UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
LARISSA ALVES LOPES
IMOBILIZAÇÃO DE UMA PEROXIDASE DE RAÍZES DE Moringa oleifera LAM. (MoPOX) EM ESFERAS DE QUITOSANA E SEU POTENCIAL NA DEGRADAÇÃO
DE CORANTES TÊXTEIS
FORTALEZA 2019
LARISSA ALVES LOPES
IMOBILIZAÇÃO DE UMA PEROXIDASE DE RAÍZES DE Moringa oleifera LAM. (MoPOX) EM ESFERAS DE QUITOSANA E SEU POTENCIAL NA DEGRADAÇÃO DE
CORANTES TÊXTEIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.
Orientador: Profa. Dra. Daniele de Oliveira Bezerra de Sousa.
Coorientador: Dra. Helen Paula Silva da Costa.
FORTALEZA 2019
LARISSA ALVES LOPES
IMOBILIZAÇÃO DE UMA PEROXIDASE DE RAÍZES DE Moringa oleifera LAM. (MoPOX) EM ESFERAS DE QUITOSANA E SEU POTENCIAL NA DEGRADAÇÃO DE
CORANTES TÊXTEIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.
Aprovada em: ___/___/______.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Profa. Dra. Daniele de Oliveira Bezerra de Sousa (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Profa. Dra. Luciana Rocha Barros Gonçalves
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Profa. Dra. Maria Izabel Florindo Guedes
A Deus.
AGRADECIMENTOS
A Deus, porque até aqui Ele tem me sustentado e me dado forças e ânimo para continuar.
À minha mãe por todo o apoio que sempre me deu. Mesmo em momentos de dificuldade, ela sempre lutou para me dar o melhor. Sem todo esse apoio e incentivo eu não teria tido a coragem para enfrentar os obstáculos da vida. Agradeço também por todas as vezes que me acompanhou nos fins de semana de experimentos.
À minha irmã Lucieuda por ter sido um exemplo a ser seguido. Grande parte dos meus sonhos eu realizei com sua ajuda e seu apoio. Me motivei ao ver seu esforço e seu exemplo e sou muito grata por ter uma irmã como você.
Aos meus tios queridos que sempre cuidaram de mim como se fosse uma filha e que sempre lutaram para que eu pudesse ter um bom ensino.
Aos meus sobrinhos por me alegrarem mesmo em momentos de cansaço.
Aos meus primos e demais familiares por toda a compreensão quando eu não podia passar muito tempo nas festas de família ou quando ia à praia levando meus livros.
Aos meus amigos Weyner e Fernanda que têm estado comigo nos últimos 15 anos, passando por muitas etapas da vida ao meu lado. Conquistei o título do bacharelado na presença deles e hoje, continuam comigo em mais essa conquista.
Aos meus amigos da graduação, em especial ao Jorge e à Virgínia, que conviveram comigo diariamente durante 5 anos e que trouxeram leveza e alegria mesmo nos períodos mais difíceis da faculdade.
Aos meus amigos do intercâmbio, Fernando, Lidiana, Sarinha, Lidiene, Júlio, Ana, Jonas e Débora, com quem eu sempre mantenho contato e os quais me ajudaram em muitos momentos.
Aos meus professores, desde a educação infantil, por terem me ensinado com tanto amor e por terem me inspirado e incentivado.
À Helen, uma pessoa com um coração enorme e sempre disposta a ajudar. Me adotou no laboratório e me ensinou muita coisa mesmo nesse pouco tempo de convivência. Abraçou minhas ideias e me impulsionou. Além disso, aguentou meus momentos ruins e comemorou comigo nos momentos bons. Esse trabalho é dela também!
Ao Lucas, por ter me ajudado diversas vezes, tanto com os experimentos quanto na escrita dos trabalhos e artigos. Fez muitas cromatografias comigo, inclusive em feriados. Sou muito grata por todo o apoio.
À Amanda, minha eterna IC, por ter carregado tantos litros de água e tantos quilos de areia comigo. Por ter me ajudado tanto logo quando entrei no mestrado e também pela ajuda nessa fase final do mestrado.
À minha orientadora, professora Daniele, por ter me acolhido no seu laboratório mesmo sem me conhecer muito bem. Me recebeu de braços abertos e se dispôs a me ajudar e orientar desde o princípio. Meu muito obrigada por todos os conselhos, sugestões e ensinamentos ao longo desses anos.
Ao professor Tadeu, por ter colaborado grandemente com o trabalho, dando diversas sugestões importantes e que me ajudaram a concluir esse trabalho.
Aos meus queridos amigos do Labtox (Xavier, Tiago, Eva, Cláudia, Luiz, Nadine, Marina e Ana Paula) os quais foram mais que companheiros de laboratório. Estivemos juntos praticamente diariamente nos últimos anos, dentro e fora do laboratório, e me ajudaram em muitos momentos
Ao pessoal do Bioprospec por terem disponibilizado a estrutura para a realização de experimentos e por toda a ajuda oferecida.
À equipe do LPVD por ter cedido material e equipamentos em vários momentos. Aos membros da banca examinadora, por terem aceitado o convite para estarem dando suas contribuições ao trabalho.
À Universidade Federal do Ceará (UFC) - Laboratório de Toxinas Vegetais (Coordenação da Dra. Daniele de Oliveira Bezerra de Sousa) e Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa (Coordenação do Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira).
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), através da concessão de auxílio financeiro para realização do presente trabalho.
À Central Analítica da Universidade Federal do Ceará (UFC) – pela disponibilidade do microscópio eletrônico de varredura.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
“A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos outros dez.” (George Bernard Shaw)
RESUMO
A indústria têxtil representa um dos setores mais lucrativos da economia mundial, tendo o Brasil um papel de destaque nesse cenário. No entanto, esse setor industrial é responsável pela geração de problemas ambientais graves, sobretudo decorrentes do despejo indevido de efluentes com alta carga poluidora, rica especialmente em corantes têxteis. Nesse contexto, surge a necessidade de métodos que sejam capazes de degradar esses compostos como, por exemplo, através do uso de enzimas. Dentre as várias classes de enzimas existentes, oxidoredutases como as peroxidases têm sido empregadas na biorremediação de efluentes têxteis. Uma peroxidase de classe III, purificada a partir de raízes de Moringa oleifera e denominada MoPOX foi imobilizada em esferas de quitosana ativadas por glutaraldeído e utilizada para a descoloração de corantes têxteis. A microscopia eletrônica de varredura foi utilizada para caracterizar a imobilização da MoPOX. MoPOX imobilizada também foi caracterizada para parâmetros como pH ótimo, temperatura ótima, estabilidade térmica, efeito de íons metálicos e especificidade do substrato. Os resultados mostraram que o pH ótimo foi de 5,2, o mesmo valor encontrado para a enzima solúvel. A temperatura ótima para MoPOX imobilizada foi 30 ºC, diferente do valor da enzima solúvel (70 ºC), e a enzima imobilizada apresentou maior estabilidade térmica. O valor da constante cinética aparente (Km) da MoPOX imobilizada foi 14,67 mM, inferior ao da MoPOX solúvel. A enzima imobilizada também foi altamente inibida na presença de DTT e tem ampla especificidade de substrato, como observado para a enzima solúvel. A atividade de MoPOX imobilizada diminuiu lentamente contra o tempo quando comparado com MoPOX solúvel, e pôde reter 40% de atividade residual após 5 ciclos consecutivos. Quanto ao potencial para descoloração, este foi aumentado após a imobilização. Para os corantes têxteis Telon® Turquesa M-5G 85%, Astrazon® vermelho, Remazol® azul, Remazol® marinho RGB e Levafix® laranja, as taxas de descoloração com a enzima solúvel foram de 60%, 14%, 65%, 26% e 10%, respectivamente. Estas taxas foram aumentadas para 80%, 38%, 83%, 82,5% e 65% quando se utilizou MoPOX imobilizada. MoPOX não apresentou toxicidade para Artemia salina. Os resultados indicam um uso promissor de MoPOX imobilizada como agente de biorremediação.
ABSTRACT
The textile industry is one of the most profitable sectors in the world economy, with Brazil playing a leading role in that scenario. However, the industrial sector is also responsible for the generation of environmental problems, especially with regard to the discharge of effluents with high pollution load, particularly rich in textile dyes. In this context, there is a need for methods that are able to degrade these compounds, for example, through the use of enzymes. Within the existing classes of enzymes, oxidoreductases such as peroxidases have been used in the bioremediation of textile effluents. A class III peroxidase purified from Moringa oleifera roots and denominated MoPOX was immobilized onto glutaraldehyde activated chitosan beads by crosslinking and used for textile dye decolorization. Scanning electron microscopy was used to characterize MoPOX immobilization. Immobilized MoPOX was also characterized for parameters such as optimum pH and temperature, thermo stability, effect of inhibitors, effect of metal ions and substrate specificity. The results showed that the optimum pH was 5.2, the same value found for the free enzyme. The optimum temperature for immobilized MoPOX was 30 ºC, which was different from the value for free enzyme (70 ºC), and the immobilized enzyme presented a higher thermo stability. The apparent kinetic constant value (Km) of immobilized MoPOX was 14.67 mM, lower than that for free MoPOX. The immobilized enzyme was also highly inhibited in the presence of DTT and has broad substrate specificity, as observed for free enzyme. The activity of immobilized MoPOX decreased in inspite of free MoPOX, and could retain 40% residual activity after 5 consecutive cycles. The potential for decolorization was increased after immobilization. For the textile dyes Telon® Turquoise M-5G 85%, Red Astrazon®, Remazol® blue, Remazol® navy RGB and Levafix® orange the decolorization rates using free enzyme were 60%, 14%, 65%, 26% and 10%, respectively. These rates were increased to 80%, 38%, 83%, 82.5% and 65% when using immobilized MoPOX. MoPOX showed no toxicity towards Artemia salina nauplii. The results indicate a promising use of immobilized MoPOX as a bioremediation agent.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 − Processo produtivo do setor têxtil ... 21
Figura 2 − Exemplo da interação iônica entre o corante têxtil (D) e os grupos amino da fibra da lã ... 22
Figura 3 − Exemplo da interação de hidrogênio entre o corante sulfonado e os grupos carboxilas da fibra de lã ... 23
Figura 4 − Exemplo da interação covalente entre um corante contendo grupos reativos e grupos hidroxila presentes na celulose da fibra de algodão ... 23
Figura 5 − Representação esquemática dos papéis desempenhados por peroxidases no metabolismo vegetal ... 28
Figura 6 − Estrutura molecular da quitosana ... 33
Figura 7 − Moringa oleifera LAM ... 37
Figura 8 − Fases da germinação de Moringa oleifera Lamarck ... 38
Figura 9 − Atividade peroxidásica de raízes de Moringa oleifera submetidas ao plantio em diferentes substratos ... 51
Figura 10 − Etapas cromatográficas para a purificação do MoPOX ... 54
Figura 11 − Espectro MALDI-MS de MoPOX obtida na faixa de 10-100 kDa ... 56
Figura 12 − Efeito da concentração de glutaraldeído na atividade enzimática de MoPOX imobilizada ... 58
Figura 13 − Efeito do tempo de ativação (crosslinking) das esferas de quitosana com glutaraldeído na atividade enzimática de MoPOX imobilizada ... 59
Figura 14 − Efeito do tempo de contato de MoPOX com as esferas de quitosana ... 61
Figura 15 − Efeito da concentração de enzima solúvel na atividade enzimática ... 62
Figura 16 − Eletromicrografias das esferas de quitosana com MoPOX imobilizada ... 66
Figura 17 − pH óptimo de atividade de MoPOX imobilizada ... 68
Figura 18 − Temperatura ótima de atividade de MoPOX imobilizada ... 71
Figura 20 − Efeito de inibidores sobre a atividade catalítica de MoPOX ... 74
Figura 21 − Atividade de MoPOX na presença de diferentes substratos ... 76
Figura 22 − Efeito de íons metálicos na atividade peroxidásica de MoPOX imobilizada ... 78
Figura 23 − Gráficos de Michaelis-Menten e de Lineweaver-Burk ... 80
Figura 24 − Potencial de descoloração de soluções de corantes têxteis por MoPOX ... 81
Figura 25 − Capacidade de reuso operacional de MoPOX ... 84
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 − Rendimento das diferentes formas de cultivo em termos de massa fresca de raíz ... 52
Tabela 2 − Tabela de purificação de MoPOX ... 55 Tabela 3 − Atividade enzimática residual de MoPOX, solúvel e imobilizada, após o
período de armazenamento na temperatura de 4 ºC e 20 ºC pelo período de 120 dias ... 64
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 17 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 20 2.1 Indústria Têxtil ... 20 2.2 Corantes têxteis ... 22 2.3 Peroxidases ... 26 2.4 Imobilização de enzimas ... 29 2.4.1 Técnicas de imobilização ... 29 2.4.1.1 Adsorção ... 29 2.4.1.2 Ligação covalente ... 30 2.4.1.3 Afinidade ... 30
2.4.2 Suportes para imobilização ... 31
2.4.2.1 Quitosana ... 32
2.5 Moringa oleifera Lamarck ... 33
3 HIPÓTESE ... 39 4 OBJETIVOS ... 39 4.1 Objetivo Geral ... 39 4.2 Objetivos Específicos ... 39 5 MATERIAL E MÉTODOS ... 40 5.1 Material ... 40
5.2 Germinação das sementes ... 40
5.3 Determinação das condições de plantio ... 40
5.4 Obtenção do extrato bruto ... 41
5.5 Quantificação de proteínas ... 41
5.6 Cromatografia de troca iônica ... 41
5.7 Cromatografia de exclusão molecular ... 42
5.8 Determinação da massa molecular por espectrometria de massas ... 42
5.9 Atividade peroxidásica ... 42
5.10 Eletroforese ... 43
5.11 Imobilização da MoPOX ... 43
5.11.1 Preparo das esferas de quitosana ... 43
5.11.3 Imobilização da MoPOX nas esferas de quitosana ... 44
5.11.4 Análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 44
5.12 Armazenamento de MoPOX ... 45
5.13 Caracterização Bioquímica ... 45
5.13.1 Determinação do pH ótimo ... 45
5.13.2 Temperatura ótima e termoestabilidade ... 45
5.13.3 Efeito de inibidores na atividade enzimática ... 46
5.13.4 Determinação da atividade catalítica na presença de diferentes substratos .... 46
5.13.5 Determinação da atividade catalítica na presença de diferentes íons metálicos ... 46
5.13.6 Parâmetros cinéticos ... 46
5.14 Ensaios de degradação de corantes têxteis ... 47
5.14.1 Corantes têxteis ... 47
5.14.2 Ensaio de degradação dos corantes têxteis ... 47
5.14.3 Reuso da enzima imobilizada nas esferas de quitosana ... 48
5.15 Ensaio de ecotoxicidade ... 48
5.16 Estatística ... 48
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 49
6.1 Forma de plantio e atividade peroxidásica ... 49
6.2 Purificação de MoPOX ... 49
6.3 Determinação da massa molecular ... 53
6.4 Imobilização da MoPOX ... 57
6.4.1 Ativação das esferas de quitosana através do tratamento com glutaraldeído .. 57
6.4.2 Imobilização de MoPOX nas esferas de quitosana ... 60
6.4.3 Armazenamento de MoPOX ... 63
6.4.4 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 65
6.5 Caracterização bioquímica ... 67
6.5.1 Determinação do pH ótimo ... 67
6.5.2 Temperatura ótima e termoestabilidade ... 69
6.5.3 Efeito de inibidores na atividade enzimática ... 73
6.5.4 Determinação da atividade na presença de diferentes substratos ... 75
6.5.5 Determinação da atividade na presença de diferentes íons metálicos ... 77
6.6 Degradação de corantes têxteis ... 79
6.7 Reuso operacional ... 83
6.8 Ensaio de ecotoxicidade ... 83
7 CONCLUSÃO ... 86
