espécies. Como pode ser constatado na literatura, já foi possível recuperar a fertilidade após transplante de tecido ovariano previamente congelado (ovinos: Almodim et al., 2004; murinos: Liu et al., 2008), bem como a obtenção de nascimentos (ovino: Imhof et al., 2006; humano: Ernst et al., 2010; murino: Li et al., 2009). Entretanto, em animais selvagens, a utilização desta técnica limita-se a poucos estudos. Em sagüis-do-tufo-branco (Callithrix jacchus) foi observado que no tecido ovariano congelado com dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de 1,5 M, o número total de folículos pré-antrais e a proporção de folículos morfologicamente normais no tecido fresco (controle) não diferiram do tecido ovariano congelado, após o transplante do tecido para a cápsula renal de camundongos imunodeficientes (Candy et al., 1995). Gunasena et al. (1998) criopreservaram fragmentos de tecido ovariano de elefantes-africanos (Loxodonta africana) por congelação lenta, utilizando 1,4 M de DMSO. Após a descongelação e remoção do agente crioprotetor, os fragmentos foram transplantados para camundongas imunodeficientes, sendo observada, após dois meses, a presença de folículos antrais. Em outro estudo, fragmentos de
córtex ovariano de wombat (Vombatus ursinus) foram congelados em solução contendo 1,5 M de DMSO e 0,1 M de sacarose. Após descongelação e remoção dos crioprotetores, os fragmentos foram xenotransplantados para a capsula renal de ratas imunodeficientes. Dez semanas após o xenotransplante, foram encontrados nos tecidos ovarianos xenotransplantados, folículos pré-antrais em diferentes estádios de desenvolvimento. Esse resultado demonstra que a criopreservação de tecido ovariano de wombat tem potencial para fornecer oócitos maturos para uso em tecnologias de reprodução assistida, como a fertilização in vitro, injeção intracitoplasmática de espermatozóide e transferência nuclear (clonagem), que futuramente poderão ser aplicadas em espécies de marsupiais ameaçadas (Wolvekamp et al., 2001).
Assim como na congelação lenta, resultados satisfatórios com o nascimento de crias saudáveis foram obtidos após vitrificação de tecido ovariano de camundongas (Migishima et al., 2003) e ovelhas (Bordes et al., 2005). Entretanto, estudos com vitrificação de tecido ovariano para a conservação de espécies selvagens são também bastante escassos. Yeoman et. al. (2005) compararam essa técnica com a congelação lenta de tecido ovariano de primatas não-humanos do gênero Macaca. Neste estudo, foi observado um percentual de viabilidade folicular (aproximadamente 70%), em ambas as técnicas de criopreservação. Esse resultado foi ainda superior após co-cultivo dos fragmentos ovarianos com fibroblastos murinos inativados, aumentando a viabilidade para 90%.
Utilização de modelos experimentais para a reprodução de animais ameaçados
Independente da TRA a ser estudada em espécies ameaçadas de extinção, é absolutamente necessário a utilização de modelos experimentais, uma vez que a disponibilidade de animais ameaçados para aplicação em pesquisas científicas é extremamente restrita ou inexistente. Geralmente, animais domésticos ou não ameaçados que sejam filogeneticamente próximos às espécies selvagens são utilizados como modelos de estudo. No entanto, deve-se salientar que uma determinada técnica que funciona de forma eficiente em um modelo experimental, poderá exigir modificações para ser utilizada da mesma forma na espécie de interesse (Pukazhenthi et al., 2006).
Os gatos e cães domésticos, além de serem considerados animais de companhia, são também um modelo experimental bastante conveniente para estudos reprodutivos em animais selvagens. Gatos, por exemplo, têm sido utilizados para estudos com felídeos selvagens, como o lince-ibérico (Lynx pardinus) (Leon-Quinto et al., 2009), enquanto que cães são
normalmente usados para estudos em espécies de canídeos, como o cachorro-selvagem-africano (Lycaon pictus), o lobo-guará (Chrysocyon brachiurus) e o cachorro-vinagre (Speothos venaticus) (Farstad, 2000), devido ao pequeno número de exemplares dessas espécies em zoológicos e reserva. Além disso, a relação taxonômica entre canídeos e ursídeos (Bininda-Emonds et al., 1999), permite que o cão doméstico também seja utilizado como modelo para o desenvolvimento de biotécnicas de reprodução em ursos (Durrant et al., 2006). Além de cães, outras espécies de ursídeos não ameaçados, como o urso-negro (Ursus americanus), também podem ser utilizados como modelos experimentais, sugerindo que, no futuro, os cientistas poderão fazer uso de biotécnicas reprodutivas, como a criopreservação, para proteger a diversidade genética de espécies raras de ursídeos (Boone et al., 1999).
Da mesma forma, primatas não-humanos não ameaçados de extinção, têm sido normalmente utilizados como modelos experimentais clinicamente relevantes para a definição de protocolos relacionados às TRAs em humanos (Wolf, 2008). Além disso, podem servir como modelos tanto para a reprodução de espécies ameaçadas (Hewitson, 2004), como para biotécnicas que visem otimizar o potencial reprodutivo de animais mantidos em cativeiro, aumentando assim a sua disponibilidade para a pesquisa (Domingues, 2006). Dentre os primatas do velho mundo, as espécies mais utilizadas são macaco rhesus (Macaca mulata) (Hewitson, 2004) e o babuíno (Papio sp) (D’hooghe, 1997), enquanto as espécies de primatas neotropicais brasileiras mais utilizadas como modelo biológico são o saimiri (Saimiri sciureus), o sagui-do-tufo-branco (Callithrix jacchus) e o macaco-prego (Cebus apella) (Domingues, 2006).
O gambá-australiano (Trichosurus vulpecula) tem sido utilizado como modelo experimental no desenvolvimento de TRAs para marsupiais ameaçados de extinção, bem como para a produção de vacina para controle da fertilidade. A inseminação artificial tem sido realizada em gambás-australianos (Molinia et al., 2007), demonstrando que esta técnica é uma estratégia viável para a reprodução assistida de marsupiais, com implicações na conservação da espécie e no controle da população. Esse animal também tem sido utilizado no desenvolvimento de uma vacina contraceptiva, demonstrando o potencial da imunocontracepção, já que com a administração dessa vacina foi possível a obtenção do bloqueio do processo de fertilização, sem, no entanto, efeito sobre a foliculogênese (Duckworth et al., 2007). Outras espécies de marsupiais australianos não ameaçadas de extinção, como wombats (Vombatus ursinus e Lasiorhinus latifrons), também têm sido utilizadas como modelo em estudos de criopreservação de sêmen (Johnston et al., 2006) e tecido ovariano (Wolvekamp et al., 2001), com o objetivo de que essas técnicas possam ser
futuramente aplicadas em espécies de marsupiais ameaçados de extinção. Estudos sobre a reprodução de roedores silvestres também são de grande relevância, pois contribuem para otimizar a produção e a reprodução, além de possibilitar o estabelecimento de parâmetros que possam caracterizá-los como modelo biológico para pesquisas laboratoriais (Fortes et al., 2005). Dentre as espécies com esse potencial, podemos destacar a cutia (Dasyprocta aguti), que tem despertado o interesse de pesquisadores que visam à obtenção de modelos experimentais (Almeida et al., 2003), devido à sua facilidade de manejo e reprodução em cativeiro (Guimarães et al., 1997).
Considerações finais
O sucesso das biotecnologias da reprodução aplicadas às espécies ameaçadas de extinção ainda é limitado, uma vez que as informações acerca dos aspectos reprodutivos de grande parte dessas espécies são escassas. Por essa razão, a preservação de recursos genéticos através da criopreservação de tecido ovariano é uma importante alternativa para minimizar esse problema, pois permite a preservação da reserva folicular ovariana, mantendo a diversidade genética de populações por longos períodos em bancos de germoplasma, até que essas biotécnicas possam ser aplicadas de maneira prática. Dessa forma, no futuro, os folículos criopreservados poderão ser cultivados in vitro ou mesmo transplantados para animais imunodeficientes, gerando assim oócitos fertilizáveis, permitindo uma maior flexibilidade à aplicação das TRAs. Contudo, devido ao número reduzido de animais disponíveis para pesquisas científicas, a utilização de modelos experimentais apresenta-se como valiosa ferramenta para o desenvolvimento de protocolos de criopreservação, bem como para as demais biotécnicas reprodutivas.
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