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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
ADRIANA FU VIVIAN
CARACTERIZAÇÃO DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE
CERVEJA ATRAVÉS DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS
MASS SPECTROMETRY CHARACTERIZATION OF BREWING
PROCESS
Campinas
2016
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ADRIANA FU VIVIAN
CARACTERIZAÇÃO DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE
CERVEJA ATRAVÉS DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS
MASS SPECTROMETRY FOR CHARACTERIZATION OF BREWING
PROCESS
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências.
Dissertation presented to the Faculty of Medical Sciences of the State University of Campinas as part of the requirements to obtain the title of Master in Science.
ORIENTADOR: PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ADRIANA FU VIVIAN E ORIENTADO PELO PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO
CAMPINAS
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Agência (s) de fomento e nº (s) de processo(s): FAPESP, 2011/50400-4;
Brasil/MS; Brasil/MS
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Mass spectrometry for characterization of brewing process Palavras-chave em inglês:
Beer
Mass spectrometry Multivariate analysis Processomics
Área de concentração: Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Titulação: Mestra em Ciências
Banca examinadora:
Rodrigo Ramos Catharino [Orientador] Gisele Leticia Alves
Estela de Oliveira Lima
Data de defesa: 21-10-2016
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BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
ADRIANA FU VIVIAN
ORIENTADOR: RODRIGO RAMOS CATHARINO
MEMBROS:
1. PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO
2. PROF. DR. ESTELA DE OLIVEIRA LIMA
3. PROF. DR. GISELE LETICIA ALVES
Programa de Pós-Graduação em FISIOPATOLOGIA MÉDICA da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
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AGRADECIMENTOS
À minha família, que sempre esteve ao meu lado, que me apoiou em minhas decisões e sempre torce para o meu sucesso.
Aos meus amigos, que me apoiam e me incentivam, em especial, Luna Fascina, que me acompanhou de perto durante todo o Mestrado e Roberto Vassalo, com suporte estatístico.
Ao meu orientador, Rodrigo Ramos Catharino, por todo seu apoio, trabalho e dedicação. Você é um exemplo de sucesso e realização. Obrigada por confiar no meu trabalho.
Ao Laboratório Innovare e seu time, que me apoiaram e me suportaram sempre que precisei, em especial Carolina e Diogo, que sem eles este trabalho não seria possível.
A Cervejaria Nacional, por abrir suas portas e contribuir nessa parceria, em especial a dedicação de Guilherme, Josemir e Murilo.
A FAPESP, pelo suporte financeiro que permitiu a realização deste trabalho (2011/50400-4, 2014/00084-2 e 2015/06809-1).
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RESUMO
A cerveja é uma das bebidas alcoólicas mais difundidas no mundo. É produzida através da fermentação de ingredientes que contém amido, principalmente cereais maltados, como a cevada e o trigo. Seu preparo inclui água como parte importante do processo, além de lúpulo e fermento. O processo de produção de cerveja envolve basicamente as etapas de malteação, moagem, mostura, fervura, clarificação, fermentação, maturação e envase . Cada etapa sofre uma série de transformações: a malteação ativa enzimas importantes para a posterior quebra de grandes moléculas no processo de mostura, a moagem prévia auxilia na exposição do amido. A fervura extrai compostos de aroma e amargor do lúpulo, além de esterilizar o mosto, para inoculação da levedura para fase de fermentação, etapa em que ocorre conversão de açúcares em etanol e formação de ésteres e outros compostos, importantes para o sabor e aroma da cerveja. A clarificação e filtração anteriores removem compostos sólidos remanescentes indesejáveis e por fim, a maturação, promove o “arredondamento” do sabor. A importância do aroma e seus componentes não é só de dar as características finais para cerveja, mas também é um forte indicador se o processo foi bem-sucedido. A espectrometria de Massas (EM) em combinação com análise estatística multivariada (PLS-DA) foi utilizada para encontrar marcadores das etapas principais de transformação da cerveja , com foco em qualidade e produtividade. Os fingerprintings mostram sinais característicos e relevantes da composição da cerveja, como açúcares, além de apontar precursores de off-flavors em etapas iniciais do processo. Os scoreplots mostram que há precisão entre as replicatas e diferenças entre as etapas, definindo marcadores de transformação. Dentre eles, vale destacar o ácido capróico e 2,3 butanodiol, compostos importantes para qualidade final da cerveja. O método de EM de injeção direta em combinação com PLS-DA demonstrou ser adequado para uma abordagem rápida, simples e robusta de misturas complexas, sendo capaz de evidenciar substâncias de interesse. A técnica é conveniente para o monitoramento do processo , sendo uma alternativa atraente para o controle de alimentos e bebidas, pois a abordagem permite evidenciar se o processo está acontecendo de acordo com o esperado antes de ser concluído, sugerindo, assim, uma nova área para aplicação de espectrometria de massa, a “processômica”.
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ABSTRACT
Beer is one of the most widespread alcoholic beverages in the world. It is produced by fermentation of ingredients containing starch, especially malted cereals, such as barley and wheat. Its brewing includes water as an important part of the process, as hops and yeast. The beer production process involves the steps of malting, grinding, mashing, boiling, clarification, fermentation, maturation and filling. Each stage undergoes a series of transformations: malting cycle activates enzymes important for the subsequent breaking of large molecules in the mashing process. Prior grinding aids in the exposure of the starch. The boiling extracts aroma and bitterness compounds of hop and sterilizes the wort, to yeast inoculation for fermentation stage, in which occurs the conversion of sugars into ethanol and ester and other compounds synthesis, important for the beer taste and flavor. The previous clarification and filtration removes undesirable remaining solid compounds, and finally, maturation, promotes the "rounded" flavor. The importance of aroma, flavor and its components is not only to give the final characteristics to beer but is also a strong indicator that the process was successful. The Mass spectrometry (MS) in combination with multivariate data analysis (PLS-DA) was used to find markers of processing steps focusing on quality and productivity. The fingerprintings show characteristic and relevant signs of beer composition, as sugars, besides indicating off-flavors precursors in the early stages of the process. The scoreplots show that there is precision between replicates and differences between steps, allowing to set markers of transformation. Among the identified markers, it is worth highlighting the caproic acid and 2,3 butanediol, important compounds for final quality of the beer. The method of MS direct injection in combination with PLS-DA proved to be suitable for a simple, fast and robust approach to complex mixtures, being able to point out substances of interest. The technique is convenient for monitoring the process, and an attractive alternative for the control of food and beverages, once the approach allows to evidence that the process is going according to expected before being completed, thus suggesting a new area for application of mass spectrometry, the "processomics".
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 9
1.1 Processo produtivo de cerveja ... 11
1.1.1. Malteação dos grãos ... 11
1.1.2. Moagem e sacarificação ... 13
1.1.3. Fervura e clarificação ... 14
1.1.4. Fermentação ... 15
1.1.5. Maturação... 19
1.1.6. Envase e armazenamento ... 21
1.2 Componentes da cerveja e sua relação com a qualidade... 24
1.3 Espectrometria de massas ... 26 1.4 PLS-DA ... 27 2. OBJETIVO ... 28 3. METODOLOGIA ... 28 3.1 Reagentes ... 28 3.2 Amostras... 28 3.3 Preparação de amostras ... 28 3.4 Equipamento ... 28
3.5 Tratamento dos dados... 29
4. RESULTADOS ... 30
5. DISCUSSÃO GERAL ... 46
6. CONCLUSÃO ... 48
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INTRODUÇÃO
A cerveja é uma das bebidas alcoólicas mais difundidas e uma das mais consumidas no mundo, estando atrás de chá, café, leite e refrigerante [Fillaudeau, 2005]. Em 2011, a produção de cerveja aumentou em 61,7 milhões de hectolitros em relação a 2010, o que significa um aumento de 3,3%. Além disso, enquanto a crise econômica tem afetado o gasto do consumidor em diversos setores, as cervejas artesanais estão desafiando tendências recessivas com uma impressionante trajetória ascendente. [Rossi, 2013]
O setor cervejeiro é um dos mais tradicionais no Brasil e tem uma ampla capilaridade, contando com uma cadeia de suprimentos completa. As associadas da CervBrasil contam com 53 fábricas, produção de 14,1 bilhões de litros anuais, movimentam uma frota de cerca de 38 mil veículos e representam 1,6% do PIB nacional. [CervBrasil, 2015]
Com sua larga flexibilidade e apresentando uma variedade de aromas, texturas e sabores, a cerveja se tornou uma rentável fonte de negócio no mercado brasileiro, consolidando-se no gosto do consumidor, sendo a bebida alcóolica mais consumida no país há pelo menos 20 anos [FLACSO, 2012]. O consumo de cerveja em 2012 no Brasil foi de 13,7 bilhões de litros, majoritariamente em centros urbanos, sendo considerado o quinto maior mercado em valor e o 22° em consumo em litros per capita [Euromonitor, 2012].
A cerveja, por definição, é uma bebida alcoólica carbonatada, produzida através da fermentação de ingredientes que contém amido, principalmente cereais maltados, como a cevada e o trigo. Seu preparo inclui água como parte importante do processo e leva ainda lúpulo e fermento, além de outros ingredientes, como frutas, ervas e outras plantas [Beltramelli, 2012]. A legislação do Mercosul (IN n°54, 2001) define cerveja como:
“...bebida resultante da fermentação, mediante levedura cervejeira, do mosto de cevada malteada ou do extrato de malte, submetido previamente a um processo de cocção, adicionado de lúpulo. Uma parte da cevada malteada ou do extrato de malte poderá ser substituída por adjuntos cervejeiros. ”
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Por sua vez, a norma ainda define como adjuntos cervejeiros:
“...matérias-primas que substituem parcialmente o malte ou o extrato de malte na elaboração da cerveja. Seu emprego não poderá, em seu conjunto, ser superior a 45% em relação ao extrato primitivo. Consideram-se adjuntos cervejeiros [...] os cereais, malteados ou não malteados, aptos para consumo humano...”
Dentre os adjuntos mais utilizados na fabricação de cerveja, encontra-se milho, arroz e até mesmo cana de açúcar, como forma de chegar ao teor alcoólico desejado de forma acelerada e com um processo produtivo de menor custo, pelo preço dos adjuntos ser mais competitivo que o malte. Apesar de reduzir custos, não há uma relação entre a porcentagem de malte e seu preço final. O uso de adjuntos como milho e arroz ainda são aplicados como forma de melhorar a estabilidade do sabor [Sleiman & Venturini, 2008].
Atualmente, existem mais de 20 mil rótulos de cerveja que se diferenciam pelas matérias-primas usadas (ex. organismo fermentador, malte e lúpulo) ou variações nos parâmetros de processo (ex. temperatura de fermentação). No geral, as cervejas são compostas por carboidratos, minerais, vitaminas, água (90 -95%) e aminoácidos. [Rada et al., 2015].
De acordo com o decreto n°6.871 de 2009, as cervejas são classificadas de acordo com 5 características: porcentagem de extrato primitivo (leve, comum, extra e forte), cor de acordo com a escala EBC (clara ou escura), teor alcóolico (sem e com álcool), proporção de malte de cevada em peso sobre o extrato primitivo (puro malte, cerveja, cerveja com nome do vegetal predominante) e fermentação (baixa e alta fermentação).
Para esse estudo, classificaremos a cerveja em dois grandes grupos de acordo com a fermentação, podendo então ser dividida em Ales (alta fermentação) ou Lagers (baixa fermentação)1. Geralmente mais aromáticas que as Lagers, dentro desse variado e amplo grupo das Ales encontramos as cervejas de trigo (Weiss), Pale Ales, Stout, dentre muitos outros. As Lagers, por sua vez, encontram as
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Dentre os tipos de fermentação também encontramos as Lambics que possuem fermentação espontânea ao expor a bebida a leveduras selvagens e bactérias, adquirindo um caráter bem ácido, com um consumo e produção muito baixa comparada com Ales e Lagers, não sendo considerada nesse estudo, tal como as cervejas híbridas, de fermentação mista. [Beltramelli, 2012]
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cervejas mais consumidas no mundo, como as Standard American Lagers e Pilsener [Beltramelli, 2012].
1.1 Processo produtivo de cerveja
O processo de produção de cerveja envolve basicamente as etapas de malteação (que ocorre geralmente fora das cervejarias), moagem, mostura, fervura, clarificação, fermentação, maturação e envase, como ilustra a Figura 01. As etapas iniciais em que ocorre mistura dos ingredientes sob calor denomina-se brassagem. As diferentes combinações de ingredientes no processo de fabricação resultam em um produto quimicamente complexo com centenas de compostos, sendo predominantes água, álcool e carboidratos. [Rodrigues, 2011]
Figura 01. Sequência das etapas principais do processo de produção de cerveja
Fonte: Elaborado pelo autor
Este processo, apesar de tradicional, vem sofrendo grandes avanços ao longo do tempo através da atuação de diferentes áreas da ciência: genética, bioquímica, microbiologia e engenharia [Mousia, 2004]. A conversão de cevada em cerveja é um dos processos mais antigos e complexos de enzimologia aplicada, tendo basicamente três estágios de reações enzimáticas: malteação, mostura e fermentação [Bamforth, 2009]. Cada etapa está descrita em detalhes a seguir.
1.1.1.
Malteação dos grãos
O grão de cevada in natura (Hordeum vulgare) consiste em um embrião rodeado por diferentes camadas, como aleurona, pericarpo e casca. O embrião
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contém a maior parte dos lipídeos e o endosperma a maior concentração de amido e β-amilases. A parede celular, que envolve a matriz proteica, é rica em β-glucanos (75%) e arabinoxilanos (20%). A casca, por fim, é rica em celulose e polifenóis. [Donkelaar et al., 2015]
No processo de malteação os grãos de cevada são colocados em contato com a água de forma a estimular a respiração embrionária e hidratar os reservatórios de amido. Com o aumento da atividade do embrião, giberelinas são produzidas e o grão inicia seu processo de germinação (controlado por 4-5 dias). Giberelinas são fitohormônios responsáveis pela produção de enzimas hidrolíticas durante a germinação, dentre elas, enzimas que quebram o amido (α-amilases e β- amilases), as paredes celulares (β-glucanases) e proteínas (carboxipeptidases e endopeptidases) [Baxter, 2001].
Todo esse processo ocorre a fim de fornecer nutrientes para a nova planta. Para interromper a atividade enzimática, isto é, a germinação, os grãos são secos em um forno com uma temperatura acima de 85°C, podendo variar até mais de 200°C dependendo do sabor e cor do malte que se pretende obter [Baxter, 2001]. O processo de secagem também tem a função de auxiliar na conservação do grão, uma vez que se elimina toda sua umidade e favorece a arma zenagem, já que o malte se torna mais leve [Morado, 2009].
Mudanças na composição do grão ocorrem durante o processo de malteação e envolvem principalmente um decréscimo de 18% da quantidade de amido, devido a tranformação em açúcares menores e uma perda inerente de processo, um aumento da quantidade de polifenóis e redução do teor de β -glucano (componente da parede celular). O teor de proteínas e ácidos graxos se mantém o mesmo. Outra mudança que ocorre durante a malteação é o aumento de albuminas e globulinas resultado da clivagem proteolítica das hordeínas ligadas por dissulfeto e secreção das enzimas do endosperma [Celus, 2006].
Uma alternativa estudada é a não-malteação dos grãos, desta forma não há perda de amido e elimina-se uma etapa do processo, porém isso resulta em uma menor atividade enzimática, o que afetaria a disponibilidade de substâncias para as etapas seguintes da brassagem, além de aumentar a turbidez e a viscosidade, afetando a etapa de filtração. Para contornar isso, sugere-se ser feito um processo de “pearling”, que envolve remover as camadas externas do grão em um método
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abrasivo de moagem com uma redução de 5%m/m [Donkelaar et al., 2015].
1.1.2.
Moagem e sacarificação
A etapa seguinte envolve triturar os grãos malteados . É importante ressaltar que a moagem deve manter a casca do malte majoritariamente intacta para ajudar no processo posterior de filtragem, porém ao mesmo tempo, ser capaz de expor a amilose e amilopectina contida em seu interior [Morado, 2009]. Grande parte dos avanços tecnológicos focam nas etapas seguinte a moagem, como uso de biorreatores para acelerar a maturação e filtros automáticos na mostura, porém a etapa de moagem é de extrema importância, pois influencia no tamanho dos grânulos e, consequentemente, na etapa de quebra dos compostos poliméricos. Assim, deve -se ter muita atenção nes-se processo, nos parâmetros e equipamentos usados, pois ele interfere diretamente nas demais etapa de processo e, portanto, na qualidade do produto final. O uso de diâmetros menores e uma maior velocidade aceleram a hidrólise do amido, assim o tempo de mostura é menor para chegar à concentração final máxima de açúcar, porém deve-se atentar a integridade da casca [Mousia, 2003]. O malte triturado é então colocado sob aquecimento para gelatinar o amido e deixá-lo mais susceptível ao ataque enzimático (amilases). É nesse momento em que, ao invés de somente malte de cevada, outros adjuntos são adicionados para a formação do mosto. O mosto é o resultado da quebra das moléculas de amilopectina e amilose em açúcar criando um líquido rico em maltose e glicose, ambos fermentáveis. O mosto também é rico em proteínas solúveis, peptídeos e aminoácidos, elementos importantes na estabilidade e qualidade da espuma da cerveja [Baxter,2001].
A rampa de aquecimento para que ocorra a ativação das diferentes enzimas é a descrita abaixo e ilustrada na Figura 02:
• De 40-45°C: ativação enzimática. Enzimas como beta-glucanase, responsável por quebrar a parede celular, se tornam ativas.
• De 50-55°C: repouso proteolítico. Ocorre a quebra de proteínas que se transformam em peptídeos e aminoácidos.
• De 60-72°C: ação de alfa e beta-amilase que agem na estrutura do amido. A regulação da ação dessas enzimas permite controlar o corpo da cerveja
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Figura 02. Rampas de temperatura para ativação enzimática e faixa de pH ideal para
processo de sacarificação
Após a formação do mosto, é necessário separá-lo dos restos de grãos. Para tal, ocorre a transferência do líquido para outro recipiente, usando o próprio corpo de fundo formado como filtro. A água em torno de 70°C é usada para a lavagem e extração de todos componentes solúveis, evitando a extração excessiva de polifenóis que podem prejudicar o sabor da cerveja [Morado, 2009].
1.1.3.Fervura e clarificação
Os cones da planta fêmea da espécie Humulus lupulus são cultivados em regiões de clima temperado e são a parte utilizada no processo cervejeiro [Stevens, 1966]. Em um recipiente, agora somente com o mosto, o lúpulo é adicionado em formato de pellets (uma versão pulverizada e comprimida) e levado a fervura gerando os seguintes efeitos: esterilização do mosto, inativação enzimática, evaporação de água e concentração do mosto, coagulação das proteínas para futura separação, extração de α- e β- ácidos do lúpulo e isomerização em iso-α-ácidos, responsável pelo amargor da cerveja. Os α-ácidos incluem humulona e análogos, já os β- ácidos
°C 70 65 60 55 50 45 40 35 30 pH 4.5 5.0 5.5 α-amilase β-amilase Enzimas protetolíticas
Β-glucanase desramificadoras Enzimas
Faixa ideal para mostura
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são lupulonas e seus análogos. [Bernotiene et al, 2004]
O aroma da cerveja, por sua vez, é formado, p rincipalmente, pelos óleos essenciais contidos no lúpulo, porém alguns deles são indesejáveis, como o monoterpeno mirceno, que possui um odor acre indesejável. Os sesquiterpenos principais são α-humulona e β-cariofileno [Bernotiene et al, 2004]. Além disso, o lúpulo também tem importante função antiséptica e bacteriostática, influenciando assim na durabilidade da cerveja. Durante a fervura, ocorre também escurecimento do mosto devido a ação de açúcares com aminas primárias (dos aminoácidos), formando pigmentos entre vermelho e marrom. [Reinold, 2009]
Após a reação ocorrer, deve-se resfriar o mosto rapidamente para evitar contaminação, oxidação e formação de DMS2 e então remover o lúpulo e proteínas coaguladas em um processo conhecido como clarificação [Baxter, 2001]. Partes das proteínas, durante a fervura, se aglomeram e formam o que se chama de trub. Esse aglomerado proteico deve ser separado do mosto e a técnica mais utilizada para isso é a de sedimentação, através de um processo chamado whirpool, isto é, forma-se um rodamoinho de forma que as proteínas se acumulam no centro do tanque e facilite o descarte.
1.1.4.Fermentação
O processo de fermentação depende de diversos mecanismos celulares que controlam a mitose e o metabolismo de nutrientes do mosto, sendo estes influenciados por outros fatores como temperatura, pH, oxigênio dissolvido, agitação, disponibilidade de açúcares e outros nutrientes, presença de contaminantes e taxa de inoculação. Para iníciar a fermentação, o mosto lupulado é resfriado até a temperatura ideal. Para Lagers (Saccharomyces pastorianus) a fermentação ocorre entre 7-13°C e para Ales (Saccharomyces cerevisae) entre 16-18°C (Quadro 01). Nessa etapa, as leveduras que são adicionadas convertem o açúcar em álcool em condições anaeróbicas. Ao fim da fermentação, as leveduras se aglomeraram e, nas Lagers, formarão um corpo de fundo (bottom fermenting), e das Ales, um corpo flutuante (top fermenting) [Baxter, 2001].
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O DMS (Dimetilsulfeto) tem sabor rançoso, considerado indesejável na maioria das cervejas, resultado da fervura ou da ação de bactérias . Em concentrações moderadas é essencial para o aroma e sabor de cervejas estilo Lager. [Palmer,2006]
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Quadro 01. Diferenças entre as Saccharomyces utilizadas na produção de cerveja
Fonte: Adaptado de Harrison, 2009
Podemos dividir o processo fermentativo em três fases de acordo com a multiplicação das células: adaptativa (lag), exponencial (log) e estacionária [McGee,2014]. O desenvolvimento de uma cultura de levedura pode ser monitorado utilizando um espectrofotômetro para medir a absorbância da suspensão celular a 600nm e gerar uma curva de crescimento. No caso do processo cervejeiro, a fermentação é monitorada usando o conceito de extrato aparente (ºP) através de um densímetro. O extrato aparente reduz ao longo da fermentação (Figura 03) e entende-se que há o consumo de açúcares e produção de álcool. Outro ponto obentende-servado é a inspeção visual de produção de CO2, através da formação de bolhas durante o
processo. Considera-se terminada a fermentação quando o extrato aparente se torna constante e a produção de CO2 cessa [Bokulich, 2013].
Figura 03. Exemplo de desenvolvimento da fermentação da amostra IPA controlada
por medição de extrato aparente (ºP) Fonte: Cervejaria Nacional
Característica S. cerevisiae S. pastoranius
Temperatura mínima de crescimento 15°C 7°C
Temperatura ótima de crescimento >30°C <30°C
Temperatura máxima de crescimento 40°C 34°C
Habilidade de esporular Parcial Não
0 2 4 6 8 10 12 14 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 G ra u s p la to Horas
Desenvolvimento da fermentação
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O pH do mosto é outra variável que deve ser controlada durante a fermentação, sendo que crescimento da população de leveduras cervejeiras se dá, geralmente, em um pH entre 4 e 5. Esse baixo pH também diminui a possibilidade de microrganismos contaminantes de se desenvolverem na cerveja. O método mais comum para detectar contaminantes microbianos nas amostras é acompanhar se há crescimento de microrganismos em meios de cultura, como o MRS ágar (para detecção de bactérias lácticas) e NBB-B (para detecção de Lactobacillus, Pediococcus, Pectinatus e Megasphaera). Entretanto, dependendo do microrganismo, o crescimento pode ser bastante lento tanto em meios sólidos quanto em meios de cultura líquidos, resultando na comercialização de cervejas que podem apresentar os típicos sinais de contaminação microbiana, como turbidez, acidez e odores desagradáveis [Sakamoto, 2001]. Na Quadro 02, apresentam-se potenciais contaminantes microbianos e seus efeitos.
Quadro 02. Problemas de deterioração na cerveja e microrganismos causadores
Fonte: Adaptado de Harrison, 2009
Microorganismo Etapa do processo Efeito
Lactobacillus spp. Todas Off-flavor Turbidez Alteração de viscosidade Pediococcus spp. Inoculação Fermentação Envelhecimento Off-flavor Turbidez Acidez Alteração de viscosidade
Bactéria acética Fermentação ao ar livre Embalagem
Off-flavor Turbidez
Alteração de viscosidade Formação de película
Hafnia protea MostoFermentação Off-flavorAcidificação
Enterobacteria Mosto Off-flavor
Bacillus spp. Mosto Off-flavor
Zymomonas spp. Embalagem Off-flavor
Pectinatus spp. Embalagem Off-flavor
Megasphaera spp. Cerveja pH>4,1 e álcool
<3,5% Off-flavor
Levedura selvagem Todas
Off-flavor Turbidez
Morte da levedura de interesse Mofo Grão de cevada Off-flavor
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Durante o processo, os açúcares mais simples são fermentados primeiro, utilizando glicose, frutose, sacarose, maltose e maltotriose, nesta ordem. Durante a fase estacionária o crescimento da população cessa, a atividade fermentativa diminui e as leveduras reabsorvem grande parte dos compostos de aroma indesejáveis, “amadurecendo” e equilibrando o aroma da cerveja. As leveduras também produzem uma série de compostos voláteis saborizantes, como álcoois e ésteres, sendo, portanto, de grande relevância no caráter de cada cerveja [Palmer, 2006].
Os ésteres são produzidos nesta etapa a partir de uma reação álcool-ácido, entre o etanol e AcilCoA, ambos produtos do metabolismo da levedura. A quantidade desdes compostos vai variar de acordo com a concentração inicial dos componentes, pH, temperatura e agitação. A via metabólica da produção de ésteres pela levedura está ilustrada na Figura 04.
Figura 04. Vias metabólicas principais na produção de ésteres
Fonte: Adapatado de García, 1994
Além de ésteres, outros compostos produzidos nessa etapa são glicerol, dicetonas vicinais, ácidos graxos de cadeia curta, ácidos orgânicos e compostos derivados do sulfato. A concentração de cada substância varia de acordo com a levedura utilizada. As dicetonas, diacetil e pentanodiona são de grande relevância,
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pois são responsáveis por gerar o aspecto amanteigado/mel, considerado indesejável na cerveja [Bokulich, 2013].
Há grande foco de viés econômico em desenvolver maneiras mais ágeis e práticas de desenvolver o processo de fermentação, uma vez que exige grande capital de investimento em equipamentos e demora até um mês para concluir o processo dependendo do estilo da cerveja. Com isso, há estudos sobre o uso de biorreator de levedura imobilizada para fermentação contínua e com alto grau de concentração de células, permitindo um processo mais ágil, com menor gasto de energia e com equipamentos de menor porte [Yamauchi, 1994].
Outras abordagens são utilizadas para intensificar a fermentação, como aumento de temperatura, concentração de levedura inoculada e aumento da gravidade do mosto. As duas primeiras estratégias atuam em uma maior multiplicação da levedura, porém essas estratégias possuem desvantagens importantes, como a alteração do sabor final, principalmente pela maior produção de ésteres [Brown, 2003].
Outras modificações a nível celular são feitas a fim não só de acelerar o processo de fermentação, mas como melhorar o processo de produção de cerveja como um todo. Alguns estudos estão sendo desenvolvidos para produção de cervejas “light”, nas quais as leveduras fermentam mais carboidratos do que as leveduras normais; outra modificação envolve desenvolver organismos para degradar α -glucanos e reduzir problemas com filtração e formação de precipitados; por fim, busca-se desenvolver capacidades proteolíticas a fim de reduzir o uso de proteases que degradam proteínas que causam o turvamento da cerveja [Harrison, 2009].
1.1.5.
Maturação
As leveduras aglomeradas então são retiradas e a cerveja segue para a maturação, que ainda conta com uma pequena quantidade desses microrganismos, que promovem dois efeitos: maior produção de dióxido de carbono (carbonatação), remoção química de compostos como o diacetil, acetaldeído e ácido sulfídrico (indesejáveis por impactar no sabor e aroma do produto final). Além disso, essa fase visa iniciar a clarificação da cerveja por sedimentação das células de levedura e manter a cerveja no estado reduzido, evitando oxidações durante a armazenagem. Durante a maturação, álcoois superiores e ácidos graxos não se modificam
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significativamente. Em contrapartida, se intensificam outros ésteres que dão origem ao aroma que caracterizam a cerveja, sendo os predominantes: acetato de etila, acetato de isoamila, caprilato de etila e caproato de etila [Carvalho et al, 2007].
A maturação é gargalo na produção de cerveja, pois esse processo pode durar alguns meses, devido a ausência de α-acetolactatodecarboxilase na levedura usada na produção cervejeira, responsável por decompor o α-acetolactato, substância que pode se converter em diacetil (limite de detecção sensorial de 0,05 mg/L) e gerar um off flavor [Yamauchi, 1995]. A remoção do diacetil ocorre envolvendo basicamente duas etapas: conversão do α-acetolactato em diacetil de forma não enzimática e a conversão de diacetil em acetoína, enzimaticamente, pela diacetilredutase, presen te nas células de levedura (Figura 05). Portanto, algumas tecnologias são desenvolvidas para diminuir a quantidade de diacetil gerada, a fim de reduzir os tempos de maturação, como por exemplo, modificação genética com foco no gene α -acetolactatodecarboxilase (ALDC) [Zhang, 2007] ou o uso de reatores para acelerar a conversão enzimática [Yamauchi, 1995]. Outros precursores de off flavor são os derivados do enxofre, como o sulfeto de hidrogênioe o ácido sulfídrico, que também possuem baixo limite de detecção sensorial e odor repugnante. Estes, também são eliminados durante a maturação [Carvalho et al., 2007].
Figura 05. Produção e conversão de diacetil durante maturação
Fonte: Adaptado de Linko, 1998
Devido aos custos envolvidos nessa fase, algumas cervejarias já utilizam um tanque único para o processo de fermentação e maturação, o que permite também ocupar melhor o espaço e diminui o risco de contaminação e oxidação durante a trasfega [Tschope, 2001]. Outra maneira usada para acelerar o processo e,
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consequentemente, reduzir custos, é fazer a clarificação através de uma separadora centrífuga. A clarificação é feita, uma vez que, para o início do processo de maturação, é necessário ter uma concentração de extrato fermentável de 0,5-1,5% m/m e contagem de leveduras viáveis de 2-5x106 células/ml, a quais devem ser eliminadas antes do envase [Carvalho et al., 2007].
A clarificação também é realizada para eliminar precipitados coloidais derivados da prolina, originária principalmente da hordeína da cevada maltada, que acabam por prover um aspecto turvo à cerveja. Entre os processos disponíveis para evitar esse inconveniente é o uso de adjuntos que reduz o pontencial de turvação, porém pode comprometer o sabor final da cerveja. Outras alternativas envolvem o uso de PVPP (polivinilpolipirrolidona), que envolve altos custos operacionais; uso de sílica gel, que possui sua capacidade de remoção de resíduo limitada; e uso de enzimas que são capazes de aumentar a estabilidade coloidal [Edens et al., 2006].
Quanto à carbonatação, podem-se utilizar métodos mecânicos para se obter CO2 na cerveja, injetando o gás via carbonatação em linha (durante a passagem da
bebida por tubulação) ou em tanque (durante a transferência da cerveja filtrada para o armazenamento final). O nível de CO2 antes do envase deve ser de 2,5- 2,8 v/v
[Carvalho et al., 2007]. Ao fim do processo de maturação, a cerveja deve ser envasada.
1.1.6.Envase e armazenamento
O prazo de validade de uma cerveja é definido, principalmente, pela sua estabilidade microbiológica, espuma, cor e sabor. Estes por sua vez são afetados pela embalagem, temperatura, exposição à luz, teor de oxigênio e teor de antioxidantes [Rodrigues et al., 2011]. Quanto ao sabor, estudos indicam que, para o consumidor, nem todos sabores que mudam ao longo do tempo de armazenagem são considerados off-flavor e as transformações variam para cada estilo de cerveja. O mais importante no momento de uma apreciação de uma cerveja é que seu sabor seja constante, isto é, que o consumidor reconheça o sabor característico da marca escolhida. Atributos considerados positivos, como aroma e sabor frutado e floral, tendem a diminuir de intensidade [Vanderhaegen, 2006].
Em contrapartida, aromas e sabores doces aumentam, tal como de aromas toffee, caramelizados e defumados, o que mascara o amargor. Desenvolve -se
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também um aroma característico de folhas de groselha (Ribes nigrum) que diminui ao longo do tempo, dando espaço para o sabor de papelão, conforme ilustrado na Figura 06. A intensidade desses aromas está intimamente relacionada com o contato e disponibilidade de oxigênio da cerveja engarrafada, isto é, está relacionado com processo de oxidação [Clapperton, 1976]. Porém, como ocorre o desenvolvimento dessas características mesmo em concentrações mínimas de oxigênio, indica que parte desse envelhecimento indesejável da cerveja é um processo não oxidativo.
Figura 06. Desenvolvimento de aromas da cerveja ao longo do tempo
Fonte: Adaptado de Vanderhaegen, 2006
Ainda de acordo com Vanderhaegen [2006], além da presença de oxigênio, outro fator importante que promove o envelhecimento indesejável da cerveja é a temperatura. Estudos sensoriais mostram que o sabor de papelão é mais pronunciado quando a cerveja é armazenada em temperaturas mais altas (30°C) do que a 20°C, faixa de temperatura em que predomina a formação de aroma caramelo. O desenvolvimento de sabores e aromas típicos de envelhecimento também está associada a reação de Maillard, a formação de aldeídos, ésteres e seus produtos de degradação, formação de acetal e degradação dos compostos de lúpulo de amargor.
In te n s id a d e Tempo (dias)
Mudanças sensoriais durante armazenagem
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Em cervejas de alto teor alcóolico e escuras, para melhorar a estabilidade do sabor, uma vez que a reação de Maillard é mais intensa, deve-se reduzir a carga térmica durante o processo de produção do mosto, gerando intermediários de Maillard menos reativos. Para prevenir a formação de aldeídos lineares, deve-se evitar a oxidação lipídica durante o processo de sacarificação e fervura. Quanto aos produtos de degradação do lúpulo, o uso de iso-α-ácidos reduzidos aumenta a estabilidade de sabor. Em cervejas com alto teor alcóolico, em que a reação com compostos do lúpulo é mais suscetível, o pH mais elevado reduz os processos de esterificação, tornando a cerveja mais estável. Cervejas do estilo ale geralmente possuem mais ésteres que dão um aroma frutado ao paladar. A hidrólise desses compostos, por sua vez, pode ser evitada com o processo de pasteurização [Vanderhaegen, 2006]. O quadro 03 apresenta alguns marcadores de envelhecimento e sua origem.
Quadro 03. Marcadores de envelhecimento e sua origem
Fonte: Adaptado de Vanderhaegen, 2006
As reações de oxidação começam assim que termina o processo de fermentação, pois finda o efeito natural redutor das leveduras. Assim, para desacelerar esse processo deve-se usar matérias-primas de qualidade, apresentar
Marcador de envelhecimento Reação
3-metilbutanal Degradação de strecker, oxidação do álcool
2-Isobutil-4,5-dimetil-1,3-dioxolano Formação de acetal cíclico do aldeído com 2,3-butanodiol
Furfural Reação de Maillard
Furfuril etil éter Eterificação do etanol e compostos de Maillard
Diacetil Reação de Maillard
Acetaldeído Oxidação do etanol
n-hexanal Liberação dos produtos de oxidação de lipídios isoamil acetato Hidrólise de ésteres produzidos pela levedura Etil acetato Hidrólise de ésteres produzidos pela levedura Etil capronato Hidrólise de ésteres produzidos pela levedura Etil lactato Esterificação do etanol e ácido orgânico
4-metilpentan-2-ona Degradação dos compostos de amargor do lúpulo 3-penten-2-ona Degradação dos compostos de amargor do lúpulo Etil 2-metilbutirato Esterificação do etanol e ácido orgânico
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um processamento adequado, passar pelo processo de pasteurização (62◦C por 20 minutos) [Harrison, 2009], armazenar em baixa temperatura, utilizar antioxidantes e/ou reduzir o máximo os traços de metais e quantidade de ar na cerveja. Um mesmo mecanismo de reação pode gerar impactos positivos e negativos, como por exemplo, aldeídos de Strecker como 3-metilbutanal, 2-metilbutanal e 3-metilpropanal podem ter contribuição positiva, enquanto metional e fenilacetaldeído são relacionados com aromas que podem ser considerados desagradáveis, de batata cozida e mel, respectivamente [Rodrigues et al., 2011]. A Figura 07 resume o processo de produção de cerveja e as transformações que ocorrem nas principais etapas.
Figura 07. Principais transformações de cada etapa do processo de produção de
cerveja
Fonte: Elaborado pelo autor
1.2 Componentes da cerveja e sua relação com a qualidade
A cerveja é um produto extremamente complexo e o seu sabor é uma mistura de componentes voláteis e não-voláteis, alguns dos quais se originam a partir das matérias-primas e outros são formados durante o processo de brassagem ou fermentação. As classes de compostos voláteis predominantes são álcoois, ésteres, aldeídos, cetonas, hidrocarbonetos e ácidos orgânicos. Os álcoois e etanol são formados durante a fermentação e contribuem com um aroma alcoólico, sendo os mais prevalentes são n-propanol e o isobutanol, o que pode provocar sabores "brutos" e dureza, o 2-feniletanol, que gera sabores "doces" e os álcoois amílicos, que causam sabores frutados [Brown, 2003].25
características finais para cerveja, mas também é um forte indicador se o processo foi bem-sucedido e de sua qualidade [Morado, 2009]. O quadro 04 mostra que existem aromas desejados e indesejados.
Quadro 04. Lista de aromas e suas respectivas causas
Fonte: Adaptado de Morado, 2009
Outra classe de compostos relevantes são os polipeptídeos, que se originam a partir dos grãos de cereais utilizados na fabricação de cerveja (cevada, trigo ou outros cereais). A proteína constitui aproximadamente 10% da massa total dos grãos de cevada, com as hordeínas sendo as proteínas mais abundantes (40-50% de proteína). O teor de proteína restante é predominantemente composto de albuminas, globulinas, inibidores de amilase, lipídios, proteínas de ligação, acompanhantes e enzimas. Está bem estabelecido que as proteínas passam por uma série de modificações e hidrólise durante o processo de fabricação de cerveja, especialmente durante a maltagem e moagem [Colgrave, 2013].
As proteínas podem ser modificadas por meio de hidrólise, a glicosilação (enzimática, a adição covalente de um açúcar), acilação, desdobramento estrutural ou glicação (não-enzimática, a adição covalente de um açúcar). Grande parte do conteúdo de proteína é removida do mosto durante a fervura com o trub e durante o
Aroma Causa provável Observação
Vinho/frutado Ésteres Desejável em Ales, não em Lagers
Papelão Oxidação Presente em cervejas com prazo de
validade vencido
Sabão Autólise da levedura Indesejável
Queijo Lúpulo fora da validade Indesejável
Leite azedo Fermentação láctica Indesejável
Remédio Contamição por cloro Indesejável
Milho Contaminação microbiológica
ou falta de fervura do mosto Indesejável
Manteiga Diacetil Aceitável em baixa concentração em Ale e indesejável em Lager
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resfriamento do mosto. As modificações que ocorrem às proteínas durante a maltagem e moagem são em grande parte responsáveis pelas características do produto acabado - não só eles dão cor e sabor, mas também eles estão envolvidos com a formação e estabilização de espuma [Colgra ve, 2013]. Dentre essas proteínas, as principais são Proteína Z (associada a estabilidade da espuma) e LTP, ambas resistentes ao calor e, consequentemente, ao processo de brassagem. Há estudos que mostram que a proteína Z sofre glicação durante o processo de malteação e pode ser o motivo pelo qual se mantém resistente a ação de proteases durante o processo de produção de cerveja, sofrendo somente quebra das ligações de hidrogênio gerando uma estrutura mais estendida, relacionando a sua função na estabilidade da espuma [Han et al., 2015].
1.3 Espectrometria de massas
A Espectrometria de Massas (EM) é uma técnica analítica por meio da qual as substâncias químicas são identificadas após moléculas na fase vapor/gasosa serem bombardeadas por um feixe de elétrons de alta energia com o objetivo de gerar íons. Estes íons atravessam um campo magnético, de maneira que suas trajetórias sejam desviadas dependendo da sua massa. A relação massa/carga (m/z) é medida através da posição dos sinais no espectro. A EM pode oferecer informação qualitativa e quantitativa sobre a composição atômica e molecular de materiais inorgânicos e orgânicos. [Dudley, 2010]
O termo fingerprinting é bastante utilizado em Espectrometria de Massas. Pode ser definido como a análise de um conjunto de amostras de forma rápida, na qual um grande número de sinais é avaliado, sem a intenção de identificar cada um dos sinais isoladamente, mas sim comparar e classificar perfis, principalmente através dos sinais principais, podendo-se identificar variações, como adulterantes ou biomarcadores [Dettmer, 2007].
A EM é uma técnica amplamente utilizada na identificação de substâncias e existem diversas técnicas de ionização, porém houve um maior avanço com relação as técnicas de Ionização por Electrospray (ESI) e Dessorção por Electrospray (DESI), o que provocou o aumento da sensibilidade dos equipamentos e contribuiu para a aplicação da EM. Na Ionização por Electrospray (ESI), as substâncias da solução analítica são protonadas ou desprotonadas, formando cátions ou ânions. Esta solução
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é então nebulizada através de um tubo capilar onde se aplica uma alta voltagem. Devido à ação deste potencial aplicado no capilar e dos gases de solvatação e nebulização, o solvente presente nas gotículas é evaporado restando assim a molécula protonada ou desprotonada na fase gasosa [Gillespie&Winger, 2011].
A difusão da técnica de ESI nos últimos anos se deve a versatilidade da técnica, podendo ser aplicada para biomoléculas e biomarcadores de processos encontradas em perfumes [Haddad et. al., 2008], ativos de limpeza [Saraiva et.al., 2009], energéticos [Catharino et. al., 2011] e matrizes complexas [Riccio et.al, 2011]. Além disso, a ESI tem se mostrado uma ferramenta confiável para elucidação de compostos desconhecidos em amostras complexas, como a cerveja. A simplicidade para preparação da amostra e a rapidez em se obter fingerprints com informações químicas diversas, aumenta sua aplicabilidade em diversas áreas [Rada,2015].
1.4 PLS-DA
O PLS-DA (Partial Least Square- Discriminant Analysis) é um método estatístico apropriado quando há múltiplos dados colineares e uma grande quantidade de informação para ser classificada, até mesmo quando o número de variáveis é maior que o número de amostras. É muito aplicado para fins de categorização e eleição de marcadores, apresentando os resultados de uma forma visual e gráfica, por exemplo, em scoreplots. [Farrés, 2015]. Marcadores são características significantes associadas a certas condições, de acordo com sua relevância para explicar as diferenças entre as amostras. A regressão PLS combina características de PCA (Principal Component Analysis) e regressão linear múltipla, de forma que reduz as variáveis preditoras para um número menor de compo nentes e descreve a correlação entre elas e as variáveis resposta [Serrano-Cinca & Gutiérrez-Nieto, 2011]. Em combinação com espectrometria de massas, o PLS-DA torna-se uma ferramenta poderosa para descrição e controle de processos, tal como para identificar os principais compostos envolvidos em uma transformação, pois responde duas perguntas: Se os grupos de amostras de fato diferem entre si (análise preditiva do
scoreplot) e quais sinais melhor descrevem as diferenças entre os grupos (VIP score).
Os coeficientes da análise VIP (Variable Importance in Projection) refletem a importância de cada variável no modelo preditivo, sendo considerados os valores de maior poder explicativo, isto é, maiores do que 1. [Akarachantachote, 2013]
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2. OBJETIVO
O objetivo do estudo é encontrar marcadores das etapas principais de transformação da cerveja, usando o estilo Ale, através de espectrometria de massas combinada com PLS-DA, com foco em qualidade e produtividade.
3. METODOLOGIA
3.1 Reagentes
Soluções de metanol, hidróxido de amônia e ácido fórmico da J. T. Baker (Xalostoc, Mexico). Água deionizada foi obtida do sistema Milli-Q (millipore, EUA)
3.2 Amostras
As amostras foram obtidas de uma cervejaria artesanal (Cervejaria Nacional), São Paulo, Brasil. Foi utilizado para o estudo uma cerveja do estilo Indian Pale Ale (IPA), 60 IBUs, 7,5% ABV e feita com maltes Pilsen, Pale Ale e Cara Munich, além de lúpulo Hallertauer Magnum, Chinook, Cascade e Sincoe. As amostras foram retiradas nos seguintes estágios: início da mostura, final da mostura, fim da fervura, fim de fermentação e fim de maturação (nomeadas de m1, m2, m3, m4 e m5, respectivamente). Os experimentos foram realizados em quintuplicatas para o mesmo lote de produção em cada fase.
3.3 Preparação de amostras
As amostras foram extraídas e armazenadas a 4°C até o momento da análise, não excedendo 24 horas entre a extração e leitura das mesmas. As amostras foram preparadas misturando 10 µL da amostra da cerveja com 990 µL de metanol:água (1:1). Para análise no modo positivo, 10 µL da solução de cerveja foi misturada com 1 µL de ácido fórmico. Para o modo negativo, a mesma diluição foi usada, porém adiciona-se 1 µL de hidróxido de amônia. Todas amostras foram filtradas antes de serem injetadas no equipamento.
3.4 Equipamento
Os espectros foram obtidos usando LTQ-XL Orbitrap Discovery (Thermo Scientific, Califórnia, EUA). A seringa de injeção 500-µL Hamilton Gastight (Hamilton, Nevada, EUA) foi parametrizada para injeção contínua a 10 µL.min-1, durante 30
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segundos, com leitura no intervalo de 50 a 2000 m/z tanto no modo positivo quanto no negativo.
3.5 Tratamento dos dados
Os dados foram processados usando Metabo Analyst 3.0 e as tabelas de m/z foram obtidas do espectro bruto. Para a identificação de marcadores de cada etapa,
scoreplots foram obtidos através de PLS-DA dos dados normalizados para visualizar
se a priori haviam diferenças entre as etapas. Sendo bem-sucedida essa etapa, foi feita análise de VIP score para definir a relevância de cada marcador, comparando as etapas sequenciais de dois em dois, isto é, início e fim de mostura; fim de mostura com fervura, e assim por diante. Foi considerado um VIP acima de 2 para seleção de marcadores. As cinco etapas principais início da mostura, final da mostura, fim da fervura, fim de fermentação e fim de maturação foram nomeadas de m1, m2, m3, m4 e m5, respectivamente. A identificação dos sinais foi feita usando as bases de dados Lipid Maps, FoodDB e Metlin.
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4. RESULTADOS
MASS SPECTROMETRY FOR CHARACTERIZATION OF BREWING PROCESS
Adriana Fu Vivian, Caroline Tiemi Aoyagui, Diogo Noin de Oliveira, Rodrigo Ramos Catharino
INNOVA RE Biomarkers Laboratory, School of Pharmaceutical Sciences, University of Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil, 13083 -877.
Abstract:
Beer is a carbonated alcoholic beverage produced by fermenting ingredients containing starch, especially malted cereals, and other compounds such as water, hops and yeast. The process comprises five main steps: malting, mashing, boiling, fermentation and maturation. There has been growing interest in the subject, since there is increasing demand for beer quality aspects and beer is a ubiquitous alcoholic beverage in the world. This study is based on the manufacturing process of a Brazilian craft brewery, which is characterized by withdrawing samples during key production stages and using electrospray ionization (ESI) high-resolution mass spectrometry (HRMS), a selective and reliable technique used in the identification of substances in an expeditious and practical way. Multivariate data analysis, namely partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) is used to define its markers. In both positive and negative modes of PLS-DA score plot, it is possible to notice differences between each stage. VIP score analysis pointed out markers coherent with the process, such as malt components ((+)-catechin), small peptide varieties, hop content (humulone), yeast metabolic compounds and, in maturation, flavoring compounds (caproic acid, glutaric acid and 2,3-butanediol). Besides that, it was possible to identify other important substances such as off-flavor precursors and other different trace compounds, according to the focus given. This is an attractive alternative for the control of food and beverage industry, allowing a quick assessment of process status before it is finished, preventing higher production costs, ensuring quality and helping the control of desirable features, as flavor, foam stability and drinkability. Covering different classes of compounds, this approach suggests a novel analytical strategy: "processomics", aiming at understanding processes in detail, promoting control and being able to make improvements,
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Introduction
Beer is a carbonated alcoholic beverage produced by fermenting ingredients containing starch, mainly malted grains such as barley and wheat1. In addition to cereals, beer has water, hops and yeasts, and may include other ingredients such as fruits, herbs and brewing adjuncts2. In general, beers are composed of carbohydrates, minerals, vitamins, polyphenols a nd amino acids3. The beer production process, regardless of the batch size and style, involves the steps of malting, mashing, wort production, filtration, boiling, fermentation, maturation and bottling. The considerable interest surrounding beer is justifiable: it is one of the most widespread alcoholic beverage and is the fifth most consumed beverage in the world, standing only behind tea, coffee, milk and soda4. Despite its millenary tradition, popularity and varieties, the quantification and identification of beer components and ingredients still represent a challenge due to the high complexity of the beer matrix, lack of commercial standard, instability of ingredients and structural similarity of the constituents5. The main classification used is according to fermentation process. There are two large groups, which may be divided into Ales and Lagers. Ale beers are also known as top fermenting because its fermentation is at the top of the tanks. The lagers are known as bottom fermenting, since fermentation takes place at the bottom of the tanks1.
In the malting process, starts the production of hydrolytic enzymes during germination, such as enzymes that break down starch (α-amylase and β-amylase), the cell walls (β-glucanases) and proteins (carboxypeptidases and endopeptidases). Then, to stop the enzymatic activity, the grains are dried at above 85°C, ranging up to more than 200°C depending on the aimed malt flavor and color6. The drying process also has the function of removing volatiles that may contribute to the emergence of off-flavors in the final product and help in grain conservation, since it eliminates all the moisture7.
The next step involves grinding the malted grains in a mill. The crushed malt goes under heating to gelatinize the starch and make it more susceptible to enzymatic attack. The wort is the result of the breakdown of amylose and amylopectin molecules into small sugars, as maltose and glucose. The wort is also rich in soluble proteins, peptides and amino acids, important elements in the stability and quality of
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beer6. There is no exact definition of the intervals and temperature in wort production, which is a characteristic of each beer and varies according to the desired result. Nevertheless, four temperature ranges may be set for the process, based on enzymatic activation range, as follows7:
• 40-45°C: Enzymatic activation. Beta-glucanase enzymes become active. • 50-55°C: Proteolysis.
• 60-72°C: Action of alpha and beta-amylase. • 76-78°C: Enzymatic inactivation.
Then, it is the moment to add hop pellets and bring to boiling temperature, causing the following effects: sterilization of the wort, enzyme inactivation, water evaporation (concentration of the wort) and coagulation of proteins. This process is also important for extraction of α- and β- hops acids, responsible for beer bitterness, flavor and antiseptic action8. The next stage, the fermentation process, is the phase in which sugars are converted into alcohol. This phase depends on many cellular mechanisms, being influenced by other factors such as temperature, pH, dissolved oxygen, agitation, availability of sugars and other nutrients, the presence of contaminants and inoculation rate9. During the process, the simplest sugars are fermented first, using glucose, fructose, sucrose, maltose and maltotriose, in that order10.
When the stationary phase of fermentation starts, the majority of yeasts are removed and then maturation starts. The remaining yeast promotes two effects: higher carbon dioxide production and chemical removal of undesirable compounds such as diacetyl, acetaldehyde and acid sulphide11. Moreover, this phase aims to initiate beer clarification (sedimentation of the yeast cells) and maintain the beer in the reduced state, preventing oxidation during storage. During maturation, higher alcohols and fatty acids do not change significantly. However, other esters intensi fy, consisting mainly: ethyl acetate, isoamyl acetate, ethyl caprylate and ethyl caproate12. After the maturation, the beer must be bottled. Before this process, the remaining yeast may be removed and the beer is then cooled and may be filtered.
Mass spectrometry (MS) is a technique widely used in the identification of substances, with several ionization techniques. Great improvements have been made, especially on electrospray ionization (ESI), which caused the increased
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sensitivity of equipment and contributed to the application of MS in a number of different products, contributing to advances in quality control (QC)13. The progress of ESI in recent years is due to technical versatility and specificity, so it can be applied to biomolecules and biomarkers processes found in complex matrices14. The simplicity for sample preparation and speed in obtaining fingerprints with several chemical information increases its applicability in several areas3. The sensory properties of food and drinks are key characteristics for customer acceptability and QC. However, in brewing, QC has a subjective evaluation by a combination of visual, flavor and taste perceptions that can lead to misunderstandings. Considering this scenario, a fast, objective, versatile and analytical method such as ESI-MS is desirable for quality and process controls14.
Moreover, current trends in manufacturing processes rely on the search for variables to predict and clarify performances and events. When elements are not redundant, have a well-understood connection and data are not extensive, multiple linear regression is advisable. On the other hand, the PLS-DA (Partial Least Squares- Discriminant Analysis) algorithm is appropriate when there are multi -collinear data and much information. It is valuable for categorization purposes and biomarker election, presenting the results in a visual and graphical way, e.g. score plots15. In combination with mass spectrometry fingerprinting, PLS-DA becomes a powerful tool for process description and control, identifying the main compounds of any process. In this trend, the present contribution focuses at demonstrating the ability of this group of techniques in pointing out markers to follow up processes based on quality and productivity aspects, as well as evidencing different compounds of interest such as off-flavors.
Results and discussion
Fingerprints obtained are presented in Figure 1 and Figure 2. PLS-DA results are presented in Figure 3 and Figure 4, for negative (neg) and positive (pos) modes, respectively. In both cases, it is possible to notice statistical differences between each stage due to the graphic separation presented in the score plots. Results after VIP score analysis and components identification are summarized in Tables 116-18 and 217-22.
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Figure 1. Representative mass spectra (fingerprints) of each beer production stage (M1 - mash; M2-
wort; M3- boiling; M4- fermentation; M5- maturation.). Negative ion mode. It is possible to identify anionic species as [M+Cl]- adducts of maltose (m/z 377.06) and matotriose (m/z 379.05); and [M+H] -species for malt ose (m/z 341.09), maltotriose (m/z 503.12) and glucose (m/z 179. 04). The signal intensity is not related to VIP analysis and marker definition.
T:FTMS + p ESI Full ms [50.00-2000.00] 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R el at iv e A bu nd an ce 381 325 258 360 116 543 145 130 156175 219229 294309 326 382 458474 522 544 296 85 383 M1
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T:FTMS - p ESI Full ms [50.00-2000.00] 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R el at iv e A bu nd an ce 191 383 221 161 339 545 179 259 341 384 425 195 290 333 377 419 503 133 263 439 M4
20151214_M5_neg_3 #1-32RT:0.00-0.50AV:32NL:2.85E3
T:FTMS - p ESI Full ms [50.00-2000.00] 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R el at iv e A bu nd an ce 223 149 283 209 153189 267 343357 981 224 297 M5
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Figure 2. Fingerprints of each stage of beer production (M1- mash; M2- wort; M3- boiling; M4-
fermentation; M5- maturation). Positive ion mode. It is possible to identify cationic species corresponding to [M+K]+ and [M+Na]+ adducts of maltose (m/z 381.10),maltotriose (m/z 543.17) and glucose (m/z 219.04). The signal intensity is not related to VIP analysis and marker definition.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 381 258 543 325 219 133 156 360 130 175 294309 382 474 221 383 205 544 M1 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 381 365 175 325 360 527 543 258 130147 382 309 474 219 127 203 294 383 M2 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 381 543 219 175 383 M3 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 175 258 325 309 381 543 294 156 266 145 337 182 127 205 85 244 471 234 705 97 544 M4 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 175 258 325 309 156 381 294 543 266 182 116145 205 268 337 244 527 M5
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Figure 3. Predictive PLS -DA plots from negative mode spectra illustrate that each stage is different
from each other and the replicat es are precise between them. M1- mash; M2- wort; M3- boiling; M4- fermentation; M5- maturation.
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Figure 4. Predictive PLS-DA plots from positive mode spectra illustrat e that each stage is different
from each ot her and the replicates are precise between them. M1- mash; M2- wort; M3- boiling; M4- fermentation; M5- maturation.
Spectra presented expected signals for beer sugars as cationic species, corresponding to [M+K]+ and [M+Na]+ adducts of maltose (m/z 381.10),maltotriose (m/z 543.17) and glucose (m/z 219.04); anionic species were observed as [M+Cl] -adducts of maltose (m/z 377.06) and matotriose (m/z 379.05); and [M+H]- species for maltose (m/z 341.09), maltotriose (m/z 503.12) and glucose (m/z 179.04)23. All of them appear mainly in M2-Wort and M3-Boiling spectra, with a lower intensity in M4-Fermentation. Despite not being a quantitative method, this variation of intensity is coherent to what is expected from the process, since fermentation transforms sugars into alcohol, and thus its concentration tends to reduce. The results are summarized in Table 1 and 2.
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Table 1. Markers found after PLS-DA and VIP score analysis- Negative mode
Stage (spectra) Ion m/z
(δPPM) Compound Compound de scription
Boiling (M3)
[M+Cl]- 503.1229 (0) Peptide Cys-Leu-Met-Cys
Remaining peptides from wort proteolysis. Yeast will consume according to amino acid proprieties17.
[M+Cl]- 575.1398 (2) Peptide Asp-Asp-Glu-Tyr [M+H]- 472.1725 (2) Peptide Tyr-Glu-Tyr
[M+H]- 221.0683 (1) Flavone Crystalline compound present in hops18
Fermentation (M4) [M+H]- 545.1339 (0) Peptide Asp-His-Cys-His Remaining peptides from wort proteolysis and not used in yeast metabolism.
Fermentation (M4)
[M+H]- 443.1064 (0) Peptide Cys-Cys-Gly-Tyr
[M+H]- 425.0946 (2) Epigalloc atechin-3-O-(4-hydroxybenzoate) Epigalloc atechins are isolated from barley grains, hops and final beer18. It is a metabolite of S. cerevisae16, by means of
O-methyltrans ferase enzyme. [M+H]- 485. 1147 (3) Epigalloc atechin 3-O-(3, 5-di-O-methylgallate)
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Table 2. Markers found after PLS-DA and VIP score analysis- Positive mode
* Arg: Arginine; Asn: Asparagine; Asp: Aspartic Acid; Cys: Cysteine; Met: Methionine; Gln: Glutamine; Glu: Glutamic acid; Gly: Glycine; His: Histidine; Phe:
Phenylalanine; Ser: Serine; Thr: Threonine; Ty r: Tyrosine;
Stage (spectra) Ion m/z
(δPPM) Compound Compound de scription
Wort (M2)
[M+H]+ 366,1330 (1) Peptide Met -Thr-Asp
Peptides res ulting from prot eolysis. [M+H]+ 528,1945 (0) Peptide Met -Phe-Gln-Cys
[M+H]+ 529,1963 (0) Peptide Ser-Glu-Met-Tyr [M+H]+ 528,1959 (1) Peptide Asn-A rg-Asn-Cys
[M+H]+ 291.0795 (2) (+)- Catechin
Phenol found in large amount in hops, can be found in small concentration in malt grain (10-100 ppm) and is responsible for
astringency mouth feel19. [M+H]+ 133.0424 (2) Glutaric Acid Non-volatile organic acid20
.
Boiling (M3)
[M+H]+ 221,0807 (2) Humulone Main component of hops18. [M+H]+ 381.1075 (1) Peptide Gly-Asp-Cys-S er
Remaining peptides from wort. Yeast will consume according to amino acid proprieties17.
[M+H]+ 382.1101 (1) Peptide Cys-Glu-Met [M+H]+ 366.1330 (1) Peptide Met -Glu-Ser [M+K+] 435.1640 (0) Peptide Pro-Pro-P ro-Ser
Maturation (M5)
[M+H]+ 117,0829 (1) Caproic Acid Result of yeast activity21. [M+H]+ 252.1201 (1) 2,3- butanediol glucoside Result of S. cerevisae metabolism22 [M+H]+ 318.1487 (2) Peptide Cys-Val-Pro Peptide remaining from raw materials. [M+H]+ 319, 1825 (2) Cohulupone Cohulupone is a constituent of hops
