PIBIC-UFU, CNPq & FAPEMIG Universidade Federal de Uberlândia Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação DIRETORIA DE PESQUISA
MONITORAMENTO DO ESTRESSE FÍSICO PELA PROTEÍNA TOTAL DA
SALIVA VIA DETECÇÃO AMPEROMÉTRICA
Rafael Rodrigues Cunha1
Universidade Federal de Uberlândia, Av. João Naves de Ávila, 2121 – Bloco 1D; Uberlândia-MG; CEP: 38400-902 rafa2008el@gmail.com
Abílio Tomaz Coelho da Silva1
abiliotcs@gmail.com
Ana Paula Silva Duarte1 aninha.sduarte@hotmail.com
Rodrigo Amorim Bezerra da Silva2
rodamorimsilva@gmail.com
Eduardo Mathias Richter3 emrichter@iqufu.ufu.br
Resumo: O objetivo principal deste trabalho é apresentar uma alternativa para identificar o
estresse físico, pela análise da proteína total da saliva, em relação ao método utilizado hoje, que é a análise da concentração de lactato no sangue. Para a detecção eletroquímica da atividade da proteína total da saliva foi utilizada a técnica eletroanalítica chamada amperometria de múltiplos pulsos acoplada a Análise por Injeção em Fluxo (FIA, do inglês, Flow Injection Analisys). Como eletrodo de trabalho foi utilizado um eletrodo de ouro comercial (Metrohm) em meio alcalino com
hidróxido de sódio 0,1 mol L-1. Coletou-se a saliva para análise com o dispositivo Salivetti®
(Sarstedt Aktiengesellschaft & Co) após os indivíduos serem submetidos a um exercício físico com sucessivos aumentos de carga. Após o monitoramento de 3 indivíduos obtivemos resultados promissores e podemos afirmar que a metodologia proposta permite identificar o estresse físico através da análise da proteína total da saliva.
Palavras-chave: estresse físico, saliva, amperometria, FIA. 1. INTRODUÇÃO
Atualmente, o material biológico mais utilizado para diagnósticos clínicos é o sangue (plasma) e a urina. Porém, uso do sangue requer procedimentos invasivos de coleta, o que sempre acarreta algum desconforto ao paciente e até pode gerar riscos de contaminação. A urina, por sua vez, devido a sua produção diária em volume elevado pelo corpo humano, provoca diluições da espécie de interesse, o que impede sua quantificação ou então, condiciona a coleta para determinados horários onde as diluições são menores (ao amanhecer).
A saliva, por sua vez, não requer procedimentos invasivos ou equipamentos especiais, como ocorre para a coleta de tecido, sangue ou plasma. Sendo a saliva um dos mais complexos, versáteis e importantes fluídos do corpo, que supre várias necessidades fisiológicas, suas propriedades são essenciais para o início da digestão (amido), a proteção da cavidade bucal, do epitélio gastrointestinal e da orofaringe. Tem sua coloração transparente e é secretada pelas glândulas salivares diretamente na cavidade bucal. Ela evidencia alterações de ordem sistêmica, emocional, alimentar, entre outras, que podem causar ardência bucal, cárie, mau hálito, lesões bucais, inflamação gengival, etc. Composta por cerca de 98% de água, contém também uma série de outras substâncias, tais como: eletrólitos (sódio, potássio, cálcio, magnésio, cloreto, bicarbonato, fosfato), muco (o muco salivar contém principalmente mucopolissacarídeos e glicoproteínas), compostos anti-bacterianos e várias enzimas ( – amilase, lisozima, etc).
Em relação à análise da saliva sabe-se do pequeno volume produzido pelo corpo humano durante um dia (0,8 a 1,0 litro), resultando em menor diluição e maior concentração das espécies de interesse, quando comparados com o do plasma (5 litros/dia no homem adulto) ou ainda, a urina. Portanto fica evidente a necessidade de se buscar um método que tenha reduzido gastos de reagentes (devido a baixa disponibilidade de amostra em comparação com os métodos convencionais) e, portanto menor geração de resíduos, alta freqüência analítica, baixo custo por análise (Schultze e Bressel, 2001).
Outra grande vantagem do uso da saliva para o monitoramento de espécies de interesse clínico é que esta amostra, quando não contaminada com sangue, é considerada como de biosegurança de classe I, de acordo com o Centro de Doenças dos Estados Unidos, sendo segura para a manipulação dos laboratórios envolvidos em pesquisa e diagnóstico a partir de amostras de saliva (Shirtcliff et all, 2000).
Diante do exposto acima, este relatório apresentada os resultados iniciais obtidos para o monitoramento da proteína total na saliva utilizando um eletrodo de ouro e amperometria de múltiplos pulsos acoplada a Análise por injeção em Fluxo.
2. MATERIAL E MÉTODOS
O sistema FIA utilizado é de linha única (d.i. = 1 mm) usando um injetor comutador manual e uma célula eletroquímica do tipo wall-jet. O eletrodo de trabalho usado é de ouro (Metrohm). Previamente ao uso, uma limpeza mecânica do mesmo é realizada usando alumina em pó. Como instrumento para a detecção eletroquímica da atividade da -amilase e da proteína total da saliva, utilizou-se o potenciostato µAutolab tipo III interfaceado a um computador via software (GPES 4.9).
Na metodologia proposta, a proteína total é detectada na saliva após diluição da mesma em
uma solução de hidróxido de sódio 0,1 mol L-1 (200 vezes), ou seja, 50 L de saliva são diluídas em
10 mL de NaOH 0,1 mol L-1. A solução de NaOH 0,1 mol L-1 também foi usada como solução
carregadora. A detecção amperométrica foi implementada com a aplicação de três pulsos de potenciais rápidos e sequênciais em função do tempo: -0,20 V (400ms), +0,55 V (400ms) e +0,75 V (200ms) (Johnson e Lacourse, 1990). O método de detecção amperométrica com a aplicação de três pulsos de potenciais pode gerar três gráficos conhecidos como amperogramas, um para cada pulso de potencial.
A utilização desta técnica, onde temos uma alternância seqüencial de aplicação dos pulsos de potenciais em função do tempo serve para a detecção do composto (+ 0,55 V) e para a limpeza (- 0,20 V) e reativação (+ 0,75 V) da superfície do eletrodo de trabalho. Nessa técnica, após o
A formação de uma camada de óxido interferiria na análise, pois reduziria a área superficial do eletrodo de trabalho. Em seguida, para que não ocorra tal interferência na análise, a atividade da superfície do eletrodo é regenerada pela dissolução catódica do filme de óxido, através da aplicação de um pulso de potencial negativo por um período de tempo (– 0,20 V por 400 ms). Assim, a superfície do eletrodo é constantemente regenerada durante a análise (Johnson e Lacourse, 1990).
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Testes foram realizados com 3 (três) indivíduos coletando a saliva antes, durante e após a realização de exercício físico em uma bicicleta ergométrica. A coleta da saliva também foi feita com o dispositivo Salivette® (Sarstedt Aktiengesellschaft & Co). A coleta foi feita nos três indivíduos antes do exercício físico e após 2, 4, 6 e 8 minutos de atividades numa bicicleta ergométrica (sob incrementos sucessivos de carga, apresentados na Figura 1), e finalmente, após 5 minutos de repouso.
Figura 1: Gráfico de tempo de exercício em função do aumento da força em Watts.
Após a coleta e a preparação da amostra para análise (centrifugação e diluição, como já mencionado), cada amostra foi injetada no sistema FIA em triplicata. Os pulsos de potenciais utilizados na detecção amperométrica de múltiplos pulsos foram de + 0,75 V, + 0,55 V e – 0,20 V. Porém, apenas o sinal de corrente adquirido no amperograma no pulso de potencial de + 0,55 V tem finalidade analítica para o trabalho, pois, os outros pulsos de potenciais servem somente para a manutenção da repetibilidade de sinal do eletrodo de trabalho em função do tempo. Os resultados obtidos estão dispostos a seguir:
Figura 2: Amperograma obtido no pulso de potencial de +0,55 V para injeções em triplicata de amostras de saliva coletadas do indivíduo P em função do tempo de exercício físico (repouso, 2,4,
6, 8 de exercício e após 5 min de repouso, respectivamente).
Como pode ser visualizado na Figura 2, o individuo P teve uma elevação do estresse físico (concentração total de proteína), pois, mesmo que não muito intenso, houve um aumento da corrente detectada em relação à linha base e, portanto, um aumento na concentração da proteína total presente na saliva. Tal diferença se torna bem visível a partir 6º minuto de exercício físico e com a força de 210 W (Figura 1).
O mesmo procedimento foi realizado para os indivíduos D e R, sendo os resultados apresentados nas duas Figuras a seguir:
Figura 3: Amperograma obtido no pulso de potencial de +0,55 V para injeções em triplicata de amostras de saliva coletadas do indivíduo R em função do tempo de exercício físico (repouso, 2, 4,
Figura 4: Amperograma obtido no pulso de potencial de +0,55 V para injeções em triplicata de amostras de saliva coletadas do indivíduo D em função do tempo de exercício físico (repouso, 2,
4, 6, 8 de exercício e após 5 min de repouso, respectivamente).
Um gráfico foi construído com a relação entre as áreas dos picos dos amperogramas dos três indivíduos e o tempo de exercício (apresentado na Figura 5).
Figura 5: Área dos picos para a proteína total presente na saliva em função tempo de exercício. Pela Figura 5 pode ser observado um aumento na área dos picos na detecção da proteína total no pulso de potencial de +0,55 V (400 ms) em função do tempo de exercício na bicicleta ergométrica. Para os 3 indivíduos estudados, um aumento inicial linear na concentração da proteína total na saliva pode ser observado. Após certo tempo, o perfil de resposta passa a ser exponencial. Esta mudança no perfil da resposta corresponde ao limiar anaeróbico, onde a respiração passa de aeróbica para anaeróbica, sendo que este tempo está diretamente relacionado com o estresse físico. Após 5 minutos do término do exercício (13 min, Fig.5), nota-se a redução da área e, portanto um decaimento do sinal, devido ao retorno aos níveis normais de concentração das proteínas totais presentes na saliva (retorno a respiração aeróbica). A diferença no tempo necessário para atingir o comportamento exponencial pode ser correlacionada ao preparo físico do indivíduo estudado.
Este perfil de resposta é semelhante a do lactato sanguíneo, que é a espécie usada com maior frequência para o monitoramento do estresse físico induzido por exercício físico (Shirtcliff et all,
Os resultados obtidos com esta metodologia (Figura 5) possibilitam diferenciar os três indivíduos analisados em relação ao preparo físico de cada um, pois quanto maior o tempo necessário para que o comportamento do gráfico passe do formato linear para exponencial, melhor o preparo físico do indivíduo.
4. CONCLUSÕES
A partir dos resultados apresentados neste trabalho, podemos confirmam que a metodologia proposta permite a analisar o estresse físico através da análise da proteína total da saliva. Como o perfil de resposta é semelhante a do lactato sanguíneo, que é a espécie usada com maior frequência para o monitoramento do estresse físico induzido por exercício físico, o método proposto tem potencial como uma alternativa ao monitoramento de lactato no sangue.
Para a finalização deste método de análise, os estudos propostos neste deverão ser repetidos com um número maior de indivíduos. Além disto, os resultados deverão ser comparados aos obtidos com um método oficial em colaboração com um grupo de pesquisa do Instituto de Genética e Bioquímica da Universidade Federal de Uberlândia.
Uma previsão para a finalização bem sucedida desta pesquisa seria a adaptação da metodologia ao uso de eletrodos de ouro comerciais e descartáveis (screen printed) disponíveis no mercado com a substituição técnica FIA para análise em “batch” (estática). Porém, tais implementações não são de fácil execução e necessitarão de novos estudos por parte de nosso grupo de pesquisa.
5. AGRADECIMENTOS
Agradeço ao apoio do CNPq e da FAPEMIG, que fomentaram este trabalho e também ao Instituto de Química da Universidade Federal de Uberlândia.
6. REFERÊNCIAS
Johnson, D. C. and Lacourse, W. R., 1990, “Liquid-chromatography with pulsed electrochemical detection at gold and platinum-electrodes”, Analytical Chemistry, Vol. 62, pp. 589.
Schultze, J. W. and Bressel, A., 2001, “Principles of electrochemical micro- and nano-system technologies”, Electrochimica Acta, Vol. 47, pp.3-21.
Shirtcliff, E. A. and Granger, D. A. and Schwartz, E. B. and Curran, M. J. and Booth, A. and Overman, W. H., 2000, “Assessing estradiol in biobehavioral studies using saliva and blood spots: Simple radioimmunoassay protocols, reliability, and comparative validity”, Hormones and Behavior, Vol. 38, pp. 137-147.
Shirtcliff, E. A. and Granger, D. A. and Schwartz, E. and Curran M. J., 2001, “Use of salivary biomarkers in biobehavioral research: cotton-based sample collection methods can interfere with salivary immunoassay results”, Psychoneuroendocrinology, Vol. 26, pp. 165-173.
PHYSICAL STRESS MONITORING BY AMPEROMETRIC DETECTION
OF TOTAL PROTEIN IN SALIVA
Ana Paula Silva Duarte
aninha.sduarte@hotmail.com
Rodrigo Amorim Bezerra da Silva
rodamorimsilva@gmail.com
Eduardo Mathias Richter
emrichter@iqufu.ufu.br
Abstract: The main objective of this paper is to show an alternative way of verify pyshical stress,
trough analysis of the salivary protein, comparing with the method that it is done nowadays, which is the analysis of the concentration lactate on blood samples. Aiming at an electrochemical detection of the activity of the salivary protein, were used FIA (Flow Injection Analisys) with multiple pulse amperometric detection. As work electrode were used a gold electrode (Metrohm)
and sodium hidroxy 0.1 mol L-1 as electrolyte. The salive for analisys were collected by a divece
called Salivetti® (Sarstedt Aktiengesellschaft & Co) after the people were subimitted to an exercise with growing levels of dificulty. After that, the analysis were performed in all 3 persons and the results were promising and we conclude that the method that were shown can analyze pyshical stress trough salivary protein analysis.
