OQFK G13 C0542 (908) H/R 1
Enzyme immunoassay for the detection of antibodies to HIV1, HIV2
and HIV1 (subtype O) antigens
Enzymimmunoassay zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV1-,
HIV2- und HIV1 (Subtyp O)-Antigene
Test immunoenzymatique pour le dépistage des anticorps
anti-antigènes VIH1, VIH2 et VIH1 (sous-type O)
Metodo immunoenzimatico per l'identificazione degli anticorpi contro
gli antigeni HIV1, HIV2 e HIV1 (sottotipo O)
Prueba inmunoenzimática para la detección de anticuerpos contra los
antígenos HIV1, HIV2 y HIV1 (subtipo O)
Teste imunoenzimático para detecção de anticorpos contra os
antigénios HIV1, HIV2 e HIV1 (subtipo O)
English: Page 2 to 9
Deutsch: Seite 10 bis 17
Français: Pages 18 à 25
Italiano: Pagina 26 fino 33
Español: Página 34 hasta 41
Português: Página 42 a 49
Summary of Test Procedure Page 9 Kurzanleitung Testdurchführung Seite 17 La technique en bref Page 25 Istruzioni en breve, esecuzione del test Pagina 33 Resumen de la técnica Página 41 Resumo da técnica Página 49
Bibliography/Literatur/Littérature/
Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia Page/Seite/Pagina/Página 50
Edition February 2004
OQFK G13 C0542 (908) H/R 2
Enzygnost
*
Anti-HIV 1/2 Plus
Intended Use
Enzyme immunoassay for the detection of antibodies to antigens of HIV1, HIV2 and HIV1 (subtype O) in serum or plasma. The enzyme immunoassay is processed on the BEP® II, BEP® III and BEP® 2000 ELISA
proces-sors. The test was developed for investigation of individual samples, not pooled samples. The product is for in vitro diagnostic use only.
Summary and Explanation
Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) was first recognized in 1981 as a clinical picture in its own right. The disease is today considered to involve two different Human Immunodeficiency Viruses (HIV1 and HIV2) as causal agents. The HIV1 virus (synonym: LAV/HTLV-III) was isolated as early as in 19831,2
and a further such pathogenic human virus (HIV2) was isolated in 19863. A high level of importance is attached to the serological
determination of antibodies to HIV, especially in the field of transfusion medicine where measures are needed to prevent the further spread of the disease.
Consequently, from 1985 onwards, donor blood was screened for HIV1 antibodies, both by blood banks and manufacturers of plasma products. Subsequent information on the spread of HIV2 infections revealed that blood donors need to be tested not only for anti-HIV1 antibodies but also for anti-HIV2 on a routine basis in order to exclude to the greatest possible extent the potential risk of transmission via blood transfusions or blood-derived products.
In 1990 a new HIV subtype was reported.4 In 1994 two independent teams succeeded, simultaneously, in
se-quencing this new subtype5,6. Parallel to this virological research, several teams were able to demonstrate the
serological significance of the virus, by then known as HIV1 Subtype O7. This research showed that some
anti-HIV 1+2 assays exhibit weaknesses in detecting Subtype O antibodies8.Consequently, a need arose for reliable
concurrent detection of this new HIV variant along with the established HIV1 and HIV2 isolates.
Although the detection of antibodies specific for HIV1 and HIV2 does not allow definite conclusions to be made on whether infectious HIV1 or HIV2 is present in the blood at the time of the test, in the same way that a negative result does not exclude the presence of HIV1 or HIV2 with certainty, currently the test provides the best means of detecting and eliminating blood donations from HIV-infected donors with a high level of probability.
Principle of the Method
HIV-specific immunoglobulins contained in the test sample bind to the recombinant HIV1, HIV2, and/or HIV1 (Subtype O) proteins bound to the surface of the microtitration plate.
The unbound sample components are washed out and then the conjugate is bound to the HIV-specific antibodies. The excess conjugate is removed and the enzyme activity of the bound conjugate is then determined (blue colour reaction). The enzymatic reaction with the chromogen is terminated by the addition of Stopping Solution POD (yellow colour reaction). The colour intensity is proportional to the concentration of antibody present in the sample.
Reagents
Materials providedEnzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 2 x 96 10 x 96
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 2 test plates 10 test plates
HIV-Ag/POD-Conjugate 2 x 15 ml 10 x 15 ml Sample Buffer (Anti-HIV) 2 x 15 ml 4 x 15 ml Control Serum, positive (Anti-HIV1) 2 x 1.4 ml 3 x 1.4 ml Control Serum, negative (Anti-HIV) 2 x 2.8 ml 3 x 2.8 ml Washing Solution POD (concentrate)** - 2 x 100 ml Buffer/Substrate TMB** - 4 x 30 ml
Chromogen TMB** - 4 x 3 ml
Stopping Solution POD** - 2 x 100 ml
Empty bottle - 1 pcs.
Label marked "Empty bottle for conjugate" - 1 pcs.
Adhesive foils 6 pcs. 30 pcs.
Instruction for Use 1 pcs. 1 pcs.
Barcode table 1 pcs. 1 pcs.
PE bag 1 pcs. 1 pcs.
Further packs: 570 x 96 (Q)
** These components are also included in the Supplementary Reagents for Enzygnost* TMB kit (code no. OUVP).
OQFK G13 C0542 (908) H/R 3
Additional materials required, but not provided, for the 2 x 96 kit
Supplementary Reagents for Enzygnost* TMB (code no. OUVP) Composition
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus (test plate)
Microtitration plate coated with a mixture of recombinant HIV(env) proteins (E. coli). The proteins represent immunoreactive regions of the following viral proteins:
gp 41 (HIV1), gp 41 (HIV1 Subtype O), gp 36 (HIV2).
HIV Ag/POD Conjugate
Recombinant HIV protein and synthetic HIV peptides, peroxidase(POD)-conjugated, ready-for-use, with the additives Tris-hydroximethylaminomethan (36 g/l) and sodium chloride (6 g/l).
Preservative: phenol (max. 1 g/l)
Sample Buffer (Anti-HIV)
Contains glycerin (100 g/l), Tween 20 (20 g/l), sodium chloride (8.8 g/l), EDTA (1.9 g/l), bovine albumin (1 g/l), polygeline and phosphate (50 mmol/l).
Preservative: phenol (max. 1 g/l)
Control Serum, positive (Anti-HIV1)
Heat-treated human serum containing antibodies to HIV1 antigens, stabilized. Preservative: phenol (max. 1 g/l)
Control Serum, negative (Anti-HIV)
Human serum without antibodies to HIV1, HIV2 and HIV1 (Subtype O) antigens, stabilized. Preservative: phenol (max. 1 g/l)
Washing Solution POD (concentrate)
Phosphate buffer solution (90 mmol/l) containing Tween (18 g/l). Preservative: phenol (max. 1 g/l)
Buffer/Substrate TMB
Hydrogen peroxide (approx. 0.1 g/l) in acetate buffer solution (25 mmol/l). Preservative: n-butanol (max. 1%)
Chromogen TMB
Tetramethylbenzidine dihydrochloride (5 g/l).
Stopping Solution POD
0.5 N sulfuric acid.
Empty bottle for working chromogen solution Polyethylene bag for storing unused test strips Barcode table
Warnings and Precautions
1. For in vitro diagnostic use.
2. Each individual blood donation for use in manufacture of the control sera is tested for HBsAg, anti-HCV, anti-HIV1 and anti-HIV2 by FDA-required test. The Control Serum, negative, is produced using only sera with negative findings. The positive control serum has been heat-treated (no less than 1 hour at +56 °C). Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all samples (e.g. patient sera) and products (e.g. control sera) obtained from human blood should always be handled with due care, obser-ving the precautions recommended for biohazardous material9.
3. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure.
4. For disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at least one hour at +121 °C. All aspirated solutions should be collected in two receptacles connected in series, which should both contain a disinfectant suitable for inactivating pathogenic human viruses. The concentrations and reaction times specified by the manufacturer must be observed.
5. The pack contains a matched set of reagents. Reagents must not be interchanged with other kits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table of values). Washing Solution POD, Stopping Solution POD and Working Chromogen Solution are exceptions to this requirement. Note that the Working Chromogen Solution must first be prepared from matched components (do not use Chromogen TMB and Buffer/Sub-strat TMB from kits with a different number).
Preparation of the Reagents
Bring all reagents and samples to +18 to +25 °C before the start of the test, without removing the test plates from the container.
The pack of Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 10 x 96 includes a barcoded label for an empty bottle for the HIV-Ag/
POD Conjugate. When running large series of samples, to avoid frequent changing of the syringes on the BEP® III it may be expedient to pour several vials of the HIV-Ag/POD Conjugate into a larger bottle (e.g. a
surplus unused empty bottle for Working Chromogen Solution or a rinsed bottle of Stopping Solution POD), to label this bottle with the label "Empty bottle for conjugate" and to insert the labelled bottle into the reagent rotor.
For each test plate, dilute 20 ml Washing Solution POD to 400 ml with distilled or demineralized water.
Working Chromogen Solution: For each test plate, dilute 1 ml Chromogen TMB with 10 ml Buffer/Sub-strate TMB in the plastic bottle supplied with the kit (= working chromogen solution) and store closed and
protected from light. Rinse the bottle thoroughly with distilled water after use.
For technical reasons (overfill) it is not permissible to pour together the full contents of the Chromogen TMB vial and the full contents of the Buffer/Substrate TMB vial.
Storage and Stability
Stored unopened at the stated temperature all the components of the Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus kit may be
used up to the dates given on the labels.
For details on the stability and storage of the opened and diluted reagents, see Table 1 in the Appendix.
Equipment required:
BEP® II: For automatic dispensing of reagent and washing
BEP® III: For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for evaluation
BEP® 2000: For fully automatic processing and evaluation of the test
Pipettes: piston-type pipettes 25, 100 and 1000 µl
Incubator: Covered water bath (+37 ± 1 °C) or comparable incubation methods All the equipment used in the test must have been validated.
Specimens
Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/heparinized/citrated plasma) obtained by standard laboratory techniques. The samples should be stored for not more than 3 days at +2 to +8 °C. If the samples are to be stored for a longer period of time, they must be frozen.
Procedure
Test procedure using the BEP® II 1. Pipetting scheme:
Ascertain the number of wells required (number of samples to be investigated plus 6 wells for controls). Remove from the holder any strips which are not required for the test and store for later use (See Table 1 for stability data).
2. Introduce sample buffer:
Fill each well with a receiving volume of 25 µl of sample buffer. 3. Dispense samples:
Pipette 100 µl/well of the negative control into 4 wells and 100 µl/well of the positive control into 2 wells. Dispense 100 µl/well of undiluted sample into the following wells. Cover the finished test plate with foil and place in the incubator as soon as possible, max. 15 min after completion of the sample dispensing step. As an alternative to the above pipetting scheme, it is also possible to pipette the positive control once at the start and once at the end of the series.
Pipetting scheme: Pipette 100 µl/well of negative Control, into 4 wells, 100 µl of positive control into the next well and then fill the following wells with 100 µl/well of undiluted sample. At the end of the series / plate pipette 100 µl of positive control once more.
4. Incubate:
Incubate at +37 ± 1 °C for 30 ± 2 minutes, then proceed immediately to the washing step. 5. Wash:
Remove the foil, aspirate all the wells and wash 4 times with approx. 0.3 ml/well of washing solution.
6. Dispense conjugate:
Fill each well with 100 µl conjugate, cover with fresh foil and immediately place into the incubator. 7. Incubate:
Incubate at +37 ± 1 °C for 30 ± 2 minutes as described in "4. Incubate", then proceed immediately to the next wash step.
8. Wash:
Remove the foil and wash as described in "5. Wash". 9. Dispense substrate:
Pipette 100 µl of the Working Chromogen Solution into each well and cover the plate with fresh foil.
10. Incubate:
Incubate at +18 to +25 °C for 30 ± 2 minutes, protected from light.
11. Stop reaction:
Remove the foil and add 100 µl of Stopping Solution POD to each well, keeping to the same timing as in "9. Dispense substrate".
12. Read:
At 450 nm within one hour.
The absorbances of the control and patient samples are to be measured at a wavelength of 450 nm. The wavelength recommended for the reference reading is 650 nm (if necessary between 615 nm and 690 nm).
OQFK G13 C0542 (908) H/R 5 Test procedure using the BEP® III
Before using the BEP® III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 and 2 at "Test
procedure with the BEP® II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates (i.e. not covered with
adhesive foil) into the BEP® III. Note that partially filled test plates need to be made up to at least half plates (6
test strips) by adding "water-filled strips". The test is then processed fully automatically (see BEP® III
instruc-tion manual).
The settings for the incubation times in the BEP® III software may differ from the times on the BEP® II for
technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost* on the BEP® III. Test procedure using the BEP® 2000
The sample dispensing steps and subsequent processing steps in the test are performed fully automatically in the instrument (see instruction manual for the BEP® 2000).
Test validation
The individual values of the absorbances for the control sera must comply with the following specification: -0.010 ≤Aneg. ≤ 0.150
Apos. ≥ 0.700
If one of the four absorbance values of the Control Serum, negative, is outside the specification, this value can be neglected.
Both absorbance values of the positive control must comply with the specification. If these conditions are not fulfilled, the test is to be repeated.
Evaluation
On the BEP® 2000 and BEP® III the results are evaluated automatically. Please consult the instruction manuals
for further details in this respect. The following sections apply if the results are evaluated without software assistance.
Calculate the mean absorbance value of the valid negative controls and then calculate the cut-off value by adding 0.400:
_
Aneg. + 0.400 = cut-off The retest range is defined as: Cut-off to cut-off - 10%
Based on the criteria of the test, the samples are classed as follows:
Test result:
^
1. Asample < cut-off - 10% = "negative" ^
2. Asample > cut-off = "reactive" ^
3. cut-off - 10% ≤ Asample≤ cut-off = "equivocal"
Samples with absorbances within or above the retest range are to be retested in dual determination. If in the retest absorbances below the retest range are yielded, the sample is to be considered antibody negative as defined by the criteria of the test.
If the mean absorbance of the sample is again within the retest range or above this range, the sample is to be considered repeatedly reactive. All samples which are equivocal or reactive in the retest must be checked in a confirmatory test (e.g. Western Blot analysis).
Limitations of the Procedure
1. Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate do not interfere with the test result. 2. Lipaemic, icteric or haemolytic samples do not interfere with the test.
3. Samples containing potential interference factors, rheumatoid factors, EBV/IgM antibodies, VZV/IgM anti-bodies, E.-Coli antianti-bodies, ANA and AMA, as well as sera from pregnant women, were checked in the test. The samples used were found not to interfere with the results.
4. No interference was observed with samples which had been repeatedly frozen and thawed, or with sera which had been heat-treated (30 min, +56 °C).
5. Inadequately coagulated sera, or microbially contaminated samples, should not be used. Any particulate constituents (e.g. fibrin clots, erythrocytes) must be removed before the assay.
6. For thawed samples ensure good homogenisation of the material.
7. The test is suitable only for testing individual samples and not for pooled or diluted samples.
8. Reagents must not be interchanged with other kits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table). Exceptions are Washing Solution POD, Stopping Solution POD and the Working Chromogen Solution (which is prepared from Chromogen TMB and Buffer/Substrate TMB using the required lots).
9. Buffer/Substrate TMB, Working Chromogen Solution and Stopping Solution POD must not be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do not use pipettes with metal parts which are in direct contact with the liquid). Do not perform the substrate reaction in the proximity of disin-fectants containing hypochlorite. If the Working Chromogen Solution has developed a blue colour before transferral into the test plate, this indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a clean container. Skin contact with the above-mentioned solutions is to be avoided. 10. The test plate should be protected from vibration during the incubation phase (e.g. placed on a secured
floatation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in contact with the thermo-stated water. If stabilizers are used to prevent microbial contamination of the water, care must be taken that neither the surface of the test plate nor the wells come into contact with these solutions since such conta-mination can lead to unspecific reactions.
11. Highly reactive samples may cause precipitation of the dye during the stopping reaction. This does not interfere with the photometric evaluation.
12. The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may occur but this has no effect on the test result.
13. Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize product performance and meet product specifications. User defined modifications are not supported by Dade Behring as they may affect performance of the system and assay results. It is the responsibility of the user to validate modifications to these instructions or use of the reagents on analyzers other than those included in Dade Behring Application Sheets or these instructions for use.
14. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical history, clinical presentation and other findings.
Specific Performance Characteristics
Sensitivity and SpecificityThe results of the study on sensitivity and specificity are summarized in Tables 2 + 3 (see Appendix). To establish the sensitivity, a total of 566 anti-HIV1, 317 anti-HIV2 and 22 anti-HIV1 (Subtype O) positive samples were investigated. All the tested 905 anti-HIV-positive samples were found to be positive as defi-ned by the criteria of the Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus test. The reactivity of the test with regard to
serocon-version samples was studied using 31 seroconserocon-version panels. The results of the study show that, in the detection of seroconversions, Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus exhibits a degree of sensitivity which matches
that of comparable tests. Nevertheless the possibility cannot be ruled out that isolated samples may escape detection when the test is used on a large scale.
To establish the specificity, a total of 9243 anti-HIV-negative samples were investigated and the specificity was found to be 99.3 to 100 % (initial testing) and 99.9 % (retest result). Deviations from these findings may occur due to variations in sample population, test procedure, etc.
Current knowledge indicates that a positive result in the anti-HIV test does not yield definite evidence that the blood contains infectious HIV1 or HIV2, just as a negative test result also does not definitely exclude the presence of HIV1 or HIV2.
Reproducibility
The results on intra-assay and inter-assay reproducibility are summarized in Table 4 (in the Appendix). The data shown are typical results. Depending on various factors (procedure, etc), different values may well be obtained.
* Enzygnost is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and other countries. BEP is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany and other countries.
Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
0197
USA Distributor:
Dade Behring Inc.
Newark, DE 19714 U.S.A.
OQFK G13 C0542 (908) H/R 7
Tab. 1 Stability and Storage
Enzygnost
*Anti-HIV 1/2 Plus
Material/reagent
State
Storage
Stability•
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus once opened +2 to +8 °C 6 weeks
(Test plate/remaining strips) in the bag with the desiccant
HIV-Ag/POD Conjugate once opened +2 to +8 °C 4 weeks +18 to +25 °C 2 days Sample Buffer (Anti-HIV) once opened +2 to +8 °C 4 weeks Control Serum, positive once opened +2 to +8 °C 4 weeks
(Anti-HIV 1) < -20 °C 3 months
Control Serum, negative once opened +2 to +8 °C 4 weeks
(Anti-HIV) < -20 °C 3 months
Chromogen TMB once opened +2 to +8 °C expiry date Buffer/Substrate TMB once opened +2 to +8 °C expiry date Working Chromogen Solution once mixed +2 to +8 °C 5 days
+18 to +25 °C 8 hours in closed container
protected from light
Washing Solution POD once opened +2 to +8 °C expiry date (concentrate) once mixed +2 to +8 °C 1 week
+18 to +25 °C 1 day Stopping Solution POD once opened +2 to +8 °C expiry date
•
use each component by the expiry date at the latestTab. 2 Sensitivity
The sensitivity studies performed at four independent centres (Br, F, G, E) yielded the following data:
Sample population
Number of samples
Initially reactive
(Br) Anti-HIV1 pos. (Europe) 51 51
Anti-HIV1 pos. (USA) 55 55
Anti-HIV1 pos. (Africa) 136 136
Anti-HIV2 pos. 54 54
Anti-HIV1 (subtype O) pos. 7 7
Serokonversion panel 31 Anti-HIV 1 panels Sensitivity matches that of comparable tests
(F) Anti-HIV1 pos. 77 77
Anti-HIV2 pos. 48 48
Anti-HIV1 (subtype O) pos. 10 10
(G) Anti-HIV1 pos. 150 150
Anti-HIV2 pos. 44 44
Anti-HIV1 (subtype O) pos. 5 5
(E) Anti-HIV1 pos. 97 97
Anti-HIV2 pos. 171 171
Tab. 3 Specificity
The specificity studies performed at four independent centres (Be, Br, E, F) yielded the following data:
Sample population Number Initially reactive Retest reactive of samples
(Be) Normal negative sera (Germany) 3160 0 -(Br) Normal negative sera (Germany) 2397 4 3 Normal negative plasmas (Germany) 197 0 -Normal negative sera (West-Africa) 436 3 not testet (E) Normal negative sera (Germany) 2003 0 -(F) Normal negative sera (France) 1050 0
-Tab. 4 Reproducibility
In the reproducibility studies the samples were tested in 8-fold determinations on each of 5 days. The coef-ficient of variation (CV) was calculated using the variance component model.
Sample Mean absorbance % CV
Intra-assay Inter-assay F1 2.36 4.7 12.6 F2 1.74 3.0 11.4 F3 0.54 7.0 5.2 F4 0.75 5.9 16.3 F5 0.51 3.9 17.0 F6 0.06 9.2 39.5
OQFK G13 C0542 (908) H/R 9
Prepare reagents 25 µl Sample Buffer
4 x 100 µl Control Serum, negative 2 x100 µl Control Serum, positive
100 µl / well undiluted sample BEP® II BEP® III
30 min ± 2 min In the case of partially (37 ± 1 °C) filled plates: Add
"water-filled strips" to half fill the plates Wash 4x:
BEP® II 100 µl conjugate
30 min ± 2 min Automatic (37 ± 1 °C) assay processing Wash 4x: BEP® II 100 µl Working Chromogen Solution 30 min ± 2 min +18 °C to +25 °C (protected from light) 100 µl Stopping Solution (after max. 1 h) Read at 450 nm (Reference wavelength: 650 nm) Test result
Enzygnost
*Anti-HIV 1/2 Plus
Test procedure
Menu programming
(BEP
®II, BEP
®III, BEP
®2000)
for the
Tab. 5 Test procedure and programming steps
BEP
®II
MENU NO
OPERATE 1
YES
Dispense Sample Buffer
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
25
CHANNEL NO
3
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
Wash and dispense conjugate
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
2
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
Wash and dispense chromogen
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
Dispense Stopping Solution
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
PHOT
YES
MEAS WL
450
REF WL
650
BLK COR
NO
EVAL MODE
1
GEN CUT
NO
NEG CONT
4
MAX NEG
0.150
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
0.400
CUT OFF
BEP® 2000OQFK G13 C0542 (908) H/R 10
Enzygnost
*
Anti-HIV 1/2 Plus
Anwendungsbereich
Enzymimmunoassay zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV1-, HIV2- und HIV1 (Subtyp O)-Antigene in Serum oder Plasma. Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP® II, BEP® III und
BEP® 2000. Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von gepoolten Proben. Das
Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden.
Diagnostische Bedeutung
Das erworbene Immundefektsystem (AIDS) wurde erstmalig 1981 als eigenständiges Krankheitsbild erkannt. Als ursächliche Erreger gelten heute zwei verschiedene Human Immundefizienz Viren (HIV1 und HIV2). Die Isolierung des HIV1 (Synonyom: LAV/HTLV III) gelang bereits 19831, 2 . Im Jahre 1986 wurde ein weiteres
Virus (HIV2) isoliert, das ebenfalls als humanpathogen gilt3. Die Bedeutung der serologischen Bestimmung
von Antikörpern gegen HIV hat besonders für die Transfusionsmedizin unter dem Gesichtspunkt der Präven-tion zur Verhütung der weiteren Ausbreitung der Erkrankung einen hohen Stellenwert.
Folgerichtig wurde ab 1985 begonnen, Spenderblut auf Anti-HIV1-Antikörper sowohl in Blutbanken als auch bei Herstellern von Plasmaprodukten zu testen. Zwischenzeitliche Informationen über die Verbreitung von HIV2-Infektionen ergaben das Bedürfnis einer routinemäßigen Untersuchung von Blutspendern außer auf Anti-HIV1- auch auf Anti-HIV2-Antikörper, um eine potentielle Übertragung durch Transfusion oder aus Blut hergestellten Präparaten nach Möglichkeit auszuschließen.
Im Jahre 1990 wurde ein neuer HIV Subtyp beschrieben4. 1994 gelang gleichzeitig die Sequenzierung dieses
neuen Subtyps bei zwei unabhängigen Arbeitsgruppen5 ,6. Parallel zu den virologischen Arbeiten konnte von
mehreren Arbeitsgruppen die serologische Bedeutung von dem nun HIV1-Subtyp O7 genannten Virus gezeigt
werden. Danach zeigen manche Anti-HIV 1+2-Assays Schwächen bei der Detektion von Anti-Subtyp O-Anti-körpern8. Folgerichtig entstand der Bedarf zum gleichzeitigen sicheren Nachweis dieser neuen HIV-Variante
und den etablierten HIV1- und HIV2-Isolaten.
Obwohl der Nachweis von HIV1- und HIV2-spezifischen Antikörpern keine sicheren Aussagen darüber er-laubt, ob zum Zeitpunkt des Testes infektiöses HIV1 bzw. HIV2 im Blut vorhanden ist, als auch bei negativem Ergebnis keineswegs die Anwesenheit von HIV1 oder HIV2 sicher ausgeschlossen werden kann, stellt der Antikörpertest dennoch die derzeit beste Möglichkeit dar, Blutspenden von HIV-Infizierten mit großer Wahr-scheinlichkeit zu erkennen und zu eliminieren.
Prinzip der Methode
In der Untersuchungsprobe enthaltene HIV-spezifische Immunglobuline binden sich an die auf der Oberfläche der Mikrotitrationsplatte fixierten rekombinanten HIV1-, HIV2- und/oder HIV1 (Subtyp O)-Proteine. Nach Entfernung der ungebundenen Probenbestandteile wird das Konjugat an die HIV-spezifischen Antikör-per gebunden.
Nach Entfernung des überschüssigen Konjugates wird die gebundene Enzymaktivität des Konjugates be-stimmt (blaue Farbreaktion). Die enzymatische Umsetzung des Chromogens wird durch Zusatz von Stopplö-sung POD unterbrochen (gelbe Farbreaktion). Die Farbintensität ist der in der Probe vorhandenen Antikörper-konzentration proportional.
Reagenzien
Inhalt der Handelspackung
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 2 x 96 10 x 96
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 2 Testplatten 10 Testplatten
HIV-Ag/POD-Konjugat 2 x 15 ml 10 x 15 ml Proben-Puffer (Anti-HIV) 2 x 15 ml 4 x 15 ml Kontroll-Serum, positiv (Anti-HIV1) 2 x 1,4 ml 3 x 1,4 ml Kontroll-Serum, negativ (Anti-HIV) 2 x 2,8 ml 3 x 2,8 ml Waschlösung POD (Konzentrat)** - 2 x 100 ml
Puffer/Substrat TMB** - 4 x 30 ml
Chromogen TMB** - 4 x 3 ml
Stopplösung POD** - 2 x 100 ml
Leerflasche - 1 Stück
Etikett "Leerflasche für Konjugat" - 1 Stück
Abklebefolien 6 Stück 30 Stück
Packungsbeilage 1 Stück 1 Stück
Barcode-Tabelle 1 Stück 1 Stück
PE-Beutel 1 Stück 1 Stück
Weitere Handelspackung: 570 x 96 (Q)
** Diese Komponenten sind auch Bestandteile der Packung Zusatz-Reagenzien für Enzygnost* TMB (Bestell-Nr. OUVP).
OQFK G13 C0542 (908) H/R 11
Zusätzlich benötigte Materialien für den Kit 2 x 96
Zusatz-Reagenzien für Enzygnost* TMB (Bestell-Nr. OUVP) Zusammensetzung
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus (Testplatte)
Mit einem Gemisch von rekombinanten HIV(env)-Proteinen (E.Coli) beschichtete Mikrotitrationsplatte. Die Proteine repräsentieren immunreaktive Bereiche folgender Virusproteine:
gp41 (HIV1), gp41 (HIV1-Subtyp O), gp36 (HIV2).
HIV-Ag/POD-Konjugat
Rekombinantes HIV-Protein und synthetische HIV-Peptide, Peroxidase (POD)-konjugiert, gebrauchsfertig mit Zusatz von Tris-hydroximethylaminomethan (36 g/l) und Natriumchlorid (6 g/l).
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l)
Proben-Puffer (Anti-HIV)
Enthält Glycerin (100 g/l), Tween 20 (20 g/l), Natriumchlorid (8,8 g/l), EDTA (1,9 g/l), Albumin vom Rind (1 g/l), Polygeline und Phosphat (50 mmol/l).
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l)
Kontroll-Serum, positiv (Anti-HIV1)
Hitzebehandeltes Humanserum mit Antikörpern gegen HIV1-Antigene, stabilisiert. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l)
Kontroll-Serum, negativ (Anti-HIV)
Humanserum ohne Antikörper gegen HIV1-, HIV2- und HIV1 (Subtyp O)-Antigene, stabilisiert. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l)
Waschlösung POD (Konzentrat)
Tween-haltige (18 g/l) Phosphat-Pufferlösung (90 mmol/l). Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l)
Puffer/Substrat TMB
Wasserstoffperoxid (ca. 0,1 g/l) in Acetat-Pufferlösung (25 mmol/l). Konservierungsmittel: n-Butanol (max. 1 %)
Chromogen TMB
Tetramethylbenzidin-dihydrochlorid (5 g/l).
Stopplösung POD
0,5 N Schwefelsäure.
Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung PE-Beutel zur Aufbewahrung nicht benötigter Testriegel Barcode-Tabelle
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung.
2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von Kontroll-Sera vorgesehen ist, wurde auf HBsAg, Anti-HCV, Anti-HIV1 und Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung des Kontroll-Serums, negativ, werden nur Sera mit nega-tivem Befund verwendet. Das positive Kontroll-Serum wurde hitzebehandelt (mindestens 1 Stunde bei +56 °C). Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Proben (z. B. Patientensera) und Produkte (z. B. Kontrollsera) wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit an-gemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen ge-handhabt werden9.
3. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird angeraten. 4. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 1
Stunde bei +121 °C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschalteten Vorlagen zu sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das geeignet ist, human-pathogene Vi-ren zu inaktivieVi-ren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten müssen beachtet werden.
5. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den chargengebun-denen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte Chromogen-Gebrauchslö-sung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der Kombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnungen, die auf der Packung aufgedruckt bzw. der separat beigepackten Barcode-Wer-tetabelle zu entnehmen sind.
Vorbereitung der Reagenzien
Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +18 bis +25 °C erwärmen. Dabei die Testplatte nicht dem Behältnis entnehmen.
Der Packung Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 10 x 96 liegt ein barcodiertes Etikett für eine Leerflasche für das
HIV-Ag/POD-Konjugat bei. Um bei großen Serienlängen einen häufigen Spritzenwechsel am BEP® III zu vermeiden,
kann es sinnvoll sein, mehrere Abfüllungen des HIV-Ag/POD-Konjugats in eine größere Flasche (z.B. noch unbe-nutzte überzählige Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung oder gespülte Flasche der Stopplösung POD) umzuschütten, mit dem Etikett "Leerflasche für Konjugat" zu etikettieren und ins Reagenzienrad einzustellen.
Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml verdünnen.
Chromogen-Gebrauchslösung: Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB in der
mitgelieferten Kunststoffflasche verdünnen (Chromogen-Gebrauchslösung) und verschlossen unter Licht-schutz aufbewahren. Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen.
Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Zusammengießen der Flascheninhalte von Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB nicht zulässig.
Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Ungeöffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus bei der
angegebe-nen Lagertemperatur bis zu den auf den Etiketten angegebeangegebe-nen Daten verwendbar.
Die Haltbarkeit und Lagerbedingungen der geöffneten bzw. gebrauchsverdünnten Reagenzien sind der Tabel-le 1 im Anhang zu entnehmen.
Erforderliche Geräte:
BEP® II: Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der Waschschritte
BEP® III: Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie Auswertung
BEP® 2000: Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung
Pipetten: Kolbenhubpipetten 25, 100 und 1000 µl
Inkubator: Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 °C) oder vergleichbare Inkubationsmethoden Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein.
Untersuchungsmaterial
Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder -EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen) verwendet wer-den, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben sollten maximal 3 Tage bei +2 bis +8 °C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Proben einzufrieren.
Testdurchführung
Testdurchführung mit BEP® II 1. Ansatzschema:Benötigte Anzahl der Auftragsstellen feststellen (Anzahl der zu untersuchenden Proben plus 6 Vertiefun-gen für Kontrollen). Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegel dem Halterahmen entnehmen und für die spätere Verwendung lagern (siehe Tabelle 1).
2. Proben-Puffer-Vorlage:
Je Vertiefung 25 µl Proben-Puffer vorlegen.
3. Proben-Dosierung:
In 4 Vertiefungen je 100 µl negative und in 2 Vertiefungen je 100 µl positive Kontrolle einfüllen; in die folgenden Vertiefungen je 100 µl unverdünnte Probe dosieren, mit Folie abkleben und baldmöglichst,
maximal 15 min nach Beendigung der Proben-Dosierung, in den Inkubator stellen.
Alternativ zu oben aufgeführtem Pipettierschema ist es auch erlaubt, die positive Kontrolle einmal zu Beginn und einmal am Ende der Testreihe aufzutragen.
Pipettierschema: In 4 Vertiefungen je 100 µl negative, in eine Vertiefung 100 µl positive Kontrolle, in die folgenden Vertiefungen je 100 µl unverdünnte Probe und am Ende der Serie bzw. Testplatte noch einmal 100 µl positive Kontrolle dosieren.
4. Proben-Inkubation:
30 ± 2 Minuten bei +37 ± 1 °C inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen.
5. Waschen:
Folie abziehen, alle Vertiefungen aussaugen und mit je ca. 0,3 ml Waschlösung 4mal waschen.
6. Konjugat-Dosierung:
In jede Vertiefung 100 µl Konjugat einfüllen, mit neuer Folie abkleben und sofort in den Inkubator stellen.
7. Konjugat-Inkubation:
30 ± 2 Minuten bei +37 ± 1 °C, wie unter 4. beschrieben, inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen.
8. Waschen:
Folie entfernen und wie unter 5. beschrieben waschen.
9. Substrat-Dosierung:
In jede Vertiefung 100 µl Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen, Platte mit neuer Folie abkleben.
10. Substrat-Inkubation:
30 ± 2 Minuten bei +18 bis +25 °C lichtgeschützt inkubieren.
11. Stoppreaktion:
Die Folie entfernen. Je Vertiefung 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabei den gleichen Zeittakt wie bei Punkt 9. einhalten.
12. Messung:
Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren.
Die Extinktionsmessung der Kontroll- und Patientenproben erfolgt bei 450 nm, als Wellenlänge der Refe-renzmessung wird 650 nm (ggfs. zwischen 615 und 690 nm) empfohlen.
OQFK G13 C0542 (908) H/R 13 Testdurchführung mit BEP® III
Bei der Abarbeitung mit BEP® III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung (Punkt 1 und 2
der "Testdurchführung mit BEP® II") vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschluss daran werden die
Testplat-ten offen, d.h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP® III eingegeben. Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte
Testplatten mit "Wasserriegeln" auf mindestens halbe Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind. Die an-schließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch (siehe BEP® III-Bedienungsanleitung).
Die in der BEP® III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen
Rahmenbe-dingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP® II Prozessierung abweichen, sind jedoch in der Kombination
BEP® III/Enzygnost* validiert worden. Testdurchführung mit BEP® 2000
Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (siehe BEP®
2000-Bedienungsanleitung).
Testvalidierung
Die Einzelwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera müssen folgende Spezifikationen erfüllen: - 0,010 ≤ Eneg.≤ 0,150
Epos. > 0,700
Von den vier Extinktionswerten des Kontroll-Serums, negativ, kann ein außerhalb der Spezifikation liegender Wert vernachlässigt werden.
Die Extinktionswerte der positiven Kontrolle müssen beide die Spezifikation erfüllen. Werden diese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test zu wiederholen.
Testauswertung
Die Auswertungen erfolgen mit BEP® 2000 und BEP® III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungen
heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützung zu beachten. Aus den validen Extinktionswerten der negativen Kontrolle wird der Mittelwert gebildet.
Zur Grenzwertberechnung wird zum Extinktionsmittelwert der negativen Kontrolle ein Wert von 0,400 addiert: _
Eneg. + 0,400 = Grenzwert (cut off)
Als Grauzone wird definiert:
Grenzwert bis Grenzwert -10 %
Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert:
Testergebnis:
^ 1. EProbe < cut off -10 % = "negativ"
^ 2. EProbe > cut off = "reaktiv"
^
3. cut off -10 % ≤ EProbe ≤ cut off = "grenzwertig"
Proben, die Extinktionswerte in der Grauzone oder höhere Extinktionen ergeben, sind in Doppelbestimmung erneut zu testen. Ergeben sich bei der Wiederholungstestung Extinktionswerte unterhalb der Grauzone, ist die Probe nach den Kriterien des Tests als Antikörper-negativ anzusehen.
Bei erneut grenzwertigen oder höheren Extinktionsmittelwerten gilt die Probe als wiederholt reaktiv. Alle wie-derholt grenzwertig oder reaktiv reagierenden Proben müssen einer Bestätigung mit Hilfe sogenannter Konfir-mationstests (z.B. Western-Blot-Analyse) zugeführt werden.
Einschränkungen der Testdurchführung
1. Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht. 2. Lipämische, ikterische oder hämolytische Proben führen zu keiner Testbeeinträchtigung.
3. Proben mit den potentiell störenden Substanzen Rheumafaktoren, EBV/IgM-Antikörper, VZV/IgM-Antikör-per, E.-Coli-AntikörVZV/IgM-Antikör-per, ANA und AMA sowie Seren von Schwangeren wurden mit dem Test überprüft. Mit den eingesetzten Proben wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet.
4. Bei mehrfach eingefrorenen und aufgetauten Proben sowie bei hitzebehandelten Seren (30 min. +56 °C) wurden keine Störungen beobachtet.
5. Ungenügend geronnene Seren und mikrobiell kontaminierte Untersuchungsproben sollten nicht einge-setzt werden. Eventuell vorhandene partikuläre Komponenten (z.B. Fibrin-Gerinnsel, Erythrozyten) müs-sen vor der Testdurchführung entfernt werden.
6. Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten.
7. Der Test ist nur für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von gepoolten oder verdünnten Proben geeignet. 8. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den chargengebun-denen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte Chromogen-Gebrauchslö-sung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der Kombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnung, die auf der Packung aufgedruckt bzw. der separat beigepackten Barcode-Tabelle zu entnehmen sind.
9. Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in Kontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit flüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe von Hypochlorit-haltigen Desinfektions-mitteln durchführen. Eine spontane Blaufärbung der Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die Testplatte deutet auf Kontamination hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen. Hautkontakt mit den vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden.
10. Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen (z.B. auf fixierter Schwimmhilfe oder im nicht zirku-lierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten Wasser. Werden Stabili-satoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet, so ist sorgfältig darauf zu achten, dass weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchen mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch unspezifische Reaktionen hervorgerufen werden könnten.
11. Bei stark reaktiven Proben kann bei der Stoppreaktion der Farbstoff ausfallen. Die photometrische Aus-wertung wird dadurch nicht beeinflusst.
12. Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungen auftre-ten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen.
13. Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf optimale Pro-duktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer vorgenommene Ände-rungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung des Systems und die Testergebnis-se beeinflusTestergebnis-sen können. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers, Änderungen an dieTestergebnis-sen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzien auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren.
14. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden.
Leistungsmerkmale des Tests
Sensitivität und SpezifitätDie Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen 2 + 3 (im Anhang) zusammengefaßt. Bei der Ermittlung der Sensitivität wurden insgesamt 566 Anti-HIV1, 317 Anti-HIV2 und 22 Anti-HIV1 (Subtyp O) positive Proben untersucht. Alle getesteten 905 Anti-HIV positiven Proben wurden nach den Kriterien des Enzygnost* Anti-HIV 1/2
Plus positiv gefunden. Die Reaktivität des Tests bei Serokonversionsproben wurde anhand von 31 Serokonversionspanel untersucht. Dabei zeigte sich, dass Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus eine Sensivität bzgl. der Erkennung von
Serokonversio-nen aufweist, die der Empfindlichkeit vergleichbarer Tests entspricht. Unabhängig davon kann nicht ausgeschlossen werden, daß sich bei breiter Anwendung des Tests einzelne Proben dem Nachweis entziehen können.
Bei der Ermittlung der Spezifität wurden insgesamt 9243 Anti-HIV- negative Blutproben untersucht und eine Spezifität von 99,3 bis 100 % (initiale Testung) bzw. 99,9 % (Retestung) ermittelt. Bedingt durch das Untersu-chungskollektiv, die Testdurchführung u.a. sind abweichende Werte möglich.
Nach derzeitigem Kenntnisstand kann aus einem positiven Ergebnis der Anti-HIV-Testung nicht mit Sicherheit abgeleitet werden, dass infektiöses HIV1 oder HIV2 im Blut vorhanden ist, wie auch ein negatives Testergeb-nis keineswegs die Anwesenheit von HIV1 oder HIV2 sicher ausschließt.
Reproduzierbarkeit
Die Ergebnisse zur Intra/Inter-assay Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 4 (im Anhang) zusammengefasst. Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführung u.a. sind durch-aus abweichende Werte möglich.
* Enzygnost ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland und anderen Ländern.
BEP ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland und anderen Ländern.
Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg
OQFK G13 C0542 (908) H/R 15
Tab. 1 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Enzygnost
*Anti-HIV 1/2 Plus
Material/Reagenz
Zustand
Lagerung
Stabilität•
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus nach Öffnen +2 bis +8 °C 6 Wochen
(Testplatte / restliche Riegel) im Beutel mit Trockenkapseln
HIV-Ag/POD-Konjugat nach Öffnen +2 bis +8 °C 4 Wochen +18 bis +25 °C 2 Tage Proben-Puffer (Anti-HIV) nach Öffnen +2 bis +8 °C 4 Wochen Kontroll-Serum, positiv nach Öffnen +2 bis +8 °C 4 Wochen
(Anti-HIV 1) < -20 °C 3 Monate
Kontroll-Serum, negativ nach Öffnen +2 bis +8 °C 4 Wochen
(Anti-HIV) < -20 °C 3 Monate
Chromogen TMB nach Öffnen +2 bis +8 °C bis Verfallsdatum Puffer/Substrat TMB nach Öffnen +2 bis +8 °C bis Verfallsdatum Chromogen-Gebrauchslösung nach Ansatz +2 bis +8 °C 5 Tage
+18 bis +25 °C 8 Stunden geschlossenes Gefäß,
lichtgeschützt
Waschlösung POD nach Öffnen +2 bis +8 °C bis Verfallsdatum (Konzentrat) nach Ansatz +2 bis +8 °C 1 Woche
+18 bis +25 °C 1 Tag
Stopplösung POD nach Öffnen +2 bis +8 °C bis Verfallsdatum
•
In keinem Fall länger als bis zum Verfallsdatum!Tab. 2 Sensitivität
Bei den Untersuchungen zur Sensitivität wurden an vier unabhängigen Zentren (Br, F, G, E) folgende Daten ermittelt:
Probenkollektiv
Probenanzahl
initial reaktiv
(Br) Anti-HIV1 pos. (Europa) 51 51
Anti-HIV1 pos. (USA) 55 55
Anti-HIV1 pos. (Afrika) 136 136
Anti-HIV2 pos. 54 54
Anti-HIV1 (Subtyp O) pos. 7 7
Serokonversionspanel 31 Anti-HIV Sensitivität entspricht der Em-Panels pfindlichkeit vergleichbarer Tests
(F) Anti-HIV1 pos. 77 77
Anti-HIV2 pos. 48 48
Anti-HIV1 (Subtyp O) pos. 10 10
(G) Anti-HIV1 pos. 150 150
Anti-HIV2 pos. 44 44
Anti-HIV1 (Subtyp O) pos. 5 5
(E) Anti-HIV1 pos. 97 97
Anti-HIV2 pos. 171 171
Tab. 3 Spezifität
Bei den Untersuchungen zur Spezifität wurden an vier unabhängigen Zentren (Be, Br, E, F) folgende Daten ermittelt:
Probenkollektiv
Probenanzahl
initial reaktiv
retest reaktiv
(Be) normal negative Seren (Deutschland) 3160 0 -(Br) normal negative Seren (Deutschland) 2397 4 3 normal negative Plasmen (Deutschland) 197 0 -normal negative Seren (West-Afrika) 436 3 nicht getestet (E) normal negative Seren (Deutschland) 2003 0 -(F) normal negative Seren (Frankreich) 1050 0
-Tab. 4 Reproduzierbarkeit
Bei den Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit wurden die Proben an 5 Tagen in jeweils 8fach-Bestimmung getestet. Die Berechnung der Variationskoeffizienten (VK) erfolgte nach dem Varianzkomponentenmodell.
Probe Extinktions- %VK
Mittelwert Intra-assay Inter-assay
F1 2,36 4,7 12,6 F2 1,74 3,0 11,4 F3 0,54 7,0 5,2 F4 0,75 5,9 16,3 F5 0,51 3,9 17,0 F6 0,06 9,2 39,5
OQFK G13 C0542 (908) H/R 17
Vorbereitung der Reagenzien 25 µl Probenpuffer 4 x 100 µl Kontrollserum, negativ
2 x 100 µl Kontrollserum, positiv je 100 µl unverdünnte Probe BEP® II BEP® III
30 min ± 2 min teilbestückte Platten mit (37 ± 1 °C) "Wasserriegeln" auf halbe
Platten ergänzen 4 x Waschen:
BEP® II
100 µl Konjugat
30 min ± 2 min automatische (37 ± 1 °C) Testabarbeitung 4 x Waschen: BEP® II 100 µl Chromogen-Gebrauchslösung 30 min ± 2 min +18 °C bis +25 °C lichtgeschützt 100 µl Stopplösung nach maximal 1 h Auswertung 450 nm (Referenzwellenlänge: 650 nm) Testergebnis
Enzygnost
*Anti-HIV 1/2 Plus
Testdurchführung
Menüprogrammierung
(BEP
®II, BEP
®III, BEP
®2000)
für den
Tab. 5 Testdurchführung und -programmierung
BEP
®II
MENU NO
OPERATE 1
YES
Dosierung Probenpuffer
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
25
CHANNEL NO
3
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
Waschen und Dosierung Konjugat
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
2
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
Waschen und Dosierung Chromogen
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
Dosierung Stopplösung
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
PHOT
YES
MEAS WL
450
REF WL
650
BLK COR
NO
EVAL MODE
1
GEN CUT
NO
NEG CONT
4
MAX NEG
0.150
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
0.400
CUT OFF
BEP® 2000OQFK G13 C0542 (908) H/R 18
Enzygnost
*
Anti-HIV 1/2 Plus
Domaines d'utilisation
Test immunoenzymatique pour le dépistage des anticorps anti-antigènes VIH1, VIH2 et VIH1 (sous-type O) dans le sérum ou le plasma. La réalisation du test immunoenzymatique se fait à l’aide des ELISA Processeurs BEP® II, BEP® III et BEP® 2000. Le test a été mis au point pour l'analyse d'échantillons individuels, et non de
pools d'échantillons. Le produit ne doit être utilisé qu'à des fins de diagnostic in vitro.
Intérêt Diagnostique
Le Syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) a été reconnu pour la première fois en 1981 comme ta-bleau clinique autonome. Deux virus différents d’immunodéficience humaine (VIH1 et VIH2) sont aujourd’hui considérés comme responsables de la maladie. L’isolement de l'VIH1 (synonymes : LAV/HTLV III) a réussi dès 19831,2. En 1986, un deuxième virus (VIH2), également pathogène pour l’Homme, a été isolé3. Le dosage
sérologique des anticorps anti-VIH présente un intérêt particulier pour la médecine transfusionnelle, puisqu’il permet de prévenir la propagation de la maladie.
Depuis 1985, la recherche d’anticorps anti-VIH1 sur les dons de sang est obligatoire aussi bien pour les centres de transfusion sanguine que pour les fabricants de produits sanguins. Des informations complémen-taires sur le développement d’infections à VIH2 ont depuis généralisé le dépistage en routine des anticorps anti-VIH1 et VIH2, dans le souci d’exclure le transfert possible de la maladie par la transfusion ou l’utilisation de préparations sanguines.
En 1990, un nouveau sous-type d'VIH a été décrit4. Ce n'est qu'en 1994 que deux équipes indépendantes
l'une de l'autre ont réussi simultanément à définir la séquence de ce nouveau sous-type5, 6. Parallèlement à
ces travaux virologiques, plusieurs équipes de recherche ont pu montrer l'intérêt sérologique du virus, aujourd'hui appelé VIH1-sous-type O7. Certains test anti-VIH 1+2 ont alors montré leur faiblesse à révéler les
anticorps anti-sous-type O8. Le besoin est donc apparu de disposer d'un test fiable pour la recherche
simulta-née de ce nouveau variant VIH et des isolats VIH1 et VIH2 déjà établis.
Bien que la mise en évidence d’anticorps anti-VIH1 ou anti-VIH2-spécifiques ne permette pas de dire avec certitude si le sang contient de l’VIH1 ou de l’VIH2 infectieux au moment du test, de même qu’un résultat négatif ne permet pas d’exclure avec certitude la présence d’VIH1 ou d’VIH2, le test des anticorps constitue pourtant actuellement la meilleu-re solution pour dépister et éliminer avec une grande probabilité les donneurs infectés par l’VIH.
Principe de la méthode
Les immunoglobulines VIH-spécifiques contenues dans l'échantillon à tester se lient aux protéines VIH1, VIH2 et/ou VIH1 (sous-type O) recombinantes fixées à la surface de la plaque de microtitration.
Après élimination par lavage des éléments non liés de l'échantillon, le conjugué se fixe aux anticorps VIH-spécifiques. Après élimination du conjugué en excès, l'activité enzymatique du conjugué fixé est mesurée (réaction colo-rée bleue). La transformation enzymatique du chromogène est stoppée par l'addition de Solution d'arrêt POD (réaction colorée jaune). L'intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration d'anticorps présents dans l'échantillon.
Réactifs
Contenu du coffretEnzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 2 x 96 10 x 96
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 2 plaques-tests 10 plaques-tests
Conjugué Ag-HIV/POD 2 x 15 ml 10 x 15 ml Tampon échantillons (Anti-HIV) 2 x 15 ml 4 x 15 ml Sérum de contrôle positif (Anti-HIV1) 2 x 1,4 ml 3 x 1,4 ml Sérum de contrôle négatif (Anti-HIV) 2 x 2,8 ml 3 x 2,8 ml Solution de lavage POD (concentrée)** - 2 x 100 ml
Tampon/substrat TMB** - 4 x 30 ml
Chromogène TMB** - 4 x 3 ml
Solution d'arrêt POD** - 2 x 100 ml
Flacon vide - 1
Etiquette «Flacon vide pour POD» - 1
Feuilles adhésives 6 30
Fiche technique 1 1
Tableau de codes à barres 1 1
Sachet PE 1 1
Autre conditionnement: 570 x 96 (Q)
** Ces éléments font également partie du Coffrert de réactifs complémentaries pour Enzygnost* TMB (code OUVP).
OQFK G13 C0542 (908) H/R 19
Autres réactifs nécessaires pour le coffret 2 x 96
Réactifs complémentaires pour Enzygnost* TMB (code OUVP) Composition
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus (plaque-test)
Plaque de microtitration recouverte d'un pool de protéines VIH (env) recombinantes (E. coli). Les protéines représentent les domaines immunoréactifs des protéines virales suivantes :
gp41 (VIH1), gp41 (VIH1 sous-type O), gp 36 (VIH2).
Conjugué Ag-HIV/POD
Protéine VIH recombinante et peptides VIH synthétiques.
Conjugué à la peroxydase (POD), prêt à l'emploi après addition de Tris-hydroximethylaminomethan (36 g/l) et de chlorure de sodium (6 g/l).
Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l)
Tampon échantillons (anti-VIH)
Contient de la glycérine (100 g/l), du Tween 20 (20 g/l), du chlorure de sodium (8,8 g/l), de l'EDTA (1,9 g/l), de l'albumine bovine (1 g/l), de la polygéline et du phosphate (50 mmol/l).
Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l)
Sérum de contrôle positif (anti-VIH1)
Sérum humain traité par la chaleur et contenant des anticorps anti-antigène VIH1, stabilisé. Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l)
Sérum de contrôle négatif (anti-VIH)
Sérum humain exempt d'anticorps anti-antigènes VIH1, VIH2 et VIH1 (sous-type O), stabilisé. Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l)
Solution de lavage POD (concentrée)
Solution tampon phosphate (90 mmol/l) additionnée de Tween (18 g/l). Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l)
Tampon/substrat TMB
Peroxyde d'hydrogène (env. 0,1 g/l) en solution tampon acétate (25 mmol/l). Agent de conservation : n-butanol (max. 1%)
Chromogène TMB
Tétraméthylbenzidine-dihydrochlorure (5 g/l).
Solution d'arrêt POD
Acide sulfurique 0,5 N.
Flacon vide pour la solution d'emploi du chromogène
Sachets PE pour la conservation des barrettes non utilisées immédiatement Tableau de codes à barres
Mises en garde et précautions d’emploi
1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro.
2. Tout don de sang prévu pour la préparation des sérums de contrôle est soumis à une recherche d'AgHBs, d'anti-VHC, d'anti-VIH1 et d'anti-VIH2. Pour la préparation du sérum de contrôle négatif, seuls les sérums trouvés négatifs sont utilisés. Le sérum de contrôle positif est traité par la chaleur (au moins 1 heure à +56 °C).
Indépendamment de cela, tout échantillon (par ex. sérum de patient) ou produit (par ex. sérum de con-trôle) obtenu à partir de sang humain doit être manipulé avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où on ne peut exclure totalement tout risque d'infection9.
3. Il est recommandé de porter des gants de protection pendant toute la réalisation du test.
4. Pour décontaminer le matériel de laboratoire infecté, l’autoclaver pendant au moins 1 heure à +121°C. Toutes les solutions aspirées doivent être récoltées dans deux récipients reliés l’un à l’autre et contenant chacun un désinfectant spécialement prévu pour inactiver les virus pathogènes pour l’homme. Respecter les concentrations et temps d’incubation indiqués par le fabricant.
5. Les réactifs (à l’exception de la Solution de lavage POD, de la Solution d’arrêt POD et de la solution d’emploi du chromogène obtenue à partir des lots de réactifs indiqués pour le Chromogène TMB et le Tampon/substat TMB) ne peuvent être utilisés que selon la combinaison des numéros de lots à 6 chiffres indiqués sur le coffret et dans le tableau des valeurs codes-barres joint.
Préparation des réactifs
Porter tous les réactifs et échantillons à +18/+25 °C avant le début du test, sans sortir la plaque-test de son emballage. Le coffret Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 10 x 96 contient une étiquette avec code à barres pour un flacon vide
destiné au Conjugué Ag-HIV/POD. Pour éviter de changer trop souvent de seringue sur le BEP® III si on
effectue de grandes séries d’analyses, verser le contenu de plusieurs flacons de Conjugué Ag-HIV/POD dans un flacon plus grand (par ex. le flacon vide pour la solution d’emploi du chromogène si on ne l’utilise pas, ou un flacon rincé de Solution d’arrêt POD), apposer l’étiquette «Flacon vide pour Conjugué», et placer le flacon dans le carrousel réactifs.
Pour une plaque, diluer 20 ml de Solution de lavage POD avec de l'eau distillée ou désionisée en complétant à 400 ml.
Solution d'emploi du chromogène : pour une plaque, diluer 1 ml de Chromogène TMB avec 10 ml de Tampon/substrat TMB dans le flacon vide joint au coffret (solution d'emploi du chromogène), et conserver la
solution, le flacon fermé, à l’abri de la lumière. Après utilisation, bien rincer le flacon à l’eau distillée. Pour des raisons de remplissage du flacon, il est impossible de verser la totalité du contenu d'un flacon de Chromogène TMB dans un flacon de Tampon/substrat TMB.
Stabilités et conditions de conservation
Avant leur ouverture, tous les éléments du coffret Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus se conservent à la température
indiquée jusqu'à la date indiquée sur l'étiquette.
Pour les stabilités et conditions de conservation après ouverture des flacons et préparation des réactifs à leur dilution d'emploi, se reporter au tableau 1 en annexe.
Matériel nécessaire:
BEP® II : pour la distribution automatique des réactifs et l'automatisation des étapes de lavage
BEP® III: pour l'automatisation du test après la distribution des échantillons et de l'exploitation
des résultats
BEP® 2000 : pour l’entière automatisation du test et de l’ exploitation des résultats
Pipettes: pipettes à embout de 25, 100 et 1000 µl
Incubateur: bain-marie couvert (+37 ± 1 °C) ou méthode d'incubation équivalente Tout le matériel utilisé pour la réalisation du test doit être validé.
Echantillons à tester
Utiliser des échantillons (sérums humains ou plasmas citratés, héparinés ou prélevés sur EDTA) obtenus selon les techniques standard des laboratoires. Les échantillons peuvent être conservés 3 jours maximum à +2/+8 °C. Pour une conservation plus longue, les congeler.
Réalisation du test
Réalisation du test à l’aide du BEP® II 1. Plan de distribution :
déterminer le nombre de cupules nécessaires (nombre d'échantillons à tester + 6 cupules pour les con-trôles). Sortir du cadre les barrettes inutiles et les conserver pour un test futur (cf. Tableau 1).
2. Prédistribution du Tampon échantillons :
distribuer dans chaque cupule 25 µl de Tampon échantillons.
3. Distribution des contrôles et échantillons :
distribuer dans 4 cupules 100 µl de contrôle négatif, dans 2 cupules 100 µl de contrôle positif, puis 100 µl de chacun des échantillons non dilués dans les cupules suivantes. Couvrir d'une feuille adhésive et placer la plaque le plus rapidement possible dans l'incubateur, au plus tard 15 min après la fin de la distribution des échantillons.
Comme alternative au schéma de pipetage indiqué ci-dessus, on peut également déposer le contrôle positif une fois en début et une fois en fin de série.
Schéma de pipetage : distribuer 100 µl de contrôle négatif dans les 4 premières cupules, 100 µl de contrôle positif dans la cupule 5, 100 µl de chacun des échantillons non dilués dans les cupules suivan-tes, puis de nouveau 100 µl de contrôle positif à la fin de la série ou de la plaque.
4. Incubation des échantillons :
laisser incuber 30 ± 2 min à +37 ± 1 °C, et enchaîner immédiatement le processus de lavage. 5. Lavage :
retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, et laver 4 fois avec env. 0,3 ml de solution de lavage.
6. Distribution du conjugué :
ajouter dans chaque cupule 100 µl de conjugué, couvrir d'une feuille adhésive et placer la plaque immé-diatement dans l'incubateur.
7. Incubation du conjugué :
laisser incuber 30 ± 2 min à +37 ± 1 °C comme décrit en 4., et enchaîner immédiatement le processus de lavage.
8. Lavage :
retirer la feuille adhésive et laver comme décrit en 5.
9. Distribution du substrat :
ajouter dans chaque cupule 100 µl de la solution d’emploi du chromogène et couvrir la plaque d’une nouvelle feuille adhésive.
10. Incubation du substrat :
OQFK G13 C0542 (908) H/R 21 11. Arrêt de la réaction :
retirer la feuille adhésive et ajouter dans chaque cupule 100 µl de Solution d'arrêt POD en respectant le même rythme qu’en 9.
12. Mesure :
faire une mesure photométrique dans l'heure qui suit à 450 nm.
La mesure de la densité optique des contrôles et des échantillons de patients se fait à 450 nm. Une longueur d’onde de référence de 650 nm est recommandée (éventuellement comprise entre 615 et 690 nm).
Réalisation du test sur le BEP® III
Pour une utilisation sur le BEP® III, les plaques-tests doivent être préparées jusqu’y compris la distribution des
échantillons (points 1 et 2 du paragraphe «Réalisation du test sur le BEP® II»). Immédiatement après cette étape,
placer la plaque ouverte, c’est-à-dire non recouverte d’une feuille adhésive, dans le BEP® III. Si la plaque n’est
pas totalement utilisée, la compléter au moins pour moitié (6 barrettes) avec des barrettes remplies d’eau. La suite du test est ensuite effectuée entièrement automatiquement (cf. Manuel d’utilisation du BEP® III).
Les temps d’incubation prévus dans le logiciel du BEP® III peuvent, du fait de conditions techniques (cadence
de l’appareil), diverger par rapport à ceux du BEP® II. Ils ont toutefois été validés dans la combinaison BEP® III/
Enzygnost*.
Réalisation du test sur le BEP® 2000
La distribution des échantillons ainsi que la réalisation du test sont effectuées entièrement automatiquement par l’appareil (cf. Manuel d’utilisation du BEP® 2000).
Validation du test
Les différentes densités optiques obtenues pour les sérums de contrôle doivent répondre aux critères suivants : -0,010 ≤ Enég≤ 0,150
Epos ≥ 0,700
Pour les quatre valeurs du contrôle négatif, si une seule ne répond pas au critère indiqué, ne pas en tenir compte pour le calcul de la moyenne.
Les deux valeurs du contrôle positif doivent répondre au critère indiqué. Si ces conditions ne sont pas remplies, le test doit être recommencé.
Exploitation du test
L’exploitation des résultats est effectuée automatiquement par le BEP® 2000 et le BEP® III. Respecter les
instructions indiquées pour l’appareil utilisé. Ci-dessous le protocole d’exploitation du test en l’absence d’un logiciel.
Calculer la valeur moyenne des densités optiques obtenues pour le contrôle négatif, et y ajouter une valeur de 0,400 pour obtenir la valeur-seuil :
–
Enég + 0,400 = valeur-seuil (cut off)
La zone grise est déterminée comme suit : valeur-seuil jusqu'à valeur-seuil -10%
Selon les critères du test, les échantillons sont classés comme suit :
Résultat du test :
^
1. Eéchan < cut off - 10% = «négatif» ^
2. Eéchan > cut off = «réactif»
^
3. cut off - 10% ≤ Eéchan ≤ cut off = «douteux»
Les échantillons trouvés dans la zone grise ou supérieurs à cette zone grise, doivent être retestés en double. Si un échantillon trouvé initialement douteux donne des valeurs inférieures à la zone grise dans le retest, le considérer comme négatif selon les critères du test.
Si les deux valeurs du retest sont de nouveau trouvées dans la zone grise ou supérieures à la zone grise, l'échantillon doit être considéré comme de nouveau réactif. Tous les échantillons retrouvés douteux ou réactif doivent être confirmés à l'aide d'un test dit de confirmation (par ex. une analyse Western-Blot).
Limites du test
1. Les anticoagulants, comme l’héparine, l’EDTA et le citrate, n’ont pas d’influence sur le résultat du test. 2. Les échantillons lipémiques, ictériques ou hémolytiques n’ont pas d’influence sur le test.
3. Des tests ont été effectués sur échantillons contenant des substances éventuellement interférentes, tels les facteurs rhumatoides, les anticorps anti-EBV/IgM, anti-VZV/IgM, anti-E. Coli, les ANA et AMA, ainsi que sur sérums de femmes enceintes. Aucune interférence sur les résultats du test n'a été observée. 4. L’utilisation d’échantillons plusieurs fois congelés ou de sérums traités à la chaleur (30 mn à +56 °C) n’a
