Criopreservação de sêmen de tambaqui Colossoma macropomum em criotubo

Texto

(1)MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA. CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE TAMBAQUI Colossoma macropomum EM CRIOTUBO. ALLAN CHARLES MARQUES DE CARVALHO. SÃO CRISTÓVÃO-SE 2013.

(2) MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA. ALLAN CHARLES MARQUES DE CARVALHO. CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE TAMBAQUI Colossoma macropomum EM CRIOTUBO. Dissertação apresentada à Universidade Federal de Sergipe como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Zootecnia.. Orientador Dr. Alexandre Nizio Maria Co-orientador Dr. Paulo César Falanghe Carneiro. SÃO CRISTÓVÃO-SE 2013.

(3) FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE Carvalho, Allan Charles Marques de Criopreservação de sêmen de tambaqui Colossoma macropomum em criotubo / Allan Charles Marques de Carvalho ; orientador Alexandre Nizio Maria. – São Cristóvão, 2013. 56 f. : il.. C331c. Dissertação (mestrado em Zootecnia) – Universidade Federal de Sergipe, 2013. O 1. Peixe. 2. Criopreservação. 3. Peixe - Fertilização. 4. Cinética espermática. 5. Zootecnia. I. Maria, Alexandre Nizio, orient. II. Título. CDU 639.3.034.

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(5) DEDICATÓRIA. Em primeiro lugar a Deus pela energia nos momentos mais difíceis. Aos meus pais pelo incentivo e por todo o carrinho. Aos meus irmãos pelos bons conselhos. À minha namorada que me ajuda a superar os longos percursos..

(6) AGRADECIMENTOS. Ao programa de pós-graduação em Zootecnia da Universidade Federal de Sergipe. À Embrapa Tabuleiros Costeiros, pelo apoio técnico e laboratorial. Aos meus colegas de mestrado que trilharam essa jornada comigo, principalmente: Diana Matos, Marta Jeidjane e Vítor Andrade. A todos que compõem o Laboratório de Biotecnologias da Reprodução Animal (LABRA): Allan Rezende, Allisson Ferro, Ana França, Carlos Adriano, David Lopes, Evelyn da Silva, Flavia Hipolito, Giselle Santana, Jadson Pinheiro, Jofferson Santos, José Eduardo, Maiana Chaves, Dr. Rafael Venâncio, Rebeca Silva, Sidney Sales e Tarsízio da Silva, pelo apoio. Ao Orientador Dr. Alexandre Nizio Maria por todo apoio pedagógico e técnico durante o mestrado. Ao Co-orientador Dr. Paulo César Falanghe Carneiro por toda ajuda. Ao Dr. Hymerson Costa Azevedo pelas conversas produtivas e pelos incentivos. Ao professor Dr. Anselmo Domingos Ferreira Santos pelos ensinamentos. Ao professor Dr. Rogério Tubino, que foi meu primeiro orientador do PIBIC. Obrigado! Quando fazia ler vários livros para testar meus conhecimentos e pelas lições de vida. Agradeço a todos que tiveram participação na minha formação acadêmica..

(7) SUMÁRIO Página RESUMO ............................................................................................................................... i ABSTRACT .......................................................................................................................... ii 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 8 2. REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................................. 9 2.1. Tambaqui Colossoma macropomum ............................................................................ 9 2.2. Criopreservação de sêmen.......................................................................................... 10 2.3. Velocidade de congelamento e de descongelamento ................................................. 16 2.4. Criotubos .................................................................................................................... 18 3. REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO ............................................................................. 19 ARTIGO ................................................................................................................................ 1 RESUMO .............................................................................................................................. 1 1. Introdução ......................................................................................................................... 2 2. Material e Métodos ........................................................................................................... 4 2.1. Seleção dos reprodutores, coleta e avaliação inicial do sêmen .................................... 4 2.2. Criopreservação do sêmen ........................................................................................... 6 2.3. Experimento 1: Avaliação do tipo de criotubo e tempo de descongelamento do sêmen. .................................................................................................................................... 6 2.3.1. Avaliação da cinética espermática ............................................................................... 7 2.3.2. Determinação das velocidades de congelamento e descongelamento ......................... 8 2.4. Experimento 2: Fertilidade do sêmen congelado em diferentes criotubos e sua correlação com os parâmetros de cinética espermática ....................................................... 10 2.5. Experimento 3: Duração da cinética espermática pós-ativação no sêmen congelado em diferentes criotubos ........................................................................................................ 11 2.6. Experimento 4: Viabilidade dos espermatozoides descongelados mantidos sob refrigeração .......................................................................................................................... 12 2.7. Análise estatística ....................................................................................................... 13 3. Resultados ....................................................................................................................... 14 3.1. Experimento 1: Avaliação do tipo de criotubo e tempo de descongelamento do sêmen. .................................................................................................................................. 14.

(8) 3.1.1. Avaliação da cinética espermática ............................................................................. 14 3.2. Experimento 2: Fertilidade do sêmen congelado em diferentes criotubos e correlação com os parâmetros de cinética espermática ......................................................................... 16 3.3. Experimento 3: Duração da cinética espermática pós-ativação no sêmen congelado em diferentes criotubos ........................................................................................................ 17 3.4. Experimento 4: Viabilidade dos espermatozoides descongelados em diferentes criotubos mantidos sob refrigeração .................................................................................... 21 4. Discussão ........................................................................................................................ 23 5. Conclusão........................................................................................................................ 27 6. Referências...................................................................................................................... 27.

(9) RESUMO Carvalho, ACM. Influência do tipo de criotubo e do tempo de descongelamento sobre a qualidade e fertilidade do sêmen de tambaqui Colossoma macropomum criopreservado. Sergipe:UFS, 2013. 56p. (Dissertação - Mestrado em Zootecnia) A criopreservação de sêmen em criotubos reduz o tempo necessário para o envase, congelamento e descongelamento das amostras, além de otimizar os procedimentos de fertilização artificial. No entanto, nenhum estudo ainda foi realizado com o sêmen de tambaqui neste recipiente. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do tipo de criotubo (1,6 e 4,5 mL) e do tempo de descongelamento (60ºC/70s e 60ºC/90s) sobre a qualidade e fertilidade do sêmen de tambaqui criopreservado. Para isso, amostras de sêmen foram diluídas em solução de congelamento (1:9 v/v) composta por 75% de glicose 290 mOsm, 10% de metilglicol e 5% de gema de ovo, sendo envasadas em criotubos de 1,6 e 4,5 mL, congeladas em vapor de nitrogênio líquido no botijão dryshipper (-175ºC) e armazenadas em botijão criogênico a -196°C. Para avaliação do tempo de descongelamento do sêmen, os criotubos foram imersas em água a 60°C durante 70 s ou 90 s e a qualidade espermática imediatamente avaliada (Motilidade total - MT; Motilidade progressiva - MP; Velocidade curvilinear - VCL; Velocidade em linha reta - VSL e Velocidade média da trajetória - VAP). Neste estudo foi determinado também o tempo de viabilidade dos espermatozoides descongelados, mantidos sob refrigeração a 5°C e avaliados durante 24 horas. Além dos parâmetros de cinética espermática foram avaliadas a morfologia e a integridade da membrana plasmática dos espermatozoides. A capacidade de fertilização do sêmen foi avaliada a partir das amostras descongeladas no melhor tempo. Todos os parâmetros de cinética espermática apresentaram valores superiores quando as amostras de sêmen foram descongeladas por 90s em relação ao tempo de 70s, independentemente do tipo de criotubo. Não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros de cinética espermática pós-descongelamento entre as amostras congeladas nos criotubos de 1,6 e 4,5 mL, com exceção da MT que foi superior nos criotubos de 1,6 mL (47±14%) em comparação com os criotubos de 4,5 mL (40±11%), independentemente do tempo de descongelamento. Após ativação, os espermatozoides reduziram significativamente os valores dos parâmetros de cinética dentro de 37 segundos, exceto a MT que se manteve constante neste período. Baseando-se na maior parte dos parâmetros espermáticos avaliados (VCL, VSL, VAP e Integridade da membrana plásmatica para ambos os criotubos e MT, MP e Morfologia espermática somente para o criotubo de 1,6 mL) o sêmen congelado manteve sua qualidade durante 3h após o descongelamento. A taxa de fertilização obtida com o sêmen in natura (74±6%) foi superior ao sêmen criopreservado (1,6 mL - 45±9% e 4,5 mL - 41±12%). Os dois criotubos não diferiram entre si neste parâmetro. Uma alta correlação significativa (p<0,05) foi observada entre a fertilização e a cinética espermática (MT - 89%; MP - 86%; VCL - 79%; VSL - 69% e VAP - 78%). Conclui-se que os criotubos de 1,6 e 4,5 mL podem ser utilizados na criopreservação do sêmen de tambaqui, sendo recomendado seu descongelamento a 60°C por 90s e seu uso em procedimentos de fertilização dentro de 3 horas após o descongelamento desde que mantido a 5°C. Palavras-chave: Peixe; Cinética espermática; Criopreservação; Fertilização.. i.

(10) ABSTRACT Carvalho, ACM. Influence of cryotube and thawing time on the quality and fertility of tambaqui Colossoma macropomum cryopreserved semen. Sergipe:UFS, 2013. 56p. (Dissertation - Master in Zootecnia) The semen cryopreservation in cryotubes reduces the time needed for filling, freezing and thawing of the samples, while optimizing the procedures for artificial fertilization. However, no study has yet been performed with tambaqui semen in this container. The aim of this study was to evaluate the influence of cryotubes (1.6 and 4.5 mL) and thawing time (60ºC/70s and 60ºC/90 s) on the quality and fertility of tambaqui cryopreserved semen. For that, semen samples were diluted in freezing solution (1:9) composed with 75% glucose 290 mOsm , 10% methylglycol and 5% egg yolk, and frozen in liquid nitrogen vapor (in a dry shipper), and stored in liquid nitrogen (-196 °C). The semen samples was thawed at 60ºC in bath water during 70s or 90s and the semen quality was evaluated (Total motility MT; Progressive motility - MP; Curvilinear velocity - VCL; Straight-line velocity - VSL and Average path velocity - VAP). In this study was also determined the time viability of spermatozoa thawed, maintained under refrigeration at 5°C, and assessed over 24 hours. Besides the kinetic parameters were evaluated sperm morphology and membrane integrity of spermatozoa. The fertilizing capacity of semen was evaluated from the samples thawed in the best time. All parameters of sperm kinetic showed higher values when the semen samples were thawed in 90 s compared to 70 s, independently of cryotube type. No significant differences were observed in sperm kinetic parameters after thawing between samples frozen in 1.6 ml and 4.5 mL cryotubes, except for total motility that was higher in 1.6 mL (47 ± 14% ) compared with 4.5 mL cryotubes (40 ± 11%), independently of thawing time. After activation, the spermatozoa significantly reduced the values of kinetic parameters within 37 seconds, except the MT which remained constant during this period. Relying on the sperm parameters evaluated (VCL, VSL, VAP and membrane integrity for both cryotubes and MT, MP and morphology only for 1.6 mL cryotube) the frozen semen maintained the quality during 3h after thawing. The fertilization rate obtained with fresh semen (74±6%) was higher than cryopreserved semen (1.6 mL - 45±9% and 4.5 mL 41±12%). The two cryotubes did not differ in this parameter. A high correlation (p <0.05) was observed between fertility and sperm kinetics parameters (MT - 89%, MP - 86%; VCL - 79%; VSL - APV and 69% - 78%). It is concluded that 1.6 and 4.5 mL cryotubes can be used in the cryopreservation of tambaqui semen being recommended to be thawed at 60°C for 90s and their use in fertilization procedures within 3 hours after thawing since kept at 5°C. Key-words: Fish; sperm kinetics; Cryopreservation; Fertilization.. ii.

(11) 1.. INTRODUÇÃO O tambaqui é considerado um peixe de grande importância para o desenvolvimento. da aquicultura no Brasil, principalmente nas regiões Norte e Nordeste. A produção do tambaqui no Brasil nos anos de 2008, 2009 e 2010 foi de aproximadamente 39.000, 46.000 e 54.000 toneladas, respectivamente, apresentando crescimento linear. Em 2010, a produção de tambaqui contribuiu com 13,77% da produção da piscicultura continental, ficando atrás apenas da tilápia com 39,42% e da carpa com 23,98% (MPA, 2010). Esta espécie é reofílica e sua reprodução nas pisciculturas é feita por meio de fertilização artificial, onde a indução hormonal se faz necessária. Outro fator relevante tanto para as pisciculturas como para os programas de melhoramento genético é a variabilidade genética no plantel de reprodutores, a fim de manter determinadas características importantes para produção comercial, tais como: aumento das taxas de crescimento e de sobrevivência, e maior resistência a doenças. Além disso, a técnica de criopreservação de sêmen tem sido utilizada para auxiliar na manutenção da variabilidade genética, pois permite a otimização do transporte de sêmen, bem como seu armazenamento em bancos de germoplasma, garantindo o intercâmbio entre as diversas instituições de pesquisa e pisciculturas. A utilização de sêmen criopreservado na fertilização artificial possibilita diminuir o plantel de reprodutores machos na piscicultura, otimizando o manejo dos reprodutores e diminuindo os custos de produção. A criopreservação de sêmen em pequenas unidades de envase como as palhetas de 0,5 mL, não é comercialmente ideal quando se trata de espécies reofílicas, pois existe a necessidade de um grande número de palhetas para fertilização dos ovócitos. Métodos para criopreservar grandes quantidades de sêmen estão sendo estudados a fim de aumentar a viabilidade comercial da técnica (FAUVEL et al., 1998; LINHART et al., 2000; CABRITA et al., 2001; RODINA et al., 2007; DING et al., 2009; LICHTENSTEIN et al., 2010). Os criotubos possuem como vantagens, o armazenamento de uma quantidade maior de sêmen, a facilidade de envase, e a possibilidade de ser esterilizado e reaproveitado em mais de um processo de criopreservação. O envase de sêmen congelado em criotubos, sem grandes perdas da qualidade espermática e fertilidade, pode aumentar a aplicabilidade da criopreservação na produção. 8.

(12) em escala comercial de peixes pela indústria piscícola, servindo de instrumento para reprodução artifical ou para formação de bancos de germoplasma. O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência do tipo do criotubo e do tempo de descongelamento na qualidade e capacidade de fertilização do sêmen criopreservado de tambaqui. 2.. REFERENCIAL TEÓRICO. 2.1.. Tambaqui (Colossoma macropomum) O Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), popularmente conhecido como. tambaqui, pertence à ordem Characiforme, espécie reofílica e endêmica das bacias dos rios Amazonas e Orinoco, sendo considerado o segundo maior peixe de escama da bacia Amazônica (GOULDING & CARVALHO, 1982). Este peixe possui desova total com fecundação externa, além de apresentar alta fecundidade por desova, ou seja, a fêmea produz mais de 1.000.000 de ovócitos (VIEIRA et al., 1999). Essa espécie possui como característica uma coloração variando de amarelo para verde-oliva no dorso e preto no ventre. A intensidade das cores está correlacionada à cor, transparência e pH da água. Tem como hábito alimentar zooplânctons, frutos e sementes, ou seja, é uma espécie onívora (GOULDING & CARVALHO, 1982). O tambaqui é criado amplamente em pisciculturas no Brasil, principalmente nas regiões Norte e Nordeste (MUNIZ et al., 2008). Este fato deve-se às características zootécnicas dessa espécie, tais como: crescimento rápido, resistência em ambientes com baixo teor de oxigênio dissolvido, adaptação ao confinamento, carne saborosa, hábito alimentar variado adaptando-se rapidamente ao arraçoamento (MENDONÇA et al., 2009). Para piscicultura o maior entrave na criação do tambaqui é a sua natureza reofílica, ou seja, na estação das enchentes dos rios ocorre a migração dos peixes para reprodução que percorrem cerca de 1000 km (GOULDING & CARVALHO, 1982). Ao subir o rio os peixes migradores são estimulados pelos fatores ambientais (temperatura, fotoperíodo e outros), sociais (interação entre machos e fêmeas) e hormonais (ZOHAR & MYLONAS, 2001). Esses estímulos são capturados pelos receptores sensoriais que são transmitidos para o sistema nervoso central que ativa o eixo endócrino (hipotálamo, hipófise e gônadas), onde se dá a produção e a liberação de hormônios na corrente sanguínea, tendo como 9.

(13) consequência a maturação sexual (NAGAHAMA & YAMASHITA, 2008). Quando os peixes reofílicos não são estimulados, ocorre uma pequena produção seminal e baixa qualidade espermática nos machos e a ovulação não se completa nas fêmeas (HONJI et al., 2009). Deste modo, quando criado em confinamento o tambaqui, sofre disfunção no sistema reprodutivo, devido à falta de estímulos ambientais, que diminuem a ação de hormônios sexuais interferindo na reprodução natural (VIEIRA, et al., 2011). O método de hipofisação, ou seja, manipulação hormonal utilizada em peixes maduros de espécies migradoras para a indução da ovulação e espermiação, se tornou um instrumento de suma importância para criação desses peixes nas pisciculturas (ZOHAR & MYLONAS, 2001; ZANIBONI FILHO & WEINGARTNER, 2007). Utilizando a indução hormonal no reprodutor, Colossoma macropomum, o volume de sêmen coletado foi 25 vezes maior em relação ao volume coletado do reprodutor sem indução hormonal (MARIA et al., 2011). 2.2.. Criopreservação de sêmen Atualmente a comunidade internacional está empenhada na preservação da. diversidade genética animal, que engloba os animais destinados à agropecuária e os de vida selvagem (MORITZ & LABBE, 2008). A formação de um banco de sêmen traz diversas vantagens para reprodução em cativeiro, tais como: redução da demanda por estrutura e mão-de-obra, diminuição dos custos e do risco de endocruzamentos e, eliminação da necessidade de captura e transporte de reprodutores (MARTÍNEZ-PÁRAMO et al., 2009). A criopreservação visa manter a estrutura e consequentemente a viabilidade celular a baixas temperaturas por um determinado período (CAVALCANTE et al., 2006). A preservação a longo prazo consiste no armazenamento e na manutenção da função biológica das células espermáticas criopreservadas em nitrogênio líquido a -196 ºC. A criopreservação pode aumentar a escala de utilização do sêmen nas criações sendo uma ferramenta importante no controle da endogamia dos plantéis de peixe cultivados (MORITZ & LABBE, 2008). A reprodução artificial através do armazenamento do sêmen em longo prazo é vantajosa, uma vez que a produção fora da estação reprodutiva pode ser. 10.

(14) feita utilizando-se espermatozoides de boa qualidade congelados em períodos mais favoráveis (GROISON et al., 2010). O processo de criopreservação do sêmen aplicado comumente em peixes compreende a sua extração, diluição, envase em palhetas ou criotubos e congelamento e de descongelamento (ROBLES et al., 2005). Na criopreservação das células espermáticas de algumas espécies de peixes, tais como:. Brycon. orbignyanus. (MARIA. et. al.,. 2006),. Piaractus. brachypomus. (NASCIMENTO et al., 2010), Piaractus mesopotamicus (ORFÃO et al., 2010), Prochilodus lineatus (VIVEIROS et al., 2010) e Colossoma macropomum (CARNEIRO et. al, 2012), o congelamento se dá colocando as amostras de sêmen diluídas e envasadas dentro de um botijão dry shipper com vapor de nitrogênio líquido (N2L) a -175ºC e armazenadas em botijão criogênico com N2L a -196ºC. Entretanto o processo de congelação promove crioinjúrias às células espermáticas devido a cristalização, desidratação e mudança de fase dos fofolipídios da membrana plasmática (MAZUR, 1984; WATSON, 2000) Para diminuir os danos causados às células espermáticas pelo congelamento, ao sêmen é adicionado meio diluidor constituído por crioprotetores intracelulares a exemplo do metilglicol e extracelulares como a glicose e gema de ovo. Os crioprotetores devem ter baixa toxidade e não provocarem choque osmótico nos espermatozoides (HOLT, 2000; BARBAS & MASCARENHAS, 2009; VIVEIROS et al., 2012). A fim de minimizar as crioinjúrias sobre a membrana plasmática, que prejudicam a fisiologia da célula espermática, técnicas mais precisas de congelamento e armazenamento do sêmen em recipientes de maior tipo precisam ser desenvolvidas (CAVALCANTE et al., 2006). Devido especialmente a sua grande variedade e capacidade de armazenamento os criotubos têm sido bastante utilizados em diferentes protocolos de congelamento e descongelamento de sêmen em diversas espécies de peixe (Quadros 1 e 2).. 11.

(15) Quadro 1. Protocolos de criopreservação de sêmen de peixes em criotubos. Volume do Criotubo. Tipo de Congelador. Velocidade de Congelamento. Velocidade de Descongelamento. Espécie. Referência. 1,0 mL. Caixa Térmica. Não mensurado. 35°C/50s. Odontesthes bonariensis. Lichtenstein et al. (2010). 1,5 mL. Caixa Térmica. -65,0°C/min. 50°C/60s. Dicentrarchus labrax. Fauvel et al. (1998). 1,6 mL 4,0 mL. Caixa Térmica. Não mensurado. 37°C/90s 37°C/120s. Hippoglossus hippoglossus. Ding et al. (2011). 1,8 mL. Programável. -8,0°C/min. 25°C/120s. Clarias gariepinus. Rurangwa et al. (2001). 1,8 mL. Programável. -18,6°C/min. 37°C/150s. Lateolabrax japonicus. Ji et. (2004). 1,8 mL. Programável. -18,6°C/min. 37°C/90s. Verasper variegatus. Tian et al. (2008). 40°C/105s. Tinca tinca. Rodina et al. (2007). 37°C/60-90s. Scophthalmus maximus. Chen et al. (2004). 35°C/110s. Cyprinus carpio. Linhart et al. (2000). -4°C/min (entre 4 e -9°C) e 11,0°C/min (entre -9 e -80°C); e -20,0°C/min (entre 4 e -80°C) -31,0°C/min (entre 16 e -15°C) e -18,6°/min (entre -12 e -180°C) -4,0°C/min (entre 4 e -9 °C) e -11,0°C/min (entre -9 e 80°C/min). 1,8 mL. Programável. 1,8 mL. Programável. 2,0 mL. Programável. 2,0 mL. Programável. -20,0°C/min. 40°C/90-110s. Pagrus major. Liu et al. (2006a). 2,0 mL. Programável. Não mensurado. 28°C/120s. Paralichthys olivaceus. Zhang et al. (2003). 2,0 mL. Caixa Térmica. Não mensurado. 37°C/60s. Pelteobagrus fulvidraco. Pan et al. (2008). Todos os procedimentos de congelação foram feitos com vapor de nitrogênio líquido.*Citação do presente estudo.. 12.

(16) Continuação do Quadro 1. Volume do Criotubo. Tipo de Congelador. Velocidade de Congelamento. Velocidade de Descongelamento. Espécie. Referência. 2,0 mL. Caixa Térmica. Não mensurado. 28°C/60s. Verasper variegates. Liu et al. (2006b). 2,0 mL. Caixa Térmica. Não mensurado. 37°C/60s. Siniperca chuatsi. Ding et al. (2009). 2,0 mL. Botijão Criogênico. -5,0°C/min. 50°C/120s. -12,0°C/min. 50°C/180s. Pangasius gigas. Mongkonpunya et al. (1995). -9,6 °C/min. 60°C/90s. -9,0 °C/min. 60°C/90s. Colossoma macropomum. Carvalho et al. (2013)*. 5,0 mL 1,6 mL* 4,5 mL*. Botijão Dry Shipper. Todos os procedimentos de congelação foram feitos com vapor de nitrogênio líquido.*Citação do presente estudo.. 13.

(17) Quadro 2. Resultados da Motilidade Total e da Taxa de Fertilização dos protocolos de criopreservação de sêmen de peixes em criotubos. Volume do Criotubo. Motilidade Total1. Taxa de Fertilização2 Espécie. Referência. 1,0 mL. 70,0%. 79,0%. Odontesthes bonariensis. Lichtenstein et al. (2010). 1,5 mL. 70,0%. 68,8%. Dicentrarchus labrax. Fauvel et al. (1998). 1,6 mL. 77,0%. 58,4%. 4,0 mL. 59,0%. 50,8%. Hippoglossus hippoglossus. Ding et al. (2011). 1,8 mL. 70,7%. 36,4%. Clarias gariepinus. Rurangwa et al. (2001). 1,8 mL. 73,3%. 81,0%. Lateolabrax japonicus. Ji et. (2004). 1,8 mL. 13,3%. 34,5%. Verasper variegatus. Tian et al. (2008). Não mensurado. Tinca tinca. Rodina et al. (2007). 1,8 mL. 10,0% 13,9%. 1,8 mL. 71,7%. 70,1%. Scophthalmus maximus. Chen et al. (2004). 2,0 mL. 69,0%. 56,0%. Cyprinus carpio. Linhart et al. (2000). 2,0 mL. 79,4-88,6%. 89,6-95,6%. Pagrus major. Liu et al. (2006a). 2,0 mL. 79,2%. 76,2%. Paralichthys olivaceus. Zhang et al. (2003). 2,0 mL. 65,0%. 90,5%. Pelteobagrus fulvidraco. Pan et al. (2008). Todos os procedimentos de congelação foram feitos com vapor de nitrogênio líquido.*Citação do presente estudo. 1,2. Foram avaliadas após o descongelamento do sêmen criopreservado.. 14.

(18) Continuação do Quadro 2. Volume do Criotubo. Motilidade Total1. Taxa de Fertilização2 Espécie. Referência. 2,0 mL. 40,5-67,5%. 59,0-70,0%. Verasper variegates. Liu et al. (2006b). 2,0 mL. 96,0%. 66,0%. Siniperca chuatsi. Ding et al. (2009). 2,0 mL. 5,0-10,0%. 2,9-15,0%. 5,0 mL. 5,0-10,0%. 65,0-66,0%. Pangasius gigas. Mongkonpunya et al. (1995). 1,6 mL* e. 47,0%. 45,0%. 4,5 mL*. 40,0%. 41,0%. Colossoma macropomum. Carvalho et al. (2013)*. Todos os procedimentos de congelação foram feitos com vapor de nitrogênio líquido.*Citação do presente estudo. 1,2. Foram avaliadas após o descongelamento do sêmen criopreservado.. 15.

(19) 2.3.. Velocidade de congelamento e de descongelamento As crioinjúrias ocasionadas nos espermatozoides, durante os processos de. congelamento e descongelamento, ocorrem devido a diversas condições, tais como: desidratação, cristalização/recristalização, toxicidade e mudanças na organização dos fosfolipídios na membrana plasmática (MAZUR, 1984; WATSON, 2000). Nesse contexto percebe-se a importância de se aperfeiçoar cada vez mais os processos de congelamento do sêmen a fim de minimizar as crioinjúrias que causam danos estruturais e funcionais às células, assim como de descongelamento, a fim de garantir as características morfológicas e fisiológicas dos espermatozoides tendo-se como referência o sêmen in natura (SAKS, 1978). No processo de criopreservação a célula até a temperatura de -5ºC não sofre com a formação de cristais de gelo, uma vez que as moléculas de água intra e extracelular encontram-se super-refrigeradas. Porém, na faixa de temperatura de -5 a -15ºC ocorre a formação de cristais de gelo no meio extracelular, causando concentração de soluto e dando início a desidratação celular, enquanto o meio intracelular permanece. super-. refrigerado (MAZUR, 1984; MEDEIROS et al., 2002). A desidratação pode ocasionar a desnaturação das macromoléculas da célula e o encolhimento da membrana plasmática de maneira irreversível (MEDEIROS et al., 2002). Segundo Mazur (1984), a faixa de temperatura intermediária de -15 a -60ºC é mais crítica, pois ocorre a formação de cristais de gelo extracelular e intracelular. Os cristais de gelo intracelular podem ocasionar dano mecânico na célula. Duas vezes nessa faixa crítica de temperatura, a primeira durante o processo de congelamento e a segunda no processo de descongelamento quando há a recristalização. A criopreservação provoca danos às membranas celulares, possivelmente ocasionando mudanças na disposição dos seus componentes. A queda de temperatura provoca uma mudança nos fosfolipídios da membrana plasmática, que passa da fase de líquido cristalino para fase de gel, resultando em uma estrutura mais rígida (MEDEIROS et al., 2002). Durante o processo de rigidez pode ocorrer a migração lateral dos lipídios e o rearranjo dos componentes da membrana, ocorrendo a formação de microdomínios de lipídios e a segregação das proteínas dos arranjos hexagonais dos lipídios gelificados. Depois do descongelamento pode ocorrer um desordenamento na estrutura da membrana,. 16.

(20) tendo como consequência a alteração da sua permeabilidade em relação à água e ao soluto (WATSON, 2000). Quando a velocidade de congelamento se dá lentamente ocorre o aumento da concentração de soluto no meio, isto é, o ambiente se torna ligeiramente hiperosmótico, ocasionando o aumento da tensão na membrana plasmática, a desidratação celular e o influxo de íons (MAZUR, 1984; YANG & TIERSCH, 2009). Entretanto, quando a velocidade de congelamento é muito rápida, não dá tempo para que ocorra a desidratação celular adequada, tendo-se como consequência uma maior formação de cristais de gelo intracelular (YANG & TIERSCH, 2009; CHAO & LIAO, 2001). A velocidade de descongelamento lenta provoca um demasiado influxo de água, fazendo com que a célula fique intumescida e sejam alteradas suas propriedades morfológicas e fisiológicas. Por outro lado, a velocidade de descongelamento rápida diminui a recristalização da água e o inchaço na célula, reduzindo danos na membrana plasmática (MAZUR, 1984). O tipo de congelação é importante no procedimento de criopreservação de sêmen de peixe, pois pode influenciar na velocidade de congelamento e descongelamento (RODINA et al., 2007). Beirão et al. (2011) estudando o sêmen criopreservado de Sparus aurata, se comparou cinco velocidades de congelamento em palhetas de 0,5 mL e três velocidades de congelamento em criotubos de 1,8 mL, onde o sêmen congelado em palhetas obteve uma melhor motilidade espermática em relação aos criotubos. Ao se comparar o sêmen congelados em criotubos de 1,8 mL em diferentes velocidades, o sêmen congelado na velocidade mais rápida a 1cm do N2L (-6,6°C/min no intervalo 4 a -20°C e 19,8°C/min no intervalo de -20 a -100°C) apresentou melhores parâmetros de qualidade espermática. E ao. comparar o sêmen criopreservado nas palhetas 0,5 mL, a palheta congelada na velocidade de 22,8°C/min e -104°C/min (no intervalo de 4 a -20°C e -20 a -100°C, respectivamente) a 1 cm do N2L obeteve os melhores parâmetros de qualidade espermática. Rodina et al. (2007) analisando o sêmen criopreservado de Tinca tinca em palhetas de 0,5, 1 e 5 mL e criotubo de 1,8 mL, os quais foram descongeladas à 40°C durante 8, 20, 35 e 105 segundos, respectivamente. Avaliaram duas curvas de congelamento, uma lenta que começou de 4 a -9°C com uma velocidade de 4°C/min e de -9°C a -80°C com velocidade de 11°C/min e uma rápida foi de 4 a -80°C com velocidade de -20°C/min, foi observado que houve diferença significativa entre os tratamentos, onde geralmente as 17.

(21) velocidades espermáticas foram superiores no sêmen criopreservado na velocidade rápida (-20°C/min). 2.4.. Criotubos Diversas formas de recipientes vêm sendo avaliadas em relação a sua capacidade de. manter a qualidade espermática durante o processo de congelamento e de descongelamento (CABRITA et al., 2001). Cada recipiente é constituído de diferentes formas e dimensões (ex.: forma cilindrica com diferentes diâmetros) e materiais (ex.: polipropileno) que podem produzir diferentes taxas de transferência de calor modificando a velocidade de congelamento e descongelamento dos espermatozoides (MONGKONPUNYA et al., 1995). Os diferentes tipos de recipientes utilizados na criopreservação de células espermáticas devem assegurar a identificação da amostra e a uniformização da velocidade de congelamento (YANG & TIERSCH, 2009). As palhetas francesas de 0,5 mL são as mais utilizadas na criopreservação do sêmen de peixe, pois possuem perda de calor mais uniforme, devido à relação superfície de contato e tipo (VIVEIROS & GODINHO, 2009). Mas devido a sua pequena capacidade de armazenar o sêmen criopreservado, se faz necessário um número maior de palhetas para fertilização de todos os ovócitos de uma desova, principalmente, em espécies de peixes reofílicos que possuem uma alta fecundidade (MONGKONPUNYA et al., 1995; VELASCO-SANTAMARÍA et al., 2006). O criotubo surgiu como alternativa à criopreservação de sêmen de humanos, porém, o seu uso está difundido para outras espécies de mamíferos e de peixes (TIAN et al., 2008; LORENZONI et al., 2011). Essa difusão ocorre, principalmente, pela quantidade maior de sêmen que se pode armazenar no criotubo, além da facilidade no manuseio durante o envase (KOZINK et al., 2006). O congelamento de espermatozoides em criotubos é de grande importância para produção em grande escala, uma vez que se pode armazenar uma grande quantidade de sêmen/espermatozoides por dose (DING et al., 2011). Mongkonpunya et al. (1995), fertilizando ovócitos de Pangasius gigas com sêmen in natura e criopreservado em criotubo de 5,0 mL, com relação de 4,2 x 106 espermatozoides. 18.

(22) por ovócito, obteve uma taxa de fertilização de 72% e 65%, respectivamente, onde não houve diferença significativa. Fauvel et al. (1998) comparando o sêmen criopreservado de Dicentrarchus labrax em palheta de 0,25 mL e criotubo de 1,5 mL, constaram que a diferença entre o tipo dos criotubos pode afetar o congelamento, tendo como consequência a queda da qualidade espermática e da taxa de fertilização. Lichtenstein et al. (2010) avaliaram o sêmen criopreservado de Odontesthes bonariensis em palhetas de 0,25 mL e em criotubos de 1,0 mL, onde não houve diferença. significativa da taxa de fertilização entre os criotubos. Horváth et al. (2007) compararam a eficiência da criopreservação em palheta de 1,2 e de 4,5 mL para o sêmen criopreservado de Cyprinus carpio, e observou-se que os ovócitos fertilizados com sêmen congelados em palhetas de 4,5 mL teve menores taxas de eclosão em relação as palhetas de 1,2 mL, quando ambas as palhetas foram congeladas durante 3 minutos. Os diferentes tipos recipientes utilizados no envase de sêmen criopreservado com taxas de congelamento e descongelamento lentas podem ocasionar baixa qualidade espermática afetando a taxa de fertilização e de eclosão (CABRITA et al., 2001). 3.. REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO. BARBAS, J. P. & MASCARENHAS, E. R. D. Cryopreservation of domestic animal sperm cells. Cell Tissue Bank, v. 10, p. 49-62, 2009. BEIRÃO, J.; CABRITA, E.; PÉREZ-CEREZALES, S.; MARTÍNEZ-PÁRAMO, S.; HERRÁEZ, M. P. Effect of cryopreservation on fish sperm subpopulations. Cryobiology, v. 62, p. 22-31, 2011. CABRITA, E.; ROBLES, V.; ALVAREZ, R.; HERRAÉZ, M.P. 2001 - Cryopreservation of rainbow trout sperm in large tipo straws: application to large scale fertilization. Aquaculture, v. 201, p. 301-314, 2001. CARNEIRO, P. C. F.; AZEVEDO, H. C.; SANTOS J. P.; MARIA, A. N. Cryopreservation of tambaqui (Colossoma macropomum) semen: extenders, cryoprotectants, dilution ratios and freezing methods. CryoLetters, v. 33, p.385-393, 2012.. 19.

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(28) ARTIGO* Influência do tipo de criotubo e do tempo de descongelamento sobre a qualidade e fertilidade do sêmen de tambaqui Colossoma macropomum criopreservado.. RESUMO A criopreservação de sêmen em criotubos reduz o tempo necessário para o envase, congelamento e descongelamento das amostras, além de otimizar os procedimentos de fertilização artificial. No entanto, nenhum estudo ainda foi realizado com o sêmen de tambaqui neste recipiente. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do tipo de criotubo (1,6 e 4,5 mL) e do tempo de descongelamento (60ºC/70s e 60ºC/90s) sobre a qualidade e fertilidade do sêmen de tambaqui criopreservado. Para isso, amostras de sêmen foram diluídas em solução de congelamento (1:9 v/v) composta por 75% de glicose 290 mOsm, 10% de metilglicol e 5% de gema de ovo, sendo envasadas em criotubos de 1,6 e 4,5 mL, congeladas em vapor de nitrogênio líquido no botijão dry-shipper (-175ºC) e armazenadas em botijão criogênico a -196°C. Para avaliação do tempo de descongelamento do sêmen, os criotubos foram imersas em água a 60°C durante 70 s ou 90 s e a qualidade espermática imediatamente avaliada (Motilidade total - MT; Motilidade progressiva - MP; Velocidade curvilinear - VCL; Velocidade em linha reta - VSL e Velocidade média da trajetória - VAP). Neste estudo foi determinado também o tempo de viabilidade dos espermatozoides descongelados, mantidos sob refrigeração a 5°C e avaliados durante 24 horas. Além dos parâmetros de cinética espermática foram avaliadas a morfologia e a integridade da membrana plasmática dos espermatozoides. A capacidade de fertilização do sêmen foi avaliada a partir das amostras descongeladas no melhor tempo. Todos os parâmetros de cinética espermática apresentaram valores superiores quando as amostras de sêmen foram descongeladas por 90s em relação ao tempo de 70s, independentemente do tipo de criotubo. Não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros de cinética espermática pós-descongelamento entre as amostras congeladas nos criotubos de 1,6 e 4,5 mL, com exceção da MT que foi superior nos criotubos de 1,6 mL (47±14%) em comparação com os criotubos de 4,5 mL (40±11%), independentemente do tempo de descongelamento. Após ativação, os espermatozoides reduziram significativamente os *. Artigo formatado segundo normas da revista Theriogenology.

(29) 2. valores dos parâmetros de cinética dentro de 37 segundos, exceto a MT que se manteve constante neste período. Baseando-se na maior parte dos parâmetros espermáticos avaliados (VCL, VSL, VAP e Integridade da membrana plásmatica para ambos os criotubos e MT, MP e Morfologia espermática somente para o criotubo de 1,6 mL) o sêmen congelado manteve sua qualidade durante 3h após o descongelamento. A taxa de fertilização obtida com o sêmen in natura (74±6%) foi superior ao sêmen criopreservado (1,6 mL - 45±9% e 4,5 mL - 41±12%). Os dois criotubos não diferiram entre si neste parâmetro. Uma alta correlação significativa (p<0,05) foi observada entre a fertilização e a cinética espermática (MT - 89%; MP - 86%; VCL - 79%; VSL - 69% e VAP - 78%). Conclui-se que os criotubos de 1,6 e 4,5 mL podem ser utilizados na criopreservação do sêmen de tambaqui, sendo recomendado seu descongelamento a 60°C por 90s e seu uso em procedimentos de fertilização dentro de 3 horas após o descongelamento desde que mantido a 5°C. Palavras-chave: Peixe; Cinética espermática; Criopreservação; Fertilização. 1.. Introdução. O tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), é um peixe oriundo da bacia do rio Amazonas [1]. Sua produção vem aumentando gradativamente ao longo dos últimos anos, sendo o peixe nativo mais produzido pelas pisciculturas, perdendo apenas para tilápia e carpa que são espécies exóticas [2]. Nos últimos anos, o tambaqui vem sendo alvo de diversos estudos relacionados à reprodução, como ciclo reprodutivo [1], indução hormonal [3], caracterização espermática [4,5] e criopreservação de sêmen [6]. A criopreservação é uma técnica que visa à conservação de material biológico em nitrogênio líquido a -196ºC. Nesta temperatura a estrutura e funcionalidade das células são mantidas, conservando-as geneticamente viáveis e reversivelmente inativas do ponto de vista metabólico [7,8]..

(30) 3. A criopreservação de sêmen de peixes é um campo novo em que pouco progresso prático, em nível comercial, foi alcançado no Brasil [9]. Durante os últimos anos várias espécies já tiveram seu protocolo de criopreservação determinado. Na maioria dos estudos apenas palhetas francesas de 0,5 mL têm sido utilizadas [6,10]. No entanto, o uso deste recipiente apresenta algumas limitações quanto à sua utilização na produção de alevinos em larga escala. Espécies migradoras, como tambaqui, apresentam alta fecundidade podendo alcançar mais de um milhão de ovócitos por desova [11], requerendo maior número de espermatozoides e consequentemente de palhetas para fertilização, o que torna o procedimento pouco prático. A criopreservação em recipientes com maior capacidade de armazenamento pode diminui custos e espaço para o acondicionamento das amostras no botijão criogênico, além de otimizar os procedimentos de congelamento e de descongelamento do sêmen para fertilização artificial, facilitando a manipulação durante os processos [12]. Vários recipientes são encontrados no mercado e podem ser utilizados na criopreservação de células espermáticas, entre eles, macropalhetas, criotubos, sacos e tubos plásticos com capacidade de armazenamento variada (1 a 5 mL). Estes recipientes, no entanto, são pouco estudados em peixes. O desenvolvimento de novos recipientes pode facilitar a utilização em campo do sêmen congelado, evitando o uso de um número muito grande de palhetas e mantendo preservadas as características espermáticas durante o congelamento e descongelamento [13]. Como características adequadas, os recipientes devem propiciar velocidades de congelamento e descongelamento uniformes [14], sendo sugerido neste sentido que estes tenham uma maior relação superfície/volume [13]..

(31) 4. Várias pesquisas relatam o uso de sêmen em criotubos para otimização da fertilização de peixes [15,16]. Os criotubos possuem diversas vantagens, tais como: simples envase e identificação, higiene, segurança e aceitação no meio científico [17]. Assim, a utilização destes recipientes na criopreservação de sêmen de peixes abre novas perspectivas para o aumento da produção de alevinos nas pisciculturas. Entretanto, como o recipiente de envase influencia as taxas de congelamento e descongelamento. [12,18],. estudos. são. necessários. para. a. adequação. ou. desenvolvimento de protocolos específicos para cada tipo de criotubo utilizado. A fim de diminuir os danos espermáticos especialmente devido ao processo de recristalização, para cada tipo de recipiente de armazenamento do sêmen congelado, torna-se importante utilizar o protocolo de descongelamento adequado determinando-se, por exemplo, os procedimentos, temperaturas e as velocidades de reaquecimento [12,16]. O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência do tipo de criotubo e do tempo de descongelamento na qualidade e fertilidade do sêmen criopreservado de tambaqui.. 2.. 2.1.. Material e Métodos. Seleção dos reprodutores, coleta e avaliação inicial do sêmen. Todos os animais utilizados nesse estudo foram manuseados de acordo com as diretrizes para experimentação animal [19]. Foram utilizadas amostras seminais de machos sexualmente maduros de tambaqui Colossoma macropomum, provenientes da Piscicultura Santa Clara localizada no município de Propriá, Sergipe..

(32) 5. Os dados das características corporais e do sêmen in natura de todos os machos utilizados nesse estudo estão apresentados na tabela 1.. Tabela 1. Características corporais e do sêmen in natura de machos de tambaqui Colossoma macropomum (n=16). Média ± Variação Coeficiente de Características DP* (min – max) Variação (%) Peso corporal (kg) 6±1 5–8 14 Comprimento (cm) 68 ± 4 59 – 74 6 Volume de sêmen (mL) 7±3 3 – 11 40 38 Concentração (espermatozoides x 109 mL-1) 9±3 5 – 16 Motilidade subjetiva (%) 83 ± 5 80 – 90 6 * DP – Desvio Padrão. Os animais que liberaram sêmen em resposta à leve pressão abdominal foram selecionados para indução hormonal e transportados para tanques de concreto com fluxo constante de água à temperatura de 27°C. O processo de indução hormonal se deu com a aplicação de uma dose intramuscular de 2 mg de extrato bruto de hipófise de carpa Cyprinus carpio por quilo de peso corporal. Aproximadamente 10 horas após a indução. hormonal o sêmen de cada macho foi coletado em tubos de ensaio por massagem abdominal, tendo-se o cuidado de enxugar a papila urogenital antes da coleta. Uma alíquota de 2 µL de cada amostra foi colocada sobre uma lâmina e observada sob um microscópio de luz (Nikon Eclipse E100®, Melville, New York, EUA) na magnitude de 400 x. Como os espermatozoides de peixes devem permanecer imóveis no plasma seminal, qualquer motilidade observada foi atribuída à contaminação das amostras por urina ou água, sendo estas descartadas. Para as amostras que continham espermatozoides imóveis, a motilidade espermática, expressa em porcentagem de células móveis, foi estimada subjetivamente imediatamente após a adição de 30 µ L de bicarbonato de sódio.

(33) 6. 230 mOsm [6]. Amostras com motilidade superior ou igual a 80% foram utilizadas nos procedimentos subsequentes. Para cada amostra de sêmen selecionada foram determinados o volume e a concentração espermática, mensurados diretamente em tubos graduados e em câmara de Neubauer, respectivamente. Os parâmetros de qualidade seminal foram avaliados à temperatura ambiente sempre pelo mesmo avaliador.. 2.2.. Criopreservação do sêmen. Após a coleta e avaliação inicial, o sêmen foi diluído em solução de congelamento (composta por 75% de glicose 290 mOsm, 10% de metilglicol e 5% de gema de ovo), na proporção de 1:9 [6]. Após a diluição, as amostras foram imediatamente envasadas em criotubos onde permaneceram por 20 minutos (tempo de equilíbrio), em temperatura ambiente (25°C), antes de serem congeladas por meio da exposição ao vapor de nitrogênio líquido (N2L) a -175°C em botijão dry-shipper (MVE SC4/2V, GA, EUA). As amostras de sêmen armazenadas foram transportadas da Piscicultura para o Laboratório de Biotecnologia da Reprodução Animal (LABRA) da Embrapa Tabuleiros Costeiros e transferidas após 24 horas para o botijão criogênico (MVE VOLTA 34, GA, EUA) contendo N2L (-196ºC), onde permaneceram por 6 meses até serem avaliadas.. 2.3. sêmen. Experimento 1: Avaliação do tipo de criotubo e tempo de descongelamento do.

(34) 7. As amostras de sêmen diluído na solução de congelamento foram envasadas em criotubos de 1,6 mL (Sarstedt Cryopure®, Nümbrecht, Alemanha - fabricado em polipropileno; tamanho 12 x 47 mm) e 4,5 mL (Sarstedt Cryopure®, Nümbrecht, Alemanha - fabricado em polipropileno; tamanho 12 x 90 mm), congeladas conforme metodologia descrita no subitem 2.2 e descongeladas em banho de água a 60°C durante 70s ou 90s. Após o descongelamento, as amostras de sêmen encontravam-se no estado líquido, e os parâmetros de cinética espermática foram imediatamente avaliados. A combinação de dois tipos de criotubos e dois tempos de descongelamento, determinou a formação de quatro grupos experimentais.. 2.3.1. Avaliação da cinética espermática. Foi realizada a análise da cinética dos espermatozoides no sêmen congelado de cinco machos, descongelando-se duas doses de cada grupo experimental. Imediatamente após o descongelamento 4 µL de sêmen foram adicionados a um recipiente plástico de 1,5 mL e ativado com 50 µL de solução de bicarbonato de sódio 230 mOsm. Imediatamente após a ativação, 3 µL de sêmen foram transferidos para uma câmara Makler ® (profundidade 10µm) previamente posicionada no “charriot” de um microscópio com contraste de fase (Nikon Eclipse 50i®, Japão: magnitude de 100 x; filtro verde; posição pH1). O microscópio foi ligado a uma câmara de vídeo (Basler Vision Technologies® 602FC, Ahrensburg, Alemanha) configurada em 100 quadros s-1, sendo a gravação iniciada 10 segundos pós-ativação. As imagens foram analisadas usando-se uma configuração específica do software Sperm Class Analyzer® (SCA®, Microptics, Versão 5.1 SL, Barcelona, Espanha) adaptada para o sêmen de tambaqui. Os parâmetros de.

(35) 8. cinética espermática avaliados foram: motilidade total (MT); motilidade progressiva (MP); velocidade curvilinear (VCL); velocidade em linha reta (VSL) e velocidade média da trajetória (VAP). Para a determinação e avaliação do comportamento da cinética ao longo do tempo de ativação, foram analisados aproximadamente 300 espermatozoides/campo.. 2.3.2. Determinação das velocidades de congelamento e descongelamento. Para determinação da velocidade de congelamento os criotubos de 1,6 e 4,5 mL (n=3 repetições) foram equipados com sensores de temperatura (termômetro digital - BK Precision 710®, Yorda Linda, Califórnia, EUA) e inseridos dentro do botijão dry shipper . A curva de congelamento foi gerada pelo software ThermoLink® (Yorda. Linda, Califórnia, EUA) registrando-se a temperatura em intervalos de cinco segundos a partir de 25°C (temperatura ambiente) até -166ºC (temperatura de estabilização das amostras congeladas) (Figura 1). Após este procedimento as amostras foram transferidas para botijão criogênico onde alcançaram a temparatura de -189ºC..

(36) 9. 25. 0. -25. Temperatura ( C). -50 1,6 mL -75. 4,5 mL. -100. -125. -150. -175. 0,0. 2,5. 5,0. 7,5. 10,0. 12,5. 15,0. 17,5. 20,0. Tempo (min). Figura 1. Curvas de congelamento do sêmen de Colossoma macropomum envasado em criotubos de 1,6 e 4,5 mL e congelados em vapor de nitrogênio líquido, no botijão dryshipper , durante 20 minutos.. A partir das curvas geradas, as velocidades de congelamento foram calculadas dentro dos seguintes intervalos: 25°C a 0°C, 0°C a -20°C, -20°C a -80°C, -80ºC a -166°C e 25°C a -166°C (Tabela 2).. Tabela 2. Velocidade de congelamento (°C/min) do sêmen de Colossoma macropomum envasado em criotubos de 1,6 e 4,5 mL, e congelados sob vapor de nitrogênio líquido em botijão dry-shipper . Criotubos. Intervalos de Temperatura de Congelamento (ºC) 25 a -166 25 a 0 0 a -20 -20 a -80 -80 a -166. 1,6 mL. -20,0. -11,9. -27,7. -6,2. -9,6. 4,5 mL. -23,6. -7,9. -24,0. -5,8. -9,0.

(37) 10. Para determinação das curvas de descongelamento, foi realizado o mesmo procedimento adotado para as curvas de congelamento, tendo sido utilizado três doses de sêmen congelado para cada um dos quatro grupos experimentais. As doses de sêmen foram descongeladas em banho de água a 60°C durante 70 e 90s. A curva de descongelamento foi gerada registrando-se a temperatura em intervalos de cinco segundos a partir de 189°C (temperatura de estabilização das amostras no botijão criogênico). A partir dos dados gerados, as velocidades de descongelamento foram calculadas dentro dos seguintes intervalos: -189°C a -80°C, -80°C a -20°C, -20°C a -2,3°C e -2,3°C a 2,9°C (Tabela 3).. Tabela 3. Velocidade de descongelamento de sêmen de Colossoma macropomum criopreservado em criotubos de 1,6 e 4,5 mL, e descongelados em banho de água a 60°C durante 70 ou 90s. Criotubos 1,6 mL 4,5 mL. 2.4.. Tempo (s) 70 90 70 90. Intervalos de Descongelamento (ºC) -189 a -80 -80 a -20 -20 a -2,3 -2,3 a 2,9 476,8 475,4 474,6 474,0. 164,2 165,4 165,6 165,7. 33,3 31,0 33.2 30,5. 15,0 16,2. Experimento 2: Fertilidade do sêmen congelado em diferentes criotubos e sua. correlação com os parâmetros de cinética espermática. Para realização deste experimento, amostras de sêmen de cinco machos foram colhidas separadamente, e congeladas nos criotubos de 1,6 e 4,5 mL, conforme metodologia descrita nos subitens 2.1 e 2.2..

(38) 11. Para avaliar a capacidade de fertilização do sêmen criopreservado, uma fêmea foi selecionada e submetida ao processo de indução hormonal da desova por meio da aplicação de duas injeções intramusculares de extrato de hipófise de Cyprinus carpio (0,5 mg e 5,0 mg por quilo de peso corporal) com intervalo de 12h entre as aplicações. Os ovócitos foram retirados por massagem abdominal, dez horas após a segunda aplicação, e armazenados em recipiente plástico. Amostras de 0,5 g (600 ovócitos) foram retiradas (n=10 por tratamento) e o sêmen in natura (controle) e o descongelado nos criotubos de 1,6 e 4,5 mL (60°C durante 90s) foram adicionados na proporção de 2,5 x 105 espermatozoides por ovócito. A fertilização foi iniciada após a adição de 5 mL de bicarbonato de sódio 230 mOsm, sendo homogeneizada durante dois minutos. Após este período os ovos foram transferidos para incubadoras cilíndricas de PVC com fundo telado (15 cm de altura x 10 cm de diâmetro; volume útil aproximado de 1 L) acopladas a um sistema de fluxo contínuo de água. A taxa de fertilização foi determinada após 8 h da fertilização por meio de um estereomicroscópio (ZEISS STEMI 2000-2, Alemanha), e expressa em porcentagem de ovos fertilizados (fechamento de blastóporo) sobre o número total de ovos. Paralelamente, os parâmetros de cinética espermática do sêmen in natura e descongelado foram avaliados, conforme metodologia descrita no subitem 2.3.1. Os resultados da fertilização foram posteriormente correlacionados com os parâmetros de cinética espermática.. 2.5.. Experimento 3: Duração da cinética espermática pós-ativação do sêmen. congelado em diferentes criotubos.

(39) 12. Para a avaliação da duração e do comportamento da cinética espermática após a ativação, amostras de sêmen de 10 machos foram congeladas em criotubos (1,6 e 5,0 mL) e descongeladas em banho de água a 60 ºC durante 90 segundos. As amostras foram ativadas com bicarbonato de sódio 230 mOsm e avaliadas em duplicata quanto à queda dos parâmetros de cinética espermática conforme metodologia descrita no item 2.3.1. A leitura foi iniciada 10 segundos pós-ativação até 37 segundos a temperatura ambiente. Para isso, o software SCA® foi previamente programado para realizar avaliações a cada três segundos.. 2.6.. Experimento 4: Viabilidade dos espermatozoides descongelados mantidos sob. refrigeração. Para. a. avaliação. dos. espermatozoides. mantidos. sob. refrigeração. após. o. descongelamento, amostras de sêmen de cinco machos foram congeladas em criotubos (1,6 e 5,0 mL) e descongeladas em água a 60ºC durante 90 segundos. Após o descongelamento as doses de sêmen foram armazenadas em microtubos cônicos de 1,5 mL e em seguida, conservadas em refrigerador a temperatura média de 5°C (4 a 6 °C) sendo avaliadas no tempo zero (imediatamente após o descongelamento, antes da refrigeração) e às 3, 6, 9, 12 e 24 horas pós-descongelamento já sob efeito da refrigeração. As amostras foram avaliadas quanto à cinética, morfologia e viabilidade espermática em duplicata para cada tipo de criotubo. Os parâmetros de cinética espermática foram analisados de acordo com metodologia descrita no item 2.3.1. Para avaliação da morfologia espermática uma alíquota do sêmen.

(40) 13. descongelado de cada um dos cinco machos foram fixadas em solução de formol-citrato na proporção de 1:1000. Posteriormente foram realizados os esfregaços com corante rosa bengala na proporção 1:30 (sêmen fixado:corante). Após a secagem, as lâminas foram avaliadas em microscópio óptico (1000x com óleo de imersão) para a avaliação de 200 células, sendo utilizada a seguinte classificação de anormalidades espermáticas: Cabeça - macrocefalia, microcefalia, degenerada e isolada, e; Cauda - fraturada, enrolada, curta e dobrada [4]. Os dados foram apresentados em porcentagem de células morfologicamente normais. Para avaliação da viabilidade espermática foi considerada a integridade da membrana plasmática dos espermatozoides. Amostras de sêmen foram incubadas com os fluorocromos iodeto de propídio e SYBR-14 (kit live/dead; Molecular Probes®, Oregon, EUA) durante 10 minutos antes da análise em microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse 50i®, Japão: magnitude de 1000 x). Os espermatozoides que apresentaram membrana plasmática íntegra (emissão de fluorescência verde na cabeça) foram classificados como viáveis, e aqueles com membrana plasmática lesada (emissão de fluorescência vermelha na cabeça) como não viáveis.. 2.7.. Análise estatística. A análise estatística foi realizada pelo programa SISVAR [20]. Os dados foram comparados pela análise de variância (ANOVA) e apresentados como média ± desvio padrão (DP). Para avaliação da normalidade dos dados utilizou-se o teste de ShapiroWilk. Os dados que não apresentaram distribuição normal foram transformados pelo arcseno da raiz de x. Quando a diferença foi significativa, o teste de Scott-Knott foi.