UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO DE QUÍMICA
LAIS PEREIRA DE OLIVEIRA
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ESPECTROFLUORIMÉTRICO PARA O ESTUDO DO PRINCÍPIO ATIVO BILASTINA EM UM NOVO MEDICAMENTO
ANTI-HISTAMÍNICO
Niterói 2019
LAIS PEREIRA DE OLIVEIRA
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ESPECTROFLUORIMÉTRICO PARA O ESTUDO DO PRINCÍPIO ATIVO BILASTINA EM UM NOVO MEDICAMENTO
ANTI-HISTAMÍNICO
Monografia apresentada ao Curso de Graduação de Bacharelado em Química Industrial da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para a obtenção do Grau de Bacharel em Química Industrial.
Orientadora: Profa. Dra. Flávia Ferreira de Carvalho Marques Coorientador: Prof. MSc. Marcos Martins Gouvêa
Niterói 2019
LAIS PEREIRA DE OLIVEIRA
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ESPECTROFLUORIMÉTRICO PARA O ESTUDO DO PRINCÍPIO ATIVO BILASTINA EM UM NOVO MEDICAMENTO
ANTI-HISTAMÍNICO
Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Química Industrial da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para a obtenção do Grau de Bacharel em Química Industrial.
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Flávia Ferreira de Carvalho Marques – Orientadora IQ-UFF
Prof. MSc. Marcos Martins Gouvêa – Coorientador IQ - UFF
Profa. Dra. Roberta Amorim de Assis IQ - UFF
Prof. Dra. Raquel Andrade Donagemma IQ-UFF
Niterói 2019
5 “Viver é a coisa mais rara do mundo. A maioria das pessoas apenas existe.” (Oscar Wilde)
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Agradecimentos
Agradeço sempre aos meus pais, Ana Maria e Edson pela paciência, incentivo e o total apoio em todas as minhas escolhas. Por nunca me deixarem desistir e sempre estarem comigo durante as etapas mais difíceis e desafiadoras.
As minhas irmãs Aretha, por ser alguém em quem me espelhar para disciplina, busca de conhecimento e seriedade na busca dos meus ideais; Isabella, por me mostrar que não é preciso seguir a regra a qual nos é colocada para ser feliz e sempre ser alguém com quem posso desabafar, brigar e a rir com nossas piadas internas.
Agradeço também as minhas amigas Julianna Pinho, Isabela Abreu e Olivia Moreira por terem estado comigo durante essa jornada sempre me auxiliando e lembrando que não estou sozinha nesse mundo.
A IC Thais que me deu tanto suporte durante a elaboração dessa monografia.
A todos os professores do Instituto de Química, como Eluzir Chacon, Méri Vieira, Annibal Duarte e Odivaldo Cambraia, que serviram além de educadores como inspiração para que sempre busque o meu melhor na minha carreira.
A minha orientadora, professora Flávia Marques, por ter embarcado nesta jornada comigo, pela atenção, ajuda e por seu comprometimento que foi capaz de marcar tão decisivamente meus últimos passos da graduação.
Ao meu coorientador Marcos pela paciência, atenção, envolvimento e auxílio prestado nesse projeto. Eu não teria conseguido sem você.
Ao Laboratório Multiusuário de RMN da UFF (LaReMN) pela análise realizada com qualidade e cuidado, ao Laboratório Universitário Rodolpho Albino (LURA) por ceder gentilmente os padrões que necessitei para a realização deste trabalho. Também agradeço ao Laboratório de Espectroanalítica Aplicada (LESPA) por possibilitar o uso do equipamento fluorímetro.
Por fim gostaria de agradecer a banca examinadora, professoras Raquel, Roberta e Aída por participar da minha defesa.
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Resumo
O uso de novos fármacos é, ocasionalmente, visto com desconfiança pelo público leigo, mesmo com a certificação dos órgãos de controle, como a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Dentre eles, destaca-se o Alekto® da empresa Tekada, cujo princípio ativo é a bilastina e tem como objetivo o tratamento de rinite alérgica e urticárias. Considerando os dados do estudo da AILA (Allergies in Latin America), cerca de 30% da população brasileira tem rinite alérgica na infância e até 80% dos asmáticos têm chances de desenvolvê-la, enquanto 25% sofrem com urticária. Sua incidência torna importante a comercialização deste medicamento, que, de acordo com a bula, não reage com álcool e nem causa sonolência. Como foi aprovado no início de 2018 para uso no Brasil, ainda existem poucos registros na literatura de metodologias analíticas descritas para o controle da qualidade. Portanto, este trabalho teve como objetivo desenvolver um método analítico baseado na espectrofluorimetria para a determinação de bilastina no medicamento e contribuir para a indústria farmacêutica. A otimização das condições analíticas desenvolvidas neste trabalho consistiu em: (i) estudo das características fluorescentes da molécula de bilastina em diferentes condições; e (ii) validação do método analítico proposto de acordo com as normas vigentes. A molécula possui alta capacidade quântica fluorescente e as condições finais otimizadas para sua determinação foram: solução de bilastina preparada em água ultrapura:etanol 70:30 %v/v (sem a necessidade de ajuste de pH); medidas de fluorescência feitas nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 250 e 295 nm, respectivamente. A faixa linear se estendeu de 1,0 a 20 mg L-1, com limite de quantificação de 0,001 mg L-1 e exatidão de 104 + 2,1% (obtida através de ensaios de recuperação). O tratamento da amostra consistiu em macerar os comprimidos de cada lote, adicionar etanol e, a seguir, manter em um banho de ultrassom por 10 min (processo foi repetido mais 2 vezes para cada amostra) e filtrar com papel de filtro qualitativo. Alíquotas das concentrações desejas eram então transferidas para um balão volumétrico de 5 mL e avolumadas com a solução água ultrapura:etanol 70:30 %v/v. O método foi aplicado com sucesso na quantificação de bilastina em 5 diferentes lotes do medicamento, confirmando em todos, o teor informado pelo fabricante. Enfim, o trabalho resultou em um método simples, robusto e de baixo custo, tornando-o uma excelente alternativa para a determinação do princípio ativo bilastina em amostras de medicamentos.
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Abstract
The use of new medicines is occasionally viewed with suspicion by the more lay public, even with the certification of the control bodies such as the National Health Surveillance Agency (ANVISA). Among them, we highlight the Alekto® from Tekada company, whose active ingredient is bilastine and aims to treat allergic rhinitis and urticaria. Considering the data from AILA study (Allergies in Latin America), about 30% of the Brazilian population has childhood allergic rhinitis and up to 80% of asthmatics are likely to develop it, while 25% suffer from urticaria. Its incidence makes it important to commercialize this drug, which, according to its lable, does not react with alcohol or cause drowsiness. As approved in early 2018 for use in Brazil, there are still few records in the literature of analytical methodologies described for the quality control. Therefore, this work aimed to develop an analytical method based on spectrfluorimetry for the determination of bilastine in the drug and to contribute to the pharmaceutical industry. The optimization of the analytical conditions developed in this work consisted of: (i) study of the fluorescent characteristics of the bilastine molecule under different conditions; (ii) validation of the proposed analytical method in accordance with current standards. The molecule has high fluorescent quantum capacity and the final conditions optimized for its determination were: bilastine solution prepared in ultrapure water:ethanol 70:30 %v/v (without the need for pH adjustment); fluorescence measurements made at the excitation and emission wavelengths of 250 and 295 nm, respective. The linear range extended from 1,0 at 20 mg L-1 with a limit of quantification of 0,001 mg L-1 and an accuracy of 104 + 2,1% (obtained through recovery assays). Sample treatment consisted of macerating the tablets from each batch, adding ethanol and then maintaining in an ultrasonic bath for 10 min (process was repeated 2 more times for each sample) and filtering with qualitative filter paper. Aliquots of the desired concentrations were then transferred to a 5 mL volumetric flask and completed with 70:30 %v/v ultrapure water:ethanol solution. The method was successfully applied to quantify bilastine in 5 different batches of the drug, confirming in all the content informed by the manufacturer. Finally, the work resulted in a simple, robust and low cost method, making it an excellent alternative for the determination of bilastina active ingredient in drug samples.
9 Sumário
1. INTRODUÇÃO ... 16
1.1 Rinite Alérgica e Urticária ...16
1.2 Bilastina ...16 1.3 Método analítico ...18 2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS ... 20 2.1 Objetivos ...20 2.2 Justificativa ...20 3. FLUORIMETRIA ... 21
4. MATERIAIS, REAGENTES, INTRUMENTAÇÃO E MÉTODOS ... 25
4.1 Materiais e Reagentes ...25
4.2 Medidas espectrofluorimétricas...25
4.3 Amostras ...26
4.4 Obtenção do padrão analítico de bilastina ...26
4.5 Preparo de soluções estoque e pH ...27
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 29
5.1 Obtenção do padrão de bilastina ...29
5.2 Estudo dos comprimentos de onda máximo de excitação e emissãofluorescente para a bilastina ...31
5.3 Análise de interferentes no medicamento ...32
5.4 Estudos de estabilidade ...33
5.5 Estudo da influência dos solventes no sinal fluorescente da bilastina ...35
5.6 Estudo da influência do pH ...36
5.7 Estudo da influência da polaridade do meio ...38
5.8 Estudo de estabilidade em etanol...39
5.9 Condições finais estabelecidas ...40
10 5.11 Aplicação do método analítico ...49
6. CONCLUSÃO ... 52 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 53
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura molecular da bilastina. ... 17 Figura 2: Diagrama dos orbitais no estado fundamental e nos estados excitados singleto e tripleto de uma molécula12. ... 22 Figura 3: Diagrama simplificado de Jablonski. ... 22 Figura 4: Diagrama simplificado das etapas do processo de extração do princípio ativo bilastina do medicamento. ... 26 Figura 5: (A) Espectro de RMN da bilastina extraída a partir da amostra comercial do medicamento; (B) Espectro de RMN da bilastina disponível na literatura [19]. ... 30 Figura 6: Espectros de excitação e emissão fluorescente de solução metanólica de bilastina , sendo (a) padrão 10 mg L-1; (b) solução preparada com o comprimido 5 mg L-1. Condições: caminho óptico caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de 1200 nm s-1. ... 32 Figura 7: Espectros de excitação e emissão fluorescente de (a) solução metanólica de bilastina 10 mg L-1 e de soluções 20 mg L-1 dos excipientes (b) celulose, (c) estearato de magnésio, (d) amidoglicolato de sódio e (e) dióxido de silício presentes no comprimido Alektos® de acordo com a bula de medicamento. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1. ... 33 Figura 8: Espectros de excitação e emissão para o estudo de controle de degradação de solução metanólica de bilastina 10 mg L-1, nas condições: (a) dentro da geladeira em frasco incolor; (b) dentro da geladeira em frasco âmbar; (c) fora da geladeira em frasco âmbar; (d) fora da geladeira em frasco incolor. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1. ... 34 Figura 9: Espectros de excitação e emissão de solução metanólica de bilastina 10 mg L-1 onde: (a) tempo zero; (b) 7 dias após o preparo; (c) 14 dias após o preparo. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1; conservação em frasco incolor mantido em geladeira. ... 35 Figura 10: Espectros de excitação e emissão fluorescente de bilastina 10 mg L-1 nos solventes (a) etanol; (b) metanol e (c) acetonitrila. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1. ... 36 Figura 11: Influência da variação do pH na intensidade do sinal fluorescente da bilastina 10 mg L-1 preparada nos solventes: (a) etanol, (b) metanol e (c) acetronitrila na proporção 50:50
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%v/v. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1, exc/em = 250/295 nm ... 37 Figura 12: Influência da polaridade do meio na intensidade do sinal fluorescente de soluções de bilastina 10 mol L-1 preparada nos solventes etanol (a), metanol (b) e acetonitrila (c) em diferentes proporções de água ultrapura. Condições: caminho óptico de 1 cm, banda espectral de passagem 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s -1; exc/em = 250/295 nm. ... 38 Figura 13: Estudo da influência da polaridade do meio na intensidade do sinal fluorescente de soluções de bilastina 10 mol L-1 preparada em diferentes proporções água ultrapura:etanol. Condições: caminho óptico de 1 cm, banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1, exc/em = 250/295 nm. ... 39 Figura 14: Estudo do controle de degradação de solução de bilastina 10 mg L-1 preparada em água ultrapura:etanol 70:30 %v/v, no qual: (a) tempo zero; (b) 7 dias após o preparo; (c) 14 dias após o preparo. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem 2,5 nm; velocidade de varredura:1200 nm s-1; λexc/em: 250/295 nm; conservação em frasco incolor mantido em geladeira. ... 40 Figura 15: Estudo da faixa linear de resposta da bilastina em água ultrapura:etanol 70:30 %v/v. Curva construída com valores médios de emissão fluorescente da bilastina. Condições conforme Tabela 2. ... 42 Figura 16: Curva analítica para emissão fluorescente da bilastina com valores de concentração entre 0,01 e 1 mg L-1 nas condições estabelecidas na Tabela 2, sendo: (a) banda espectral de passagem de 5 nm e (b) banda espectral de passagem de 2,5 nm. ... 43 Figura 17: Curva analítica para faixa de concentração de 0,01 a 20 mg L-1 gerada utilizando o fator de 5,30, obtido com as concentrações de 0,01 a 1 mg L-1 analisadas nas bandas de passagem de 2,5 e 5,0 nm. Condições experimentais da Tabela 2. ... 44 Figura 18: Curva analítica construída a partir dos espectros de emissão fluorescente de bilastina dos valores intermediários de concentrações na faixa de 0,01 a 1 mg L-1 no solvente água ultrapura:etanol 70:30 %v/v.Condições experimentais da Tabela 2 ... 45 Figura 19: Curva analítica de emissão fluorescente da bilastina no solvente água ultrapura:etanol 70:30 %v/v. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1, λexc/em: 250/295 nm. ... 45 Figura 20: Curva analítica construída através dos espectros de emissão de soluções de bilastina. Condições experimentais da Tabela 2. ... 46
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Figura 21: Espectros de excitação e emissão fluorescente de soluções de bilastina obtidas a partir das amostras do lote E nas concentrações: (a) 5 mg L-1; (b) 10 mg L-1; (c) 15 mg L-1; (d) 20 mg L-1. Condições conforme Tabela 2. ... 51
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Análise comparativa de diferentes técnicas usadas na determinação de bilastina .. 18 Tabela 2: Resumo das condições experimentais (analíticas e instrumentais) obtidas como resultado dos estudos para determinação da bilastina por espectrofluorimetria ... 41 Tabela 3: Resultados para os ensaios de recuperação. ... 47 Tabela 4: Valores de massa obtidas com extração em 100% etanol ou água ultrapura:etanol 70:30 %v/v ... 48 Tabela 5: Resumo dos parâmetros analíticos de mérito calculados para o método espectrofluorimétrico desenvolvido ... 49 Tabela 6: Resultados dos valores de intensidade de fluorescência obtidos pelas amostras de comprimidos de bilastina ... 50
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LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária ESP+ - Electrospray Ionization Interphase
F.M – Fase Móvel
HILIC – Cromatografia Líquida com Interação Hidrofílica, do inglês Hydrophilic Interaction
Chromatography
HPLC-FLUO/MS – Cromatografia LÍquida de Alta Eficiência, do inglês High Performance
Liquid Chromatography with Fluorescence-Mass Detection
M/Z – Razão massa/ carga, do ingles mass to charge ratio OMS – Organização Mundial da Saúde
SBD – Sociedade Brasileira de Dermatologia U.A. – Unidades arbitrárias
λem – Comprimento de onda de emissão (nm)
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1. INTRODUÇÃO
1.1 Rinite Alérgica e Urticária
Rinite alérgica é uma reação inflamatória na cavidade nasal em resultado da ação de um alérgeno, que atinge, aproximadamente, 25 a 30% da população brasileira na infância [1]. Tanto a urticária quanto a rinite são comuns, com cerca de 10-30% da população sendo atingida pela rinite alérgica e pelo menos 20% sofrendo com a urticária [2].
Os sintomas mais comuns da rinite alérgica incluem os espirros, congestão nasal, coriza, coceira, tosse, entre outros, que podem afetar diretamente a qualidade de vida do indivíduo [1].
A chegada das estações mais úmidas (primavera e verão) resulta em um aumento no número de alergênicos no ar e, consequentemente, no crescimento dos casos registrados de rinite alérgica em adultos e crianças. Este quadro representa a rinite alérgica sazonal, causada muitas vezes pelos alérgenos vegetais (pólen de árvores, gramíneas e ervas daninhas), além de também poder ser provocada por esporos transportados pelo ar [4].
A urticária, por sua vez, apresenta-se como uma irritação da pele marcada por lesões avermelhadas e levemente inchadas [5]. Pode ocorrer em qualquer idade, sendo mais comum em jovens e adultos entre 20 e 40 anos. De acordo com a Sociedade Brasileira de Dermatologia (SBD), uma em cada cinco pessoas desenvolverá, pelo menos, um episódio de urticária ao longo da vida [5].
Um estudo realizado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) mostra que, basicamente, todo ser humano é propenso a ter uma alergia a algo presente no ar, independente do que seja (poeira, fumaça etc.) [3].
1.2 Bilastina
Como uma alternativa para o tratamento dos males citados na Seção 1.1, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) aprovou, em maio de 2018, um novo fármaco do grupo Alekto®, com registro e comercialização exclusivos no Brasil pela indústria Takeda [6]. O princípio ativo é a molécula de bilastina (Figura 1), com nomenclatura química oficial de 2- [4- [2- [4- 1- (2-etoxietil benzimidazol – 2 - il] piperidin-1- il] etil] fenil] – 2 – ácido metilpropanoico), fórmula química C28H37N3O3 e massa molar 463,61 g mol-1 [7]. A molécula apresenta estrutura química parecida com o piperidinil-benzimidazol, podendo
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assim ser incluída no mesmo grupo químico de vários anti-histamínicos atualmente presentes no mercado. Apresenta baixa solubilidade em água (0,160 mg L-1 a 25 ºC), ponto de fusão de 332,6 ºC e ponto de ebulição de 639,1 ºC à pressão atmosférica [8].
Figura 1: Estrutura molecular da bilastina.
A bilastina é altamente seletiva para a inibição de receptores periféricos H1 da histamina. O fármaco apresenta alto poder anti-histamínico e é classificado como um representante de segunda geração. A administração é feita por via oral, não há interação com álcool ou outros medicamentos e não apresenta a sedação como efeito adverso, ao contrário da maioria dos fármacos desta classe. Além disso, não é metabolizado pelo fígado, permitindo seu uso por pacientes hepáticos, e não causa alterações cardíacas [9]. Foram observados alguns efeitos adversos, como dores de cabeça e sonolência (casos raros). Seu uso é contraindicado em associação com alimentos ou sumos de frutas, já que foi observada uma queda no efeito da bilastina [9].
De acordo com a bula, a dose recomendada é de 1 comprimido de 20 mg por dia, devendo ser protegido da luz e umidade. Seus excipientes são a celulose microcristalina, amidoglicolato de sódio, dióxido de silício e estearato de magnésio [9].
Com preço mais acessível do que os fármacos semelhantes no mercado, foi desenvolvido pela FAES FARMA na Espanha e é distribuído no Brasil pela empresa Takeda [1].
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1.3 Método analítico
A indústria farmacêutica está constantemente lançando novos fármacos para o combate dos males que afligem a sociedade. Com esses lançamentos, surge uma necessidade de métodos capazes de verificar se o produto chega ao consumidor de acordo com as características descritas nas bulas.
A Tabela 1 retrata um comparativo dentre alguns estudos já publicados para a determinação de bilastina e descreve as principais condições analíticas dos métodos.
Tabela 1: Análise comparativa de diferentes técnicas usadas na determinação de bilastina
TÉCNICA CARACTERÍSTICAS REFERÊNCIA
HPLC-Fluo Coluna: C8 F.M: acetonitrila/NaH2PO4 0,02 mol L-1 pH: 7 ou 10 λexc/emc = 250/310nm LD: 0,01 µg g-1 LUCERO E ORJALES (2001) [7] HILIC-UV
Coluna: LUNA® de HILIC 100 mm X 4,6 mm; Partícula: 5 µm; F.M: acetonitrila/MeOH/acetato de amônio pH: 5,3 Fluxo: 1 mL min-1 λ = 275 nm TERZIC et al. (2016) [10] HPLC-Fluo/MS Coluna: C16; 100 mm X 4,6 mm; Partícula: 5 µm Vazão: 1 mL min-1
F.M: acetato de amônio 10 mmol L-1 (pH 4,6/acetonitrila Eluição 80:20 isocrático) ESP+ m/z: 150 e 700 íon selecionado: 464 m/z LUCERO et al. (2012) [11]
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Como pode ser visto na Tabela 1, não há na literatura métodos analíticos como a espectrofluorimetria, que com sua simplicidade e baixo custo poderia contribuir como uma alternativa para o controle de qualidade do medicamento e determinação dos fármacos em diferentes matrizes.
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2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS 2.1 Objetivos
2.1.1 Objetivo geral
Desenvolver e validar metodologia analítica baseada na espectrofluometria a fim de determinar a bilastina no medicamento Alekto®, recém aprovado pela ANVISA, que é comercializado na forma de comprimidos.
2.1.2 Objetivos específicos
̵ Realizar estudos de preparo de amostras;
̵ Avaliar as propriedades fluorescentes do princípio ativo bilastina, buscando otimizar as condições experimentais (solvente, pH, polaridade, estabilidade, comprimentos de onda máximos) a fim de obter a condição ótima para o estudo do método analítico; ̵ Validar o método desenvolvido considerando os parâmetros: seletividade, faixa
linear, limites de detecção e quantificação, robustez, precisão e exatidão; ̵ Aplicar o método nas amostras comerciais de comprimidos.
2.2 Justificativa
O controle da qualidade é uma ferramenta extremamente necessária, principalmente quando se trata de fármacos. É necessária a existência de métodos analíticos que sejam capazes de quantificar rapidamente e sem altos custos para garantir a qualidade dos produtos disponíveis aos consumidores.
Com o intuito de desenvolver um método rápido, robusto, simples e de menor custo para o controle da qualidade de fármacos contendo o princípio ativo bilastina recentemente introduzido no mercado brasileiro, este trabalho se baseou na técnica analítica da espectrofluometria.
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3. FLUORIMETRIA
A fluorimetria é uma técnica fundamentada na fluorescência de espécies químicas, chamadas de luminóforos. Essas espécies podem se encontrar nos mais variados estados (sólidos, líquidos ou gasosos) em sistemas simples ou complexos [12].
Na fluorescência e fosforescência, fenômenos similares que podem ocorrer simultaneamente, o que se percebe é uma diferença no tempo de duração do efeito [12]. Na fosforescência, o intervalo de tempo entre a captação do fóton e a emissão da energia pode chegar a alguns segundos, enquanto na fluorescência a duração é consideravelmente menor, podendo ser da ordem de 10-5 até 10-10 segundos [12].
O processo de fluorescência ocorre quando uma molécula absorve radiação eletromagnética na região do visível e do ultravioleta, sem que ocorra uma mudança de spin eletrônico, e envolve a emissão de fótons de radiação para possibilitar o retorno ao estado fundamental. É importante salientar que a fluorescência raramente é resultado da absorção de radiação ultravioleta de λ menor que 250 nm [13].
Quando uma molécula absorve um fóton, ela é promovida para um estado de maior energia (estado excitado), de forma que os seus elétrons migram do estado fundamental singleto, designado de S0, a estados de maior energia (estados excitados singletos). Já na fosforescência, ocorre uma excitação que envolve a mudança de spin que, neste caso, ocorre nos estados excitados tripletos. A Figura 2 representa simplificadamente os orbitais envolvidos nessas excitações [14].
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Figura 2: Diagrama dos orbitais no estado fundamental e nos estados excitados singleto e tripleto de uma molécula12.
A Figura 3 representa, de maneira simplificada, o Diagrama de Jablonski demonstrando os estágios energéticos para uma molécula fotoluminescente e suas possíveis transições.
Figura 3: Diagrama simplificado de Jablonski.
A conversão interna, transição entre dois estados de mesma multiplicidade (singleto-singleto por exemplo), acontece quando a molécula vai para um estado eletrônico de menor energia sem emissão de radiação. Já o cruzamento intersistema, cuja probabilidade de ocorrer
ENERGIA S -2 S0 Fluorescência Absorção S1 Fosforescência T1 Cruzamento intersistema Conversão Interna
Singleto Singleto Tripleto Fundamental Excitado Excitado
ENERGIA A
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depende da proximidade entre os níveis energéticos vibracionais, acontece com a inversão do spin de um elétron excitado alterando a multiplicidade da molécula. O cruzamento intersistemas pode ser um caminho rápido o suficiente (entre 10-7 – 10-9 s) podendo ser preferível a outros caminhos de desexcitação. [12].
A técnica que estuda o fenômeno da fluorescência, a espectrofluometria, resulta nos espectros de emissão molecular a partir da absorção de radiação, gerando estados excitados [15]. A tradução destes sinais em resultados produz espectros com imagens de excitação e emissão que muitas vezes podem ser sobrepostos, pois em uma molécula a intensidade entre a excitação e a emissão não é, normalmente, diferente, sendo os espectros imagens espelhadas um do outro [15].
A fluorescência de uma molécula compreende a excitação eletrônica a partir da absorção da radiação em um comprimento de onda fixo, registrando a intensidade da emissão em função do comprimento de onda. Sobre o analito é incidida energia na forma de luz, resultando na excitação das moléculas em seu λ de absorção, também chamado de excitação, e em comprimentos de onda maiores (λ de fluorescência) ocorre a emissão radiativa.
A razão entre o número de moléculas luminescentes e o número total de moléculas excitadas fornece o Rendimento quântico (ϕ), que é determinado a partir das constantes de velocidades relativas kx para o processo pelo qual o estado excitado singleto é desativado.
Ao absorver um fóton com certa quantidade de energia, ocorre a transferência de um elétron π para um orbital não ocupado π* (estado singleto excitado π, π*). Quanto maior for a extensão do sistema de elétrons π, menor será a energia de transição π → π* e, assim, maior o comprimento de onda da banda de absorção em sistemas conjugados lineares e conjugados cíclicos. Quando a excitação é de um elétron não ligado para um orbital não ocupado, a transição de absorção molar menor é do tipo n → π* (estado excitado n, π*) [16].
Quando a substituição envolve um grupo carboxílico ou carbonílico, tem-se uma energia de transição n → π* menor que energia π → π*, resultando na queda do rendimento da fluorescência [16].
As variáveis que podem interferir no efeito incluem a baixa temperatura e a alta viscosidade, que reduzem o número das colisões entre as partículas e normalmente causam o aumento da fluorescência. A polaridade e o caráter prótico dos solventes também podem causar efeitos na intensidade da fluorescência [15].
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Compostos orgânicos aromáticos tendem a demonstrar valores intensos de fluorescência, resultado do alto número de elétrons deslocalizados sobre a superfície das moléculas. A eficiência quântica geralmente aumenta com o número de anéis e seu grau de condensação. A substituição por halogênios é impactante no decréscimo da fluorescência, pois, ao aumentar a massa molar do átomo substituído (efeito do átomo pesado), aumenta a possibilidade de um cruzamento intersistema, e, consequentemente, a chance de fosforescer é maior.
Outro fator, neste caso contribuindo para a fluorescência, é a rigidez molecular. Possibilita, inclusive, explicar o porquê certas moléculas quando complexadas apresentam aumento na fluorescência.
O pH deve ser rigorosamente controlado quando se trabalha com moléculas contendo grupos ácido-base, pois a intensidade de emissão e o comprimento de onda podem ser distintos em suas formas protonadas e desprotonadas, devido à alteração do comportamento do estado excitado [15].
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4. MATERIAIS, REAGENTES, INTRUMENTAÇÃO E MÉTODOS 4.1 Materiais e Reagentes
Para o preparo das soluções aquosas, foi utilizada água ultrapura (18,2 MΩ cm-1) obtida através do sistema de purificação Arium Comfort, da Sartorius, Alemanha. Etanol (Vetec, Brasil), metanol (J.T. Baker, EUA) e acetonitrila (J.T. Baker, EUA) foram utilizados para a otimização do método espectrofluorimétrico. Para o preparo do tampão Britton-Robinson, foram utilizados ácido bórico (Vetec, Brasil), ácido acético (Vetec, Brasil) e ácido fosfórico (Vetec, Brasil) e o ajuste do pH foi feito com uma solução de 0,1 mol L-1 de hidróxido de sódio (Merck, Brasil) em um pHmetro (DM-22, Digimed, Brasil). A extração do princípio ativo, no solvente metanol, foi realizada em banho de ultrassom em Lavadora Ultra-Sônica Unique e o solvente foi evaporado à secura em um rotaevaporador (Biovera, UMA TB digital) com bomba Edwarcs.
Balões volumétricos, micropipetas automáticas e béqueres de vidro foram utilizados para o preparo das soluções. Balança analítica (AND GR-202) foi utilizada para pesagem do padrão e amostras.
4.2 Medidas espectrofluorimétricas
As amostras foram analisadas em espectrofluorímetro VARIAN, modelo Cary Eclipse, com uma lâmpada pulsátil do tipo descarga de xenônio com 80 Hz e 12 W, banda espectral de passagem que pode variar de 2,5 a 20 nm e velocidade de varredura de 0,01 a 2400 nm s-1. O equipamento apresenta detector do tipo fotomultiplicador PMT R928, com uma sensibilidade de resposta à radiação até 900 nm. Os dados e o controle do equipamento são feitos pelo sistema operacional com o sofware SWEclipse® Bio Pack V 1.1 (XP WINDOWS 2000).
As medidas foram realizadas utilizando cubetas de quartzo com caminho óptico de 1 cm de comprimento e bandas espectrais de passagem de 2,5 e 5,0 nm, com velocidade de varredura de 1200 nm s-1. Os comprimentos de onda de excitação (λexc) e emissão (λem) máximos nos quais foram realizadas as medidas foram 250 e 295 nm, respectivamente.
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4.3 Amostras
Para a realização deste trabalho, foi adquirido o medicamento Alektos®, com o princípio ativo bilastina, produzido pela empresa Tekada, disponível no mercado brasileiro desde o primeiro trimestre do ano de 2018. O medicamento, que não necessita de prescrição médica, foi comprado em farmácias nas cidades de Niterói e Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
4.4 Obtenção do padrão analítico de bilastina
O padrão analítico da bilastina ainda não está disponível comercialmente no Brasil, de forma que foi necessário obtê-lo a partir da extração do próprio medicamento, conforme mostra o diagrama da Figura 4.
Figura 4: Diagrama simplificado das etapas do processo de extração do princípio ativo bilastina do medicamento.
Para o processo de extração, realizado de acordo com as recomendações da Farmacopeia Brasileira, 10 comprimidos foram finamente triturados com gral e pistilo. O sólido foi transferido para um balão volumétrico de 50,0 mL com metanol e colocado em banho de ultrassom por 10 min. O sobrenadante foi filtrado e o sólido remanescente foi novamente levado para o banho por mais duas vezes. Ao final do processo as soluções foram transferidas para um balão de rotaevaporador e foi realizada a evaporação do solvente. Este processo resultou em 0,080 g de um sólido branco muito fino mantido em sílica sem a presença de luz. Sólido branco 1,23 g 40 mL MeOH Ultrassom 10 min Avolumar Filtrar sobrenadante em um béquer Repetir 2 vezes
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Para comprovar que se tratava do princípio ativo bilastina, foi realizada sua caracterização pela técnica de RMN, a qual foi feita no Laboratório de Multiusuário de Ressonância Magnética da UFF (LaReMN).
4.5 Preparo de soluções estoque e pH
Para obtenção dos espectros de excitação e emissão da bilastina, soluções estoque 100 mg L-1 foram preparadas a partir de 5 mg do padrão a cada 7 dias, em razão da sua estabilidade. Foram feitas diluições em etanol para o preparo das curvas analíticas.
A otimização do método espectrofluométrico foi realizada com uma solução padrão de bilastina 10 mg L-1, preparada a partir da diluição de solução estoque 100 mg L-1 nos solventes etanol, metanol e acetonitrila, além do tampão Britton-Robinson em diferentes valores de pH.
O tampão Britton-Robinson foi preparado pela mistura (em partes iguais) das soluções dos ácidos bórico, acético e fosfórico em concentrações iguais a 0,04 mol L-1. Soluções de NaOH 0,1 mol L-1 foram utilizadas para o ajuste do pH das soluções tamponadas nos valores desejados.
De modo a avaliar o método de preparo das amostras, partindo do medicamento triturado, foi preparada uma solução em metanol. Considerando a informação na bula do medicamento, na qual é relatado que cada comprimido apresenta 20 mg de bilastina, 1 comprimido foi triturado e uma massa de 0,12 g foi pesada. Esta massa então foi transferida para um balão volumétrico de 25,0 mL com cerca de 10,0 mL de metanol. A solução então foi mantida em um banho de ultrassom por 10 min. Ao final deste tempo o balão volumétrico teve seu volume completado. A solução foi homogeneizada e filtrada por um papel de filtro qualitativo em um frasco âmbar.
Para o estudo de recuperação realizou-se um novo processo de extração. O comprimido foi triturado e pesou-se a massa correspondente a 10 mg de bilastina (0,062 g) que foi transferida para um balão volumétrico de 10,0 mL com etanol. Essa solução foi para o banho de ultrassom por 10 min. Após esse tempo o balão foi avolumado e homogeneizado. O sobrenadante foi filtrado em um papel de filtro qualitativo e uma alíquota de 50 µL foi transferida para um balão volumétrico de 5,0 mL avolumado com etanol. O sólido remanescente teve o processo repetido mais duas vezes.
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Soluções em metanol de dióxido de silício, celulose, amidoglicolato de sódio e estearato de magnésio foram preparadas a partir de seus sólidos obtidos no Laboratório Universitário Rodolpho Albino (LURA) da Universidade Federal Fluminense. Para o preparo das soluções com concentração de 20 mgL-1, uma massa de 1 mg de cada sólido foi pesada e transferida para balões volumétricos de 50,0 mL com metanol. Após 10 min no banho de ultrassom, as soluções foram filtradas e medidas no espectrofluorímetro.
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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Estudos de otimização, considerando variáveis, como solvente e pH, foram realizados a fim de correlacionar o sinal fluorescente a esses fatores, com a obtenção do maior grau de seletividade e sensibilidade do método.
Para a realização dos primeiros estudos foram preparadas soluções em metanol devido à boa solubilidade que a bilastina apresenta neste solvente.
5.1 Obtenção do padrão de bilastina
Conforme mencionado na Seção 4.4, não foi possível a compra do padrão analítico de bilastina por sua indisponibilidade no mercado brasileiro. Portanto, foi desenvolvido um método para extração do princípio ativo a partir dos comprimidos do medicamento comercial Aletkos®, como descrito na Seção 4.5.
O espectro obtido do produto de extração está representado na Figura 5, bem como o obtido na literatura [19]. Pode-se verificar a similaridade entre os sinais de ambos os espectros, evidenciando que a substância extraída se trata realmente da bilastina.
Com esse resultado, pôde-se prosseguir com os testes considerando o sólido extraído como um padrão de bilastina.
30
Figura 5: (A) Espectro de RMN da bilastina extraída a partir da amostra comercial do medicamento; (B) Espectro de RMN da bilastina disponível na literatura [19].
(A)
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5.2 Estudo dos comprimentos de onda máximo de excitação e emissãofluorescente para a bilastina
Foi realizada uma varredura com a solução padrão de bilastina em metanol preparada com o princípio ativo extraído do medicamento (padrão) de modo a identificar no espectrofluorímetro quais os máximos de excitação e emissão da molécula. O par de comprimentos de onda máximos nas condições estudadas foi λexc/em = 250/295 nm (Figura 6-a), valores próximos aos descritos por LUCERO e colaboradores (2001) com análises por HPLC [7].
A verificação dos λexc/em também foi feita partindo de um comprimido triturado e transferido para um balão volumétrico de 25,0 mL com metanol. A solução foi posta em banho de ultrassom e filtrada. Ao realizar a análise por espectrofluorimetria, o sinal obtido apresentou os mesmos valores de comprimento de onda de excitação e emissão do que o obtido pelo princípio ativo. O espectro pode ser visto na Figura 6-b.
Na Figura 6 o espectro “a” representa o espectro da solução preparada com o padrão e “b” a resposta obtida pela solução preparada diretamente com o comprimido. Nota-se que ambos apresentam as bandas correspondentes à bilastina nos mesmos comprimentos de onda, apesar da diferença esperada entre a intensidade das bandas, pois o espectro “b” foi inicialmente preparado em uma concentração mais baixa para verificar o comportamento da bilastina na faixa estabelecida de comprimento de onda. Já o espectro “a”, tendo certeza dos comprimentos de onda de emissão e excitação foi preparada em 10 mg L-1 Assim, juntamente com a resposta de RMN, foi comprovado mais uma vez que o sólido obtido na extração do princípio ativo pode ser utilizado como padrão para o preparo das soluções.
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Figura 6: Espectros de excitação e emissão fluorescente de solução metanólica de bilastina , sendo (a) padrão 10,0 mg L-1; (b) solução preparada com o comprimido 5,0 mg L-1. Condições: caminho óptico caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de 1200 nm s-1.
5.3 Análise de interferentes no medicamento
Em posse dos valores de λ de emissão e excitação obtidos a partir do padrão, foram estudados quais os excipientes fazem parte da composição do medicamento, de modo a verificar a existência de possíveis interferentes. De acordo com a bula estão presentes como excipientes as seguintes substâncias: celulose, estearato de magnésio, amidoglicolato de sódio e carboximetilcelulose. Soluções metanólicas destes excipientes foram preparadas na concentração 20,0 mg L-1 a qual era maior que a discriminada na bula para garantir um excesso dos excipientes na solução.
Como é possível observar na Figura 7, nenhum dos excipientes apresentou sinal fluorescente nos comprimentos de onda máximos da bilastina. Estes resultados permitiram concluir que qualquer sinal fluorescente obtido provinha exclusivamente da molécula de bilastina. 0 50 100 150 200 250 300 350 200 250 300 350 400 In te n s id a d e d e s in a l fl u o re s c e n te ( u .a .) Comprimento de onda (nm) (a) (b)
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Figura 7: Espectros de excitação e emissão fluorescente de (a) solução metanólica de bilastina 10 mg L-1 e de soluções 20 mg L-1 dos excipientes (b) celulose, (c) estearato de magnésio, (d) amidoglicolato de sódio e (e) dióxido de silício presentes no comprimido Alektos® de acordo com a bula de medicamento. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1.
5.4 Estudos de estabilidade
Com a finalidade de se verificar o tempo em que uma solução de bilastina poderia ser armazenada sem que houvesse degradação, ensaios de estabilidade foram realizados considerando duas variáveis: temperatura e incidência de luz.
Uma solução de concentração 10 mg L-1 em metanol foi preparada e dividida em quatro frascos de vidro e com tampa: dois âmbares e dois incolores. Um de cada foi guardado na geladeira e os dois restantes foram mantidos fora da geladeira, ou seja, em temperatura ambiente e sob incidência da luz. Ao final de duas semanas, verificou-se que a solução mantida na geladeira no frasco incolor apresentava melhor estabilidade. Na Figura 8 estão representadas as respostas apresentadas por cada solução sete dias após o preparo. O que se nota é que, apesar de não haver diferenças entre o comportamento das soluções, quando estas eram mantidas em frascos incolores na geladeira (na Figura representada por “a” e “c”) ocorriam as menores variações em termos de intensidade de sinal e deslocamento das bandas e, quando mantidas fora da geladeira em frascos incolores, maior era essa variação.
0 50 100 150 200 250 300 350 200 250 300 350 400 In te ns ida de de f lu or es cê nc ia (u .a .) Comprimento de onda (nm) (a) (b), (c), (d), (e)
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Figura 8: Espectros de excitação e emissão para o estudo de controle de degradação de solução metanólica de bilastina 10 mg L-1, nas condições: (a) dentro da geladeira em frasco incolor; (b) dentro da geladeira em frasco âmbar; (c) fora da geladeira em frasco âmbar; (d) fora da geladeira em frasco incolor. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1.
Com base nos resultados anteriores pode-se concluir que, desde que mantida sob refrigeração, o tipo de frasco exerce pouca influência na degradação da solução. Assim, devido a uma maior disponibilidade, frascos de vidro incolores foram utilizados para guardar as soluções estoque.
De modo a verificar o tempo máximo que a solução poderia ser mantida, um novo estudo foi realizado. A solução foi preparada e os espectros realizados nos tempos 0, 7 e 14 dias para observar a partir de quando o sinal começaria a sofrer alterações. Percebeu-se que no início da terceira semana aconteciam quedas no sinal, além de deslocamentos nas bandas de emissão e excitação. A Figura 9 mostra a tendência de perda de estabilidade. Pôde-se observar que em 7 dias após o preparo da solução acontecem deslocamentos nas bandas espectrais, e em 14 dias ocorrem mudanças no formato da banda, além de uma maior queda em sua intensidade. Com estes resultados, um tempo máximo de 7 dias foi estabelecido para guardar a solução. 0 70 140 210 280 350 200 250 300 350 400 In te s id a d e d e s in a l fl u o re s c e n te ( u .a ) Comprimento de onda (nm) (a), (b), (c) (d)
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Figura 9: Espectros de excitação e emissão de solução metanólica de bilastina 10 mg L-1 onde: (a) tempo zero; (b) 7 dias após o preparo; (c) 14 dias após o preparo. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1; conservação em frasco incolor mantido em geladeira.
5.5 Estudo da influência dos solventes no sinal fluorescente da bilastina
Conforme já mencionado, as características dos solventes, como polaridade, viscosidade e seu caráter prótico, podem afetar diretamente a capacidade luminescente de um analito, estabilizando-o em seu estado excitado, favorecendo a fluorescência. Neste trabalho, os seguintes solventes foram estudados: metanol, etanol e acetonitrila. Conforme pode ser visto na Figura 10, tanto com o metanol quanto com o etanol como solventes, os valores de fluorescência foram muito similares, enquanto que com a acetonitrila o sinal foi ligeiramente mais baixo. 0 50 100 150 200 250 300 200 250 300 350 400 In te ns ida de de s in al flu or es ce nt e (u .a ) Comprimento de onda (nm) (a) (b) (c)
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Figura 10: Espectros de excitação e emissão fluorescente de bilastina 10 mg L-1 nos solventes (a) etanol; (b) metanol e (c) acetonitrila. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1.
A partir desses resultados, foi possível confirmar a possibilidade de utilizar tanto o metanol quanto o etanol como solvente orgânico preferencial. No entanto, os outros experimentos descritos a seguir ainda foram realizados com todos os solventes estudados de modo a verificar a influência na sensibilidade e, por fim, escolher o mais adequado para as determinações.
5.6 Estudo da influência do pH
As alterações de pH nas soluções são responsáveis pelas diferenças nas propriedades luminescentes de uma molécula. A presença de carga na estrutura pode levar a uma maior luminescência devido a maior rigidez molecular.
Para iniciar o estudo, o pH original de soluções 50 %v/v aquosas de bilastina 10 mol L-1 nos três solventes estudados foi medido, e os seguintes resultados obtidos: (i) em metanol: 7,42; (ii) em etanol: 8,03; (iii) em acetonitrila: 7,53.
O estudo da influência do pH foi, portanto, realizado em soluções do tampão Britton-Robinson, na faixa de pH compreendida entre 3,0 e 13,0 medido nos comprimentos de onda de excitação e emissão 250/295 nm, respectivamente. Foi estabelecida a proporção 50:50
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 200 250 300 350 400 In te n s id a d e d e s in a l fl u o re s c e n te ( u .a .) Comprimento de onda (nm) (a) (b) (c)
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%v/v para solvente orgânico e solução tampão para que a polaridade total da solução não fosse alterada ao longo da faixa de pH estudada.
Na Figura 11, pode ser visto o sinal fluorescente líquido obtido para cada valor de pH, sinalizando que a intensidade do sinal da fluorescência da bilastina é ligeiramente alterado com a variação do pH. Além disso, a Figura 11 também mostra que o solvente etanol proporciona maior intensidade de sinal para a bilastina. Sendo assim, soluções de bilastina preparadas em etanol sem a necessidade de ajuste de pH, ou seja, usando o pH original da solução 100 % etanólica, foi a condição escolhida para prosseguir com os estudos. Com isto, não houve a necessidade de incluir mais uma variável no método, que seria o preparo de solução tampão e o controle do pH. Vale ressaltar que este resultado demonstra também uma alta robustez para o método.
Figura 11: Influência da variação do pH na intensidade do sinal fluorescente da bilastina 10 mg L-1 preparada nos solventes: (a) etanol, (b) metanol e (c) acetronitrila na proporção 50:50 %v/v. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1, exc/em = 250/295 nm
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 In te ns ida de de f lu or es cê nc ia (u .a ) pH (b) (c) (a)
38
5.7 Estudo da influência da polaridade do meio
Com o intuito de buscar uma maneira de usar menos solvente orgânico, tornando o método mais limpo e mais econômico, foi realizado também o estudo da influência da proporção água ultrapura:solvente no sinal fluorescente da bilastina.
Apesar de o estudo descrito na Seção 5.6 indicar o etanol como melhor solvente, para fins de resultados mais completos, este estudo foi realizado também com o metanol e a acetonitrila.
A Figura 12 mostra que o etanol continua sendo o melhor solvente orgânico para prosseguir com os estudos e que a proporção de água não afetou significativamente a intensidade do sinal fluorescente neste caso.
Figura 12: Influência da polaridade do meio na intensidade do sinal fluorescente de soluções de bilastina 10 mol L-1 preparada nos solventes etanol (a), metanol (b) e acetonitrila (c) em diferentes proporções de água ultrapura. Condições: caminho óptico de 1 cm, banda espectral de passagem 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s -1;
exc/em = 250/295 nm.
Sendo assim, um estudo mais detalhado da proporção água ultrapura:etanol foi realizado, conforme mostra a Figura 13.
0 200 400 600 800 1000 1200 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 In te n s id a d e d e f lu o re s c ê n c ia ( u .a )
Proporção de solvente orgânico (% v/v)
a (b) (c) (a)
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Figura 13: Estudo da influência da polaridade do meio na intensidade do sinal fluorescente de soluções de bilastina 10 mol L-1 preparada em diferentes proporções água ultrapura:etanol. Condições: caminho óptico de 1 cm, banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1,
exc/em = 250/295 nm.
Mais uma vez, foi evidenciado um comportamento bastante linear em toda a extensão da proporção água ultrapura:etanol estudada. Assim, a proporção água água ultrapura:etanol 70:30 %v/v foi selecionada para se garantir a total solubilização e por facilitar o preparo das soluções.
5.8 Estudo de estabilidade em etanol
Inicialmente, seguindo as informações disponíveis na literatura, na qual a bilastina é solúvel em metanol, o estudo de estabilidade foi feito em um solvente diferente daquele definido pelo método. Assim, um novo estudo de estabilidade foi realizado, na proporção água ultrapura:etanol estabelecida. A solução foi mantida em geladeira em frasco de vidro transparente.
A Figura 14 demonstra o comportamento da solução de bilastina 10 mg L-1 água ultrapura:etanol 70:30 %v/v durante 14 dias. É possível perceber que, neste solvente, a solução quase não sofre alterações entre o tempo zero (a) e 7 dias (b). Contudo, após 14 dias há uma queda significativa na intensidade de fluorescência e uma pequena alteração em sua
0 100 200 300 400 500 600 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 In te ns ida de de s in al flu or es ce nt e (u .a ) Proporção de etanol (v/v%)
40
forma. Assim, as soluções preparadas com etanol também foram mantidas por um tempo máximo de 7 dias sob refrigeração em frascos de vidro incolores.
Figura 14: Estudo do controle de degradação de solução de bilastina 10 mg L-1 preparada em água ultrapura:etanol 70:30 %v/v, no qual: (a) tempo zero; (b) 7 dias após o preparo; (c) 14 dias após o preparo. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem 2,5 nm; velocidade de varredura:1200 nm s-1; λexc/em: 250/295 nm; conservação em frasco incolor mantido em geladeira.
5.9 Condições finais estabelecidas
A Tabela 2 resume os parâmetros analíticos estabelecidos após a realização dos estudos descritos das seções 5.1 a 5.8, realizados em triplicatas reais, e as condições utilizadas no equipamento, que tiveram como objetivo buscar a melhor resposta analítica.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 In te n si da de de s in a l fl u or e sc e n te (u .a ) Comprimento de onda (nm) (a) (b) (c)
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Tabela 2: Resumo das condições experimentais (analíticas e instrumentais) obtidas como resultado dos estudos para determinação da bilastina por espectrofluorimetria
Parâmetro Resultado
λexc/em 250/295 nm
Solvente água ultrapura:etanol 70:30 %v/v
pH Original da solução (5,73)
Tempo de estabilidade da solução 7 dias sob refrigeração Banda espectral de passagem (fenda) 2,5 nm
Caminho óptico (cubeta de quartzo) 1 cm
Velocidade de varredura 1200 nm s-1
5.10 Cálculo dos parâmetros analíticos de mérito
5.10.1 Determinação da faixa linear e construção da curva analítica
Com a finalidade de explorar a linearidade do sinal fluorescente da bilastina, soluções nas concentrações compreendidas entre 5 e 100 mg L-1 foram preparadas a partir de diluições apropriadas da sua solução estoque 100 mg L-1 em água ultrapura:etanol 70:30 %v/v. Cada ponto foi feito em triplicatas autênticas e as medidas foram realizadas nas condições experimentais otimizadas (Tabela 2). A Figura 15 mostra os resultados obtidos para a fluorescência de cada ponto.
42
Figura 15: Estudo da faixa linear de resposta da bilastina em água ultrapura:etanol 70:30 %v/v. Curva construída com valores médios de emissão fluorescente da bilastina. Condições conforme Tabela 2.
Os resultados mostrados na Figura 15 indicam que a faixa linear parece ser até a concentração próxima a 20 mg L-1. Sendo assim, um estudo mais minucioso foi realizado em concentrações menores na faixa compreendida entre 0,01 e 20 mg L-1.
No entanto, como a molécula de bilastina apresenta alta eficiência quântica de fluorescência, não foi possível realizar as medições de todas as concentrações na mesma banda espectral de passagem. Para a faixa de concentração de 1 a 20 mg L-1 as medidas foram feitas em banda espectral de passagem de 2,5 nm, enquanto que na a faixa de concentração de 0,01 a 1 mg L-1 as medidas foram realizadas nas bandas de 2,5 e 5 nm. Construir toda a curva (0,01 a 20 mg L-1) na fenda de 2,5 nm não seria possível porque não haveria sensibilidade para a faixa de concentração menor (0,01 a 1 mg L-1).
Os resultados obtidos pelas duas bandas espectrais de passagem na faixa de concentração de 0,01 a 1 mg L-1 estão apresentados na Figura 16.
y = 1,6022x + 78,752 R² = 0,7937 0 50 100 150 200 250 300 5 15 25 35 45 55 65 75 85 95 In te n si da de de s in a l fl uo re sc en te (u. a .) Concentração (mg L-1)
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Figura 16: Curva analítica para emissão fluorescente da bilastina com valores de concentração entre 0,01 e 1 mg L-1 nas condições estabelecidas na Tabela 2, sendo: (a) banda espectral de passagem de 5 nm e (b) banda espectral de passagem de 2,5 nm.
Com estes resultados, foi calculado um fator de correção com a equação 𝑓 = 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 fluorescência 𝑛𝑎 𝑓𝑒𝑛𝑑𝑎 5,0
𝐼𝑛𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐ê𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑛𝑎 𝑓𝑒𝑛𝑑𝑎 2,5 para cada concentração, obtendo-se um valor médio de
5,30. Os valores de fluorescência obtidos na banda espectral de passagem de 2,5 nm pela faixa mais alta de concentração, foram multiplicados por esse fator com o propósito de obter as intensidades de excitação aproximadas e, a partir delas, construiu-se uma única curva com todos os pontos na faixa de 0,01 a 20 mg L-1. A curva analítica pode ser vista na Figura 17.
y = 97,702x + 7,9873 R² = 0,9903 y = 510,82x + 41,186 R² = 0,9956 0 100 200 300 400 500 600 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 In te n si a d e d e s in a l fl u o re sc ê n te (u .a .) Concentração (mg L-1) (b) (a)
44
Figura 17: Curva analítica para faixa de concentração de 0,01 a 20 mg L-1 gerada utilizando o fator de 5,30, obtido com as concentrações de 0,01 a 1 mg L-1 analisadas nas bandas de passagem de 2,5 e 5,0 nm. Condições experimentais da Tabela 2.
A partir desta curva, foi notada a presença de duas faixas lineares: uma referente a concentrações de 1 a 20 mg L-1, utilizada como faixa linear de trabalhoe outra englobando os valores de concentração menores na faixa 0,01 a 1 mg L-1.
A curva analítica compreendendo a faixa mais baixa de concentração pode ser vista na Figura 18, sendo resultado de triplicatas em três dias.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 0 5 10 15 20 25 In te n si da de de s in a l fl uo re sc en te (u. a ) Concentração (mg L-1)
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Figura 18: Curva analítica construída a partir dos espectros de emissão fluorescente de bilastina dos valores intermediários de concentrações na faixa de 0,01 a 1 mg L-1 no solvente água ultrapura:etanol 70:30 %v/v.Condições experimentais da Tabela 2
A faixa linear de 1 a 20 mg L-1 foi a escolhida porque a proposta deste trabalho foi fazer as determinações nos comprimidos, nos quais a concentração esperada é alta e está compreendida nesta faixa (Figura 19).
Figura 19: Curva analítica de emissão fluorescente da bilastina no solvente água ultrapura:etanol 70:30 %v/v. Condições: caminho óptico de 1 cm; banda espectral de passagem de 2,5 nm; velocidade de varredura de 1200 nm s-1, λ
exc/em: 250/295 nm. y = 513,51x + 41,135 R² = 0,9949 0 100 200 300 400 500 600 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 In te n si d a d e d e si n a l f lu o re sc en te ( u .a .) Concentração (mg L-1) y = 23,448x + 32,326 R² = 0,9976 0 100 200 300 400 500 600 0 5 10 15 20 In te n si d a de d e fl uo re sc ênc ia ( u. a .) Concentração (mg L-1)
46
5.10.2 Limites de Quantificação (LQ) e Detecção (LD)
Como a concentração de bilastina na amostra é alta, não são tão necessários os cálculos de precisão. No entanto, o estudo para estimar os limites de detecção e quantificação foi realizado apenas para aumentar o número de informações acerca da luminescência da bilastina, contribuindo para futuros trabalhos.
Assim, medidas de fluorescência foram realizadas até chegar ao menor sinal diferente do ruído, o qual correspondeu à concentração de 0,001 mg L-1. Este foi então considerado o limite de quantificação (LQ) e o primeiro ponto de uma curva analítica (de concentrações mais baixas) que se estendeu até 0,01 mg L-1 (Figura 20).
Figura 20: Curva analítica construída através dos espectros de emissão de soluções de bilastina. Condições experimentais da Tabela 2.
Para o cálculo do LD foi usada a relação LD = LQ/3,33 e o valor obtido foi de 3,0 x 10-4 mg L-1. Vale ressaltar que estes valores de LD e LQ podem ser muito menores caso a banda espectral de passagem utilizada seja maior que 2,5 nm, mostrando a enorme eficiência quântica de fluorescência da bilastina.
y = 5580,6x + 11,114 R² = 0,9935 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 In te n si d a d e d e si n a l f lu o re sc en te ( u .a .) Concentração (mg L-1)
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5.10.3 Precisão através da repetitividade
A precisão do método foi avaliada através de estudos de repetitividade, que analisa a variação das medidas obtidas pelo mesmo operador, equipamento e método, em um mesmo dia. Para isso, foram realizadas seis medições independentes do ponto de 10 mg L-1 referente ao valor de concentração representado pela metade da curva (Figura 19). O resultado para o desvio padrão relativo foi de 3,23%, podendo ser considerado satisfatório, já que está abaixo do valor mínimo recomendado (5%), segundo as normas de validação do INMETRO.[18]
5.10.4 Ensaios de recuperação
A viabilidade do método foi avaliada através de estudos de recuperação. Para estes estudos, foram utilizados dois lotes distintos (A e B), analisados separadamente com suas soluções, cada uma preparada em triplicatas reais, sendo fortificadas com solução de concentração 5 mg L-1. Para o cálculo da recuperação, a equação utilizada foi:
𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎çã𝑜(%) = 𝐶𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑓𝑜𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎− 𝐶𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐶𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜 𝑎𝑑𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑑𝑎 𝑛𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑓𝑜𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎𝑥 100
.
Tabela 3: Resultados para os ensaios de recuperação.
Lote Triplicatas Amostra fortificada (mg L-1) Amostra não fortificada (mg L-1) Fortificação (mg L-1) Recuperação (%) A a 9,8 4,9 5,0 98 b 9,3 4,1 5,0 104 c 9,6 4,9 5,0 93 B d 9,6 4,1 5,0 110 e 9,8 4,5 5,0 107 f 9,7 4,3 5,0 109 Média + SD 104% ± 2,1
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5.10.5 Robustez
De acordo com critérios da RDC nº 166, a robustez é definida como a capacidade do método analítico em resistir a certas variações de algum parâmetro analítico [18].
Conforme mostrado nas Seções 5.6 e 5.7, o método se mostrou robusto para a faixa de pH compreendida entre 3 e 13 e para a proporção de etanol compreendida entre 10 e 100 %v/v.
Além destes dois parâmetros, também foi avaliado o efeito do solvente no processo de extração descrito na Seção 4.4. Os solventes água ultrapura:etanol 70:30 %v/v e 100 % etanol foram utilizados durante o processo de extração. Os valores de intensidade do sinal fluorescente obtidos em cada extração foram plotados na curva analítica (y = 23,448*X + 32,326) e a massa extraída calculada, conforme mostra a Tabela 4 .
Para esta análise, o processo foi realizado de acordo com o recomendado pela Farmacopeia Brasileira [17], no qual é considerado o peso médio de uma cartela de comprimidos, e de acordo com o fabricante, o qual relata que cada comprimido possui 20 mg de princípio ativo. A cada extração, uma massa de 0,062 g de comprimido triturado (correspondente teoricamente a 10 mg de bilastina) foi transferida para um balão volumétrico 10 mL, o qual foi avolumado com (i) etanol ou (ii) água ultrapura:etanol 70:30 %v/v. O processo (feito em triplicatas reais) para cada massa foi realizado mais 2 vezes, gerando os resultados na Tabela 4. O que se obteve foi um valor aproximado de 9,7 mg (esperado de 10 mg) de bilastina recuperada (cerca de 97%).
Tabela 4: Valores de massa obtidas com extração em 100% etanol ou água ultrapura:etanol 70:30 %v/v
Extração Massa média de bilastina recuperada na extração (mg) Água:etanol 70:30 %v/v Etanol 100% 1 5,39 ± 0,7 5,47 ± 0,5 2 2,77 ± 1,2 2,26 ± 1,3 3 1,27 ± 1,3 1,93 ± 1,1 Total 9,43 ± 0,7 9,66 ± 0,9 SD 2,38 ± 0,8%
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O desvio padrão de 2,38 % obtido mostrou que não há diferença significativa entre as extrações realizadas nos dois tipos de solventes, confirmando mais uma vez a robustez do método (mais especificamente o método de extração). Os parâmetros analíticos de mérito estão resumidos na Tabela 5.
Tabela 5: Resumo dos parâmetros analíticos de mérito calculados para o método espectrofluorimétrico desenvolvido
Parâmetros analíticos de mérito Bilastina Equação da curva analítica representativaª Y = 23,448*X + 32,326 Coeficiente de determinação (R²) 0,9976 Faixa linear (mg L-1) 1,0 – 20,0 LD (mg L-1) 0,001 LQ (mg L-1) 0,0003 Repetitividade (DPR%, n = 6) 3,23%, Recuperação (n = 9) 104 ± 2,1% Robustez pH entre 3 e 13
Solução preparada em etanol 10 a 100 %v/v Extração em água:etanol 70:30 %v/v e etanol 100%
ªY = intensidade de sinal fluorescente (u.a.); X = concentração de bilastina em mg L-1
5.11 Aplicação do método analítico
As amostras dos comprimidos foram adquiridas em diferentes farmácias com lotes distintos, a fim de apresentar uma variedade de respostas. Foram analisados cinco lotes, todos extraídos seguindo os passos descritos na Seção 4.5 deste trabalho e suas soluções analisadas em triplicatas autênticas, seguindo o método analítico desenvolvido.
Como se trata de um fármaco novo, cujo fabricante disponibilizou apenas comprimidos na concentração de 20 mg, as amostras foram preparadas nas concentrações de 5, 10, 15 e 20 mg L-1.
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A Tabela 6 mostra os valores obtidos de e intensidade de sinal fluorescente, e a Figura 21 os espectros de fluorescência representativos de uma das amostras em diferentes concentrações.
Tabela 6: Resultados dos valores de intensidade de fluorescência obtidos pelas amostras de comprimidos de bilastina Lote Concentração teórica (mg L-1) Concentração experimental (mg L-1) Erro % A 10,0 8,9 11 B 10,0 9,4 6,0 C 5,0 3,9 22 10,0 9,4 6,0 15,0 14,3 4,7 20,0 20,1 0,5 D 5,0 4,9 2,0 10,0 9,6 4,0 15,0 13,9 7,3 20,0 20,0 0,0 E 5,0 5,1 2,0 10,0 9,4 6,0 15,0 14,1 6,0 20,0 20,0 0,0
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Figura 21: Espectros de excitação e emissão fluorescente de soluções de bilastina obtidas a partir das amostras do lote E nas concentrações: (a) 5 mg L-1; (b) 10 mg L-1; (c) 15 mg L-1; (d) 20 mg L-1. Condições conforme Tabela 2.
Os resultados mostraram que o método é capaz de identificar e quantificar a bilastina através do método analítico desenvolvido. Os valores de intensidade de fluorescência (u.a.) foram aplicados na curva analítica para verificar se os resultados obtidos estavam de acordo com o informado na bula do medicamento, ou seja, (20 mg de bilastina em cada comprimido com massa média de 1,22 g).
Os valores encontrados demonstraram que o rótulo apresenta informações verídicas, pois foi obtida uma quantidade de bilastina próxima àquela esperada de acordo com as informações cedidas pelo fabricante.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 Inte ns idade de s inal f luor e s c e nte (u. a ) Comprimento de onda (nm) (d) (c) (b) (a)
