Anestesia com óleo essencial de Lippia alba seguida de atordoamento elétrico ou hipotermia: impacto sobre indicadores de estresse e qualidade da carne de Jundiá (Rhamdia quelen)

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DOS ALIMENTOS. Juliana Cristina Veit. ANESTESIA COM ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia alba SEGUIDA DE ATORDOAMENTO ELÉTRICO OU HIPOTERMIA: IMPACTO SOBRE INDICADORES DE ESTRESSE E QUALIDADE DA CARNE DE JUNDIÁ (Rhamdia quelen). Santa Maria, RS 2016.

(2) Juliana Cristina Veit. ANESTESIA COM ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia alba SEGUIDA DE ATORDOAMENTO ELÉTRICO OU HIPOTERMIA: IMPACTO SOBRE INDICADORES DE ESTRESSE E QUALIDADE DA CARNE DE JUNDIÁ (Rhamdia quelen). Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia dos Alimentos, Área de Concentração em Ciência e Tecnologia de Alimentos, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciência e Tecnologia dos Alimentos.. Orientador: Profa. Dra. Tatiana Emanuelli. Santa Maria, RS 2016.

(3) FICHA CATALOGRÁFICA. © 2016 Todos os direitos autorais reservados a Juliana Cristina Veit. A reprodução de partes ou do todo deste trabalho só poderá ser feita mediante a citação da fonte. Endereço: Avenida Roraima, n. 1000, Bairro Camobi, Santa Maria, RS. CEP: 97105-900 Fone (0xx)55 3220 8547; e-mail:juliana_veit@hotmail.com.

(4) Juliana Cristina Veit. ANESTESIA COM ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia alba SEGUIDA DE ATORDOAMENTO ELÉTRICO OU HIPOTERMIA: IMPACTO SOBRE INDICADORES DE ESTRESSE E QUALIDADE DA CARNE DE JUNDIÁ (Rhamdia quelen). Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia dos Alimentos, Área de Concentração em Ciência e Tecnologia de Alimentos, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciência e Tecnologia dos Alimentos.. Aprovado em 15 de abril de 2016.. Santa Maria, RS 2016.

(5) DEDICATÓRIA. Dedico esta tese ao meu esposo Eduardo, por todo seu amor, carinho e apoio em todos os momentos desta jornada, à minha família por todo o amor e a tudo que representam para mim. Dedico também ao meu sogro Clodomir e minha sogra Cladir e à sua família por todo seu apoio, amor e cuidados comigo ao longo destes quatro anos..

(6) AGRADECIMENTOS Aos meus pais Antônio e Vera e às minhas irmãs Vanessa e Camila pela família linda e unida que formamos, pelos seus exemplos de superação, por me amarem e apoiarem nas minhas escolhas e por serem tudo de mais valioso que tenho. Tudo o que sou devo a vocês. Ao meu sobrinho Murilo por ser a criança linda que é, por tornar minha vida mais feliz e cheia de amor. Ao meu cunhado Fabricio pelo exemplo de ser humano que é e por cuidar tão bem da minha irmã e meu sobrinho. Ao meu marido Eduardo, por ser meu porto seguro, meu amigo e parceiro de vida, por ter me apoiado nessa “aventura maluca” e jornada incrível, que me amou e acalmou nos momentos mais difíceis, mesmo estando a quase setecentos quilômetros de distância. Ao meu sogro Clodomir e minha sogra Cladir por me acolherem em seu lar, por me amarem e me cuidarem como uma filha, pela família linda que construíram e por permitirem que eu faça parte dela. À minha cunhada Karen por ser uma “irmã” e amiga amável, por me aconselhar e me ajudar sempre que precisei. À minha cunhada Camila e seu marido Thiago por seu amor, apoio e conselhos, pela família linda e exemplar que têm, e por me proporcionarem a alegria de ser tia dos lindos e cheios de vida e personalidade Murilo e Cecília. Ao meu cunhado Cristiano e sua esposa Nubia, pelo seu exemplo de superação, por me ensinarem a nunca desistir dos sonhos, por me proporcionarem o privilégio de ser tia das princesas Caroline e Aline. Serei eternamente grata por tudo que me ensinaram e fizeram e fazem por mim. Minha eterna gratidão para à admirável orientadora Profa. Tatiana Emanuelli. Por ser uma pessoa generosa, compreensiva e amável e uma profissional ética e responsável. Tu és um grande exemplo para todos ao seu redor e me sinto privilegiada por ter sido sua orientada e convivido contigo esses quatro anos. Serei eternamente grata por ter lhe conhecido e trabalhado contigo. Às minhas queridas amigas e companheiras de labuta e de vida Jaqueline Piccolo, Sabrina Somacal, Andreia Quatrin, Luana Maurer, Cristine Rampelotto, Bruna Milbradt, Carol Speroni, Bruna Klein, Lauren Ferreira, Grasi Facco, Aline Scherer, Isadora Machado, Lisiane Conte, Amanda Ruviaro, Ana Paula Daniel, Vivian Bochi, Cassiele Figueiredo, Marcelle Peres, Janaina Schwerz, Dariane Trivisiol, Natalia Minuzzi, Renata Fritzsche e ao amigo Miguel Roehrs pelos momentos de descontração, pelas palavras de carinho, amizade, parceria e ajuda na execução deste projeto. Aos amigos e companheiros de laboratório Ana Burin, Flavia Stefanello, Diego Vargas, Francielle Trombetta, Luciano Ritt, Patrícia Fonseca e Gustavo Argenta, pela amizade, pelos mates, risadas e trocas de experiência. À todos os colegas que passaram e ou estão trabalhando no NIDAL, agradeço as palavras de carinho e pela amizade e convivência tão agradável durante esses anos. Aos professores do DCTA e do PPGCTA pelos ensinamentos e amizade, e aos colegas do doutorado pelo convívio e amizade durante as aulas. Ao Programa de Pósgraduação em Tecnologia e Ciência dos Alimentos da UFSM, por possibilitar a realização deste trabalho..

(7) Ao Prof. Bernardo Baldisserotto, à Profa. Berta Maria Heinzmann, à Profa. Vania Lucia Loro, à Pós-doutoranda Charlene Menezes, à doutoranda Gessi Koakoski e ao Prof. Leonardo José Gill Barcellos, à mestranda Gabriela Poletto, ao Prof. Cristiano Ragagnin Menezes e ao Prof. Renius Mello pelas contribuições na realização dos trabalhos e artigos. À Profa. Doutora Leila Picolli da Silva e seus alunos por toda a ajuda ao longo destes anos. Ao Carlos Rubini Junior pelo seu trabalho na injeção das minhas amostras no cromatógrafo gasoso (CG) e por toda a ajuda na execução dos experimentos. Ao Luiz Fernando Guarenti Martins e ao Fernando Coelho de Faria Correa do Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento em Engenharia Elétrica por construírem o equipmaneto elétrico utilizado nos experimentos. Muito obrigada! Aos membros da banca, Profa. Elisabete Maria Macedo Viegas, Profa. Juliana Antunes Galvão, Prof. Ernesto Hashime Kubota, Profa. Ana Paula de Lima Veeck, Profa. Leila Picolli da Silva e Dra. Vivian Caetano Bochi por terem aceitado o convite, pela análise e contribuições deste trabalho. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) pela concessão da bolsa para o desenvolvimento deste trabalho. A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, especialmente ao Pai Celestial pela benção da vida e por conduzir meus passos pelos caminhos corretos e colocar em minha vida pessoas especiais..

(8) “Há três caminhos para o fracasso: não ensinar o que se sabe, não praticar o que se ensina, e não perguntar o que se ignora”. (São Beda).

(9) RESUMO Tese de Doutorado Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia dos Alimentos Universidade Federal de Santa Maria ANESTESIA COM ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia alba SEGUIDA DE ATORDOAMENTO ELÉTRICO OU HIPOTERMIA: IMPACTO SOBRE INDICADORES DE ESTRESSE E QUALIDADE DA CARNE DE JUNDIÁ (Rhamdia quelen) AUTORA: JULIANA CRISTINA VEIT ORIENTADORA: TATIANA EMANUELLI Este trabalho teve como objetivo otimizar o atordoamento elétrico para jundiás e avaliar se a anestesia com óleo essencial (OE) de L. alba antes do atordoamento elétrico ou hipotermia, na etapa de insensibilização pré-abate, reduz o estresse e influência a estabilidade e características sensoriais do pescado. Foram avaliadas frequências elétricas entre 50 e 1000 Hz, força de campo elétrico de 128 ou 256 V m -1 e tempo de exposição a corrente entre 1 e 60 segundos. As frequências elétricas de 100, 300 e 500 Hz, combinadas com a força de campo elétrico de 128 V m-1 durante 5 segundos foram as combinações elétricas mais adequadas para a insensibilização pré-abate de jundiás, uma vez que contribuíram para maior duração do atordoamento aparente, menores níveis de glicose e lactato e menor alteração nas características da carne comparadas às demais. A anestesia com OE (300 mg L-1) não reduziu os níveis de marcadores bioquímicos de estresse dos jundiás, entretanto, comparado aos peixes não anestesiados, retardou a perda de frescor e deterioração do pescado conservado em gelo, já que atrasou a degradação do ADP em AMP e a formação de inosina, e contribuiu para menor pontuação de demérito na avaliação sensorial do odor dos peixes e das brânquias, firmeza da região ventral e no esquema TFRU, especialmente quando associado ao atordoamento elétrico. Além disso, os peixes não anestesiados estavam inaceitáveis para o consumo no 23° dia de armazenamento refrigerado, enquanto que os peixes anestesiados tornaram-se inaceitáveis somente no 33° dia. O OE também apresentou atividade antimicrobiana contra espécies da família Enterobacteriaceae, porém, quando utilizado antes da insensibilização por hipotermia não impediu as alterações oxidativas post mortem nos filés congelados, e potencializou a oxidação lipídica dos filés congelados quando associada ao atordoamento elétrico. O atordoamento por hipotermia não modificou as alterações post mortem do pescado estocado em gelo, porém os filés dos peixes submetidos à hipotermia apresentaram maior oxidação de grupos sulfidrila e carbonilação de proteínas com consequente redução da luminosidade e aumento na intensidade da cor amarela durante o congelamento, o que também pode ter influenciado na maior diferença total de cor, e maior elasticidade dos filés ao longo dos 18 meses de armazenamento congelado em relação ao atordoamento elétrico. Em contrapartida, o atordoamento elétrico resultou em instalação mais rápida do rigor mortis quando comparado à hipotermia, mas não acelerou a resolução do rigor mortis nem a degradação do ATP dos peixes inteiros armazenados em gelo. O atordoamento elétrico favoreceu a geração de hidroperóxidos no final do período de estocagem congelada dos filés, e resultou em maior intensidade da cor vermelha no início do armazenamento comparado à hipotermia. Dessa forma, o atordoamento elétrico, utilizando um campo elétrico de 128 V m-1 combinado à frequência elétrica de 300 Hz durante 5 segundos, pode ser utilizado na insensibilização pré-abate de jundiás, já que não apresentou qualquer efeito negativo na estabilidade post mortem do pescado refrigerado ou dos filés congelados em comparação com a hipotermia. Além disso, a anestesia prévia com 300 mg L-1 de OE de L. alba também pode ser utilizada nessa etapa do processamento do pescado, especialmente para os peixes conservados inteiros em gelo.. Palavras-chave: Eletronarcose. Lippia alba. Óleo essencial. Anestesia. Escore sensorial. Frescor. Oxidação. Rhamdia quelen..

(10) ABSTRACT Doctoral Thesis Graduate Program on Food Science and Technology Federal University of Santa Maria ANESTHESIA WITH ESSENTIAL OIL OF Lippia alba FOLLOWED BY ELECTRICAL STUNNING OR HYPOTHERMIA: IMPACT ON INDICATORS OF STRESS AND MEAT QUALITY OF SILVER CATFISH (Rhamdia quelen) AUTHOR: JULIANA CRISTINA VEIT ADVISER: TATIANA EMANUELLI This study aimed to optimize the electrical stunning for silver catfish and to evaluate whether the anesthesia with essential oil (EO) of L. alba before electrical stunning or hypothermia, used in pre-slaughter stunning stage, would reduce stress and influence on stability and sensory characteristics of fish produtcts. The effect of electrical frequencies between 50 and 1000 Hz associated to 128 or 256 V m-1 electric field strength and duration of exposure to the current between 1 and 60 seconds were evaluated. The electrical frequencies of 100, 300 and 500 Hz, combined with electric field strength of 128 V m-1 during 5 seconds were the most appropriate electrical combinations for pre-slaughter stunning of silver catfish as they yielded longer apparent stunning, lower levels of glucose and lactate and smaller changes in flesh characteristics compared to the others. Anesthesia with EO (300 mg L-1) did not reduce the biochemical markers of stress in silver catfish. However, compared to nonanesthetized fish, anesthesia did delay the loss of freshness and deterioration of chilled fish as it delayed the degradation of ADP to AMP and the generation of inosine, and contributed to reduce the sensory demerit scores for overall and gills odor, belly firmness and whole TFRU scheme, especially when associated with the electrical stunning. Furthermore, non-anesthetized fish were unacceptable for consumption on the 23rd day of chilled storage, whereas anesthetized fish become unacceptable only on the 33 rd day. The EO also showed antimicrobial activity against Enterobacteriaceae species, however, when used before hypothermia the EO anesthesia did not prevent the post mortem oxidative changes in the frozen fillets, and potentialized lipid oxidation of frozen fillets when associated with electrical stunning. Hypothermia stunning did modify post mortem changes of fish stored in ice, however fillet from fish submitted to hypothermia had greater oxidation of sulfhydryl groups and protein carbonylation with consequent reduction in lightness and increase in yellowness along frozen storage, which may be responsible for the greater total color difference and increased elasticity of fillets over 18 months of frozen storage compared to electrical stunning. In contrast, electrical stunning resulted in faster onset of rigor mortis than hypothermia but did not accelerate the resolution of rigor mortis or the degradation of ATP in whole fish stored in ice. In addition, electrical stunning favored the generation of hydroperoxides in fillets by the end of frozen storage, as well as more intense red color at the beginning of storage. Thus, electrical stunning with 128 V m-1 electric field strength combined with 300 Hz frequency during 5 seconds, can be used in the pre-slaughter stunning of silver catfish as it was less stressful for fish than hypothermia and did not have any negative effect on the post mortem stability of chilled fish or frozen fillets compared to hypothermia. In addition, prior anesthesia with 300 mg L-1 of EO of L. alba may also be used in this step of the fish processing, especially for whole fish stored in ice.. Keywords: Electrical stunning. Lippia alba. Essential oil. Anesthesia. Sensory score. Freshness. Oxidation. Rhamdia quelen..

(11) LISTA DE ILUSTRAÇÕES INTRODUÇÃO Figura 1 – Lippia alba (Mill.) N.E. Brown .................................................................................. 25 Figura 2 – Principais reações da oxidação lipídica....................................................................... 29 Figura 3 – Reações envolvidas na oxidação proteica em sistemas cárneos ................................. 30 Figura 4 – Exemplar de jundiá (Rhamdia quelen) ........................................................................ 33 ARTIGO 1 Figura 1 – Texture profile of fillets from silver catfish submitted to electrical stunning for 5 s ...................................................................................................................................................... 72 Figura 2 – pH of fillets from silver catfish (R. quelen) submitted to electrical stunning for 5 s .. ...................................................................................................................................................... 73 Figura 3 – Biplot for silver catfish (R. quelen) submitted to electrical stunning for 5 s by canonical variables indicators of apparent stun duration, stress and fillet properties .................. 74 Figura 4 – Effect of increasing exposure time to 128 V m-1 (300 Hz) on the spinal fracture (A) and hemorrhaging score in catfish fillets (B) ............................................................................... 75 MANUSCRITO 1 Figura 1 – Schematic experimental design ................................................................................... 93 Figura 2 – Rigor mortis index (a) and muscle pH (b) during ice storage of silver catfish exposed to different pre-slaughtering procedures ........................................................................ 94 Figura 3 – Effect of different pre-slaughter procedures on the degradation of nucleotides in the muscle of silver catfish during ice storage: water (control) (a) and anesthesia with EO of L. alba (b). .................................................................................................................................... 95 Figura 4 – Effect of different pre-slaughter procedures on mesophilic (a), psychrotrophic (b), Enterobacteriaceae (c), and pseudomonas counts (d) of silver catfish during ice storage .......... 96 Figura 5 – Effect of different pre-slaughter procedures on the sensory quality of silver catfish during storage in ice: TFRU sensory score (a), belly firmness (b), general odor (c and d) and gills odor (e and f) ........................................................................................................................ 97 MANUSCRITO 2 Figura 1 – Effect of pre-slaughtering procedures on the changes in conjugated dienes value (A), peroxide value (B) and TBARS value (C) of fish fillets during frozen storage ................... 128 Figura 2 – Effect of pre-slaughtering procedures on total sulfhydryl (A) and protein carbonyl (B) content of fish fillets during frozen storage ........................................................................... 129 Figura 3 – Effect of pre-slaughtering procedures on lightness (pooled data from 0 and 18 months) (A) and total color difference (B) of fish fillets during frozen storage .......................... 130 Figura 4 – Effect of pre-slaughtering procedures on texture changes in fish fillets during frozen storage: hardness (A), springiness (B) and cohesiveness (C and D) of silver catfish fillets during frozen storage .......................................................................................................... 131.

(12) LISTA DE TABELAS ARTIGO 1 Tabela 1 – Duration of apparent stun of silver catfish submitted to electrical stunning for 5 s ...68 Tabela 2 – Plasma markers of stress for silver catfish submitted to electrical stunning for 5 s .......................................................................................................................................................69 Tabela 3 – Spinal fracture and fillet hemorrhaging scores for silver catfish submitted to electrical stunning for 5 s ..............................................................................................................70 Tabela 4 – Instrumental color of silver catfish fillets exposed to 128 V m-1 (300 Hz) for increasing time ..............................................................................................................................71 MANUSCRITO 1 Tabela 1 – Water quality during the pre-slaughtering procedures ................................................91 Tabela 2 – Blood markers and muscle glycogen of silver catfish exposed to different preslaughtering procedures ................................................................................................................92 MANUSCRITO 2 Tabela 1 – Water quality in tanks used for the pre-slaughtering procedures ................................123 tabela 2 – Effect of pre-slaughtering procedures on the changes in instrumental color coordinates of fish fillets during frozen storage............................................................................124 Tabela 3 – Effect of pre-slaughtering procedures on sensory changes of fish fillets during frozen storage ................................................................................................................................125.

(13) LISTA DE ABREVIATURAS ADP – Adenosina 5’-difosfato AMP – Adenosina 5’-monofosfato ANOVA – Análise de variância ATP – Adenosina trifosfato BVT – Bases voláteis totais DC – Dienos conjugados HxR – Inosina IMP – Inosina 5’-monofosfato MDA – Malondialdeído OD – Oxigênio dissolvido OE – Óleo essencial de L. alba OTMA – Óxido de trimetilamina EROs – Espécies reativas de oxigênio TBARS – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TFRU – Unidade de Pesquisa em Alimentos da Tasmânia TMA – Trimetilamina VP – Valor de peróxidos SNS – Sistema nervoso simpático HPI - Hipotálamo-pituitária-inter-renal.

(14) SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 15 1.1 SENCIÊNCIA E BEM-ESTAR DE PEIXES .................................................................... 15 1.2 ESTRESSE EM PEIXES ................................................................................................... 17 1.3 MÉTODOS DE INSENSIBILIZAÇÃO E ABATE DE PEIXES ..................................... 18 1.3.1 Atordoamento elétrico .................................................................................................. 20 1.3.2 Anestésicos para peixes ................................................................................................. 23 1.3.2.1 Lippia alba ................................................................................................................... 24 1.4 QUALIDADE DO PESCADO APÓS O ABATE ............................................................. 26 1.5 JUNDIÁ (Rhamdia quelen) ............................................................................................... 32 2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 35 3 DESENVOLVIMENTO ..................................................................................................... 36 3.1 ARTIGO 1.......................................................................................................................... 36 INFLUENCE OF ELECTRONARCOSIS ON BEHAVIORAL RESPONSES, BLOOD MARKERS AND FILLET PROPERTIES OF SILVER CATFISH (Rhamdia quelen) ......... 36 3.2 MANUSCRITO 1 .............................................................................................................. 76 PRE-SLAUGHTER ANESTHESIA WITH ESSENTIAL OIL OF Lippia alba PRIOR TO ELECTRICAL STUNNING OR HYPOTHERMIA DELAYS SPOILAGE OF CHILLED SILVER CATFISH .................................................................................................................. 76 3.3 MANUSCRITO 2 .............................................................................................................. 98 STABILITY OF FROZEN FILLETS FROM SILVER CATFISH ANESTHETIZED WITH ESSENTIAL OIL OF Lippia alba PRIOR TO ELECTRICAL STUNNING OR HYPOTHERMIA..................................................................................................................... 98 4 DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 133 5 CONCLUSÃO ................................................................................................................... 140 REFERENCIAS ................................................................................................................... 141 ANEXO A – PARECER DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS – UFSM ................................................................................................................................................ 158 ANEXO B – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA – UFSM.............. 159 ANEXO C – FICHA DE ANÁLISE SENSORIAL PARA JUNDIÁS FRESCOS ......... 162 ANEXO D – LICENÇA PARA USO DA FIGURA 2 - REAÇÕES ENVOLVIDAS NA OXIDAÇÃO PROTEICA EM SISTEMAS CÁRNEOS .................................................. 163.

(15) 15. 1 INTRODUÇÃO 1.1 SENCIÊNCIA E BEM-ESTAR DE PEIXES A aquicultura tem apresentado crescimento sólido e constante, e juntamente com ele a preocupação com a qualidade dos produtos oferecidos, seja relacionada à saúde do consumidor ou a questões éticas e de bem-estar animal. A definição e medida do bem-estar dos peixes é uma tarefa complexa e desafiadora, pois envolve vários fatores únicos dos animais aquáticos (POLI et al., 2005; HÅSTEIN; SCARFE; LUND, 2005). O bem-estar dos peixes está relacionado à ausência de fome e sede, desconforto, dor, lesão, medo, doença, angústia e sofrimento mental, bem como a liberdade para expressar seu comportamento normal (ASHLEY, 200). Além disso, o bem-estar de peixes está definido como o oposto de sofrimento, representado por condições físicas, fisiológicas e comportamentais negativas, mas acima de tudo, sobre a experiência subjetiva dos indivíduos sob estas condições (HUNTINGFORD, 2002). Contudo, as diferentes definições de bemestar, baseadas no funcionamento biológico adequado, no comportamento natural ou no que os peixes sentem, não estão corretas nem incorretas, uma vez que cada uma delas se concentra em diferentes questões relacionadas ao bem-estar dos animais (HUNTINGFORD et al., 2006). Além disso, dependendo da espécie, os fatores que têm impacto sobre a forma de pensar e definir o bem-estar podem ser muito diferentes (HUNTINGFORD; KADRI, 2014), refletindo na necessidade de pesquisas para responder às preocupações de bem-estar específicas para cada espécie (CHANDROO; DUNCAN; MOCCIA, 2004). Contudo, os conceitos de bem-estar, especialmente aquele baseado no que os animais sentem, têm sido aplicados para animais que são considerados capazes de detectar a dor, medo e sofrimento, e como tal têm sido associados com as espécies que possuem nível cognitivo mais elevado comparado aos peixes (ASHLEY, 2007). Além disso, os peixes frequentemente não evocam compaixão/preocupação em seres humanos, pois não são capazes de emitir som quando estão estressados ou com medo (POLI, 2009). No entanto, estudos revelam que a nocicepção, ou seja, a percepção e reação a um estímulo nocivo (SNEDDON, 2009), e especialmente a senciência, capacidade de ter consciência de sensações e de sentimentos subjetivos (BROOM, 1991; PEDRAZZANI et al., 2007b), pode ser extensível aos peixes (SNEDDON et al., 2003; HÅSTEIN; SCARFE;.

(16) 16. LUND, 2005), uma vez que avaliações anatômicas, fisiológicas e comportamentais sugerem que eles são capazes de cognição e podem experimentar sentimentos bons e ruins (dor, fome, conforto e desconforto, diferença entre bom e ruim, prazeroso e desagradável) de maneira similar aos demais vertebrados (CHANDROO; DUNCAN; MOCCIA, 2004). Portanto, os peixes devem ser incluídos nas considerações éticas e de bem-estar animal (PEDRAZZANI et al., 2007a; SNEDDON, 2009), já que a natureza de suas experiências não deve ser menos importante que a de outros animais (ASHLEY; SNEDDON, 2008). Considerando que bem-estar refere-se a uma gama de estados, desde “muito bom” até “muito ruim”, é necessário avaliar o quão bem ou mal o animal se encontra (BROOM; MOLENTO, 2004). A avaliação do bem-estar e sofrimento animal e seu impacto na qualidade do produto, requer uma abordagem multidisciplinar, devendo-se analisar desde o comportamento do peixe até os processos bioquímicos e fisiológicos envolvidos, que poderão ser avaliados através de indicadores da função cerebral, resposta endócrina, processos post-mortem de tecidos, processos bioquímicos e variações de qualidade (POLI, 2009; HUNTINGFORD; KADRI, 2014). Frequentemente, estes indicadores estão relacionados ao estresse e associados a uma condição de mal-estar. Porém, não há razão em particular para sugerir que a ativação fisiológica temporária que prepara os peixes para uma reação a determinada situação (resposta aguda a um estressor) seja prejudicial ao bem-estar, e em alguns contextos tais respostas de curto prazo podem ser benéficas. Dessa forma, a ausência de estresse não significa bem-estar, mas a presença deste pode muitas vezes significar uma condição precária de bem-estar, e portanto, não abrange totalmente a complexidade do bem-estar animal (HUNTINGFORD; KADRI, 2014). Nesse sentido, a literatura a respeito do bem-estar de peixes traz como base científica consensual que: os peixes têm capacidade de sofrer ou estar em desconforto; é necessária a consideração do bem-estar dos peixes nas condições de cultivo; o fato de não estar sofrendo não indica bem-estar, senciência e cognição, acesso a estados de conforto, motivacionais e afetivos; as questões de bem-estar de peixes devem ser abordadas considerando as especificidades de cada espécie, e são necessárias mais pesquisas em relação a preferências, questões cognitivas, aquicultura em geral na perspectiva do bem-estar dos peixes, indicadores concretos de bem-estar e mecanismos de ação (BARCELLOS, 2014)..

(17) 17. 1.2 ESTRESSE EM PEIXES Estresse pode ser definido como uma condição em que o equilíbrio dinâmico do organismo, ou homeostase, é ameaçado ou perturbado em decorrência da ação de estímulos intrínsecos denominados estressores (WENDELAAR BONGA,1997). A resposta ao estresse é um mecanismo que permite ao peixe preservar sua saúde, mas dependendo do tempo e da severidade do estressor, o mecanismo de resposta pode se tornar disfuncional e impactar negativamente a fisiologia do animal (LIMA et al., 2006), bem como seu bem-estar. As principais respostas ao estresse em peixes podem ser classificadas em três níveis: respostas primárias, secundárias e terciárias (BARTON, 2002). As respostas primárias incluem mudanças hormonais, em particular os níveis circulantes de catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) e corticosteroides, coordenados respectivamente pelos eixos sistema nervoso simpático (SNS)-células cromafins e hipotálamo-pituitária-inter-renal (HPI) (ROSS; ROSS, 2008; WENDELAAR BONGA, 1997). Portanto, a percepção do estressor induz um rápido aumento nos níveis de catecolaminas circulantes na corrente sanguínea que tende a causar reações imediatas (reação de luta ou fuga), geralmente dentro de segundos a minutos, já que é acionada por um circuito neural (em vez de uma cascata de mensageiros químicos) (ELLIS et al., 2012). Em contrapartida, a liberação de corticosteroides, em especial o cortisol, é menos imediata, e geralmente promove efeitos a longo prazo, com duração de algumas horas a vários dias (ROSS; ROSS, 2008). Tendo em vista que a resposta acionada pelas catecolaminas é muito rápida, sua mensuração é praticamente impossível, e por isso tem recebido menos atenção do que os níveis de cortisol em peixes (ELLIS et al., 2012). Embora o cortisol seja um dos indicadores mais utilizados na avaliação do estresse em peixes, deve-se ter cautela ao interpretá-lo, já que inúmeros fatores podem afetar sua concentração, como a espécie, estágio de maturação sexual, estação do ano, temperatura, ritmo circadiano e o método utilizado para a coleta do plasma (BARTON, 2002). Além disso, o cortisol não indica necessariamente o estresse, mas simplesmente mostra que o eixo HPI, que é uma parte integrante da fisiologia normal, é funcional e operante, o que facilita a resposta do animal frente a condições adversas (ELLIS et al., 2012). Já as respostas secundárias, podem ou não ser causadas diretamente pela resposta do sistema endócrino, e caracterizam-se pela elevação do ritmo cardíaco, aumento na taxa de absorção de oxigênio pelas brânquias, em função do aumento da taxa de ventilação, da estimulação do fluxo branquial e da elevada capacidade de difusão do oxigênio (LIMA et al.,.

(18) 18. 2006), além da mobilização de fontes de energia como glicose e ácidos graxos (POLI et al., 2005). A maior mobilização e utilização dessa energia, na sequência do aumento da atividade muscular, inicia a glicólise anaeróbica e consequentemente um aumento na concentração de lactato no plasma, causando ainda aumento no número de eritrócitos e no valor do hematócrito (POLI et al., 2005). Finalmente, as respostas terciárias compreendem alterações no crescimento, resistência a doenças e comportamento, que causam consequências negativas ao bem-estar dos peixes e podem ser resultantes direta ou indiretamente das respostas primárias e secundárias (BARTON, 2002). Assim, os principais indicadores utilizados para avaliar as respostas ao estresse são os indicadores comportamentais (frequência respiratória, natação, alterações no consumo de alimentos, entre outros), hematológicos (cortisol, glicose, hematócrito, e ácidos graxos livres) e indicadores de qualidade da carne (fases do rigor mortis, pH e ácido lático, nucleotídeos e valor de K) (POLI, 2009). Durante o cultivo dos peixes uma série de condições e práticas, tais como o ambiente e qualidade da água, densidade de estocagem, manejo, alimentos e nutrição, genética, doenças e patógenos, captura, transporte e abate, podem promover algum estresse fisiológico e afetar negativamente. a. saúde. dos. animais,. bem. como,. comprometer. seu. bem-estar. (HUNTINGFORD; KADRI, 2014). Dentre estas práticas, as etapas de pré-abate e abate têm sido consideradas as mais traumáticas, e se realizadas sem cuidado para evitar condições graves de estresse para o animal, além de influenciarem fortemente seu bem-estar, podem comprometer as características organolépticas, a qualidade sanitária e comercial do pescado (HÅSTEIN; SCARFE; LUND, 2005; POLI, 2009; DIGRE et al., 2010).. 1.3 MÉTODOS DE INSENSIBILIZAÇÃO E ABATE DE PEIXES O abate de peixes geralmente é um processo realizado em duas etapas. Inicialmente o peixe é atordoado com o objetivo de torná-lo insensível à dor. Em seguida, a morte pode ser induzida por vários métodos. Essas duas etapas podem ocorrer de forma concomitante ou em operações distintas, mas quando separadas o tempo de insensibilização do animal deve ser suficiente para evitar que ele recupere a consciência antes da morte (LINES et al., 2003)..

(19) 19. Diversos trabalhos relacionados a métodos de insensibilização e abate humanitário de peixes têm sido desenvolvidos em todo mundo, principalmente nos países europeus, com o objetivo de tornar a morte dos peixes menos dolorosa e aumentar a qualidade do pescado (CONTE, 2004). Infelizmente, no Brasil essa é uma questão ainda pouco discutida e normatizada, já que as diretrizes legais a respeito do abate humanitário aplicam-se exclusivamente a mamíferos, aves domésticas e animais silvestres criados em cativeiro, não especificando os animais aquáticos, conforme pode ser observado na Portaria nº 47, de 19 de março de 2013, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 2013). No Brasil, os métodos tradicionais de abate de peixes baseiam-se na asfixia, evisceração ou choque térmico (VIEGAS et al., 2012), e são considerados pouco aceitáveis do ponto de vista do bem-estar animal, uma vez que os expõem a períodos prolongados ao desconforto, dor, estresse e sofrimento (VAN DE VIS et al., 2003; BENSON, 2004; CONTE, 2004), além de reduzirem a qualidade de sua carne (ROTH et al., 2002). Em revisões a respeito das diversas técnicas de insensibilização pré-abate, como corte das brânquias, saturação da água com dióxido de carbono, percussão, choque térmico, asfixia, decapitação e atordoamento elétrico, foi observado que o atordoamento percussivo e o elétrico são os métodos mais humanitários (VAN de VIS et al., 2003; BENSON, 2004). Já os métodos de asfixia e com recurso de gelo, como o choque térmico, foram menos aceitáveis por exporem os peixes a períodos prolongados ao sofrimento (VAN de VIS et al., 2003; BENSON, 2004; CONTE, 2004). O tempo que o peixe demora para morrer depois de ser retirado da água é dependente da temperatura a que é exposto (ROBB et al., 2002), ou seja, quanto mais baixa a temperatura, mais lentamente o peixe morre (KESTIN; WOOTTON; GREGORY, 1991). Assim, a 20°C a truta levou 2,6 min para perder a função cerebral, 3,0 min a 14°C e 9,6 min a 2°C (ROBB et al., 2002). Para o salmão, que suporta baixas temperaturas, o atordoamento utilizando gelo é considerado desumano por causar sofrimento inaceitável, uma vez que pode haver um período prolongado de tensão antes da morte, já que os peixes somente se tornam insensíveis após 14 min. (ROOB et al., 2002). Além disso, o salmão do Atlântico mostrou reações de angústia e sofrimento quando submetido à queda brusca de temperatura (de 16 a 1°C em 1 h) (FOSS et al., 2012). Dessa forma, a imersão do peixe em água gelada, embora barato e conveniente, pode apenas paralisá-lo e mantê-lo vivo por horas até a ocorrência de problemas osmorregulatórios e a exaustão (HÅSTEIN; SCARFE; LUND, 2005), não podendo ser.

(20) 20. considerado um método humanitário de insensibilização e abate de peixes (LINES; SPENCE, 2014), especialmente para as espécies que toleram baixas temperaturas. A Autoridade Europeia de Segurança Alimentar (EFSA, 2009) recomenda que os métodos de atordoamento devem induzir imediata inconsciência (menos de 1 segundo), de forma a evitar a dor e o sofrimento dos animais, além disso, o profissional responsável por esta etapa deve ser capaz de reconhecer essa rápida inconsciência. Um dos métodos que atende a esse requisito é o atordoamento elétrico ou eletronarcose, pois torna os peixes imediatamente imobilizados e inconscientes até a morte (ROBB; ROTH, 2003), promovendo uma morte mais humanitária.. 1.3.1 Atordoamento elétrico. O atordoamento elétrico consiste na aplicação de uma corrente elétrica na água, formando um campo elétrico uniforme, ou por meio de eletrodos acoplados diretamente na cabeça do peixe (LINES et al., 2003), que causa uma reação epilética responsável pela imediata inconsciência e insensibilidade à dor (LIONCH et al., 2012). O efeito da eletronarcose baseia-se, portanto, na estimulação de todas as partes do cérebro pela corrente elétrica, provocando a sua disfunção, quer por indução de um insulto epileptiforme generalizado, quer pela supressão completa de sua função, deixando-o incapaz de responder a estímulos, tornando os peixes insensíveis imediatamente (KESTIN; WOTTON; ADAMS, 1995).. Após o choque deve ser observada uma fase tônica, que é um padrão cerebral. epileptiforme caracterizado por uma contração muscular duradoura, representando imediata inconsciência, que pode ser seguida por uma fase clônica, representada por espasmos musculares (KESTIN; WOTTON; ADAMS, 1995). A indução dessas fases indica um atordoamento elétrico eficaz, tendo em vista que o animal neste estado fica incapaz de sentir dor (GRANDIN, 2013). Há duas formas principais de corrente elétrica que podem ser utilizadas para o atordoamento elétrico, a corrente contínua e a alternada. A primeira produz corrente constante unidirecional, de igual intensidade e com fluxo suave e contínuo que ocorre de polo a polo. Assim, a força e direção permanecem constantes. Já a alternada é uma corrente elétrica cuja direção se inverte um determinado número de vezes por segundo (D’AGARO, 2011). Ambas têm sido utilizadas para o atordoamento de peixes, mas com maior frequência a corrente alternada ou a associação das duas..

(21) 21. Além da forma da onda, a tensão, duração e a frequência elétrica são consideradas as principais variáveis que caracterizam um atordoamento elétrico e determinam a intensidade da corrente elétrica que passa através do animal, sendo responsáveis pela insensibilização dos peixes (LINES et al., 2003; ROBB et al., 2002). A eficácia da eletronarcose depende do fornecimento de uma corrente elétrica suficientemente alta para se obter sedação completa, caso contrário, o peixe só será paralisado (HÅSTEIN; SCARFE; LUND, 2005). Além disso, se a corrente fluir por tempo suficiente o peixe se tornará insensível ou morrerá por anoxia antes do cérebro ser capaz de recuperar a sensibilidade (BENSON, 2004). No entanto, se a corrente for demasiadamente alta ou aplicada por tempo excessivamente prolongado, poderão ocorrer problemas na carcaça (HÅSTEIN; SCARFE; LUND, 2005). Porém, se a duração da corrente e a força do campo elétrico forem minimizados para os limiares necessários para atordoar o peixe, o efeito da estimulação elétrica nos músculos pode ser minimizado, evitando as lesões (ROTH et al., 2002). Também tem sido relatado que a intensidade da frequência, condutividade da água e a espécie do peixe (ROTH et al., 2003) estão relacionadas com o surgimento de fraturas nas vértebras e hemorragias na carne (HÅSTEIN; SCARFE; LUND, 2005), que são os principais danos observados em peixes submetidos ao atordoamento elétrico. A principal causa da fratura nas vértebras após exposição a campos elétricos ocorre devido à contração dos músculos de ambos os lados do corpo do peixe que se contraem abrupta e simultaneamente, aplicando forças contrárias à coluna vertebral, ocasionando quebra ou deslocamento de vértebras (SILVA, 2010). Essas fraturas ou até mesmo a elevação da pressão arterial (SANDBLOM et al., 2012), podem levar ao rompimento de vasos sanguíneos e ocasionar hemorragias nos filés. A ocorrência de hemorragias nos filés de trutas submetidas tanto à asfixia quanto a diferentes combinações de tempo, frequências e estágios do atordoamento elétrico não foi diferente significativamente entre os tratamentos (LINES; KESTIN, 2005). Já baixas frequências de ondas senoidais (50 Hz) promoveram maior tempo de insensibilização em trutas arco-íris, enquanto altas frequências (500 a 2000 Hz) reduziram significativamente os escores de hemorragias quando comparado a frequências menores (50, 100 e 300 Hz), mantendo a qualidade e a garantia da comercialização dos filés (LINES et al., 2003). Dessa forma, o atordoamento elétrico tem apresentado um grande potencial de melhoria da qualidade da carne, por evitar a atitude de fuga dos animais ante mortem, e retardar o início e resolução do rigor mortis (ROTH et al., 2003)..

(22) 22. Tendo em vista que existem inúmeras variáveis envolvidas no processo de atordoamento elétrico de peixes, trabalhos têm sido desenvolvidos com diferentes condições elétricas (LINES et al., 2003; ROBB; ROTH, 2003; LINES; KESTIN, 2004; SATTARI et al., 2010) a fim de otimizá-las para as espécies de interesse, promover insensibilização eficaz e reduzir os danos na carne. Diversas espécies de peixes já foram estudadas em relação ao atordoamento elétrico, tais como bacalhau (DIGRE et al., 2010), salmão do Atlântico (ROBB, et al., 2000; ROTH et al., 2002, 2003), truta arco-íris (ROBB, et al., 2002; LINES et al., 2003; LINES; KESTIN, 2004; LINES; KESTIN, 2005), carpa capim (SCHERER et al., 2005, 2006) enguia (ROBB; WOTTON; VAN de Vis, 2002) e tilápia (OLIVEIRA FILHO et al., 2015). Contudo, para atender a crescente demanda da aquicultura, reduzir preços, melhorar a qualidade dos produtos frescos e promover a ética e sustentabilidade do setor, novas espécies (LIONCH et al., 2012) ou espécies que se adaptam a diversas condições de cultivo como o bagre africano (“catfish”) (LAMBOOIJ, et al., 2003) também tem sido alvo dos estudos em relação ao atordoamento elétrico (LAMBOOIJ, et al., 2006a, 2006b). Quando comparado a outros métodos, o atordoamento elétrico tem reduzido o estresse e mantido a qualidade do pescado. Em bagres africanos, o atordoamento elétrico insensibilizou os peixes de forma imediata, enquanto que os peixes atordoados por hipotermia apresentaram câimbras musculares e taquicardia, indicando estresse antes da inconsciência (LAMBOOIJ et al., 2006a). Se após o atordoamento elétrico os peixes recuperarem a consciência, também pode ocorrer estresse fisiológico causado pelo método, bem como pelas alterações na pressão sanguínea, ritmo cardíaco e taxas de ventilação (SANDBLOM et al., 2012). Portanto, o atordoamento elétrico, desde que em condições adequadas para cada espécie, pode ser utilizado para a insensibilização pré-abate de peixes, sem causar lesões significativas na carcaça, contribuindo para uma melhor qualidade da carne, bem como reduzir o estresse dos peixes e preservar seu bem-estar. Anestésicos químicos também podem ser usados para insensibilizar peixes, prevenir o estresse e evitar consequências ao seu bem-estar durante as etapas de pré-abate e abate. No entanto, há crescente preocupação em relação à segurança destas substâncias para a saúde do consumidor, havendo interesse cada vez maior em relação aos anestésicos naturais ou de grau alimentício para a insensibilização de uma série de espécies de peixes (LINES; SPENCE, 2014)..

(23) 23. 1.3.2 Anestésicos para peixes. A palavra anestesia tem derivação grega e significa perda reversível e generalizada da percepção sensorial, que pode ser induzida por drogas ou por meios físicos. As drogas podem agir por depressão generalizada do sistema nervoso central, produzida por uma ação nos axônios, liberação de neurotransmissores ou redução da excitabilidade da membrana, ou mesmo uma combinação destes mecanismos (ROSS; ROSS, 2008). Os anestésicos tem papel importante na criação de peixes, pois reduzem ou minimizam seu estresse (LINES; SPENCE, 2014), além de assegurar a qualidade de carne (ERIKSON et al., 2012). Atualmente no Brasil não há legislação a respeito da utilização de anestésicos para uso na aquicultura, por isso as regulamentações de outros países são frequentemente consultadas para orientar a utilização destas substâncias. Dessa forma, um dos anestésicos sintéticos mais utilizados em peixes destinados ao consumo humano é a tricaína metanossulfonato (MS-222), porém, seu manuseio é difícil (CARTER; WOODLEY; BROWN, 2011), pode provocar estresse em peixes (KIESSLING et al., 2009; READMAN et al., 2013), além de requerer um período de carência de 21 dias antes do abate nos EUA e de 5 dias no Canadá (MEINERTZ et al., 2014). Portanto, não pode ser usado na fase final da vida do animal. Tendo em vista que alguns anestésicos utilizados em peixes podem iniciar respostas ao estresse (READMAN et al., 2013), e que um novo medicamento poderia ser percebido pelos consumidores como forma de envenenamento do peixe (LINES et al., 2003), tem crescido o interesse por anestésicos de grau alimentício (LINES; SPENCE, 2014). Dessa forma, anestésicos obtidos de plantas poderia ser uma alternativa, especialmente quando utilizados em conjunto com outros métodos de insensibilização ou abate de peixes, já que a dose anestésica não mata o animal. Anestésicos a base de eugenol (ingrediente 100% ativo do óleo de cravo) e isoeugenol (ingrediente 50% ativo do AQUI-STM, não encontrado naturalmente no óleo de cravo) (JAVAHERY; MORADLU, 2012), têm sido utilizados na produção de peixes destinados ao consumo humano, sem a necessidade de um período de carência antes do abate, em países como Austrália, Chile, Nova Zelândia, Coréia e Costa Rica (ZAHL; SAMUELSEN; KIESSLING, 2012). No bacalhau, o AQUI-STM induziu inconsciência e insensibilidade sem causar comportamento de fuga no animal (ERIKSON et al., 2012), e no salmão do Atlântico reduziu o estresse em baixas doses (IVERSEN et al., 2003). Embora induza anestesia, seja.

(24) 24. barato, fácil de ser obtido, e seguro, tanto para o meio ambiente quanto para o usuário (IVERSEN et al., 2003), o eugenol nas concentrações de 20-50 mg L-1, alterou o sabor de filés de jundiá, sendo contra-indicado no pré-abate caso o peixe seja destinado ao consumo humano (CUNHA et al., 2010a). O óleo essencial (OE) de outras plantas como Aloysia triphylla e Lippia alba, também tem apresentado efeito sedativo e anestésico. Concentrações acima de 30 μL L-1 do OE de A. triphylla induziram anestesia e melhoraram o sistema antioxidante contra espécies reativas de oxigênio durante transporte de camarão branco (Litopenaeus vannamei) por 6 horas (PARODI et al., 2012). Já a exposição de jundiás ao OE de A. triphylla nas concentrações de 30 a 50 μL L-1 reduziram o dano fisiológico produzido pelo transporte (PARODI et al., 2014), enquanto que a concentração de 40 μL L-1 deste mesmo óleo, utilizado como sedativo, reduziu o estresse de jundiás durante o transporte (por 6 h) (ZEPPENFELD et al., 2014). O OE de L. alba também foi eficaz na indução de sedação leve em jundiá nas concentrações 5-20 mg L-1 e anestesia profunda nas concentrações de 100-500 mg L-1 (CUNHA et al., 2010b). Além disso, a utilização de 300 mg L-1 inibiu a elevação do cortisol após manipulação dos animais (CUNHA et al., 2010b). Esse mesmo óleo usado nas concentrações de 10 ou 20 μL L-1 induziu sedação leve em jundiás e inibiu o aumento dos níveis de amônia total e reguladores iônicos, indicando aparente redução do estresse causado por 4 horas de transporte destes animais (BECKER et al., 2012). O efeito anestésico do OE de L. alba em jundiás está relacionado com a modulação do sistema GABAérgico, promovendo a hiperpolarização da membrana sináptica e depressão do sistema nervoso central, causando a insensibilização dos animais (HELDWEIN et al., 2012). A concentração de 50 μL L−1 de OE de L. alba também induziu anestesia em camarão branco (Litopenaeus vannamei) durante seu transporte (PARODI et al., 2012). Nesse sentido, foi patenteado o processo de obtenção do OE de L. alba para uso como sedativo e anestésico natural aplicado a aquicultura devido à sua capacidade em reduzir o estresse em peixes e evitar perdas econômicas na aquicultura (CUNHA et al., 2010b).. 1.3.2.1 Lippia alba A Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (Figura 1), mais comumente conhecida como ervacidreira, é um subarbusto aromático, de aproximadamente 1,7 m de altura, com ramos finos, esbranquiçados e quebradiços (HENNEBELLE et al., 2008). Pertence à família Verbenaceae,.

(25) 25. e ocorre praticamente em todas as regiões do Brasil (TAVARES; MOMENTÉ; NASCIMENTO, 2011).. Figura 1 - Lippia alba (Mill.) N.E. Brown. Fonte: Arquivo pessoal da Prof.a Dr.a Berta M. Heinzmann. (Reproduzido com autorização).. Em geral, o gênero é frequentemente utilizado na medicina popular brasileira como analgésico,. anti-inflamatório,. sedativo,. antiespasmódico. e. ansiolítico. (TAVARES;. MOMENTÉ; NASCIMENTO, 2011) na forma de infusão ou decocto de suas folhas, partes aéreas ou flores (PASCUAL et al., 2001). Além destes efeitos e da capacidade sedativa e anestésica citada anteriormente (item 1.3.2), extratos e óleos essenciais de L. alba também apresentaram ação antimicrobiana e antioxidante in vitro e in vivo (STASHENKO et al., 2003, 2004; OLIVEIRA et al., 2006; HENNEBELLE et al., 2008). O OE apresentou atividade protetora contra a degradação de uma emulsão de ácido linoléico (modelo de sistema lipídico) submetido a um processo de oxidação acelerada por íons metálicos (1 mM de Fe2+, 37◦C, 12 h), inibindo também a formação do hexanal, composto carbonílico liberado pela peroxidação do ácido linoleico (STASHENKO et al., 2003, 2004). Além disso,.

(26) 26. concentrações de 30 e 40 µL L-1 de OE na água de transporte de jundiás retardaram a oxidação lipídica de seus filés durante o congelamento (VEECK et al., 2012), assim como a aspersão de seus extratos hidroalcóolicos retardaram a oxidação lipídica de filés de carpa comum durante o armazenamento congelado (VEECK et al., 2015). Os efeitos observados tanto para os extratos quanto para os óleos essenciais podem ser decorrentes de sua composição química, que além de ser influenciada pelas condições climáticas também se deve aos fatores genéticos das plantas (HENNEBELLE et al., 2008; TAVARES et a., 2005). Algumas espécies apresentaram composição do óleo variável e estas diferenças podem ser separadas em sete quimiotipos a partir da análise dos constituintes químicos majoritários do óleo essencial e suas rotas metabólicas (HENNEBELLE et al., 2008), sendo estes: limoneno, β-cariofileno, ρ-cimeno, cânfora, linalol, α-pineno e timol (PASCUAL et al., 2001). Nesse sentido, o OE de L. alba pode ser utilizado como anestésico em peixes antes do abate, reduzindo o estresse desses animais (CUNHA et al., 2010b) e retardando a oxidação lipídica dos filés (VEECK et al., 2012). Ele é provavelmente seguro para o consumidor, uma vez que é utilizado há muito tempo na medicina popular (TAVARES; MOMENTÉ; NASCIMENTO, 2011), e efeitos tóxicos foram observados apenas após a exposição a doses elevadas do OE (igual ou maior do que 1.000 mg kg-1 em ratos) (OLIVERO-VERBEL; GUERRERO-CASTILLA; STASHENKO, 2010).. 1.4 QUALIDADE DO PESCADO APÓS O ABATE Dentre os produtos de origem animal, o pescado é considerado um dos mais suscetíveis à deterioração, principalmente devido sua composição química, que apresenta pH próximo à neutralidade, elevada atividade de água nos tecidos, alto teor de nutrientes facilmente utilizáveis por micro-organismos, bem como alto conteúdo de ácidos graxos poliinsaturados suscetíveis a oxidação (SOARES; GONÇALVES, 2012). Assim, a rapidez com que as alterações enzimáticas, oxidativas e microbiológicas que acontecem no pescado post mortem, dependem de fatores como higiene, manutenção da cadeia do frio, espécie e métodos de captura e abate (GONÇALVES; TAVARES, 2011). Nesse sentido, se a atividade muscular estiver aumentada devido ao estresse no momento do abate, a degradação do pescado será acelerada, proporcionando rápido esgotamento das reservas de ATP, que ocorre na seguinte sequência: adenosina-5'-trifosfato.

(27) 27. (ATP) → adenosina-5'-difosfato (ADP) → adenosina-5'-monofosfato (AMP) → inosina-5'monofosfato (IMP) → inosina (HxR) → hipoxantina (Hx) → xantina (HOWGATE, 2006). Quando a concentração de ATP reduz para cerca de 1 µmol/g, o músculo entra no estado de rigor mortis pleno (WANG et al., 1998) e o pH muscular chega a seu valor mínimo (GONÇALVES; TAVARES, 2011), devido ao acúmulo de ácido lático resultante da glicólise aneróbica (BAGNI et al., 2007), podendo afetar as proteínas do músculo, promovendo desnaturação proteica e rápido amaciamento da carne, o que não é desejável no caso do pescado (BAGNI et al., 2007; HULTMANN et al., 2012). Após a resolução do rigor mortis ocorre autólise, que é decorrente da ação de sucos digestivos e de enzimas proteolíticas e lipolíticas endógenas, que promovem o amolecimento e desintegração dos tecidos, facilitando a disseminação e multiplicação de micro-organismos responsáveis pela deterioração final do pescado (SOARES; GONÇALVES, 2012). Com o aumento da proteólise e crescimento microbiano, ocorre à formação de bases voláteis totais, que compreendem compostos nitrogenados voláteis gerados pela acão de enzimas bacterianas. Os principais compostos incluídos neste grupo são a trimetilamina (TMA) formada a partir da decomposição do óxido de trimetilamina (OTMA) em trimetilamina (TMA), a dimetilamina que se forma a partir da decomposição da trimetilamina e a amônia que se forma a partir da decomposicão da uréia, aminoácidos e proteínas (AUBOURG, 2001). A legislacão brasileira preconiza o limite de 30 mg % de BVT, como indicador de qualidade do pescado refrigerado (BRASIL, 1952). Entretanto, as espécies de peixes de água doce, como o jundiá, apresentam quantidades mínimas de OTMA e uréia em comparacão com as de água salgada, e assim os níveis de BVT geralmente são muito baixos, não sendo apropriada esta medida como indicador de qualidade para essas espécies (SCHERER et al., 2006). Conforme a deterioração do pescado avança e a formação de BVT aumenta, os valores de pH se elevam (OCAÑO-HIGUERA et al., 2009), sendo que o limite máximo aceitável para o pescado ser considerado fresco é inferior a 6,5 para carne interna e inferior a 6,8 para carne externa (BRASIL, 1952). Peixes de águas tropicais tendem a ter biota mais rica em bactérias gram-positivas, inclusive bactérias entéricas, do que os peixes de água temperada, nos quais predominam bactérias gram-negativas (GRAM; HUSS, 1996). Tendo em vista que a decomposição do pescado é causada predominantemente pelas bactérias, uma das maneiras de retardar essa decomposição é diminuir a temperatura até um nível em que seu crescimento seja reduzido. Contudo, com a redução da temperatura passam a predominar os micro-organismos psicrotróficos gram-negativos esporulados como, Pseudomonas, Acetinobacter, Moraxella, Flavobacterium (SOARES; GONÇALVES, 2012), que através de seu metabolismo.

(28) 28. proteolítico geram odores e sabores desagradáveis que promovem a rejeição do pescado (ZAMBUCHINI et al., 2008). Além disso, com o aumento do consumo de oxigênio provocado pelo estresse do peixe antes do abate, componentes celulares presentes nas membranas lipoproteicas, tais como proteínas, nucleotídeos e lipídeos (principalmente os ácidos graxos poli-insaturados) (POLI, 2009; BAGNI et al., 2007), podem ser expostos a ação oxidante causada pelo aumento na formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) (LIMA; ABDALLA, 2001). Portanto, a sucessão de estímulos que perturbam a condição homeostática de um animal antes do abate pode induzir ao estado de estresse oxidativo (FALOWO; FAYEMI; MUCHENJE, 2014), reduzindo a estabilidade oxidativa da carne, diminuindo sua qualidade nutricional e vida de prateleira (SECCI et al., 2016). Além disso, durante o congelamento, lipídios e proteínas podem sofrer oxidação. As reações oxidativas podem ser aceleradas durante o congelamento devido à formação e crescimento de cristais de gelo por dois processos simultâneos: 1) dano mecânico nas membranas e outras estruturas celulares rígidas, que podem facilitar a exposição de pró-oxidantes, e 2) o aumento na concentração de soluto, incluindo pró-oxidantes na fase de descongelamento (ZARITZKY, 2012). A oxidação de lipídeos pode ser modulada por fatores intrínsecos, como a estrutura química dos lipídios e seu grau de insaturação, e fatores extrínsecos, como presença de oxigênio, luz, anti- ou pró-oxidantes (metais de transição, por exemplo), temperatura, superfície de contato e atividade de água (SAMPELS, 2013). O processo oxidativo de lipídeos é complexo e dinâmico (KERR; KELLNER; SHURSON, 2015), e ocorre em três estágios, denominados iniciação (auto-oxidação), propagação e terminação (ARABTEHRANY et al., 2012; SAMPELS, 2013) (Figura 2). Na iniciação, um átomo de hidrogênio é removido de um ácido graxo insaturado, deixando um elétron desemparelhado, formando um radical alquila, que pode sofrer rearranjo e estabilizar-se pelo deslocamento sobre a dupla ligação e resultar na formação de dienos conjugados. O estágio de propagação sucede o de iniciação, quando os radicais livres formados reagem com o oxigênio molecular para formar o radical peroxil. Estes por sua vez são altamente reativos e capazes de remover outros átomos de hidrogênio de outros ácidos graxos insaturados formando os hidroperóxidos (ROOH) e novos radicais alquila, assim, a reação é propagada em cadeia, de um ácido graxo a outro (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; SAMPELS, 2013). Os produtos primários da oxidação lipídica, dienos conjugados e hidroperóxidos, podem sofrer clivagem para formar diferentes produtos secundários de baixo peso molecular, tais como aldeídos, alcanos, alcenos, alcoóis e ácidos (EYMARD; BARON; JACOBSEN, 2009), muitos deles voláteis,.

(29) 29. que alteram o sabor e odor do produto, e que se formam conforme avança a oxidação lipídica, resultando em produtos secundários potencialmente tóxicos, como o malondialdeído (MDA) e produtos da oxidação do colesterol (MORRISSEY; KERRY, 2004).. Figura 2 – Principais reações da oxidação lipídica. Fonte: (Adaptado de SALDAÑA; MARTINEZMONTEAGUDO, 2013).. Dessa forma, a oxidação de lipídeos pode reduzir o valor nutricional dos produtos devido a destruição de ácidos graxos essenciais e vitaminas lipossolúveis como A, D, E e K, diminuição do conteúdo calórico, produção de off-flavors e odores pronunciados (ranço), alterações na cor, tais como escurecimento das gorduras e óleos e mitigação de pigmentos, bem como a perda do aroma de frescor (ARAB-TEHRANY et al., 2012). Além disso, embora não esteja totalmente esclarecido se a oxidação de lipídeos e proteínas são processos concomitantes ou se um evento precede outro, sugere-se que compostos resultantes da oxidação lipídica, como hidroperóxidos e malondialdeido, podem reagir com proteínas e iniciar seu processo oxidativo (ESTÉVEZ, 2011). Contudo, a conexão entre os dois processos.

(30) 30. é governada por diferentes fatores e mecanismos (ESTÉVEZ, 2011). Além dos produtos da oxidação lipídica, a oxidação proteica pode ser iniciada por espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio, metais de transição e por metabólitos secundários do estresse oxidativo (STADTMAN; LEVINE, 2003).. Assim, o processo de oxidação de proteínas pode ser. iniciado com a captação de um átomo de hidrogênio da proteína por radicais livres, gerando um radical alquila (P•) (Reação 1), que na presença de oxigênio é convertido a radical peroxil (POO•), e em alquilperóxido (POOH) pela abstração de um átomo de hidrogênio de outra molécula suscetível (Reações 2 e 3). Outras reações com EROs como o radical hidroperoxil ou com metais de transição também podem conduzir a formação de radicais alcoxil (Reações 4 e 5) e seus derivados hidroxilados (POH) (Reações 6 e 7) (Figura 3) (ESTÉVEZ, 2011).. Figura 3 – Reações envolvidas na oxidação proteica em sistemas cárneos. Fonte: (ESTÉVEZ, 2011)..

(31) 31. Essas alterações, levam a modificações nas cadeias de aminoácidos, fragmentação, agregação e polimerização de proteínas (SOLADOYE et al., 2015), bem como na conversão de aminoácidos em outros aminoácidos ou compostos diferentes (STADTMAN; LEVINE, 2000). Dependendo do alvo e do agente oxidante, a oxidação proteica se propaga e resulta na perda de grupos sulfidrila, formação de grupos carbonila em proteínas, formação de ligações cruzadas, e a modificação dos aminoácidos aromáticos, entre outros (LUND et al., 2011; ZHANG; XIAO; AHN DU, 2013). Todos os aminoácidos são passíveis à oxidação, mas a cisteína e a metionina, são os primeiros a serem oxidados devido à alta suscetibilidade de seus centros sulfurados, assim como os resíduos de triptofano (ESTÉVEZ et al., 2008; VILJANEN; KIVIKARI; HEINONEN, 2004), levando a perda dos grupos sulfidrila e sua degradação. Já as ligações cruzadas estão relacionadas à formação de cistina (pontes dissulfeto) e ditirosinas a partir de dois resíduos de cisteína e de tirosina, respectivamente (LUND et al., 2011), enquanto que a carbonilação de proteínas se deve à oxidação dos resíduos de treonina, prolina, arginina e lisina (STADTMAN; LEVINE, 2003) e estão relacionadas a uma modificação não enzimática e irreversível das proteínas, envolvendo a formação de radicais carbonil induzidos pelo estresse oxidativo e outros mecanismos (BERLETT; STADTMAN, 1997). Há quatro vias de geração de compostos carbonilados (ESTÉVEZ, 2011), no entanto, a oxidação direta dos aminoácidos é o único mecanismo que tem efeito comprovado no aumento de grupos carbonila a partir de proteínas cárneas e é comprovadamente a principal rota de carbonilação e a mais potente fonte de ataque direto às proteínas (ESTÉVEZ; HEINONEN, 2010; SHACTER, 2000). O impacto da oxidação proteica na qualidade da carne está relacionado a alterações e redução na funcionalidade da proteína como perda da elasticidade do gel e da capacidade de retenção de água, além de alterações na textura, cor, sabor, aparência e perda de aminoácidos essenciais, com consequente redução na digestibilidade e valor nutricional (LUND et al., 2011; SOLADOYE et al., 2015).Nesse sentido, a complexidade do processo de decomposição do pescado torna impossível o uso de apenas um método para avaliar sua qualidade. Portanto, é mais seguro a utilização de métodos combinados, como os físico-químicos, microbiológicos e sensoriais (GONÇALVES, 2011), sendo que a percepção sensorial é o método de avaliação do frescor do pescado mais antigo e empregado largamente na pesquisa científica e na rotina industrial devido a sua rapidez, confiabilidade e baixo custo (SOARES; GONÇALVES, 2012). Assim, muitos estudos utilizam como ferramenta a Tabela da Unidade de Pesquisa em Alimentos da Tasmania (TFRU), como uma alternativa para a avaliacão sensorial de pescados.