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TÍTULO: ESTUDO IN VITRO DA ATIVIDADE PROLIFERATIVA DE FIBROBLASTOS HUMANOS SUBMETIDOS AO TRATAMENTO COM ZINCUM METALLICUM E CALENDULA OFFICINALIS EM ULTRA DILUIÇÕES HOMEOPÁTICAS
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: FARMÁCIA
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE ANHEMBI MORUMBI
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): VICTOR CAVALARO
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): CARLOS ROCHA OLIVEIRA
Resumo
A cicatrização pode ser dividida em três fases: inflamação, fibrioblástica,
maturação e remodelação. (Ringles, 200). A matriz extracelular pode ser
substituída por um tecido conjuntivo mais forte e mais elástico. Em uma
cicatriz, o colágeno é o principal componente do tecido conjuntivo
maduro.(Ryan e Majno, 1977) Na área homeopática,o maior segmento
pesquisado é o de ultra diluições.( Mano, 2013). Entretanto, poucas
investigações tem sido feitas para explorar o efeito dos medicamentos
dinamizados em cultura de células in vitro. (Sunila, 2007). A área
dermomedicamentosa, bem como dermocosmética, tem sido atrativa por ser o
local de efeito (administração tópica) que é efetivo e seguro.(Mano, 2013).
Usando o metalicum Zincum 6CH e Calendula officinalis 6CH aplicada de
forma independente, em diferentes concentrações em culturas de fibroblastos
procuraram determinar o aumento na actividade proliferativa, utilizando
técnicas tais como IC50, MTT, citometria de fluxo e quantificação de colagénio.
Como esperado a partir da literatura, ou seja, tanto homeopáticas de acordo
com a literatura são usados para os tratamentos que exigem a cicatrização da
pele, ambos apresentaram um aumento da actividade proliferativa, tendo
Calendula mais resposta celular, apresentando-se como estimulante do ciclo
celular verificado através de citometria de fluxo.
Palavras-Chave:
Zincummetallicum,
Calendulaofficinalis,
ultra-diluições,
atividade proliferativa, fibroblastos.
Introdução
De imensa complexidade, conforme indicado por Carvalho, 2001, a cicatrização tem ganhado a atenção dos pesquisadores ao longo dos anos, tendo como enfoque os fatores que a retardam ou dificultam. Tratando-se de um processo não linear mas dinâmico que envolve a integração de diversos eventos celulares e bioquímicos, que no reparo de lesões, pode ser dividido em três fases: inflamação, fase fibrioblástica, maturação e remodelação. (Ringles, 200).
A matriz extracelular pode ser substituída por um tecido conjuntivo mais forte e mais elástico, etapa conhecida como fase fibrioblástica. Em uma cicatriz, o colágeno é o principal componente do tecido conjuntivo maduro. Assim, uma lesão que se encontra em processo de regeneração é possível afirmar que o principal componente são fibroblastos produtores de colágenos, que são estimulados por sinais que ocorra maior
biossíntese de colágeno como
conseqüência de aumento da atividade fibroblástica. (Ryan e Majno, 1977)
A administração tópica de substâncias para melhora do processo de cicatrização tem sido largamente estudada. ( Santos et al,
2006)De grande atratividade, a
administração de compostos na pele deve-se ao fato de deve-ser o próprio local de ação (administração tópica) com boa efetividade e segurança por não possuir efeitos sistêmicos, não possuir metabolismo de primeira passagem nem efeitos sistêmicos adversos. (Prausnitz, Mitragotri e Langer, 2004).
Uma das formas de prática integrativa mais popular, a Homeopatia vem sendo estudada a longo de mais de 200 anos e é baseada em três pilares: medicamentos dinamizados, experimento em homem são e princípio do similar. Para ser considerado medicamento homeopático, este deverá ter sido potencializado através do succuionamento (dinamização), experimento em indivíduos saudáveis e ter sido escolhido pelo princípio da similitude. (Sunila et al, 2007).A confiança nos Princípios da Homeopatia e as várias abordagens teóricas fundamentas por bases científicas colaboraram para evidências observadas em linhagens celulares laboratoriais. (Bellavite, 2006). Na área homeopática,o maior segmento pesquisado é o de ultra diluições de substâncias, geralmente alergênicas ou irritantes visando prevenir ou curar demais irritações e alergias. Quando tais substâncias são submetidas ao processo farmacotécnico homeopático(ultra diluições e dinamizações), estes compostos
resultante são denominados de
bioterápicos. Os bioterápicos possuem muitas aplicações específicas em outros ramos homeopáticos, mas na prática clínica são recomendados para melhora dos aspectos mentais, emocionais e fisiológicos. Os efeitos gerados pelo tratamento são pesquisados por inúmeros pesquisadores,
que reportam a progressão do
quadro.(Mano, 2013).
Avanços com experimentos em condições laboratoriais em diversas áreas, como em imunologia e toxicologia, tem sido relatados. A exemplo do Arsenicumalbum, em camungodos bem como em ensaios clínicos , usado para melhorar toxicidade induzida
por arsênico por diminuir o alto título de anticorpos antinucleares e toxicidade hematológica. Entretanto, poucas investigações tem sido feitas para explorar o efeito dos medicamentos dinamizados em cultura de células in vitro. (Sunila, 2007). O Zincunmetallicum, originário do Zinco é um elemento metálico de número atômico 30 e massa atômica de 65,38 e símbolo Zn. Forma uma parte essencial de muitas enzimas, tento função essencial na síntese de proteínas e divisão celular, sendo assim um oligoelemento necessário na dieta. Sua deficiência está associada a carências hormonais e a debilidade na cicatrização de férias.O Zincunmetallicum é extremamente comum na crosta terreste e é obtido diretamente da indústria química (IUPAC, 2014). Sua indicação é para casos de eczema, que quando utilizado, ocorre o retrocesso de erupções(BOERICKE, 2003). A Calendulaofficinalis, da família Asteraceae e originaria do Mediterrâneo, é uma planta anual; de folhas alternas e sem estípulas; com um grupo de flores sem pendúculo e terminais, de cor amarelo-alaranjado. Em sua composição química pode-se encontrar: óleo essencial, pigmentos carotenóides, mucilagens, flanonóides, saponinas, resinas, ácidos orgânicos e mineiras (VAZ e JORGE, 2006). A parte empregada são as sumidades florais e a preparação da tintura-mãe dá-se pelos métodos e percolação ou maceração (BRASIL, 2011).É indicada para casos em que há necessidade de cicatrizações, quando há queimaduras superficiais e erisipela, ocorrendo uma cicatrização mais favorável com menor quantidade de supuração (BOERICKE, 2003).
A área dermomedicamentosa, bem como dermocosmética, tem sido atrativa por ser o local de efeito (administração tópica) que é efetivo e seguro.(Mano, 2013). Por este motivo, torna-se útil a pesquisa em linhagens de fibroblasto aplicando-se o princípio de simillium, buscando aumento de atividade proliferativa celular através de aplicações de pequenas doses de ultra diluição de 6CH de Zincummetallicum e
Calendulaofficinalis.
METODOLOGIA
Delineamento experimental
O presente Projeto foi desenvolvido no laboratório de Biologia Molecular e Cultura de Células da Escola de Ciências da Saúde da Universidade Anhembi. A linhagem de fibroblastos CCD – 1072 Sk, que corresponde a fibroblastos humanos de recém-nascido do sexo masculino, fornecida
pela organização ATCC
(http://www.atcc.org), foi submetida ao tratamento com diferentes volumes
deZincummetallicum6CH e
Calendulaofficinalis 6CH, que foi gentilmente cedido pela Farmácia Interativa Farmácia Homeopática localizada na Rua Dr. Jesuino Maciel, 1008 Campo Belo – São Paulo, Brasil. Após os tratamentos foram realizados ensaios de viabilidade celular e de proliferação onde buscou-se elucidar mecanismos moleculares que possam estar envolvidos neste processo.
As células da linhagem CCD - 1072Sk foram cultivadas em meio ISCOVE´S com 10% de soro fetal bovino, 0,292 g/l de L-glutamina, 1,0 g/l de D-glicose, 2,2 g/l de NaHCO3, 10.000UI de Penicilina e 0,060 g/l de Estreptomicina. As células foram mantidas em frascos de 25 cm2 (1 × 105cells/mL) em estufa úmida com atmosfera de 5% de CO2 a 37 °C. Em todos os experimentos as culturas de fibroblastos foram submetidos ao teste de viabilidade celular utilizando o corante azul de tripano e foi realizada a leitura em câmara hemocitométrica por microscopia óptica. Todos os experimentos descritos foram realizados quando a viabilidade celular for igual ou superior a 95%.
Avaliação da citotoxicidade (determinação do IC50)
Foi determinada a curva de concentração que nos forneceu o IC50, do composto teste, se realizou o método de incoroporação do corante azul de tripano, onde após 24horas de incubação com os diferentes volumes homeopáticas e controles, o conteúdo de cada poço das culturas de fibroblastos foi recolhido em tubos de 15 mL, e centrifugados a 1500 rpm por 5 minutos. Os
pellets foram ressuspendidos em 1 mL de
meio RPMI. Após isso, as soluções de células foram diluídas (1:2) em corante de azul de tripano e a contagem das células viáveis e inviáveis foi realizada em câmara hematocitométrica por microscopia óptica. A soma da contagem de células totais (viáveis e inviáveis de cada poço) foi considerada como 100% de células, sendo realizados os cálculos para verificar as porcentagens
correspondentes às células viáveis e as inviáveis analisadas no experimento.
Ensaios de redução MTT à formazan.
O teste de redução MTT ([3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)2,5-Difenil Brometo de Tetrazólio]) é usado com grande sucesso para estimar o número de células viáveis em um screening inicial de fármacos. Sua interpretação serve de indicativo da atividade metabólica celular, e o local de ocorrência das reações redox inclui tanto mitocôndrias como o citosol. A redução do sal de MTT à formazan é realizada principalmente pela enzima succinato-desidrogenase, e resulta em cristais de formazan insolúveis na cor violeta. A intensidade da coloração é utilizada para medir a atividade mitocondrial e consequentemente a viabilidade celular. Assim, às células tratadas com diferentes volumes (10 µL ,20 µL ,30 µL, 40 µL e 50 µL) da diluição 6 centesimal segundo metodologia de Hahnemann (CH) de
ZincummetallicumeCalendulaofficinalise na
concentração 5x104 células por poço, foram adicionados 10µl da solução de MTT 5mg/ml (Sigma-Aldrich) em cada poço. Após 4 horas, a placa foi centrifugada, o sobrenadante de cada poço descartado e o pellet com os cristais formado no fundo da placa dissolvido com 100µL de etanol puro e em seguida homogeneizado em agitador de placas por 15 minutos. A densidade óptica foi medida pelo leitor de microplacas (FlexStation® 3 multimodebenchtopreader) em 540 nm.
A porcentagem de sobrevivência celular na presença dos compostos em estudo foi calculada da seguinte maneira:
% 𝑪é𝒍𝒖𝒂𝒔𝑽𝒊á𝒗𝒊𝒆𝒔 =𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎𝑑𝑜𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 ∗ 100
Ensaio de incorporação do iodeto de propídeo (PI)
Foram realizados ensaios de incorporação de PI para avaliação de fases do ciclo celular por citometria de fluxo.
Resumidamente, as células
foramplaqueadas em placas de vinte e quatro poços (densidade inicial em células/poço, de 2x105) e a elas foi adicionada a solução fluorocrômica hipotônica (HFS – 0,1% p/v de citrato de sódio trissódico, 0,5% p/v de Triton-X 100 e 50 µg/ml de iodeto de propídeo). Após período de incubação de quatro horas, a 4 ᵒC e ao abrigo da luz, as células e o
sobrenadante foram recolhidos e
analisados. Foi utilizado o citômetro de fluxo FACScan, o programa CELLQuest e os dados obtidos, considerando-se 20.000 eventos por análise em cada ensaio, foram analisados no programa WinMDI 2.8.
Sirius Red - quantificação de colágeno
As células serão cultivadas e tratadas conforme descrito anteriormente. Após cultivo, o meio será retirado e os poços lavados três vezes com PBS 0,1M. Serão adicionados 100 μL de Fluído de Bouin (ácido pícrico, formaldeído e ácido acético glacial) para fixação durante 1 h. As amostras serão lavadas com PBS, em
seguida, adicionado o corante Sirius Red. Após o tempo de 1 h, será removido o máximo do corante e procedendo-se á lavagem com 150 μL de solução de ácido hidroclórico 0,01M por 30 seg para remoção do corante que não se ligou ao colágeno. Em seguida, o corante será retirado das camadas celulares com a adição de solução de NaOH 0,1M durante 30 min. Alíquotas de 100 μL das soluções contidas nos poços serão transferidas para uma nova placa. A absorbância será medida em um leitor de
microplacas Elx-800-UV
(Bio-TekInstruments, EUA) a 570 nm.
Análises estatísticas
Os resultados foram apresentados como média + EPM (erro padrão da média). Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística por análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido de teste a posteriori de Tukey. As semi-quantificações foram analisadas por test t de Student. Valores de P<0,05 foram considerados significativamente diferentes. As análises
foram realizadas no programa
GraphPadPrism versão 5.0.
Resultados
Avaliação da citotoxicidade (determinação do IC50)
De acordo com os resultados obtidos pelo teste de incorporação do azul de tripan, o
Zincummetallicum 6CH e a
Calendulaofficinalis 6CH não apresentam
IC50 quando aplicados o volume de 50 µl (5%) quando comparados ao grupo controle, figura 1.Foi verificado também, um
aumento linear no número de células viáveis tanto nas culturas tratadas com 5% de Z. metallicum quanto de C. officinarum quando comparadas com o número de células viáveis presentes no grupo controle, figura 2.
Controle Z. metallicum C. officinalis 0 50 100 150 ** * % Cé lu la s v iá v e is
Figura 1. Resultados da porcentagem de viabilidade celular através da técnica azul de trypan após 24 horas de exposição com 50uL de Zincummetallicum 6CH e Calendulaofficinalis 6CH. Antes do inicio dos testes, as células foram carenciadas de soro fetal bovino. (*) P>0,05 - significativo em relação ao controle, ANOVA, Tukey. (**) P>0,05 - significativo em relação ao controle, ANOVA, Tukey.
Controle Z. metallicum C. officinalis 0 50 100 150 ** * Nú m e ro Cé lu la s v iá v e is
Figura 2. Resultados da viabilidade celular através da técnica azul de trypan após 24 horas de exposição com 50uL de Zincummetallicum 6CH e Calendulaofficinalis 6CH. Antes do inicio dos testes, as células foram carenciadas de soro fetal bovino. (*) P>0,05 - significativo em relação ao controle, ANOVA, Tukey. (**) P>0,05 - significativo em relação ao controle, ANOVA, Tukey.
Ensaios de redução MTT à formazan
Já em relação ao teste de proliferação MTT, a tendência de proliferação do Z. metallicum e C. officinarum sobre os fibroblastos CCD-1072SK testados neste estudo, também foi observada. Neste teste foram aplicados volumes de 10 µL (1%), 20 µL (2%), 30 µL (3%), 40 µL (4%) e 50 µL (5%), buscando verificar em qual percentual ocorrereria a melhor resposta da cultura. Para o
Zincummetallicum, foi verificado um aumento linear de proliferação dos fibroblastos à partir de 2%, sendo esse aumento significativo, em relação ao grupo controle, para as porcentagem de 4% e 5%, figura 3. Em relação a Calendulaofficinalis, esse mesmo aumento linear na proliferação foi verificado, contudo houve aumento já na cultura tratada com 1% do medicamento, entretanto foi observado significância nesse aumento proliferativo à partir das culturas tratadas com 3%, figura 4.
C 10 L 20 L 30 L 40 L 50 L 0 50 100 150 * Z. metallicum 6CH * (% ) Cé lu la s v iá v e is
Figura 3. Resultados da viabilidade celular através da técnica de MTT após 24 horas de exposição com diferentes volumes de Zincummetallicum 6CH. Antes do inicio dos testes, as células foram carenciadas de soro fetal bovino. (*) P>0,05 - significativo em relação ao controle, ANOVA, Tukey. (**) P>0,05 - significativo em relação ao controle, ANOVA, Tukey.
C 10 L 20 L 30 L 40 L 50 L 0 50 100 150 200 * C. officinalis 6CH *** *** (% ) C é lu la s v iá v e is
Figura 4. Resultados da viabilidade celular através da técnica de MTT após 24 horas de exposição com diferentes volumes de Calendulaofficinalis 6CH. Antes do inicio dos testes, as células foram carenciadas de soro fetal bovino. (*) P>0,05 - significativo em relação ao controle, ANOVA, Tukey. (***) P>0,05 - significativo em relação ao controle, ANOVA, Tukey.
Sirius Red - quantificação de colágeno
A quantificação do colágeno produzido pelos fibroblastos CCD-1072SK foi realizado pela técnica que emprega o corante ácido Sirius Red. Os resultados mostraram que a
exposição dos fibroblastos aos
homeopáticos só foi capaz de aumentar significativamente o teor de colágeno para a cultura tratada com Zincummetallicum na maior concentração utilizada, após exposição única em 24 horas, entretanto, os resultados para a Calendulaofficinalis indica um aumento significativo na produção de colágeno já na concentração de 40µL (4%), chegando até a de 50µL(5%) (figura 4).
C 10 20 30 40 50 0 50 100 150 * Zincum metallicum 6CH (L) (% ) C o lá g e n o t o ta l C 10 20 30 40 50 0 50 100 150 *** * Calendula officinalis 6CH(L) (% ) C o lá g e n o t o ta l
Figura 4. Resultado da quantificação de colágenos total através da incorporação do corante ácido Sirius Red após 24 horas de exposição ao Zincummetallicum (6CH) e Calendulaofficinalis (6CH). Antes do inicio dos testes, as células foram carenciadas de soro fetal bovino. (*) e (***) P>0,05 - significativo em relação ao controle, ANOVA, Tukey.
Ensaio de incorporação do iodeto de propídeo (PI)
Por fim, a partir dos resultados obtidos acima, que estão relacionados com proliferação celular após tratamento in vitro com os homeopáticos testados, utilizamos a citômetria de fluxo e a incorporação do iodeto propídeo para quantificarmos as frações celulares que estão nas fases S-G2-M do ciclo celular (Figura 4A e 4B). A Figura 4A, mostra a representação gráfica do percentual de células tratadas com os homeopáticos que estão nas fases S-G2-M do ciclo celular quando comparadas ao controle não tratado.
CTL 40 50 40 50 0 20 40 60 * Zincum metallicum 6CH Calendula officinalis 6CH (L) S -G 2 -M ( % )
Figura 4. Efeitos da exposição dos homeopáticos
sobre linhagem de fibroblastos humanos. (A)
Percentual de células em fase S-G2-M. * P<0,05 quando comparado ao controle. (ANOVA, tukey). (B) Histogramas representativos das populações celulares estudadas quando expostas por 24 horas à C.
officinalis 50µL 6CH, após período de carenciamento.
Conclusão
Diante dos resultados expostos, conclui-se que tanto Zincummetallicum 6CH e Calendulaofficinalis 6CH, quando aplicados à 5% em cultura de fibroblastos CCD-1072SK por 24 horas foi o suficiente para desenvolver repostas celulares para que induzisse o aumento do número de células viáveis, do metabolismo oxidativo e produção de colágeno. Foi observado resposta ao nível de aumento das fases S-G2-M do ciclo celular em todas as culturas tratadas com Zincummetallicum e Calendulaofficinalis 6CH à 4% e 5%, entretante este aumento de células em atividade de síntese de DNA só teve signficância estatística para o grupo de
células CCD-1072SK tratadas com
Calendulaofficinalis 6CH á 5% por 24 horas,
sugerindo uma possível aplicação dermocosmética.
Recomenda-se que sejam feitos mais estudos na área, ao estilo dos desenvolvidos por Mano (2014) utilizando-se de bautilizando-ses cosméticas como meios de incorporação dos dois medicamentos homeopáticos testados.
Bibliografia
BELLAVITE, P. et al. Immunologyandhomeopathy. 2. cells of the immune system and inflammation.
Evidence-Based Complementary and Alternative
Medicine. Vol.3. 2006.
BOERICKE, W. Manual de
MatériaMédicaHomeopática. 9ª Ed. Robe, Brasil: 2003.
BRASIL, ANVISA. AGÊNCIA NACIONAL DE
VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Farmacopeia homeopática brasileira, 3º ed. Brasilia 2011.
CARVALHO, P. de T. C. de. Análise da cicatrização de lesões cutâneas através da espectrofotometria: estudo experimental em ratos diabéticos. 2001.
Dissertação (Mestrado em Bioengenharia) -
Bioengenharia, Universityof São Paulo, Ribeirão Preto,
2002. Disponível em:
<http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/82/82131/td e-07012003-100025/>. Acesso em: 2016-02-08
IUPAC. Compendium of Chemical Terminology - Gold Book. International Union of Pure and Applied Chemistry, 2014.
MANO, D. M. et al. Cationic topical formulations tested in high dilutions offers protective effects in fibroblast cells culture. International Journal of High Dilution Research, Vol 13. N, 48. 2014.
A
RYAN, G.B.; MAJNO, G. Acute Inflammation: A Review. AM. J. Pathol., v. 86, p. 185-276, 1997.
RINGLER, D.J. Inflamação e reparo. In: JONES, T.C. et al. Patologia veterinária. São Paulo: Manole, 2000. Cap.5, p.119-165.
Sunila, E.S; Kuttan et al. Dynamized Preparations in Cell Culture. AmalaCancerResearch Centre. India: 2007.
VAZ, A.P.A.; JORGE, M.H.A. Calêndula – Série
Plantas Medicinais, Condimentares e Aromáticas. Corumbá: Embrapa Pantanal, Brasil: 2006. Disponível
em: <
http://www.cpap.embrapa.br/publicacoes/online/FOL75. pdf >. Acessado em 21/05/2016.
WATSON, D. J. et al. Biologia Molecular do Gene. 5ª
