INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO
PAOLA MONTEIRO DE OLIVEIRA
PRODUÇÃO DE L-(+)-ÁCIDO LÁTICO POR
LACTOBACILLUS RHAMNOSUS ATRAVÉS DE
BATELADA ALIMENTADA
Rio Claro 2011
PAOLA MONTEIRO DE OLIVEIRA
PRODUÇÃO DE L(+)-ÁCIDO LÁTICO POR LACTOBACILLUS
RHAMNOSUS ATRAVÉS DE BATELADA ALIMENTADA
Orientador: Prof. Dr. Jonas Contiero
Co-orientadora: Profa. Dra. Luciana Fontes Coelho
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Câmpus de Rio Claro, para obtenção do grau de Bacharel e Licenciatura.
Rio Claro
2011
batelada alimentada / Paola Monteiro de Oliveira. - Rio Claro : [s.n.], 2011 40 f. : il., gráfs., tabs., fots.
Trabalho de conclusão de curso (licenciatura e bacharelado - Ciências Biológicas Noturno) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro
Orientador: Jonas Contiero
Co-Orientador: Luciana Fontes Coelho
1. Fermentação. 2. Alimentação por pH stat. 3. Alimentação por pulso. 4. Alimentação por fluxo constante. I. Título.
Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP
Dedico este trabalho a minha mãe, Luciana, e aos meus irmãos, Marcelo Filho e Eduarda, obrigada por existirem e por tornarem a minha vida muito melhor. Vocês são a minha inspiração
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus porque sem Ele nada seria possível.
Sou imensamente grata a minha mãe, que além de me dar a vida sempre foi também meu pai, minha protetora, meu porto seguro, quem me encoraja e me fortalece. Sem ela com certeza não chegaria onde estou.
Agradeço também a pessoa responsável por me dar essa grande oportunidade de trabalhar no Laboratório de Microbiologia Industrial, o meu orientador Prof. Dr. Jonas Contiero. Sou grata por todo apoio, incentivo, amizade, conversas e por todo conhecimento adquirido. Também agradeço com muito carinho a minha co-orientadora Luciana Fontes Coelho por cada segundo dedicado a esse trabalho e por estar ao meu lado nos momentos mais difíceis e estressantes. Sem vocês dois com certeza este trabalho não seria possível.
Quero agradecer também aos meus queridos irmãzinhos, Marcelo Filho e Eduarda, por abrilhantarem e iluminarem a minha vida com sua vinda ao mundo.
Obrigada aos meus amigos do LMI, Mariana, Paula, Francielle, Marcela, Mary, Natália por todos os dias de trabalho, companheirismo e risadas. Agradeço especialmente ao Fabrício e ao Paulo por toda ajuda ao longo do desenvolvimento deste trabalho.
Aos meus grandes amigos Tulio, Vinícius, Roberta e Katie, quero agradecer imensamente pela amizade, por todo apoio, conversas e conselhos. Vocês com certeza tornaram os meus dias no laboratório muito melhor.
Aos demais amigos da graduação muito obrigada por todos os momentos que passamos juntos os quais jamais esquecerei.
Muito obrigada a minha avó Ângela, a minha bisavó Maria, aos meus tios e primos e a toda a minha família e amigos fora da universidade, que são muito importantes pra mim e sem vocês eu não teria a estrutura necessária para desenvolver este trabalho.
A todas as pessoas queridas que me ajudaram, me incentivaram e me apoiaram no desenvolvimento deste trabalho, muito obrigada.
Ao Lucas e aos meus grandes e eternos amigos Marcinho e Solange muito obrigada por me ajudarem, me incentivarem e me apoiarem no desenvolvimento deste trabalho.
Agradeço também à FAPESP pelo financiamento da pesquisa.
A todos vocês a minha imensa gratidão.
“A recompensa de uma coisa bem feita é a de tê-la feito”
RESUMO
O Ácido Lático é um ácido orgânico que possui uma ampla gama de aplicações nas indústrias farmacêuticas, químicas e de alimentos. Ultimamente ele tem sido considerado promissor como bloco na construção de polímeros biodegradáveis (PLA), os quais podem ser usados na produção de plásticos biodegradáveis como embalagens de alimentos e utensílios plásticos e assim substituir os produtos derivados do petróleo. O Ácido Lático pode ser produzido tanto por síntese química como através da fermentação por micro-organismos. As bactérias que produzem ácido lático são chamadas de bactérias láticas e podem produzir D-(-)-ácido lático puro, L-(+)-ácido lático puro ou uma mistura racêmica dos dois isômeros. A produção de somente um dos isômeros puro é uma grande vantagem de se produzir Ácido Lático por fermentação, uma vez que uma mistura racêmica é produzida via síntese química, além disso, a produção a partir da fermentação é mais econômica. Assim, vários estudos estão sendo feitos com o objetivo de se baratear o processo de fermentação lática e de se aperfeiçoar este processo. Este estudo visa à avaliação da produção de L-(+)-ácido lático por Lactobacillus rhamnosus B103 em reator pela utilização de batelada alimentada, uma vez que este processo tem se mostrado o mais eficiente em diversos estudos. Existem vários tipos de alimentação: batelada alimentada por pulso, batelada alimentada por fluxo constante, batelada alimentada com controle por pH stat. Neste presente estudo foram avaliados além do processo de batelada, vários processos de batelada alimentada, como a batelada alimentada com controle por pH stat, batelada alimentada por pulso e batelada alimentada por fluxo constante. O processo de batelada alimentada por fluxo constante foi no qual se obteve a maior concentração final de ácido lático (149,8 g L-1), mas, a melhor produtividade foi obtida no método de batelada alimentada por pulso (2,55 g L-1 h-1). Em relação aos valores das velocidades de crescimento do micro-organismo, produção de ácido lático e consumo de lactose, o experimento em batelada alimentada por fluxo constante foi o mais satisfatório.
Palavras-chave: Lactobacillus rhamnosus, batelada, batelada alimentada.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01 - Foto da fermentação em batelada realizada em reator de 13 L da Infors---20
Figura 02 - Foto da fermentação em batelada alimentada com controle por pH stat com concentração da lactose de soro de leite na alimentação de 110 g L-1. Reator de 13 L da Infor---22 Figura 03 - Foto da fermentação em batelada alimentada por pulso. Reator de 13 L da Infors.---23
Figura 04 - Foto da fermentação em batelada alimentada por fluxo constante. Reator de 13 L da Infors.--- 23 Figura 05 - Cinética da fermentação em batelada realizada em reator de 2 litros com adição de CaCO3 para controle do valor de pH. Temperatura: 37 ºC. Agitação: 200 rpm. pH: 6,---27
Figura 06 - Cinética da fermentação em batelada realizada em shaker com adição de CaCO3
para controle do valor de pH. Temperatura: 37 ºC. Agitação: 150 ---28 Figura 07 - Cinética da fermentação em batelada. . Temperatura: 37 ºC. Agitação: 200 rpm. pH: 6,2.--- ---29 Figura 08 - Cinética da fermentação em batelada alimentada por pulso. As setas indicam pulso de 200 mL de soro de leite com concentração de 840 g/L de lactose. Temperatura: 37 ºC. Agitação: 200 rpm. pH: 6,2.---31 Figura 09 - Cinética da fermentação em batelada alimentada por fluxo constante. A seta indica o início da alimentação. Temperatura: 37 ºC. Agitação: 200 rpm. pH: 6,2.--- 33 Figura 10 - Cinética da fermentação em batelada alimentada com controle por pH stat com concentração de lactose de soro de leite no meio de alimentação de 110 g/L. Temperatura: 37 ºC. Agitação: 200 rpm. pH: 6,2.---35 Figura 11 - Gráfico da cinética da fermentação em batelada alimentada por pH stat com concentração de lactose de soro de leite no meio de alimentação de 350 g/L. Temperatura: 37 ºC. Agitação: 200 rpm. pH: 6,2.---36
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 8
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 10
2.1 O ácido lático ...10
2.2 Aplicações do Ácido Lático ...11
2.3 Produção de ácido lático por fermentação ...12
2.4 O processo de batelada ...13
2.5 O processo de batelada alimentada ...13
2.6 Produção do Polímero PLA ...15
3 OBJETIVO GERAL ... 16 4 OBJETIVO ESPECÍFICO ... 17 5 METERIAL E MÉTODOS ... 18 5.1 Micro-organismo ...18 5.2 Substrato ...19 5.3 Fermentação ...19 5.3.1 Fermentação em batelada ... 20
5.3.2 Fermentação em batelada alimentada ... 21
5.4 Cinética do processo fermentativo e parâmetros estequiométricos ...24
5.5 Metodologia analítica ...25
5.5.1 Quantificação do ácido lático e da lactose ... 25
5.5.2 Determinação da concentração celular ... 26
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 27
6.1 Fermentação em batelada ...27
6.2 Fermentação em batelada alimentada ...30
7 CONCLUSÕES ... 39
1 INTRODUÇÃO
O ácido lático é um ácido orgânico amplamente empregado em diversos setores da indústria. Na indústria farmacêutica, o ácido lático pode ser utilizado como matéria-prima na produção de cosméticos, formulação de pomadas e loções; na indústria química é utilizado na produção de bases químicas e solventes orgânicos e na indústria alimentícia atua como acidulante, flavorizante, aromatizante e emulsificante (WEE et al., 2004; ALTAF et al., 2005).
Outro grande campo de interesse do ácido lático está na produção de plásticos biodegradáveis a partir do ácido polilático (PLA), tais como embalagens de alimentos e utensílios plásticos variados, os quais podem substituir os produtos fabricados com matéria prima à base de petróleo (DATTA et al., 1995). Além disso, os biopolímeros de PLA por serem biocompatíveis, podem ser empregados na medicina, na regeneração de tecidos, suturas, fixações de fraturas, reposição óssea, reparo da cartilagem, fixação de ligamentos e implantes (SAKATA et al., 2004).
Os polímeros produzidos a partir de D-(-) e L-(+)-ácido lático têm mostrado propriedades físico-mecânicas comparáveis à dos plásticos produzidos a partir de reservas fósseis de energia, porém com elevadas taxas de biodegradabilidade quando passa por um tratamento térmico. O ácido lático pode ser obtido tanto pela ação fermentativa de bactérias, fungos e leveduras quanto por síntese química. Porém, os processos fermentativos são mais vantajosos por serem mais econômicos (SILVA; MANCILHA, 1991). Aproximadamente 90% do total do ácido lático produzido no mundo é obtido por fermentação utilizando bactérias (ZHOU et al., 2006). Por outro lado, a síntese química do ácido lático sempre produz uma mistura racêmica. A produção fermentativa de ácido lático oferece ótima vantagem na obtenção de L-(+) e D-(-) ácido lático oticamente puro e também DL ácido lático, dependendo da estirpe selecionada para fermentação, a pureza ótica do acido lático é fator crucial nas propriedades físicas do PLA (SODEGARD; STOLT, 2002).
Diversos subprodutos e matérias-primas da agroindústria têm sido empregados para a produção de ácido lático, pela alta disponibilidade e baixo custo, tais como, bagaço, melaço e caldo de cana de açúcar (DE LIMA et al, 2009; DE LIMA et al., 2010; COELHO et al., 2011), soro de queijo (DE LIMA et al., 2010), manipueira (COELHO et al., 2010) além da água de maceração de milho (AMM) e o autolisado de levedura.
Para aperfeiçoar a produção de ácido lático, alguns parâmetros devem ser considerados durante a fermentação, tais como, concentração de nutrientes, pressão parcial de oxigênio e dióxido de carbono, pressão osmótica, variação do pH, o “stress” provocado pela agitação sobre as células, além da temperatura de cultivo, do tempo de fermentação e do tipo de fermentação, contínua ou por batelada (BOUDRANT et al., 2005).
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O ácido lático
O ácido lático, também conhecido como ácido 2-hidroxipropiônico (ZHAO, et al., 2010), segundo Wee et al. (2006), foi descoberto primeiramente em soro de leite por Scheele em 1780 que inicialmente o considerou um componente do leite. Em 1789, Lavoisier nomeou esse "componente do leite" como "acide latique", termo que se tornou a possível origem da terminologia “ácido lático”. Em 1857, Pasteur descobriu que ele não era um componente do leite, mas um metabólito fermentativo gerado por certos micro-organismos (BENNINGA, 1990).
O ácido lático é um composto químico versátil usado como acidulante em comida, usado também em produtos farmacêuticos e na indústria têxtil, para a produção de bases químicas e na formação de polímeros biodegradáveis de poli ácido lático (PLA) (HOFVENDAHL e HAHN-HÄGERDAL, 2000).
Em 2000, de acordo com Hofvendahl e Hahn-hägerdal (2000), cerca de 80 mil toneladas de ácido lático eram produzidas no mundo todo ano, sendo que 90% era produzido por fermentação de bactérias láticas e o restante produzido sinteticamente por hidrólise de lactonitrito. Hoje esse número provavelmente é maior. A produção por fermentação tem a vantagem porque se uma determinada bactéria lática produzir somente um dos isômeros, uma produção de um isômero óptico puro pode ser obtida. Já a produção sintética possui como resultado uma mistura racêmica de ácido lático.
Por ter um ácido carboxílico e um grupo hidroxila, o ácido lático pode sofrer uma variedade de conversões químicas potencialmente úteis como produtos químicos como óxido de propileno, glicol propileno, ácido acrílico, 2-3, pentanodiona e éster de lactato (LITCHFIELD, 1996; RICHTER e BERTHOLD, 1998; YUN et al., 2003).
Recentemente, devido ao aumento da conscientização de questões ambientais e o limite de recursos fósseis (ZHAO, 2010) existe um crescente interesse na produção de L(+)-ácido lático porque ele pode ser usado na produção de poli ácido lático, um polímero usado especialmente na medicina e na produção de plástico biodegradáveis, os quais podem substituir plásticos derivados do petróleo (DATTA et al., 1995; LUNT, 1998; AMASS et al., 1998).
2.2 Aplicações do Ácido Lático
Na indústria farmacêutica o ácido lático é usado na produção de cosméticos, formulação de pomadas e soluções anti-acne e umectantes. Na indústria alimentícia o ácido lático é empregado como aditivo, acidulante, flavorizante, aromatizante e emulsificante, além de inibir a esporulação de bactérias em alimentos processados (HOFVENDAHL; HAHN-HAGERDAL, 2000; NARAYANAN et al., 2004; NAVEENA et al., 2005). Na indústria química é empregado na produção de solventes orgânicos (HOFVENDAHL; HAHN-HAGERDAL, 2000; NARAYANAN et al., 2004).
No entanto, o maior interesse na aplicação do ácido lático é na produção de biopolímeros (HUJANEN e LINKO, 1996; CHANG et al. 1999; HUJANEN et al. 2001; DANNER et al. 2002; LEE, 2005).
O ácido polilático tem sido considerado um dos plásticos biodegradáveis mais promissores (GROSS; KALRA, 2002; SAKATA et al., 2004). A elevada resistência química desse composto é vantajosa para manufatura de fibras e filmes, enquanto a resistência ao calor é favorável para produção dos mais diversos utensílios, como copos, bandejas (TANAKA et al., 2006), talheres, pratos, garrafas de refrigerante e embalagens (BUSTOS et al., 2004; NAVEENA et al., 2005).
Além disso, os polímeros de ácido lático, também, podem ser utilizados na medicina, pois têm a importante característica de serem biocompatíveis, podendo ser empregados na regeneração de tecidos, suturas, fixações de fraturas, reposição óssea, reparo da cartilagem, reparo do menisco, fixação de ligamentos e implantes (SAKATA et al., 2004).
Seu tempo de vida útil é curto, podendo ser totalmente degradado no meio ambiente em condições de aerobiose ou anaerobiose. Sendo essa ação facilitada quando exposto as altas temperaturas e umidade (AURAS et al., 2003; TUOMINEN; JUKKA, 2003).
No ácido polilático (PLA), a proporção de L-(+) e D-(-) ácido lático influencia na degradabilidade dos polímeros (KHARRAS et al., 1993), e por isso é mais fácil fabricar PLA com propriedades específicas se L-(+) e D-(-) são fornecidos separadamente. Além disso, a pureza ótica do acido lático é fator crucial nas propriedades físicas do PLA (SODEGARD; STOLT, 2002).
Portanto, existe um forte interesse na produção biotecnológica de ácido lático, uma vez que ela oferece uma alternativa à poluição do meio ambiente causada pela indústria petroquímica e à oferta limitada de recursos petroquímicos (WEE et al., 2006).
Para que a produção biotecnológica de ácido lático seja possível, um substrato barato é necessário, porque a produção de biopolímeros e outros materiais industriais usualmente requerem grandes quantidades de ácido lático com um custo relativamente baixo (WEE et al., 2006).
2.3 Produção de ácido lático por fermentação
Segundo Hofvendahl e Hahn-Hägerdal (2000), um grande número de diferentes substratos tem sido utilizado na produção de ácido lático por fermentação de bactérias láticas. A pureza do produto é obtida quando um açúcar puro é fermentado, resultando em um baixo custo de purificação. No entanto, isto é economicamente desfavorável, porque açúcares puros são caros e o ácido lático é um produto barato, por isso resíduos agro-industriais são utilizados.
Alguns parâmetros devem ser considerados durante a fermentação para otimizar a produção de ácido lático: concentração e fonte de nutrientes, oxigênio e dióxido de carbono, pressão osmótica, variação do pH, o “stress” provocado pela agitação sobre as células e a temperatura de cultivo (BOUDRANT et al., 2005).
Liew et al. (2005) utilizaram técnicas estatísticas para otimizar a produção da biomassa por Lactobacillus rhamnosus, variando as concentrações de extrato de levedura, glicose e vitaminas em diferentes valores de pH, estudando os efeitos individuais ou interativos desses parâmetros, afim de alcançar uma condição ótima. As condições ótimas de crescimento para Lactobacillus rhamnosus foram pH 6,9, solução de vitamina a 1,28% (v/v), glicose a 5% (p/v) e extrato de levedura a 6% (p/v).
Para uma fermentação rápida e completa, o pH ótimo deve estar entre 5,5–6,5 dependendo do micro-organismo usado. A fermentação é fortemente inibida por pH baixo e cessa em pH com valor abaixo de 4,5 (PANESAR et al., 2007). Mussatto et al. (2008), utilizando meio MRS suplementado com cevada hidrolisada e controle de pH, atingiu uma produção máxima de 35,54 g L-1 de ácido lático, enquanto que o mesmo meio sem controle de pH atingiu 13,02 g L-1. Observaram, também, menor consumo de substrato e menor crescimento celular na fermentação realizada sem controle de pH. Assim, o ácido lático produzido durante a fermentação tem que ser constantemente neutralizado. Para controlar o pH durante a fermentação são utilizados alguns agentes neutralizantes, como carbonato de cálcio, carbonato de sódio e hidróxido de sódio, adicionados ao meio de fermentação.
O ácido lático possui um valor de pKa de 3,86 a 30 oC. Assim, lactato em vez de ácido lático é formado em um pH elevado, o que resultará em um aumento dos custos de purificação, devido a necessidade de recuperação do ácido lático (YANG et al., 1995). Além disso, quando o carbonato de cálcio é utilizado, o sulfato de cálcio pode ser produzido no processo de reconversão do lactato a ácido lático, o que pode causar consideráveis problemas ambientais, além de custos extras.
2.4 O processo de batelada
Segundo Ding e Tan (2006), o processo de fermentação em batelada tem sido o método utilizado industrialmente para a produção de L-(+)-ácido lático. Para a fermentação em batelada por bactérias láticas, um dos melhores resultados obtidos publicados na literatura com glicose, sendo usada como substrato, são 150,2 g L-1 para a concentração final de ácido lático e 1,34 g L-1 h-1 para produtividade (BAI et al., 2004).
No entanto, de acordo com Ding e Tan (2006), a maior desvantagem da fermentação em batelada é que a concentração de ácido lático e a sua produtividade diminuem devido à inibição pela alta concentração de substrato, uma propriedade convencional do processo de batelada alimentada.
2.5 O processo de batelada alimentada
O processo de batelada alimentada é um processo de alimentação contínua ou sequencial com substrato, sem a remoção do caldo de fermentação, como acontece na batelada continua. O processo de batelada alimentada é geralmente superior aos processos de batelada e batelada contínua e é especialmente benéfico quando a mudança na concentração de nutrientes afeta a produtividade e a biomassa desejada (LEE et al.; 1999; ROUKAS e KOTZEKIDOU, 1998).
Yamane e Shimizu (1984) definiram batelada alimentada como sendo um cultivo onde existe adição de um ou mais nutrientes. Dependendo da finalidade, a batelada alimentada é um processo muito eficiente, pois elimina a inibição pelo substrato, resultando em alta produtividade, maior concentração do produto e melhoras na taxa de crescimento celular (HUJANEN et al., 2001, KORZ et al., 1995).
Existem vários métodos de alimentação, a vazão pode ser constante ou variável, batelada alimentada por pulso, batelada alimentada com controle por feedback e batelada alimentada exponencial (KELLER; DUNN, 1978).
Ding e Tianwei (2006) estudaram vários métodos de fermentação de ácido lático por
Lactobacillus casei LA-04-1 com o objetivo de aumentar o rendimento de L-(+)-ácido lático.
Solução de glicose (850 g L-1) e extrato de levedura (1 %) foram adicionadas à fermentação em batelada alimentada pelo método exponencial. A máxima concentração de ácido lático (210 g L-1) e a máxima concentração de L-(+)-ácido lático (180 g L-1) foram obtidas em batelada alimentada exponencial com glicose e extrato de levedura, a máxima concentração celular (4,30 g L-1) foi obtida após 70,5 h de fermentação, o rendimento e a produtividade de L-(+)-ácido lático foi 90,3 % e 2,14 g L-1 h-1, respectivamente.
Várias razões para se empregar processos em batelada alimentada são citadas na literatura (YAMANE; SHIMIZU, 1984; SCHMIDELL et al., 2001), tais como diminuição de repressões por catabólitos, em que as fontes de carbono rapidamente metabolizáveis reprimem a expressão de genes que codificam enzimas relacionadas ao metabolismo; prevenção da inibição por substratos, em que qualquer fonte de nutriente pode se tornar inibitória, dependendo da concentração do meio, do micro-organismo e das condições de fermentação; minimização da formação de produtos de metabolismo tóxico.
Na produção fermentativa do ácido lático pode haver a formação de subprodutos como ácido acético, ácido fórmico e dióxido de carbono, dependendo da cepa utilizada e das condições do processo (WOOD; HOLZAPFEL, 1995). Uma produção industrial eficiente deve evitar ou minimizar a formação desses subprodutos. Os processos em batelada alimentada apresentaram maior eficiência do que os demais.
Bai et al. (2004) desenvolveram um processo para produção de lactato de amônia por
Lactobacillus lactis BME5-18 M em fermentação por batelada alimentada controlada pelo
pH. Observaram que a produção de lactato de amônio foi marcadamente melhorada pela alimentação contínua de glicose, sendo que a concentração de produto, o máximo peso seco
de células e a produtividade média obtida foram 161,2 g L-1, 2,15 g L-1 e 2,02 g L-1 h-1, respectivamente.
2.6 Produção do Polímero PLA
O PLA pode ser dividido em três formas isoméricas: poli(L-ácido lático) (PLLA), poli(D-ácido lático) (PDLA) e poli(DL-ácido lático) (TOKIWA e CALABIA, 2006). A pureza óptica do ácido lático usado é crítica para as propriedades do PLA porque o DL-ácido lático fornece um polímero amorfo e opticamente inativo, enquanto o D-(-) ou o L-(+)-ácido lático são cristalinos e opticamente ativos (IKADA et al., 1987).
De acordo com Xu et al. (2006), PLLA é restrito a aplicações médicas devido à sua fragilidade diante de cargas de impacto. Isso pode ser atribuído a sua baixa temperatura de fusão e a sua baixa habilidade de cristalização.
Um polímero complexo feito da mistura de PLLA e PDLA exibe novas características como uma alta temperatura de fusão (IKADA et al. 1987).
Os autores Karst e Yang (2006) encontraram para uma mistura 50/50 de PLLA e PDLA uma maior resistência a hidrólise. Isso contece devido às pontes de hidrogênio e às interações dipolo-dipolo, as quais são mais fortes do que aquelas do PLLA ou PDLA puros.
A síntese de polímeros de ácido lático pode ser feito de três maneiras, condensação e polimerização do ácido lático bruto, em que se produz polímero de baixa massa molar e é limitado em suas aplicações industriais; condensação e polimerização em meio a base de solvente, nesse caso é possível a obtenção de um polímero de alta massa molar. Já a terceira maneira é coletar, purificar e polimerizar o anel lático aberto, para obter alta massa molar .
A existência de dois grupos funcionais do ácido lático (-OH e -COOH) torna possível a policondensação a poliéster. No entanto, a reação de policondensação convencional não leva a produtos de alta massa molar, a menos que se utilizem solventes orgânicos para a destilação azeotrópica de H2O condensada onde os tempos de polimerização são longos.
A rota mais comum para obter moléculas de PLA de alta massa molar consiste de duas etapas básicas: a abertura do anel lactídeo, seguido de polimerização. O lactato é o intermediário para este tipo de reação. O mesmo é um dímero de ácido láctico fechado e se forma durante o primeiro passo da reação, quando a água do produto da condensação é removida por evaporação durante a oligomerização.
3 OBJETIVO GERAL
4 OBJETIVO ESPECÍFICO
Avaliar a produção de L-(+)-ácido lático por Lactobacillus rhamnosus B103 em reator pela utilização de batelada alimentada utilizando-se soro de queijo desproteinizado como fonte de carbono.
5 METERIAL E MÉTODOS
5.1 Micro-organismo
O micro-organismo Lactobacillus rhamnosus B103 foi cedido pela Dra. Georgina L. Michelena Alvarez do ICIDCA (Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar) de Cuba e se caracteriza por ser um excelente produtor de L-(+) ácido lático. O isolado encontrava-se liofilizado.
A partir de culturas estoques armazenadas em freezer a -20 °C, 2 mL foram inoculados em 20 mL de meio MRS (Tabela 01) em Erlenmeyers de 150 mL e incubados em
shaker por 48 horas a 35 °C, 150 rpm. Após esse tempo, 5 mL do conteúdo deste Erlenmeyer
foi inoculado em 50 mL de meio MRS em frascos de 250 mL e incubados em 35 °C, 150 rpm por mais 24 horas. Após este tempo, para se obter as culturas estoques, o conteúdo do Erlenmeyer foi igualmente distribuído em 25 Eppendorfs contendo 500 µL de solução de glicerol 40 % (com concentração final de 20%) e congelado à -20°C.
Tabela 01 - Composição do meio MRS.
Substrato Concentração (g L-1) Glicose 20 Peptona 10 Extrato de Carne 10 Extrato de Levedura 5 Citrato de amônio 2 Acetato de Sódio 5 Sulfato de Magnésio 0,1 Sulfato de Manganês 0,05 Fosfato de Potássio 2
5.2 Substrato
O substrato utilizado foi o soro de queijo em pó, fornecido pelo laticínio Tavolaro (Brotas-SP). Primeiramente 600 g L-1 do soro em pó foram diluídos em água destilada e então foi realizada a desproteinização do soro pelo aquecimento por 5 minutos em autoclave. Este processo provocou a coagulação das proteínas. Em seguida, a solução foi resfriada naturalmente até atingir a temperatura ambiente, e então centrifugada a 10000 x g por 10 minutos para a remoção das proteínas (soro de queijo desproteinizado). O sobrenadante foi congelado a -20 ºC para posteriormente ser usado no preparo do meio para a fermentação em reator.
5.3 Fermentação
Para a fermentação, 2 mL do tubo de estoque foi colocado em 20 mL de meio de caldo MRS (Tabela 01) e incubado em shaker a 150 rpm, 35 °C por 48 horas. Após este período, 5 mL da suspensão bacteriana formada foi transferida para um Erlenmeyer contendo 50 mL de caldo MRS. O Erlenmeyer foi mantido em incubadora nas mesmas condições citadas acima, só que por 24 horas. Após esse período, 35 mL da suspensão bacteriana formada foi transferida para o Erlenmeyer, contendo 315 mL de meio MRS e foi realizada a incubação na mesma temperatura e agitação, só que por 18 horas. Em todos os experimentos foi adicionado 10 % de inóculo.
Foram realizadas sete (7) fermentações, sendo uma realizada por batelada em reator de 2 litros e uma em shaker, em frascos de 300 mL contendo 100 mL de meio de produção, ambas com adição de CaCO3 para controle de pH, para comparação entre as duas
fermentações com relação a escala. Uma fermentação por batelada foi realizada em reator de 13 litros da marca Infors, a fim de se obter a cinética de crescimento, produção de ácido lático e consumo de lactose do micro-organismo Lactobacillus rhamnosus nessas condições de fermentação. Outras quatro (4) fermentações por batelada alimentada também foram conduzidas em reator de 13 litros da Infors.
A temperatura, agitação e pH nos reatores, tanto de 2 quanto de 13 litros foram de 37 oC, 200 rpm e 6,2 respectivamente. No shaker, a temperatura e a agitação foram de 37 oC, 150 rpm.
5.3.1 Fermentação em batelada
Nos experimentos em fermentação por batelada foi utilizado o meio de produção que se segue.
Tabela 02 - Composição do meio de produção nos experimentos em fermentação por batelada.
Substrato Concentração
Lactose de soro de leite 110 g L-1
Água de maceração de milho 90 mL L
Tween 80 1,5 mL L-1
MnSO4 0,15 g L-1
Este meio de produção foi baseado nos experimentos feitos anteriormente que determinaram quais substratos são mais significativos e quais as suas concentrações ideais para melhores resultados na concentração final de L-(+)-ácido lático e no rendimento utilizando-se o micro-organismo Lactobacillus rhamnosus e lactose de soro de leite como fonte de carbono.
No experimento realizado no reator de 13 litros o meio inicial foi de 3,5 litros sendo que durante o percurso da fermentação apenas NaOH 10 N foi adicionado para o controle de pH. A temperatura, agitação e pH foram de 37 ºC, 200 rpm e 6,2, respectivamente.
Quando o experimento em batelada foi realizado em reator de 2 litros, a quantidade de meio durante toda a fermentação permaneceu em 1,2 litros, sendo que 6,6 % de CaCO3 foi
adicionado ao meio para controlar o pH. A temperatura, agitação e pH permaneceram em 37 ºC, 200 rpm e 6,2 respectivamente.
Para fins de comparação, o mesmo experimento foi realizado em shaker, em triplicata, em Erlenmeyers de 300 mL contendo 100 mL de meio de fermentação, com adição de 6,6 % de CaCO3. A temperatura foi de 37 ºC e a agitação foi de 150 rpm.
5.3.2 Fermentação em batelada alimentada
Todos os experimentos em batelada alimentada foram realizados em reator de 13 litros, com meio inicial de 3,5 litros. A temperatura, agitação e o pH foram de 37 ºC, 200 rpm, 6,2, respectivamente. Foram comparados quatro (4) tipos de fermentação em batelada alimentada, duas (2) bateladas alimentadas com controle por pH stat, sendo uma com meio de alimentação com lactose de soro de leite a 110 g L-1 e a outra com meio de alimentação com concentração de lactose do soro de leite de 350 g L-1. Foi feito também um experimento de fermentação em batelada alimentada por pulso, no qual a concentração de lactose de soro de leite no meio de alimentação foi de 840 g L-1. O último experimento foi uma fermentação por batelada alimentada com fluxo constante. Neste experimento a concentração de lactose de soro de leite no meio de alimentação também foi de 840 g L-1. O meio de produção inicial, para todos os experimentos, possuía a mesma composição do meio de produção nos experimentos de fermentação por batelada (Tabela 02).
No experimento de fermentação em batelada alimentada com controle por pH stat com concentração de lactose de soro de leite no meio de alimentação de 110 g L-1, a alimentação era composta por soro de leite e NaOH 5 N, os quais foram colocados no mesmo recipiente para que quando o valor de pH diminuísse, a bomba puxasse ambos, a lactose de soro de leite e o NaOH 5 N (o valor da concentração inicial do NaOH era de 10N, mas como este foi adicionado ao soro de leite seu valor de concentração diminuiu pela a metade: NaOH 5N).
Como a fonte de carbono é, principalmente, convertida a ácido lático por uma bactéria lática homofermentativa, a quantidade de álcali consumido para neutralizar o ácido lático é proporcional à fonte de carbono. Portanto, o caldo de fermentação usado durante o estágio de
alimentação da fermentação de ácido lático foi uma mistura de fonte de carbono e álcali. A concentração da fonte de carbono pode ser controlada pelo ajuste do pH.
Figura 02 - Foto da fermentação em batelada alimentada com controle por pH stat com concentração
da lactose de soro de leite na alimentação de 110 g L-1. Reator de 13 L da Infors.
No experimento em batelada alimentada com controle por pH stat no qual a concentração de lactose de soro de leite no meio de alimentação foi de 350 g L-1, foram adicionados lactose de soro de leite e NaOH 5N juntos pela bomba para controle de pH.
Na batelada alimentada por pulso, a lactose de soro de leite, em concentração de 840 g L-1, foi adicionada separadamente no meio de produção, em dois pulsos de 200 mL, um em 16 horas de fermentação e outro em 30 horas de fermentação. Os dois pulsos tiveram uma vazão de 100 mL por minuto. Neste experimento, o NaOH 10 N foi adicionado ao meio de produção independentemente e separadamente da alimentação para o controle de pH.
Figura 03 - Foto da fermentação em batelada alimentada por pulso. Reator de 13 L da Infors.
No último experimento, no qual a alimentação foi por fluxo constante, a concentração de lactose de soro de leite também era de 840 g L-1, só que neste a alimentação iniciou-se no tempo de 36 horas de fermentação e esta foi a um fluxo constante de 1 mL por hora. Neste experimento, o NaOH 10 N também foi adicionado ao meio de produção independentemente e separadamente da lactose, para controlar o pH.
Figura 04 - Foto da fermentação em batelada alimentada por fluxo constante. Reator de 13 L da
A temperatura de cultivo, o pH e a agitação em todas estas fermentações foi de 37 oC, 6.2 e 200 rpm, respectivamente.
Nos experimentos em batelada no reator de 13 litros e batelada alimentada, amostras de 10 mL foram retiradas do caldo de fermentação em diferentes intervalos de tempo. No experimento em batelada, as amostras foram retiradas no início e após 6, 9, 12, 19, 24, 36 e 48 horas após o início da fermentação.
Já no experimento em batelada alimentada com controle por pH stat no qual a concentração de lactose de soro de leite no meio de alimentação foi de 110 g L-1 as amostras foram retiradas no início da fermentação e nos tempos de 6, 12, 18, 24 e 48 após o início da mesma. Quando o meio de alimentação teve a concentração de lactose de soro de leite de 350 g L-1, no experimento em batelada com controle por pH stat, as amostras foram retiradas no início da fermentação e nos tempos 6, 9, 12, 18, 24 e 48 horas após o início desta.
As amostras no experimento em batelada alimentada por pulso foram retiradas no início da fermentação e nos tempos de 6, 12, 16, 18, 24, 30 e 45 após o início desta, sendo que amostras também foram retiradas logo após os pulsos de alimentação.
No experimento em batelada alimentada por fluxo constante, as amostras foram retiradas no início e nos tempos de 16, 19, 24, 27, 36, 48, 52 e 72 horas após o início da fermentação.
Os experimentos em batelada realizados no reator de 2 litros e em shaker, com controle de pH feito com adição de CaCO3, tiveram 1 mL de amostras retiradas em
determinados intervalos de tempo, sendo que no primeiro, as amostras foram retiradas no início e após 18, 24, 36 e 48 horas do início da fermentação. Já no experimento em batelada realizado em shaker, as amostras foram retiradas no início da fermentação e nos tempos de 6, 12, 18, 24, 36 3 48 horas após o início.
As células microbianas foram separadas por centrifugação para determinação da biomassa. O sobrenadante era imediatamente congelado para posterior determinação do ácido lático e da lactose (MERCIER; YERUSHALMI, 1992).
5.4 Cinética do processo fermentativo e parâmetros estequiométricos
A partir dos resultados dos experimentos acima foram construídos gráficos da cinética de crescimento, consumo de substrato e produção de ácido lático. Foram retiradas amostras em diferentes momentos para o conhecimento da cinética do processo fermentativo.
Foram avaliados os fatores de conversão de substrato em produto, Yp/s (g de ácido lático/g de lactose), de substrato em biomassa, Yx/s (g de células/g de substrato) do experimento em batelada. A relação entre a produção de ácido lático e a produção de células, Yp/x (g de ácido lático/g de células) em todos os experimentos. A produtividade instantânea tanto em células como em ácido lático é definida, para o sistema em batelada a volume constante, como velocidade rx e rp. A partir dos perfis de concentração celular, formação de produto e consumo do substrato com o tempo, é possível por um balanço de massa para cada componente, determinar, em cada instante, as velocidades de crescimento microbiano (rx) e formação de produto (rp).
Os cálculos foram feitos considerando-se o gráfico da cinética de produção de ácido lático, do crescimento microbiano e do consumo de lactose. As partes do gráfico com maior inclinação foram consideradas.
Como a velocidade máxima constante é dada pela tangente do ângulo da inclinação desta parte ou reta considerada, pode-se calculá-la por:
Cateto oposto / Cateto adjacente,
Ou seja, Δx / Δt, Δp/ Δt e Δs / Δt, sendo respectivamente a velocidade máxima constante de crescimento microbiano, a velocidade máxima constante de formação de produto e a velocidade máxima constante de consumo de substrato.
Para a obtenção da velocidade específica os valores das velocidades máximas constantes obtidos foram divididos pelas respectivas médias dos valores de concentração de ácido lático, concentração de biomassa e concentração de lactose nos intervalos de tempo considerados.
5.5 Metodologia analítica
5.5.1 Quantificação do ácido lático e da lactose
Foi empregado o método de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O cromatógrafo era da marca Shimadzu e este foi equipado com detector Ultra-violeta a 210 nm e detector de índice de refração. Uma coluna Rezex ROA (300 x 7,8 mm) da Phenomenex foi utilizada. Esta foi eluída com H2SO4 2,5 mM como fase móvel, fluxo de 0,6 mL/min e
O volume de injeção foi de 20 µL e apenas a lactose foi quantificada, visto que galactose e glicose eram praticamente inexistentes.
Foram realizadas a centrifugações das amostras retiradas em 10000 x g por 10 minutos e os sobrenadantes foram diluídos 20x em fase móvel, filtrados e passados para viais, os quais foram colocados no equipamento para a análise.
5.5.2 Determinação da concentração celular
A concentração celular foi determinada por densidade ótica, no comprimento de onda de 650 nm. Após a centrifugação da amostra em 10000 x g por 10 minutos e separação do sobrenadante, o precipitado foi lavado duas vezes com água destilada e diluído antes da sua introdução no espectrofotômetro. A diluição foi feita de modo que a absorbância permanecesse na faixa de 0,1 - 0,7 unidades de absorbância. O espectrofotômetro foi calibrado com água destilada. A medida da absorbância foi convertida em concentração celular (g massa seca/litro de meio) por meio de uma curva de calibração.
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Fermentação em batelada
Comparando-se as fermentações em batelada utilizando CaCO3 para o controle do
valor de pH observa-se que os valores tanto de produtividade quanto de concentração de ácido lático foram maiores na fermentação realizada em shaker (2,11 g L-1 h-1 e 127,4 g L-1, respectivamente) do que os valores de produtividade e concentração final de ácido lático obtidos na fermentação realizada em reator de 2 litros (1,875 g L-1 h-1 e 116 g L-1, respectivamente). Essa diferença pode ter ocorrido devido à diferença de volume de meio nas duas fermentações em função da necessidade de se otimizar parâmetros como agitação e temperatura devido a mudança de escala.
Figura 05 - Cinética da fermentação em batelada realizada em reator de 2 litros com adição de CaCO3
para controle do valor de pH. Temperatura: 37 ºC. Agitação: 200 rpm. pH: 6,2.
Figura 06 - Cinética da fermentação em batelada realizada em shaker com adição de CaCO3 para
controle do valor de pH. Temperatura: 37 ºC. Agitação: 150 rpm.
Na fermentação realizada em reator de 2 litros a velocidade máxima constante de consumo de substrato foi de 6,65 g L-1 h-1 entre 18 e 24 horas de fermentação e a velocidade específica de consumo de substrato foi de 0,13 h-1, enquanto que as velocidades obtidas para a fermentação em shaker foram de 6,36 g L-1 h-1, entre 12 e 24 horas, e 0,07 h-1, respectivamente. Porém a velocidade máxima constante de produção de ácido lático foi de 2,8 g L-1 h-1 (entre 24 e 36 horas) para o reator e de 4,78 g L-1 h-1 (entre 12 e 24 horas) no shaker. A velocidade específica de produção de ácido lático foi de 0,03 h-1 para o reator e de 0,07 h-1 para o shaker. Isso mostra que a velocidade máxima constante foi semelhante nos dois experimentos e ocorreu em intervalos de tempos parecidos. Ou seja, o micro-organismo consumiu a lactose em velocidades semelhantes e em intervalos de tempo semelhantes, mas no experimento feito em shaker a velocidade máxima constante de produção de ácido lático foi maior e foi obtida em um menor tempo, ou seja, o micro-organismo consumiu o açúcar na mesma velocidade nos dois experimentos e em intervalos de tempo parecidos, mas no shaker o micro-organismo produziu ácido lático a uma velocidade maior e em menor tempo.
Os cálculos da cinética da fermentação em batelada em reator de 13 litros foram efetuados com o objetivo de se analisar como o micro-organismo se comporta nas condições em que estavam sendo realizadas as fermentações.
Abaixo o gráfico da cinética da fermentação em batelada:
Figura 07 - Cinética da fermentação em batelada. . Temperatura: 37 ºC. Agitação: 200 rpm. pH: 6,2.
De acordo com a Figura 07, pode ser observado que, a concentração máxima de ácido lático em fermentação por batelada foi de 109,3 g L-1, uma concentração esperada e aceitável quando comparada com a concentração de ácido lático obtida por Ding e Tan (2006), que para a fermentação em batelada foi de 112,5 (+/- 2,5) g L-1. A maior concentração de biomassa alcançada pelos autores foi de 2,55 (+/-0,12) g L-1, já a maior concentração de biomassa neste experimento foi de 7,02 g L-1, um valor considerado alto quando comparado com o primeiro.
Os valores para rendimento e produtividade nesta fermentação foram de 87 % e de 1,96 g L-1 h-1, respectivamente. Ding e Tan (2006), em seu trabalho, chegaram ao valor de 88,6 % (+/-1,2) para rendimento e 1,34 (+/- 0,03) g L-1 h-1 para produtividade.
Ainda no experimento de batelada realizado neste presente trabalho, a velocidade máxima constante de crescimento do micro-organismo obtida entre 6 e 9 horas foi de 0,51 g L-1 h-1 e a velocidade específica de crescimento foi de 0,19 h-1 . A velocidade máxima constante de produção de ácido lático foi de 4,58 g L-1 h-1, entre 6 e 19 horas, e a velocidade
especifica foi de 0,09 h-1. Já a velocidade máxima constante de consumo de substrato foi de 5,81 g L-1 h-1 nos intervalos de tempo entre 9 e 12 horas e a velocidade especifica foi de 0,06 h-1.
Observa-se pelo gráfico que no tempo de 36 horas já não havia mais açúcar disponível. O fator de conversão de substrato em biomassa (Yx/s) neste experimento de batelada foi de 0,049 g/g e o fator de conversão de biomassa em produto (Yp/x) foi de 17,48 g/g.
Tendo como base estes parâmetros da fermentação em batelada, foram realizadas as demais fermentações, em batelada alimentada.
6.2 Fermentação em batelada alimentada
A partir dos resultados obtidos por batelada, foram realizadas as fermentações em batelada alimentada, assim como a cinética de produção, formação de biomassa e consumo de substrato. Segue abaixo a Tabela 03 comparando as diferentes fermentações:
Tabela 03 - Comparação das fermentações.
Batelada1,2 Batelada em shaker1 Batelada Batelada alimentada ph stat (110 g L-1)3 Batelada alimentada ph stat (350 g L-1)3 Batelada alimentada por pulso (840 g L-1)3 Batelada alimentada por fluxo constante (lactose + AMM)4 Ácido Lático (g/L) 116 127,4 109,3 104,4 112 128 149,8 Biomassa (g/L) - - 7,023 8,64 5,58 5,51 7,46 Produtividade (g/L/h) 1,875 2,11 1,96 1,76 2,07 2,55 1,88 Açúcar residual (g/L) 0 0 0 2 1,56 12,76 1,9 Volume de meio inicial (L) 1,2 0,1 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 1
Controle de pH feito por adição de CaCO3 no meio de fermentação. 2
Batelada feita em reator de 2 litros.
3
Concentração de lactose do soro de leite no meio de alimentação.
4
A partir da Tabela 03 é possível observar que a maior produtividade (2,55 g L-1 h-1) foi obtida na fermentação por batelada alimentada por pulso onde a concentração de lactose do soro de leite na alimentação era de 840 g L-1. Este valor de produtividade pode ser considerado alto quando comparado ao obtido por Ding e Tan (2006) para a fermentação por batelada alimentada por pulso, que foi de 1,55 g L-1 h-1 (+/-0,05).
Nesta fermentação foram realizados dois (2) pulsos, um pulso no tempo de 16 horas e um no tempo de 30 horas de fermentação. Cada pulso continha 200 mL de meio de alimentação e um fluxo de 100 mL por minuto.
Abaixo o gráfico da cinética desta fermentação:
Figura 08 - Cinética da fermentação em batelada alimentada por pulso. As setas indicam pulso de 200
mL de soro de leite com concentração de 840 g/L de lactose. Temperatura: 37 ºC. Agitação: 200 rpm. pH: 6,2.
A fermentação teve duração de 48 horas. A concentração final de ácido lático foi de 128 g L-1, o segundo melhor valor obtido entre os experimentos. O que se pode perceber pelo gráfico da Figura 08 é que a formação do produto está associada ao crescimento do micro-organismo. A partir de 30 horas o crescimento e a produção começam a se estabilizar, logo após o último pulso, isso significa que a fonte de carbono passou a não ser tão efetiva como antes. Pode-se perceber ainda pela Figura 08, que o consumo de açúcar é alto se comparado à produção e ao crescimento. Isso indica que o micro-organismo não está na fase log e sim na
fase estacionária, pois está se mantendo. O açúcar residual foi de 12,76 g L-1, um valor aparentemente alto se comparado aos valores de açúcar final das outras fermentações, o que pode indicar o stress microbiano, ou seja, sobrou açúcar porque o micro-organismo já não podia consumi-lo como antes.
A maior concentração de biomassa (5,51 g L-1) nesta fermentação foi obtida no tempo de 48 horas.
Neste experimento o valor para a velocidade máxima constante de crescimento do micro-organismo foi de 0,21 g L-1 h-1 entre 16 e 24 horase para a velocidade específica de crescimento foi de 0,07 h-1. A velocidade máxima constante de produção de ácido lático foi de 5,64 g L-1 h-1 entre 6 e 12 horas de fermentação e a velocidade específica de produção foi de 0,13 h-1.
A velocidade máxima constante de consumo de substrato entre 12 e 16 horas de fermentação e a velocidade específica eram de 8,8 g L-1 h-1e 0,13 h-1, respectivamente. Ao final do primeiro pulso as velocidades já eram de 5,35 g L-1 h-1 para a velocidade máxima constante entre 24 e 30 horas e de 0,12 h-1 para a específica. No fim do segundo pulso a velocidade máxima constante entre 30 horas e dois minutos e 45 horas e a velocidade específica eram de 3 g L-1 h-1 e 0,085 h-1, respectivamente. Pode-se ver claramente que a velocidade de consumo de substrato diminui ao longo do tempo. Se no primeiro pulso, que ocorreu em 16 horas de fermentação o micro-organismo consumia o açúcar mais rapidamente, no final do segundo pulso, após 30 horas de fermentação, o micro-organismo já estava na sua fase estacionária (como pode ser visto nas Figuras 07 e 08) e, portanto consumia o substrato de forma mais lenta, o que pode ser uma indicação do seu stress.
A maior concentração de ácido lático (149,8 g L-1) foi obtida na fermentação por batelada alimentada com fluxo constante (Figura 09). Ding e Tan (2006) obtiveram menor produção de ácido lático (135 g L-1) (+/- 5) para a batelada alimentada por fluxo constante.
Figura 09 - Cinética da fermentação em batelada alimentada por fluxo constante. A seta indica o
início da alimentação. Temperatura: 37 ºC. Agitação: 200 rpm. pH: 6,2.
A alimentação, como indica a seta, iniciou-se no tempo de 36 horas de fermentação. Neste tempo, já não havia mais açúcar disponível no meio e a biomassa e a concentração de ácido lático já estavam se estabilizando.
Diferentemente das outras fermentações, a alimentação neste caso, além de lactose de soro de leite, possuía também 1 % de fonte de nitrogênio que no caso era a água de maceração de milho (AMM). Este diferencial pode ser um dos motivos da produção ter sido maior neste experimento.
Apesar da maior concentração de ácido lático ser obtida nesta fermentação, a produtividade (1,88 g L-1 h-1) foi menor que a produtividade obtida na fermentação em batelada alimentada por pulso (2,55 g L-1 h-1). Porém, esta produtividade obtida no experimento em batelada alimentada por fluxo constante foi maior do que a obtida por Ding e Tan (2006) que foi de 1,61 g L-1 h-1 (+/- 0,05) com o mesmo experimento. Entretanto, no trabalho feito por estes autores, o experimento de batelada alimentada com fluxo constante teve um valor de produtividade maior que o experimento em batelada e batelada alimentada por pulso.
Porém, neste presente trabalho, a produtividade pode ter sido menor porque esta fermentação durou 72 horas, um tempo bem maior que a maioria das outras fermentações, que foi de 48 horas.
A velocidade máxima constante de produção de ácido lático neste experimento foi de 6 g L-1 h-1 entre 19 e 27 horasde fermentaçãoe a velocidade específica de produção foi de
0,07 h-1. A velocidade máxima constante de crescimento do micro-organismo foi de 0,42 g L-1 h-1 nos tempos entre 24 e 27 horas e a velocidade específica de crescimento foi de 0,06 h-1. Comparando-se com a velocidade máxima constante de crescimento do micro-organismo do experimento em batelada alimentada por pulso, pode-se verificar que esta última possui um valor de velocidade máxima constante de crescimento de quase metade da primeira. Ou seja, o micro-organismo cresceu de forma mais lenta no experimento em batelada alimentada por pulso, porém a velocidade máxima constante de produção de ácido lático foi semelhante ao experimento em batelada alimentada por fluxo constante.
A velocidade de consumo de substrato era bem maior antes da alimentação, sendo a velocidade máxima constante e a velocidade especifica de 8,26 g L-1 h-1, entre 16 e 19 horas, e 0,22 h-1, respectivamente, antes do início da alimentação e de 1,06 g L-1 h-1,entre 52 e 72 horas, e 0,08 h-1 no final da alimentação. Isto porque no tempo de 36 horas, que foi quando se iniciou a alimentação, o micro-organismo já estava na sua fase estacionária, como pode ser visto no gráfico de batelada (Figura 07) e no próprio gráfico deste experimento (Figura 09).
Pode-se ter uma ideia do rendimento nas fermentações analisando-se as quantidades de açúcar no final de cada fermentação. No caso da fermentação em batelada alimentada por fluxo constante o açúcar residual foi de 1,9 g L-1, uma quantidade baixa se for considerado a quantidade de açúcar inicial (110 g L-1) mais a quantidade de açúcar que foi adicionado ao longo da alimentação. Levando-se em conta tal fato, pode se afirmar que o rendimento neste experimento foi satisfatório.
As fermentações em batelada alimentada com controle por pH stat tiveram os menores valores para concentração final de ácido lático e produtividade, sendo que o experimento em que a alimentação possuía 110 g L-1 de lactose de soro de leite foi menos eficiente (104,4 g L
-1
e 1,76 g L-1 h-1, respectivamente) que o experimento em que a concentração de lactose de soro de leite era de 350 g L-1 (112 g L-1e 2,07 g L-1 h-1, respectivamente).
Isto, provavelmente, ocorreu devido à diferença na concentração de lactose de soro de leite no meio de alimentação. O experimento em que a concentração de lactose de soro de leite no meio de alimentação era maior, os valores foram mais satisfatórios. Isso porque a concentração de lactose influencia a produção de biomassa e de ácido lático. Quanto mais açúcar no meio, mais fonte de carbono o micro-organismo terá para realizar o seu metabolismo e consequentemente ele irá se reproduzir mais e produzir mais. Isso desde que essa concentração não atinja o nível de inibição por substrato do metabolismo do micro-organismo.
Porém, apesar da fonte de carbono influenciar, a fonte de nitrogênio é determinante para o crescimento microbiano, para a formação de proteínas, enzimas e DNA, necessária para a reprodução. Um exemplo disso são as fermentações em batelada alimentada por pulso e por fluxo constante: ambas têm alimentação de 840 g L-1 de lactose, porém o crescimento microbiano é maior no experimento em batelada alimentada por fluxo constante, no qual a alimentação também possui fonte de nitrogênio (AMM).
Figura 10 - Cinética da fermentação em batelada alimentada com controle por pH stat com
concentração de lactose de soro de leite no meio de alimentação de 110 g/L. Temperatura: 37 ºC. Agitação: 200 rpm. pH: 6,2.
Figura 11 - Gráfico da cinética da fermentação em batelada alimentada por pH stat com concentração
de lactose de soro de leite no meio de alimentação de 350 g/L. Temperatura: 37 ºC. Agitação: 200 rpm. pH: 6,2.
A velocidade máxima constante entre 0 e 6 horas e a velocidade específica de crescimento do micro-organismo no experimento em batelada com controle por pH stat onde a concentração de lactose de soro de leite no meio de alimentação era de 110 g L-1 foram de 0,32 g L-1 h-1 e 0,072 h-1, respectivamente. A velocidade máxima constante de produção de ácido lático neste experimento ocorreu entre 6 e 12 horas e foi de 5,25 g L-1 h-1 e a velocidade especifica foi de 0,11 h-1. A velocidade máxima constante e a velocidade específica de consumo de lactose foram de 7,41 g L-1 h-1,entre 12 e 24 horas, e de 0,14 h-1 respectivamente.
No experimento em batelada alimentada com controle por pH stat, no qual a concentração de lactose de soro de leite foi de 350 g L-1, os valores de velocidade máxima constante, que ocorreu entre 6 e 12 horas, e velocidade especifica de crescimento do micro-organismo foram de 0,3 g L-1 h-1 e 0,16 h-1, respectivamente. A velocidade máxima constante entre 6 e 9 horas e a velocidade especifica de produção de ácido lático foram de 8,96 g L-1 h-1 e 0,26 h-1, respectivamente. A velocidade máxima constante de consumo de lactose foi de 4,35 g L-1 h-1 entre 9 e 24 horas e a velocidade especifica de consumo de lactose teve o valor de 0,073 h-1.
Abaixo a Tabela 04 contendo os valores da cinética da produção de ácido lático, crescimento do micro-organismo e consumo de lactose de todos os experimentos feitos.
Tabela 04 - Valores das velocidades máxima constante e específica de crescimento do
micro-organismo, produção de ácido lático e consumo de substrato de todos os experimentos realizados.
Batelada Batelada1,2 Batelada em shaker1 Batelada alimentada ph stat (110 g L-1)3 Batelada alimentada ph stat (350 g L-1)3 Batelada alimentada por pulso (840 g L-1)3 Batelada alimentada por fluxo constante (lactose + AMM)4 Velocidade máxima constante de crescimento (g L-1 h-1) 0,51 - - 0,32 0,31 0,21 0,4 Velocidade específica de crescimento (h-1) 0,19 - - 0,07 0,03 0,07 0,06 Velocidade máxima constante de produção (g L-1 h-1) 4,58 2,8 4,78 5,25 8,96 5,64 6 Velocidade específica de produção (h-1) 0,09 0,03 0,07 0,11 0,26 0,13 0,07 Velocidade máxima constante de consumo de substrato (g L-1 h-1) 5,81 6,65 6,36 7,41 4,34 8,81 / 5,352/ 33 8,34 / 15 Velocidade específica de consumo de substrato (h-1) 0,06 0,13 0,08 0,14 0,07 0,131 / 0,132 / 0,083 0,224 / 0,085 1
Antes do primeiro pulso de alimentação
2
Final do primeiro pulso de alimentação
3
Final do segundo pulso de alimentação
4
Antes do início da alimentação
5
O maior valor para a velocidade de crescimento do micro-organismo foi obtido no experimento em batelada, seguido pelo valor obtido no experimento em batelada alimentada por fluxo constante. Porém, o experimento que obteve maior valor para a velocidade de produção foi o experimento de batelada alimentada com controle por pH stat, seguido pelo valor obtido no experimento de batelada alimentada por fluxo constante. Já o experimento de batelada obteve o segundo valor mais baixo para velocidade de produção.
Em relação ao consumo da lactose, o maior valor foi obtido no experimento em batelada alimentada por fluxo constante.
Pode-se concluir que o experimento em batelada alimentada por fluxo constante foi o que possuiu os melhores valores para as três velocidades (de crescimento, produção e consumo de substrato).
Segue abaixo uma Tabela 05 com os valores de conversão de biomassa em produto (Yp/x).
Tabela 05 - Valores de conversão de biomassa em produto (Yp/x) dos experimentos realizados.
Experimentos Valores de conversão (Yp/x)
Batelada em reator de 13 litros 17,48
Batelada alimentada pH stat (110 g/L) 16,25
Batelada alimentada pH stat (350 g/L) 18,04
Batelada alimentada por pulso 24,3
Batelada alimentada por fluxo continuo 24,7
A partir da Tabela 05 se pode concluir que os melhores valores foram obtidos nas fermentações nas quais se obteve maior concentração final de ácido lático (batelada alimentada por pulso e por fluxo constante). Isso demonstra que apesar de ter se obtido um valor baixo de biomassa no experimento em batelada alimentada por pulso (5,51 g L-1), esta quantidade de micro-organismo produziu um valor alto de ácido lático (128 g L-1), sendo o valor de fator de conversão muito próximo ao valor de fator de conversão do experimento em batelada alimentada por fluxo constante, no qual se obteve um valor alto de concentração de biomassa e de produção de ácido lático.
7 CONCLUSÕES
O método de batelada alimentada por fluxo constante foi o método no qual se obteve a maior concentração final de ácido lático (149,8 g L-1), porém, a melhor produtividade foi obtida no método de batelada alimentada por pulso 2,55 g L-1 h-1 contra 1,88 g L-1 h-1 de produtividade alcançada no método de batelada alimentada por fluxo constante.
Embora a concentração final de ácido lático tenha sido um pouco menor no experimento em batelada alimentada por pulso, comparada com a concentração final obtida no experimento em batelada alimentada por fluxo constante, tem que se levar em consideração que nesta última foi adicionado 1% de fonte de nitrogênio (AMM), que estende a fase log. Talvez um melhor resultado possa ser obtido em uma fermentação em batelada alimentada com pulso na qual fosse adicionado ao meio de alimentação fonte de nitrogênio. Porém, está adição pode elevar os custos da fermentação e isto teria que ser avaliado.
Em relação aos valores das velocidades de crescimento do micro-organismo, produção de ácido lático e consumo de lactose, o experimento em batelada alimentada por fluxo constante foi o mais satisfatório em todos.
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