Silvani Verruck
MICROENCAPSULAÇÃO DE Bifidobacterium BB-12
COM LEITE DE CABRA E PREBIÓTICOS:
APLICAÇÃO EM FROZEN IOGURTE E AVALIAÇÃO
DAS SUAS PROPRIEDADES FUNCIONAIS IN VITRO
Florianópolis 2019
Silvani Verruck
MICROENCAPSULAÇÃO DE Bifidobacterium BB-12
COM LEITE DE CABRA E PREBIÓTICOS:
APLICAÇÃO EM FROZEN IOGURTE E AVALIAÇÃO
DAS SUAS PROPRIEDADES FUNCIONAIS IN VITRO
Tese submetida ao Programa de Pós Graduação em Ciência dos Alimentos da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de doutora em Ciência dos Alimentos. Orientadora: Profa. Dra. Elane Schwinden Prudêncio
Florianópolis 2019
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária
Silvani Verruck
MICROENCAPSULAÇÃO DE Bifidobacterium BB-12 COM LEITE DE CABRA E PREBIÓTICOS: APLICAÇÃO EM
FROZEN IOGURTE E AVALIAÇÃO DAS SUAS PROPRIEDADES FUNCIONAIS IN VITRO
Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutora em Ciência dos Alimentos, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos.
Florianópolis, 22 de fevereiro de 2019.
________________________ Profa. Ana Carolina Costa, Dra.
Coordenadora do Programa Banca Examinadora:
________________________ Prof.ª Elane Schwinden Prudêncio, Drª.
Orientadora - UFSC ________________________
Prof.ª Neila Silvia Pereira dos Santos Richards, Dr.ª UFSM
_______________________ Prof.ªAdriano Gomes da Cruz, Dr.
IFRJ
________________________ Prof.ª Sheila Mello da Silveira, Dr.ª
IFC
_______________________ Prof.ª Carmen Maria de Olivera Müller, Dr.ª
Dedico este trabalho aos meus pais, por todo o apoio e incentivo e ao Joel por estar ao meu lado em todos os momentos.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Santa Catarina e ao Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, pela oportunidade de realizar o doutorado.
À minha orientadora Profa. Dra. Elane Schwinden Prudêncio, a quem eu serei eternamente grata por tudo que fez e faz por mim. Tenho um profundo respeito, carinho e admiração pela professora e profissional que és. Muito do que eu sou hoje eu devo a ti e ao seu apoio. Muito mais que minha orientadora, és uma amiga que vou levar para toda a minha vida. Muito obrigada por todas as oportunidades que me deste, por ter me ensinado a ser mais que uma aluna e me dar asas para me tornar uma pesquisadora. Uma parte sua estará sempre comigo, onde eu estiver.
À Profa. Dra. Sheila Mello da Silveira por me ensinar os primeiros passos na pesquisa e pelo incentivo a seguir a vida acadêmica. Obrigada por acreditar em mim quando eu mesma ainda não acreditava e por aceitar ser membro da banca de defesa. Gratidão.
À Profa. Dra. Carmen Maria de Olivera Müller, pela ajuda e ensinamentos na área de propriedades físicas dos alimentos e por aceitar ser membro da banca de defesa.
À Profa. Dra. Neila Richards por aceitar o convite para relatar este documento, por suas considerações e por aceitar ser membro da banca de defesa.
À Profa. Dra. Marília Miotto pela ajuda nas análises de qPCR da Escherichia coli.
À Profa. Dra. Cleide Rosana Werneck Vieira, pela colaboração com as análises de simulação gastrointestinal in vitro.
Ao Prof. Dr. Adriano Gomes da Cruz pelas oportunidades e por aceitar ser membro da banca de defesa.
Ao Prof. Dr. Pedro Luiz Manique Barreto e seus alunos do Laboratório de Reologia de Alimentos (LABRINTO) por sempre estarem à disposição quando precisei usar o Spray Dryer.
Aos colegas do Laboratório de Leite e Derivados e do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia de Alimentos pela ajuda e companhia durante esse período. Em especial à Gabriela Rodrigues de Liz pela ajuda desde as análises do mestrado e à Clarissa Barreta pela ajuda nas análises de qPCR da Escherichia coli. Vocês foram fundamentais.
Ao Laboratório Central de Microscopia Eletrônica (LCME) da UFSC, pela utilização do Microscópio Eletrônico de Varredura e do Microscópio Confocal de Varredura à Laser.
Ao Laboratório de Materiais Poliméricos (POLIMAT) do Departamento Química da UFSC e à Fabiani Santana pela ajuda com a análise termogravimétrica.
À Central de Análises do Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos da UFSC pelo auxílio na análise de calorimetria diferencial de varredura (DSC).
Ao Ângelo Paggi Matos pela ajuda com os corantes da microscopia confocal.
À Daiane Pierosan pelo auxílio com algumas figuras da tese. Ao Guilherme Hassemer pela revisão do inglês em alguns capítulos da tese.
À banca, por aceitar o convite de participação e pelas considerações.
À minha família pelo constante incentivo, em especial ao Joel por me apoiar e estar comigo em todos os momentos e aos meus pais, Seni e Alcindo, por compreenderem a minha constante ausência neste período.
Aos professores, funcionários e colegas do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos.
A CAPES pela bolsa de estudos e ao CNPq pelo apoio financeiro através do projeto Universal (Processo nº 471942/2012-0) e projeto Universal (Processo nº 405965/2016-8).
À empresa Christian Hansen, pela doação da cultura de Bifidobacterium BB-12.
À empresa Beneo Orafti, pela doação dos prebióticos inulina e oligofrutose.
A todos que contribuíram para a realização deste trabalho. Muito obrigada!
“No man is an island entire of itself; every man is a piece of the continent, a part of the main;
if a clod be washed away by the sea, Europe is the less,
as well as if a promontory were, as well as any manner of thy friends or of thine own were;
any man's death diminishes me, because I am involved in mankind. And therefore never send to know for whom the bell tolls;
it tolls for thee.”
John Donne
RESUMO
Este documento se encontra dividido nos seguintes capítulos: (a) Capítulo 1 - Funcionalidade dos componentes do leite de cabra, avanços recentes no desenvolvimento de produtos lácteos funcionais e suas implicações na saúde humana. Esta revisão apresenta um quadro completo do conhecimento atual das características e vantagens do leite de cabra como um potencial alimento funcional. Ele também fornece a base teórica necessária e alguns detalhes sobre o uso de prebióticos e/ou probióticos em produtos lácteos caprinos. Portanto, foram abordados alguns dos fatores que tornam a combinação de leite de cabra e ingredientes funcionais uma das áreas de pesquisa mais promissoras no campo da moderna indústria de laticínios caprinos. (b) Capítulo 2 - Sobrevivência de Bifidobacterium ssp. durante a passagem gastrointestinal e seu mecanismo de ação para inibição de bactérias patogênicas no intestino: uma breve revisão. Esta revisão apresenta uma visão concisa e direta do conhecimento atual sobre a sobrevivência das cepas de bifidobactérias durante a passagem pelo sistema gastrointestinal humano. Ela também fornece a base teórica necessária e detalhes sobre mecanismos de ação de bifidobactérias contra bactérias patogênicas. Também reportaremos alguns dos fatores que tornam a combinação de alimentos e bifidobactérias um dos tópicos de pesquisa mais promissores no campo da moderna ciência de alimentos. (c) Capítulo 3 - Técnicas para a microencapsulação de bactérias probióticas na incorporação e desenvolvimento de novos produtos lácteos. Este capítulo descreve as principais técnicas de microencapsulação de bactérias probióticas, tais como spray drying, spray cooling, spray freeze drying, spray dryer ultrassônico, extrusão, emulsão, recobrimento em leito fluidizado, encapsulamento através da coagulação-formação de gel de proteínas, liofilização, sistema de hibridação, encapsulamento por aerossol e electrospinning, bem como foram descritos os agentes encapsulantes mais utilizados nestes processos. (d) Capítulo 4 - Metodologias de caracterização de microcápsulas com bactérias probióticas para serem adicionadas em derivados lácteos. Este capítulo descreve a caracterização das microcápsulas probióticas através de análises morfológicas, de umidade, atividade de água, solubilidade, análises térmicas, densidade, fluidez, coesividade e análises de cor. Além disso, aborda a estabilidade das bactérias probióticas microencapsuladas durante a passagem através do sistema gastrointestinal, o processamento e armazenamento, bem como
suas aplicações em derivados lácteos e seu impacto na indústria de alimentos. (e) Capítulo 5 – Sobrevivência de Bifidobacterium BB-12 microencapsulada com leite de cabra integral e prebióticos quando exposta a condições gastrointestinais simuladas e tratamentos térmicos. Neste estudo utilizou-se leite de cabra integral e/ou prebióticos (inulina e/ou oligofrutose) como agentes encapsulantes de Bifidobacterium BB-12 visando minimizar os danos à bactéria probiótica e otimizar a contagem de células viáveis após o processo de microencapsulação. O efeito protetor dos agentes encapsulantes também foi avaliado quando as células livres e as microcápsulas foram submetidas às condições gastrointestinais simuladas in vitro e após tratamento térmico. A contagem mais alta de células viáveis (9,58 log UFC g-1) e o rendimento de encapsulação (97,43%) foram observados para as microcápsulas que foram produzidas apenas com leite de cabra integral. Após serem submetidas às condições gastrointestinais simuladas in vitro, observou-se o melhor resultado da taxa de sobrevivência probiótica para as microcápsulas produzidas com leite de cabra integral (94,29%), seguidas das produzidas com leite de cabra integral e inulina (86,77%). Todos os agentes encapsulantes melhoraram a sobrevivência das bifidobactérias após as microcápsulas terem sido submetidas a tratamentos térmicos. (f) Capítulo 6 – Efeito do uso de leite de cabra integral e prebióticos na sobrevivência de Bifidobacterium BB-12 e nas propriedades físicas do pó ao longo do armazenamento. Neste artigo, os efeitos do leite integral de cabra e/ou inulina e/ou oligofrutose, como agentes carreadores, foram investigados para melhorar as taxas de sobrevivência de Bifidobacterium BB-12 e as propriedades físicas das microcápsulas nas condições de armazenamento. No dia da sua fabricação, as microcápsulas foram avaliadas quanto à morfologia, tamanho de partícula e distribuição de gordura e bifidobactérias. A viabilidade das bifidobactérias, umidade e teor de gordura, atividade de água, solubilidade, densidade, fluidez, coesividade e propriedades de cor foram avaliadas por 120 dias a 4 ºC e a 25 ºC. O leite em pó integral de cabra com ou sem inulina como agentes encapsulantes apresentou as maiores taxas de sobrevivência de Bifidobacterium BB-12 após o spray drying e armazenamento. Ambos os pós apresentaram as propriedades físicas mais desejáveis, que podem ser creditados ao leite de cabra integral (200 g L-1) e à presença de inulina (100 g L-1), além do teor de gordura mostrando alta correlação com os valores de solubilidade. O menor volume ocupado pelos pós foi observado quando a oligofrutose foi usada como agente carreador. As
amostras que apresentaram presença de rachaduras influenciaram os valores obtidos para viabilidade, atividade de água, solubilidade, densidade, fluidez e coesividade. Em relação aos parâmetros de cor, menor estabilidade foi observada quando a oligofrutose foi utilizada, enquanto a melhor estabilidade também foi observada para os pós com leite de cabra integral e/ou inulina. Durante o tempo de armazenamento, o melhor desempenho foi alcançado pelo processo de microencapsulação que usou apenas leite de cabra integral e/ou inulina e armazenamento a 4 °C. (g) Capítulo 7 – Propriedades térmicas e de sorção de água de microcápsulas de Bifidobacterium BB-12 obtidas com uso de leite de cabra e prebióticos. Neste estudo, os pós contendo as microcápsulas de Bifidobacterium BB-12 com leite de cabra e/ou prebióticos (inulina e/ou oligofrutose) foram caracterizados quanto às suas propriedades térmicas e de sorção de água. As propriedades térmicas das amostras mostraram que a adição de prebióticos contribuiu para a maior estabilidade térmica, destacando as microcápsulas produzidas com inulina. Em relação às propriedades de sorção de água, o modelo de Peleg ajustou-se bem aos dados experimentais, fornecendo valores adequados da taxa de transferência de massa inicial. A isoterma encontrada para a amostra com leite de cabra integral com ou sem oligofrutose foi uma Isoterma Sigmoide (Tipo II), comumente observada na maioria dos alimentos. O uso de inulina resultou em uma mudança da curva de isoterma do Tipo II para o Tipo III, onde os mecanismos de relaxamento molecular e as forças de adsorção são fracos. Portanto, as condições de umidade relativa acima de 43% e 11% podem ser responsáveis pela diminuição da estabilidade de armazenamento dos pós secos por atomização, que continham as microcápsulas. (h) Capítulo 8 – Eficiência de inativação de Escherichia coli por Bifidobacterium BB-12 microencapsulada e adicionada em Frozen Yogurt durante as condições gastrointestinais simuladas do intestino grosso. Neste trabalho, o objetivo foi verificar a interação de Bifidobacterium BB-12 microencapsulada e adicionado em Frozen Yogurt com a bactéria patogênica Escherichia coli no intestino grosso. Para isto, leite de cabra (200 g/L) e leite de cabra (100 g/L) e inulina (100 g/L) foram utilizados como agentes encapsulantes de Bifidobacterium BB-12 e aplicados em Frozen Iogurte (GF2 e GF3, respectivamente). A simulação da digestão gastrintestinal ocorreu de forma sequencial, considerando-se a boca, esôfago-estômago, duodeno, íleo, cólon ascendente, transverso e descendente. A cepa Escherichia coli ATCC 25922 foi usada como modelo de bactéria patogênica e
adicionada no início da etapa ascendente do cólon. Uma amostra de controle contendo apenas E. coli (GF1) foi realizada. A quantificação de Bifidobacterium BB-12 foi realizada usando contagem de placas enquanto a contagem de E. coli foi comparada com quantificação por qPCR com diferenciação de células viáveis e não viáveis. No cólon ascendente, todas as amostras apresentaram contagens de E. coli de aproximadamente 5 log UFC g-1 por contagem de placas e por qPCR. A contagem de Bifidobacterium BB-12 foi <1,0, 9,23 e 9,11 log UFC g-1 para GF1, GF2 e GF3, respectivamente. Ao longo do cólon transverso (24h) e do cólon descendente (48h), as amostras GF2 e GF3 mostraram diminuição na contagem de E. coli e manutenção na contagem de bifidobactérias. A produção de ácidos orgânicos por bifidobactérias está diretamente relacionada à diminuição da contagem de E. coli. A amostra GF3 apresentou maior decréscimo de E. coli no cólon descendente devido à característica bifidogênica da inulina. Na contagem em placas, a E. coli não foi detectada para a amostra GF3 no cólon descendente. No entanto, quando quantificada por qPCR a amostra apresentou amplificação que correspondeu a 3 log UFC g-1. Desta forma, foi possível observar o fenômeno das células viáveis, mas não cultiváveis, de E. coli. Finalmente, recomenda-se a microcápsula produzida com leite de cabra e inulina para aplicação em produtos lácteos de cabra, devido ao melhor efeito antagonista frente a E. coli.
Palavras-chave: leite de cabra, desenvolvimento de alimentos, inovação, bactérias probióticas, alimento funcional, bifidobacteria, sistema gastrointestinal, inibição de patógenos alimentares, mecanismos de ação, microencapsulação, Spray drying, inulina, oligofrutose, simulação das condições gastrointestinais, condições de estresse, encapsulamento probiótico, análise térmica, isoterma de adsorção, efeito antagonista, bactéria patogênica, simulação do intestino grosso.
ABSTRACT
This document is divided into the following chapters: (a) Chapter 1 - Functionality of the components from goat’s milk, recent advances for functional dairy products development and its implications on human health. This review presents a comprehensive picture of current knowledge of the characteristics and advantages of goat's milk as a potential functional food. It also provides the theoretical background and some details about the use of prebiotics and / or probiotics in goat’s milk products. Therefore, some of the factors that make the combination of goat's milk and functional ingredients one of the most promising research areas in the modern dairy goat industry were addressed. (b) Chapter 2 - Survival of Bifidobacterium ssp. during gastrointestinal passage and their mechanism of action for pathogenic bacteria inhibition in the gut: a concise review. This review presents a concise and direct view of current knowledge on the survival of strains of bifidobacteria during passage through the human gastrointestinal system. It also provides the necessary theoretical basis and details on the mechanisms of action of bifidobacteria against pathogenic bacteria. It was also reported some of the factors that make foods and bifidobacteria combination one of the most promising research topics in the field of modern food science. (c) Chapter 3 - Techniques for the microencapsulation of probiotic bacteria in the incorporation and development of new dairy products. This chapter describes the main microencapsulation techniques of probiotic bacteria, such as spray drying, spray cooling, spray freeze drying, ultrasonic spray dryer, extrusion, emulsion, fluidized bed coating, encapsulation through coagulation-protein gel formation, lyophilization, hybridization system, aerosol encapsulation and electrospinning, as well as the encapsulating agents most used in these processes have been described. (d) Chapter 4 - Methodologies for the characterization of microcapsules with probiotic bacteria to be added in dairy products. This chapter describes the characterization of probiotic microcapsules through morphological analysis, moisture, water activity, solubility, thermal analysis, density, fluidity, cohesiveness and color analysis. In addition, it addresses the stability of microencapsulated probiotic bacteria during passage through the gastrointestinal system, processing and storage, as well as their applications in dairy products and their impact on the food industry. (e) Chapter 5 – Survival of Bifidobacterium BB-12 microencapsulated with full-fat goat’s milk and prebiotics when
exposed to simulated gastrointestinal conditions and thermal treatments. In this study, full-fat goat’s milk and/or prebiotics (inulin and/or oligofructose) were used as carrier agents aiming to minimize the damage on the Bifidobacterium BB-12 and optimize viable cell count after the microencapsulation process. The protective effect was also evaluated when the free cells and the microcapsules were submitted to in vitro simulated gastrointestinal conditions and after undergoing thermal treatments. The highest viability count (9.58 log CFU g-1) and encapsulation yield (97.43%) were noted for the microcapsules that were produced with full-fat goat’s milk only. After being submitted to in vitro simulated gastrointestinal conditions, the best probiotic survival rate result was noted for the microcapsules produced with full-fat goat’s milk (94.29%), followed by those produced with full-fat goat’s milk and inulin (86.77%). All of the carrier agents improved the survival of the bifidobacteria after the microcapsules underwent thermal treatments. (f) Chapter 6 – Effect of full-fat goat’s milk and prebiotics use on Bifidobacterium BB-12 survival and on the physical properties of spray-dried powders under storage conditions. In this study, the effects of full-fat goat’s milk and/or inulin and/or oligofructose, as carrier agents, were investigated to improve the survival rates of Bifidobacterium BB-12, and the physical properties of the microcapsules under storage conditions. On the day of their manufacture, the microcapsules were evaluated for morphology, particle size, and distribution of fat and bifidobacteria. The viability of the bifidobacteria, moisture and fat content, water activity, solubility, bulk and tapped density, flowability, cohesiveness and color properties were evaluated for 120 days at 4 ºC and at 25 ºC. The full-fat goat’s milk powder with or without inulin as encapsulating agents showed the highest survival rates of Bifidobacterium BB-12 after spray drying and storage. Both of these spray-dried powders showed the more desirable physical properties, which could only be credited to full-fat goat’s milk (200 g L-1) and to the presence of inulin (100 g L-1), besides the fat content showing high correlation with the solubility values. The lowest volume occupied by the spray-dried powders was noted when oligofructose was used as the carrier agent. The samples that showed presence of cracks influenced on the values obtained for viability, water activity, solubility, density, flowability, and cohesiveness. In relation to the color parameters, smaller stability was noted when oligofructose was used, while the best stability was also noted for the powders with full-fat goat’s milk and/or inulin. During storage time, the best performance
was achieved by the microencapsulation process that used only full-fat goat’s milk and/or inulin and storage at 4 °C. (g) Chapter 7 – Thermal and water sorption properties of Bifidobacterium BB-12 microcapsules obtained from goat’s milk and prebiotics. In this chapter, the spray-dried powders with Bifidobacterium BB-12 microcapsules with full-fat goat’s milk and/or prebiotics (inulin and/or oligofructose), were characterized about their thermal and water sorption properties. The samples’ thermal properties showed that the addition of prebiotics contributed to the higher thermal stability, highlighting the microcapsules produced with inulin. Regarding the water sorption properties, the Peleg model fitted well to the experimental data, providing adequate values of the initial mass transfer rate. The isotherm found for the sample with full-fat goat’s milk with or without oligofructose was a Sigmoid Isotherm (Type II), commonly observed in most foods. The inulin use resulted in a change from Type II to Type III isotherm curve, where the molecular relaxation mechanisms and the adsorption forces are weak. Therefore, the relative humidity conditions above 43% and 11% can be responsible by a decrease of the storage stability of spray-dried powders, with microcapsules. (h) Chapter 8 – Evaluation of the interaction between microencapsulated Bifidobacterium BB-12 added in goat’s milk Frozen Yogurt and Escherichia coli in the large intestine In this chapter, goat milk (200 g/L) and goat milk (100 g/L) and inulin (100 g/L) were used as encapsulating agents of Bifidobacterium BB-12 and then applied in Frozen Yogurt (GF2 and GF3, respectively). The simulation of gastrointestinal digestion occurred sequentially considering the mouth, esophagus-stomach, duodenum, ileum, ascending, transverse, and descending colon. The strain Escherichia coli ATCC 25922 was used as a model of pathogenic bacteria and added at the beginning of the ascending colon step. A control sample containing only E. coli (GF1) was performed. Quantification of Bifidobacterium BB-12 was performed using plate counting while the E. coli count was compared with quantification by qPCR with viable and nonviable cell differentiation. In the ascending colon, all samples showed E. coli counts of approximately 5 log CFU g-1 by plate counting and by qPCR. The Bifidobacterium BB-12 count was <1.0, 9.23 and 9.11 log CFU g-1 for GF1, GF2 and GF3, respectively. Throughout the transverse (24h) and descending colon (48h) samples GF2 and GF3 showed decrease in E. coli and maintenance of bifidobacteria counts. The production of organic acids by bifidobacteria was directly related to the decrease in the
E. coli count. GF3 showed higher decrease of E. coli in the descending colon because of inulin bifidogenic characteristic. In plate counts, E. coli was not detected for the GF3 sample in the descending colon. However, when quantified by qPCR the sample presented amplification that corresponded to 3 log CFU g-1. In this way, it was possible to observe the phenomenon of the viable but not-culturable cells of E. coli. Finally, it is recommended the microcapsule produced with goat milk and the inulin for application in goat milk products, due to the better antagonist effect against E. coli.
Keywords: goat's milk, food development, innovation, probiotic bacteria, functional food, bifidobacteria, gastrointestinal system, inhibition of food pathogens, mechanisms of action, microencapsulation, spray drying, inulin, oligofructose, simulation of gastrointestinal conditions, stress, probiotic encapsulation, thermal analysis, adsorption isotherm, antagonistic effect, pathogenic bacteria, colon simulation.
LISTA DE FIGURAS PARTE 1
CAPÍTULO 1
Figura 1.1 Resumo dos principais agentes responsáveis pelos efeitos benéficos do leite de cabra.
68
Figura 1.2 Atividade biológica de peptídeos bioativos do leite. Adaptado de Korhonen (2009).
71
Figura 1.3 Principais estruturas oligossacarídicas encontradas no leite de cabra. Adaptado de Martinez-Ferez et al. (2006).
74
Figura 1.4 Produtos lácteos funcionais de leite de cabra e adição de prebióticos, probióticos ou simbióticos.
79
Figura 1.5 Resumo de estudos in vivo com produtos lácteos funcionais de leite de cabra, cepas utilizadas e efeitos sobre a saúde.
101
CAPÍTULO 2
Figura 2.1 Resumo da atividade antibacteriana das bifidobactérias.
134
CAPÍTULO 3
Figura 3.1 Morfologia de diferentes tipos de microcápsulas. 155 Figura 3.2 Representação esquemática do processo de
microencapsulação pela técnica de spray drying. 157
Figura 3.3 Representação esquemática do processo de microencapsulação pela técnica de recobrimento em leito fluidizado.
169
Figura 3.4 Representação esquemática do processo de microencapsulação pela técnica de extrusão.
Figura 3.5 Representação esquemática do processo de microencapsulação pela técnica de emulsão.
174
Figura 3.6 Representação esquemática do processo de microencapsulação pela técnica de aerossol.
180
Figura 3.7 Representação esquemática do processo de microencapsulação pela técnica de eletrospinning.
181
CAPÍTULO 4
Figura 4.1 Morfologia de Bifidobacterium BB-12 microencapsulada com leite de cabra integral por microscopia eletrônica de varredura.
206
PARTE 2 CAPÍTULO 5
Figura 5.1 Sobrevivência de Bifidobacterium BB-12 livre e microencapsulada após cada etapa das condições gastrointestinais simuladas. (a) GM (●) e GMC (○); (b) GMI (●) e GMIC (○); (c) GMO (●) e GMOC (○); (d) GMIO (●) e GMIOC (○); (e) Células livres (●) e Células livres C (○). GM: microcápsulas produzidas com leite de cabra em pó integral (200 g L-1). GMI: microcápsulas produzidas com leite de cabra em pó integral (100 g L-1) e inulina (100 g L-1). GMO: microcápsulas produzidas com leite de cabra em pó integral (100 g L-1) e oligrofrutose (100 g L -1
). GMIO: microcápsulas produzidas com leite de cabra em pó integral (100 g L-1), inulina (50 g L-1) e oligofrutose (50 g L-1). Células livres: Bifidobacterium BB-12 não microencapsulada. A letra C após cada identificação respectiva representa as amostras não expostas às condições gastrointestinais simuladas, ou seja, usadas apenas como controle. As barras de erro representam o desvio padrão da média.
Figura 5.2 Resultados da sobrevivência de Bifidobacterium BB-12 livre e microencapsulada após sua exposição a (a) 55ºC, (b) 65ºC, e (c) 75ºC por 5 min ( ), 10 min ( ) e 15 min ( ), respectivamente. As barras de erro representam o desvio padrão da média. GM: microcápsulas produzidas com leite de cabra em pó integral (200 g L-1). GMI: microcápsulas produzidas com leite de cabra em pó integral (100 g L-1) e inulina (100 g L-1). GMO: microcápsulas produzidas com leite de cabra em pó integral (100 g L-1) e oligrofrutose (100 g L-1). GMIO: microcápsulas produzidas com leite de cabra em pó integral (100 g L-1), inulina (50 g L-1) e oligofrutose (50 g L-1). Células livres: Bifidobacterium BB-12 não microencapsulada.
274
CAPÍTULO 6
Figura 6.1 Contagem de células viáveis de Bifidobacterium BB-12 das microcápsulas durante 120 dias de armazenamento a (a) 4 ± 1°C e (b) 25 ± 1°C. (□) GM1, (○) GMI2, (Δ) GMO3 e (◊) GMIO4. Barras de erro representam o desvio padrão da média do experimento.
300
Figura 6.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) de microcápsulas de Bifidobacterium BB-12: GM1 (a,b); GMI2 (c,d); GMO3 (e,f); e GMIO4 (g,h). Setas pretas indicam concavidades nas superfícies das microcápsulas. Setas brancas indicam rachaduras nas superfícies das microcápsulas.
302
Figura 6.3 Micrografias por microscopia confocal de varredura a laser (CSLM) de microcápsulas de Bifidobacterium BB-12: GM1 (a,b); GMI2 (c,d); GMO3 (e,f); e GMIO4 (g,h). A barra de escala é igual a 10 µm. As cores amarela e azul indicam o
glóbulo de gordura do leite e a presença de Bifidobacterium, respectivamente. (Para interpretação das referências a cor nesta legenda da figura, o leitor deve se encaminhar para a versão web deste artigo).
CAPÍTULO 7
Figura 7.1 Curvas de TGA ( __ ) (linha sólida) e DrTGA ( _ _ _ ) (linha tracejada espessa) de (a) leite de cabra integral em pó puro, (b) inulina (DP >10), e (c) oligofrutose (DP = 2-8) usados para a produção das microcápsulas.
334
Figura 7.2 Curvas de TGA ( __ ) (linha sólida) e DrTGA ( _ _ _ ) (linha tracejada espessa) das microcápsulas GM1, GMI2, GMO3, e GMIO4, produzidas com: (a) leite de cabra integral e Bifidobacterium BB-12; (b) leite de cabra integral, inulina e Bifidobacterium BB-12; (c) leite de cabra integral, oligofrutose e Bifidobacterium BB-12; e (d) leite de cabra integral, inulina, oligofrutose e Bifidobacterium BB-12.
336
Figura 7.3 Curvas de DSC das microcápsulas GM1, GMI2, GMO3, e GMIO4, produzidas com: (a) leite de cabra integral e Bifidobacterium BB-12; (b) leite de cabra integral, inulina e Bifidobacterium BB-12; (c) leite de cabra integral, oligofrutose e Bifidobacterium BB-12; e (d) leite de cabra integral, inulina, oligofrutose e Bifidobacterium BB-12.
338
Figura 7.4 Cinética de adsorção de água das microcápsulas GM1, GMI2, GMO3, e GMIO4, produzidas com: (a) leite de cabra integral e Bifidobacterium BB-12; (b) leite de cabra integral, inulina e Bifidobacterium BB-12; (c) leite de cabra integral, oligofrutose e Bifidobacterium BB-12; e (d) leite de cabra integral, inulina, oligofrutose e Bifidobacterium BB-12; ajustadas ao modelo de Peleg (linha sólida) (R² > 0.99).
Figura 7.5 Isotermas de adsorção de água das microcápsulas GM1, GMI2, GMO3, e GMIO4, produzidas com: (a) leite de cabra integral e Bifidobacterium BB-12; (b) leite de cabra integral, inulina e Bifidobacterium BB-12; (c) leite de cabra integral, oligofrutose e Bifidobacterium BB-12; e (d) leite de cabra integral, inulina, oligofrutose e Bifidobacterium BB-12; ajustadas ao modelo de GAB (linha sólida) (R² > 0.99).
345
CAPÍTULO 8
Figura 8.1 Condições utilizadas em cada etapa das condições gastrointestinais simuladas.
364
Figura 8.2 Alterações no pH (□) e no teor de ácido láctico (○) durante a interação de Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 com Escherichia coli na passagem pelo cólon ascendente, transverso e descendente. (a) Amostra de frozen iogurte sem adição de B. animalis subsp. lactis BB-12; b) Amostra de frozen iogurte contendo microcápsulas de Bifidobacterium BB-12 produzidas com leite de cabra; e (c) Amostra de frozen iogurte contendo microcápsulas de Bifidobacterium BB-12 produzidas com leite de cabra e inulina.
370
Figura 8.3 Alterações no pH (□) e no teor de ácido acético (○) durante a interação de Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 com Escherichia coli na passagem pelo cólon ascendente, transverso e descendente. (a) Amostra de frozen iogurte sem adição de B. animalis subsp. lactis BB-12; b) Amostra de frozen iogurte contendo microcápsulas de Bifidobacterium BB-12 produzidas com leite de cabra; e (c) Amostra de frozen iogurte contendo microcápsulas de
Bifidobacterium BB-12 produzidas com leite de cabra e inulina.
LISTA DE TABELAS PARTE 1
CAPÍTULO 1
Tabela 1.1 Comparação entre a composição dos principais ácidos graxos (%) do leite de cabra e do leite de vaca.
69
Tabela 1.2 Comparação da composição proteica do leite de cabra com o leite de vaca.
70
Tabela 1.3 Cepas probióticas usadas na fabricação de produtos lácteos de cabra.
83
Tabela 1.4 Cepas probióticas em associação com substâncias prebióticas usadas na fabricação de produtos lácteos de cabra.
97
CAPÍTULO 2
Tabela 2.1 Cepas probióticas de Bifidobacterium utilizadas em produtos comerciais ou estudadas in vitro e em humanos.
130
CAPÍTULO 3
Tabela 3.1 Diferentes agentes encapsulantes utilizados para a microencapsulação de cepas de Bifidobacterium spp. por spray drying.
159
CAPÍTULO 4
Tabela 4.1 Classificação da fluidez e coesividade de pós com base no índice de Carr e na razão de Hausner, respectivamente.
216
Tabela 4.2 Exemplos de microcápsulas probióticas aplicadas em iogurtes e queijos.
PARTE 2 CAPÍTULO 5
Tabela 5.1 Composição das soluções de alimentação empregadas na microencapsulação de Bifidobacterium BB-12 por spray drying.
261
Tabela 5.2 Condições de processamento utilizadas em cada etapa das condições gastrointestinais simuladas, adaptadas de Verruck et al. (2015).
262
Tabela 5.3 Contagem de células viáveis de Bifidobacterium BB-12 nas soluções de alimentação (antes da secagem por spray drying) e nas microcápsulas (após secagem por spray drying) produzidas com diferentes agentes encapsulantes e os seus rendimentos de encapsulação (EY).
266
Tabela 5.4 Taxas de sobrevivência (%) de Bifidobacterium BB-12 livre e microencapsulada após cada etapa das condições gastrointestinais simuladas.
270
Tabela 5.5 Efeito dos tratamentos térmicos na viabilidade de Bifidobacterium BB-12 livre e microencapsulada com diferentes agentes carreadores.
275
CAPÍTULO 6
Tabela 6.1 Contagem de células viáveis de Bifidobacterium BB-12 das soluções de alimentação e microcápsulas.
299
Tabela 6.2 Propriedades morfológicas de microcápsulas de Bifidobacterium BB-12 por MEV e CLSM.
304
Tabela 6.3 Teor de umidade, atividade de água, teor de gordura e solubilidade das microcápsulas de Bifidobacterium BB-12 ao longo do armazenamento.
307
Tabela 6.4 Densidade aparente, densidade compactada, fluidez e coesividade das microcápsulas de Bifidobacterium BB-12 ao longo do armazenamento.
310
Tabela 6.5 Parâmetros de cor (L*, a*, b*, C*, h*, ∆E*) das microcápsulas ao longo do armazenamento.
CAPÍTULO 7
Tabela 7.1 Temperatura de DTGpico das medições termogravimétricas dos materiais puros e microcápsulas (R² > 0.99).
333
Tabela 7.2 Constantes de Peleg da taxa inicial de adsorção de água (1/k1) (g água. (g sólido seco.h)-1) e capacidade de adsorção de água (1/k2) (g água. g sólido seco-1) das microcápsulas.
341
Tabela 7.3 Parâmetros de ajuste do modelo GAB (Xm, C, k) para os dados experimentais das microcápsulas (R² > 0.99).
346
CAPÍTULO 8
Tabela 8.1 Contagem de Bifidobacterium animalis subps. lactis BB-12 e comparação das contagens de Escherichia coli por qPCR e contagem em placa durante a passagem pelo cólon ascendente (0, 6, 12h), transverso (24 e 36h), e descendente (48h).
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Ala – Alanine
ANOVA – Analysis of Variance
AOAC – Association of Official Agricultural Chemists ATCC – American Type Culture Collection
ATP – Adenosina Trifosfato aw – Atividade de Água
BET – Modelo de Brunauer, Emmett e Teller BOD – Biochemical Oxygen Demand Ca – Calcium
CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CFU – Colony-Forming Unit CI – Carr’s index
CIELAB – Escala L* a* b* da Comissão Internacional de Eclairage CLA – Conjugated Linoleic Acid
CN – Casein
CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Cr – Chrome
CSLM – Confocal Laser Scanning Microscopy Cu – Copper
DAPI – Corante 4',6-Diamidino-2-phenylindole DE – Dextrose Equivalente
DNA – Deoxyribonucleic Acid DP – Degree of Polymerization
DrTGA – Derivative Thermogravimetry DSC – Calorimetria Diferencial de Varredura EY – Encapsulation Yield
FA – Fatty Acids
FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations FAOSTAT – Statistics of Food and Agriculture Organization of the United Nations
Fe – Iron
FFA – Free Fatty Acids
GAB – Modelo de Guggenheim, Anderson e Boer
GM – Feed solution produced with full-fat goat’s milk powder GM1 – Microcapsules produced with full-fat goat’s milk powder GMI – Feed solution produced with full-fat goat’s milk powder inulin GMI2 – Microcapsules produced with full-fat goat’s milk powder inulin
GMIO – Feed solution produced with full-fat goat’s milk powder, inulin and oligofructose
GMIO3 – Microcapsules produced with full-fat goat’s milk powder, inulin and oligofructose
GMO – Feed solution produced with full-fat goat’s milk powder and oligofructose
GMO4 – Microcapsules produced with full-fat goat’s milk powder and oligofructose
HR – Hausner Ratio
IDF – International Dairy Federation LAB – Lactic Acid Bacteria
Log – Logaritmo Lys – Lysine MA – Massachusetts MF – Membrane Filter Mg – Magnesium Mn – Manganese MO – Missouri
MRS – De Man, Rogosa and Sharpe ND – Not detected
P – Phosphorus
PBS – Phosphate Buffered Saline PUFA – Polyunsaturated Fatty Acids PWP – Polymerized Whey Protein RH – Relative Humidity
RNA – Ribonucleic Acid Rod. – Rodovia
SA – Sodium Alginate
SACH – Sodium Alginate-Casein Hydrolysate SACM – Sodium Alginate-Cow Milk
SAGM – Sodium Alginate-Goat Milk SC – Santa Catarina
Se – Selenium
SEM – Scanning Electron Microscopy Tg – Temperatura de Transição Vítrea TGA – Análise Termogravimétrica UFC – Unidades Formadoras de Colônias UHT – Ultra-High Temperature
UK – United Kingdom
USP – United States Pharmacopeia WHC – Water Holding Capacity WHO – World Health Organization WP – Whey Protein
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO 47
REFERÊNCIAS 52
PARTE 1 – REVISÃO DE LITERATURA 57
CAPÍTULO 1 – Funcionalidade dos componentes do leite de cabra, avanços recentes no desenvolvimento de produtos lácteos funcionais e suas implicações na saúde humana
59
RESUMO 61
ABSTRACT 63
1. INTRODUÇÃO 65
2. COMPOSIÇÃO E FUNCIONALIDADE DOS
COMPONENTES DO LEITE DE CABRA
67 3. CARACTERÍSTICAS SENSORIAIS E TECNOLÓGICAS DO LEITE DE CABRA
74
4. ALIMENTOS FUNCIONAIS 77
4.1 Produtos lácteos prebióticos de leite de cabra 79 4.2 Produtos probióticos de leite de cabra 81 4.3 Produtos simbióticos de leite de cabra 95 5. ESTUDOS IN VIVO COM PRODUTOS FUNCIONAIS DE LEITE DE CABRA
99
6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 103
REFERÊNCIAS 104
CAPÍTULO 2 – Sobrevivência de Bifidobacterium spp. durante a passagem gastrointestinal e seu mecanismo de ação para inibição de bactérias patogênicas no intestino: uma breve revisão
121
RESUMO 123
1. INTRODUÇÃO 127
2. BIFIDOBACTERIA COMO PROBIÓTICO 128
3. TOLERÂNCIA DE BIFIDOBACTÉRIAS ÀS CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS
130
4. MECANISMOS DE AÇÃO DE PROBIÓTICOS PARA INIBIÇÃO DE BACTÉRIAS PATOGÊNICAS
134
5. CONCLUSÕES 137
REFERÊNCIAS 137
CAPÍTULO 3 – Técnicas para a microencapsulação de bactérias probióticas na incorporação e desenvolvimento de novos produtos lácteos
147
CONCEITOS APRESENTADOS NESSE CAPÍTULO 149
CONCEPTS PRESENTED IN THIS CHAPTER 151
1. INTRODUÇÃO 153
2. MICROENCAPSULAÇÃO 154
2.1 Técnicas para microencapsulação de probióticos 156
2.1.1 Spray drying 156
2.1.2 Spray cooling 163
2.1.3 Spray freeze drying 164
2.1.4 Spray dryer ultrassônico 166
2.1.5 Recobrimento em leito fluidizado 166
2.1.6 Extrusão 168
2.1.7 Emulsão 172
2.1.8 Encapsulação através da coagulação-formação de gel de proteínas
175
2.1.10 Sistema de hibridização 178
2.1.11 Encapsulamento por aerossol 179
2.1.12 Eletrospinning 180
3. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 182
REVISÃO DOS CONCEITOS APRESENTADOS 183
QUESTÕES 183
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA 184
CAPÍTULO 4 – Metodologias de caracterização de microcápsulas com bactérias probióticas para serem adicionadas em derivados lácteos
197
CONCEITOS APRESENTADOS NESSE CAPÍTULO 199
CONCEPTS PRESENTED IN THIS CHAPTER 201
1. INTRODUÇÃO 203
2. CARACTERIZAÇÃO DAS MICROCÁPSULAS 204
2.1 Morfologia e tamanho de partícula 204 2.2 Umidade, atividade de água (aw) e solubilidade 207
2.3 Análises térmicas 213
2.4 Densidade, fluidez e coesividade 214
2.5 Propriedades de cor 216
3. ESTABILIDADE DAS BACTÉRIAS PROBIÓTICAS
MICROENCAPSULADAS NO SISTEMA
GASTROINTESTINAL, NO PROCESSAMENTO E NO ARMAZENAMENTO
218
4. USO E IMPACTO DOS PROBIÓTICOS
MICROENCAPSULADOS EM PRODUTOS LÁCTEOS
220
5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 231
QUESTÕES 233
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA 233
PARTE 2 – PARTE EXPERIMENTAL 249
CAPÍTULO 5 – Sobrevivência de Bifidobacterium BB-12 microencapsulada com leite de cabra integral e prebióticos quando exposta a condições gastrointestinais simuladas e tratamentos térmicos 251 RESUMO 253 ABSTRACT 255 1. INTRODUÇÃO 257 2. MATERIAL E MÉTODOS 259 2.1 Material 259
2.2 Preparação da suspensão de bifidobactérias 260 2.3. Preparo das soluções de alimentação e das microcápsulas
260
2.4. Sobrevivência de bifidobactérias sob condições gastrointestinais simuladas in vitro
261
2.5. Contagem de células viáveis de Bifidobacterium BB-12
263
2.6. Rendimento de encapsulação (EY) 264 2.7. Taxa de sobrevivência de bifidobactérias em condições gastrointestinais simuladas in vitro
264
2.8. Sobrevivência de bifidobactérias submetidas a tratamentos térmicos
264
2.9. Análise estatística 265
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 265
12 e rendimento de encapsulação (EY)
3.2. Sobrevivência de Bifidobacterium BB-12 microencapsulada sob condições gastrointestinais simuladas in vitro
267
3.3. Sobrevivência de Bifidobacterium BB-12 microencapsulada a tratamentos térmicos
273
4. CONCLUSÃO 277
REFERÊNCIAS 278
CAPÍTULO 6 – Efeito do uso de leite de cabra integral e prebióticos na sobrevivência de Bifidobacterium BB-12 e nas propriedades físicas do pó ao longo do armazenamento
285 RESUMO 287 ABSTRACT 289 1. INTRODUÇÃO 291 2. MATERIAL E MÉTODOS 293 2.1 Material 293
2.2 Microencapsulação de Bifidobacterium BB-12 por spray drying
293
2.3. Contagem de células viáveis de Bifidobacterium BB-12
295
2.4. Propriedades dos pós contendo as microcápsulas 295
2.4.1 Morfologia e tamanho de partícula 295
2.4.2 Microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) 295 2.4.3 Umidade, atividade de água e teor de gordura 296
2.4.4 Solubilidade em água 296
2.4.5 Densidade aparente e compactada 297
2.4.7 Análise de cor 297
2.5 Análise estatística 297
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 298
3.1. Contagem de células viáveis de Bifidobacterium BB-12
298
3.2. Propriedades dos pós contendo as microcápsulas 301
4. CONCLUSÃO 315
REFERÊNCIAS 316
CAPÍTULO 7 – Propriedades térmicas e de sorção de água de microcápsulas de Bifidobacterium BB-12 obtidas com uso de leite de cabra e prebióticos
321 RESUMO 323 ABSTRACT 325 1. INTRODUÇÃO 327 2. MATERIAL E MÉTODOS 329 2.1 Material 329 2.2 Microencapsulação de Bifidobacterium BB-12 329 2.3 Propriedades térmicas 330
2.4 Propriedades de sorção de água 330
2.5 Análise estatística 332
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 332
3.1. Propriedades térmicas 332
3.2. Propriedades de sorção de água 339
4. CONCLUSÕES 347
CAPÍTULO 8 – Avaliação da interação entre Bifidobacterium BB-12 microencapsulada adicionada em Frozen Iogurte de leite de cabra e Escherichia coli no intestino grosso 351 RESUMO 353 ABSTRACT 355 1. INTRODUÇÃO 357 2. MATERIAL E MÉTODOS 360 2.1 Material 360 2.2 Microencapsulação de Bifidobacterium BB-12 360 2.3 Produção de frozen iogurte de leite de cabra 361
2.4 Preparação da cepa patogênica 361
2.5 Frozen iogurte adicionado de microcápsulas de Bifidobacterium BB-12 submetidas a condições gastrointestinais simuladas in vitro
362
2.5.1 Interação entre Bifidobacterium BB-12 e E. coli no intestino grosso
362
2.6 Contagem de células viáveis cultiváveis de Bifidobacterium BB-12
363
2.7 Contagem de Escherichia coli viável e viável mas não cultivável 365 2.8 Análise estatística 366 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 366 4. CONCLUSÕES 374 REFERÊNCIAS 374 CONSIDERAÇÕES FINAIS 381
ANEXOS 385 Anexo A – Artigo “Functionality of the components from goat’s milk, recent advances for functional dairy products development and its implications on human health” publicado na revista Journal of Functional Foods (ISSN: 1756-4646).
387
Anexo B – Artigo “Survival of Bifidobacterium ssp. during gastrointestinal passage and their mechanism of action for pathogenic bacteria inhibition in the gut: a concise review” publicado na revista Food Biology (ISSN: 2249-4790).
391
Anexo C – Capítulo “Técnicas para a microencapsulação de bactérias probióticas na incorporação e desenvolvimento de novos produtos lácteos” publicado em In CRUZ, A.G. et al.. (Eds). Inovações e Avanços em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados. Setembro Editora. Março, 2019. ISBN 978-85-64217-03-4.
395
Anexo D – Capítulo “Metodologias de caracterização de microcápsulas com bactérias probióticas para serem adicionadas em derivados lácteos” publicado em In CRUZ, A.G. et al. (Eds). Inovações e Avanços em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados. Setembro Editora . Março, 2019. ISBN 978-85-64217-03-4.
403
Anexo E – Artigo “Survival of Bifidobacterium BB-12 microencapsulated with full-fat goat’s milk and prebiotics when exposed to simulated gastrointestinal conditions and thermal treatments” publicado na revista Small Ruminant Research (ISSN: 0921-4488)
411
Anexo F – Artigo “Effect of full-fat goat’s milk and prebiotics use on Bifidobacterium BB-12 survival and on the physical properties of spray-dried powders under storage conditions” publicado na revista Food Research International (ISSN: 0963-9969).
415
Anexo G – Artigo “Thermal and water sorption properties of Bifidobacterium BB-12 microcapsules obtained from goat’s milk and prebiotics” publicado na revista LWT – Food Science and Technology (ISSN: 0023-6438).
Anexo H – Artigo “Evaluation of the interaction between microencapsulated Bifidobacterium BB-12 added in goat’s milk Frozen Yogurt and Escherichia coli in the large intestine” submetido à revista Food Research International (ISSN: 0963-9969).
423
Anexo I – Declarações de direito para incluir os artigos publicados na tese.
427
INTRODUÇÃO
O Brasil ocupa a quarta colocação entre os maiores produtores mundiais de leite, sendo que este produto está entre os seis mais importantes para a agropecuária brasileira, desempenhando um importante papel como alimento e fonte de renda (FAOSTAT, 2017). De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) a média da produção de leite no Brasil foi de 34 bilhões de litros, em 2015 (IBGE, 2017). No entanto, apesar de ser um grande produtor, o país ainda importa lácteos para abastecer o mercado interno. No primeiro semestre de 2016 foram importados 104,9 milhões de toneladas de produtos, enquanto que as exportações ficaram bem abaixo, somando 20 milhões de toneladas (EPAGRI, 2017). Sendo assim, para suprir a demanda interna de produtos, ainda há muito potencial para a produção leiteira no Brasil, principalmente no que diz respeito aos leites de outras espécies, como o leite de cabra, ainda pouco explorado em nosso país.
A Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO) relatam que o leite de cabra é o terceiro leite mais produzido no mundo (FAOSTAT, 2017). O Brasil se destaca como o maior produtor de leite de cabra da América do Sul com produção estimada de 8.779 milhões de litros por ano (IBGE, 2017). A Região Nordeste do Brasil representa mais de 90% da produção de leite, seguidas pela região Sul e Sudeste (COSTA; QUEIROGA; PEREIRA, 2009). Isso mostra como esta espécie pode se adaptar a diferentes climas e regiões para produzir grande quantidade de leite onde a exploração da criação de vacas leiteiras não é favorecida, tornando-se um meio de subsistência para muitas famílias (PANDYA; GHODKE, 2007). Além disso, o leite de cabra movimenta a economia de pequenas cidades, ajuda na distribuição de renda e gera emprego permanente, principalmente no meio rural (COSTA; QUEIROGA; PEREIRA, 2009). No mundo, as cabras são amplamente distribuídas e estão bem adaptadas a vários tipos de clima e regiões, como ambientes tropicais, temperados, áridos, úmidos, frios, quentes, montanhosos e íngremes (DEVENDRA; HAENLEIN, 2011). A composição química do leite de cabra, assim como de outros pequenos ruminantes, composta por proteínas de alto valor biológico, ácidos graxos essenciais, alta biodisponibilidade mineral e de vitaminas, qualifica-o como alimento de alto valor nutricional, representando grande importância na alimentação de lactentes e idosos, devido às características de hipoalergenicidade e maior digestibilidade (HAENLEIN, 2004). De acordo com Mayer e
Fiechter (2012), os produtos lácteos de cabra (iogurte e diferentes variedades de queijo) podem fornecer uma alternativa lucrativa aos produtos de leite de vaca, devido ao seu sabor específico e à imagem natural e saudável aos consumidores. Assim, o leite de cabra é uma excelente matriz para o desenvolvimento de uma grande variedade de produtos inovadores e alimentos funcionais (SILANIKOVE et al., 2010; SILVEIRA et al., 2015), tais como aqueles adicionados de bactérias probióticas (BAKR, 2015).
Probióticos são um dos elementos-chave que estão sendo reconhecidos como força motriz do mercado de alimentos funcionais devido aos seus benefícios já bem documentados (KENT; DOHERTY, 2014). A Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura (FAO) e a Organização Mundial da Saúde (OMS) definem probióticos como "microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde ao hospedeiro" (FAO/WHO, 2006; HILL et al., 2014). Ribeiro et al. (2014) relataram que os probióticos fornecem vários benefícios, como a redução da intolerância à lactose, redução do colesterol, estimulação do sistema imunológico, alívio da constipação, aumento da absorção de minerais, bem como possuir efeitos mutagênicos, cancerígenos e anti-hipertensivos. Entretanto, é imprescindível que os probióticos estejam metabolicamente estáveis e ativos no produto alimentar, sendo que as cepas de Bifidobacterium são as bactérias probióticas mais utilizadas para este fim (SHORI, 2017). Uma das propriedades mais importantes das bifidobactérias é a sua capacidade de produzir ácidos orgânicos (por exemplo, ácido lático e acético), peróxido de hidrogênio e bacteriocinas para suprimir a colonização de bactérias patogênicas e deteriorantes no intestino (SHAH, 2011). Para exercer seus benefícios à saúde, a ingestão diária mínima recomendada de probióticos é de cerca de 8-9 unidades formadoras de colônia (UFC g-1 ou mL-1), o que pode ser alcançado com consumo diário de pelo menos 100 g de 6-7 log Unidades Formadoras de Colônias (UFC g-1 ou mL-1 do produto) (BOYLSTON et al., 2004). Embora as bifidobactérias estejam bem estabelecidas como probióticas e sejam reconhecidas devido às suas propriedades vantajosas para a saúde, elas também são delicadas e obrigatoriamente anaeróbicas e, portanto, representam um desafio tecnológico para a indústria de laticínios (HANSEN et al., 2002). Além disso, fatores como altos níveis de oxigênio, pH, acidez, tempo e temperatura de armazenamento e processamento causam sensibilidade e afetam diretamente a viabilidade de bifidobactérias quando adicionados a produtos (ANAL; SINGH,
2007; HOLKEM et al., 2016). Portanto, um dos maiores desafios no desenvolvimento de um produto probiótico com Bifidobacterium é garantir uma alta taxa de sobrevivência das bactérias durante a fabricação do produto e ao longo do tempo de armazenamento, além de ser capaz de sobreviver durante a passagem pelo sistema gastrointestinal humano (GRANATO et al., 2010; TRIPATHI; GIRI, 2014; ZARE et al., 2012).
Neste sentido, métodos de microencapsulação têm sido utilizados para melhorar a viabilidade de bactérias probióticas durante o processamento, armazenamento e passagem de alimentos pelo trato gastrointestinal (CAVALHEIRO et al., 2015; DING; SHAH, 2009). Na microencapsulação de bactérias probióticas, é possível usar diferentes tipos de materiais encapsulantes, também conhecidos como agentes carreadores. Alguns dos agentes encapsulantes de origem láctea incluem leite desnatado reconstituído, leite de cabra, caseinatos e proteínas de soro de leite (FRITZEN-FREIRE et al., 2012; LIU et al., 2016; PINTO et al., 2015; RANADHEERA et al., 2015). Assim, o uso de leite de cabra como agente encapsulante pode ser uma alternativa importante para a indústria de laticínios, pois pode ser utilizado diretamente como alimento probiótico ou como inóculo para produtos lácteos probióticos sem qualquer risco de contaminação de outros agentes encapsulantes, como com o leite de vaca (RANADHEERA et al., 2015). Além disso, é possível encontrar uma quantidade considerável de trabalhos de pesquisa publicados que também empregaram prebióticos como agentes carreadores para a microencapsulação de bactérias probióticas (FRITZEN-FREIRE et al., 2012; PINTO et al., 2015; SOUKOULIS et al., 2014; ZHENG et al., 2015).
Os prebióticos, como a inulina e a oligofrutose, são considerados ingredientes alimentares não digeríveis que estimulam seletivamente o crescimento de bactérias probióticas, beneficiando o hospedeiro (GIBSON et al., 2017). Os prebióticos que são mais comumente usados comercialmente são a inulina e a oligofrutose, ambas contendo uma mistura de oligossacarídeos que possuem um número variável de frações de frutose ligadas por ligações glicosídicas β (2-1) (MENSINK et al., 2015). Tripathi e Giri (2014) observaram que há um crescente interesse no uso de simbióticos (combinação probiótico/prebiótico), pois quando os probióticos atingem o cólon, eles podem usar os prebióticos como fonte de nutrientes para sua sobrevivência e colonização e, assim, beneficiar o hospedeiro. Embora estudos de aplicação de microcápsulas em derivados lácteos a partir de
leite de vaca apresentem resultados promissores para a sobrevivência de probióticos durante o processamento, armazenamento e passagem pelo trato gastrointestinal (CHAMPAGNE et al., 2015; HOMAYOUNI et al., 2008; PINTO et al., 2012; RIBEIRO et al., 2014), não há estudos avaliando se bactérias probióticas microencapsuladas melhoram seu efeito antagônico às bactérias patogênicas no cólon após serem aplicadas em um produto lácteo de leite de cabra. Ainda, a não ser a realização deste trabalho, não há informações disponíveis sobre a microencapsulação de Bifidobacterium BB-12 com leite de cabra integral e/ou prebióticos (inulina e/ou oligofrutose). Adicionalmente, com relação às microcápsulas, sua caracterização física e química; viabilidade de bifidobactérias durante o armazenamento; efeito na sobrevivência durante a passagem pelo sistema gastrointestinal; avaliação de suas características de adsorção de água e propriedades térmicas; e a aplicação em um produto lácteo com a intenção de avaliar o efeito antagonista de bifidobactérias com bactérias patogênicas após a passagem pelo sistema gastrointestinal ainda não foram relatadas.
Para abordar todos os aspectos mencionados, este trabalho, estruturado na forma de artigos, está dividido em duas partes, a Parte 1 correspondendo aos capítulos de revisão bibliográfica (Capítulos 1, 2, 3 e 4) e a Parte 2 aos capítulos relacionados com a parte experimental da tese (Capítulos 5, 6, 7 e 8). Sendo assim, este documento se encontra dividido nos seguintes capítulos:
(a) Capítulo 1 - Funcionalidade dos componentes do leite de cabra, avanços recentes no desenvolvimento de produtos lácteos funcionais e suas implicações na saúde humana. Esta revisão apresenta um quadro completo do conhecimento atual das características e vantagens do leite de cabra como um potencial alimento funcional. Ele também fornece a base teórica necessária e alguns detalhes sobre o uso de prebióticos e/ou probióticos em produtos lácteos caprinos. Portanto, foram abordados alguns dos fatores que tornam a combinação de leite de cabra e ingredientes funcionais uma das áreas de pesquisa mais promissoras no campo da moderna indústria de laticínios caprinos. O comprovante da publicação deste artigo está apresentado no Anexo A.
(b) Capítulo 2 - Sobrevivência de Bifidobacterium ssp. durante a passagem gastrointestinal e seu mecanismo de ação para inibição de bactérias patogênicas no intestino: uma breve revisão. Esta revisão apresenta uma visão concisa e direta do conhecimento atual sobre a sobrevivência das cepas de bifidobactérias durante a passagem pelo sistema gastrointestinal humano. Ela também fornece a base teórica
necessária e detalhes sobre mecanismos de ações de bifidobactérias contra bactérias patogênicas. Também reportaremos alguns dos fatores que tornam a combinação de alimentos e bifidobactérias um dos tópicos de pesquisa mais promissores no campo da moderna ciência de alimentos. O comprovante da publicação deste artigo está apresentado no Anexo B.
(c) Capítulo 3 - Técnicas para a microencapsulação de bactérias probióticas na incorporação e desenvolvimento de novos produtos lácteos. Este capítulo descreve as principais técnicas de microencapsulação de bactérias probióticas, tais como spray drying, spray cooling, spray freeze drying, spray dryer ultrassônico, extrusão, emulsão, recobrimento em leito fluidizado, encapsulamento através da coagulação-formação de gel de proteínas, liofilização, sistema de hibridação, encapsulamento por aerossol e electrospinning, bem como foram descritos os agentes encapsulantes mais utilizados nestes processos. O comprovante da publicação deste capítulo de livro está apresentado no Anexo C.
(d) Capítulo 4 - Metodologias de caracterização de microcápsulas com bactérias probióticas para serem adicionadas em derivados lácteos. Este capítulo descreve a caracterização das microcápsulas probióticas através de análises morfológicas, de umidade, atividade de água, solubilidade, análises térmicas, densidade, fluidez, coesividade e análises de cor. Além disso, aborda a estabilidade das bactérias probióticas microencapsuladas durante a passagem através do sistema gastrointestinal, o processamento e armazenamento, bem como suas aplicações em derivados lácteos e seu impacto na indústria de alimentos. O comprovante da publicação deste capítulo de livro está apresentado no Anexo D.
(e) Capítulo 5 – Sobrevivência de Bifidobacterium BB-12 microencapsulada com leite de cabra integral e prebióticos quando exposta a condições gastrointestinais simuladas e tratamentos térmicos. Neste estudo utilizou-se leite de cabra integral e/ou prebióticos (inulina e/ou oligofrutose) como agentes encapsulantes de Bifidobacterium BB-12 visando minimizar os danos à bactéria probiótica e otimizar a contagem de células viáveis após o processo de microencapsulação. O efeito protetor dos agentes encapsulantes também foi avaliado quando as células livres e as microcápsulas foram submetidas às condições gastrointestinais simuladas in vitro e após tratamento térmico. O comprovante da publicação deste artigo está apresentado no Anexo E.
