UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MARINA PAVANELLO
AVALIAÇÃO ÓPTICA POR GERAÇÃO DE SEGUNDO HARMÔNICO DOS PARÂMETROS DAS FIBRAS DE COLÁGENO COMO PREDITOR DE RESISTÊNCIA À PLATINA EM PACIENTES COM CARCINOMA SEROSO DE
ALTO GRAU DE OVÁRIO
EVALUATION OF COLLAGEN FIBER PARAMETERS AS PREDICTORS OF PLATINUM RESISTANCE IN PATIENTS WITH HIGH-GRADE SEROUS OVARIAN CANCER BY OPTICAL SECOND HARMONIC GENERATION
CAMPINAS 2016
MARINA PAVANELLO
AVALIAÇÃO ÓPTICA POR GERAÇÃO DE SEGUNDO HARMÔNICO DOS PARÂMETROS DAS FIBRAS DE COLÁGENO COMO PREDITOR DE RESISTÊNCIA À PLATINA EM PACIENTES COM CARCINOMA SEROSO DE
ALTO GRAU DE OVÁRIO
EVALUATION OF COLLAGEN FIBER PARAMETERS AS PREDICTORS OF PLATINUM RESISTANCE IN PATIENTS WITH HIGH-GRADE SEROUS OVARIAN CANCER BY OPTICAL SECOND HARMONIC GENERATION
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências da Saúde, área de concentração Oncologia Ginecológica e Mamária.
Dissertation presented to the Postgraduate Program in Gynecology and Obstetrics, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas, as a prerequisite to obtain the title of Master in Health Sciences, area of concentration in Gynecologic Oncology and Breast Cancer.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Luis Otavio Zanatta Sarian
COORIENTADORA: Profa. Dra. Sophie Françoise Mauricette Derchain
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA MARINA PAVANELLO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. LUIS OTAVIO ZANATTA SARIAN.
CAMPINAS 2016
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Pavanello, Marina,
P288a PavAvaliação óptica por Geração de Segundo Harmônico dos parâmetros das fibras de colágeno como preditor de resistência à platina em pacientes com carcinoma seroso de alto grau de ovário / Marina Pavanello. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
PavOrientador: Luis Otavio Zanatta Sarian.
PavDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Pav1. Neoplasias ovarianas. 2. Platina. 3. Colágeno. 4. Microscopia. I. Sarian, Luis Otavio Zanatta,1974-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Evaluation of collagen fiber parameters as predictors of platinum resistance in patients with high-grade serous ovarian cancer by optical Second-harmonic Generation Palavras-chave em inglês: Ovarian neoplasms Platinum Collagen Microscopy
Área de concentração: Oncologia Ginecológica e Mamária Titulação: Mestra em Ciências da Saúde
Banca examinadora:
Luis Otavio Zanatta Sarian [Orientador] Maria Laura Costa do Nascimento Francisco José Candido dos Reis Data de defesa: 28-11-2016
Programa de Pós-Graduação: Tocoginecologia
ORIENTADOR: PROF. DR. LUIS OTAVIO ZANATTA SARIAN
COORIENTADORA: PROFA. DRA. SOPHIE FRANÇOISE MAURICETTE DERCHAIN
MEMBROS:
1. PROF. DR. LUIS OTAVIO ZANATTA SARIAN
2. PROFA. DRA. MARIA LAURA COSTA DO NASCIMENTO
3. PROF. DR. FRANCISCO JOSÉ CANDIDO DOS REIS
4. DRA. ADRIANA YOSHIDA
5. PROF. DR. DANIEL GUIMARÃES TIEZZI
Programa de Pós-Graduação em Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Ao meu orientador, Prof. Luis Otavio, pela ajuda nos momentos decisivos,
À Prof. Sophie pela disponibilidade e empenho de sempre,
Às professoras Maria Laura e Adriana pelas sugestões pertinentes durante o processo de qualificação,
Aos professores do curso de Pós-graduação em Tocoginecologia,
Aos amigos do grupo de pesquisa que sempre me ajudaram e estiveram carinhosamente ao meu lado,
Aos funcionários do Laboratório de Patologia Especializada pela companhia agradável de todos os dias,
Ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fotônica Aplicada à Biologia Celular pela disponibilidade e ensinamentos em relação à técnica,
À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudos e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo auxílio de custos,
À minha família, em especial meus pais e minha irmã, pela confiança e pelo exemplo de dedicação,
Introdução: A sobrevida global de mulheres com carcinoma seroso de alto grau de
ovário (CSAGO) é menor em pacientes que desenvolvem a resistência à quimioterapia com platina. Estudos genéticos in vitro demonstraram recentemente que, em linhagens celulares tumorais ovarianas resistentes à platina, genes relacionados ao colágeno apresentaram aumento de expressão. Entretanto, estudos clínicos descrevendo a relação entre as fibras de colágeno tumorais e a resistência à platina em pacientes com CSAGO ainda não foram apresentados. Objetivo: Avaliar a quantidade, uniformidade e organização das fibras de colágeno tumorais em relação à resistência à platina, sobrevida livre de progressão e sobrevida global em pacientes com CSAGO. Métodos: Foram selecionadas 59 pacientes diagnosticadas com CSAGO em estádios III ou IV tratadas entre 1996 e 2012, e seguidas clinicamente até 2016. Vinte e seis (44%) mulheres foram consideradas sensíveis à platina e 33 (56%) mulheres foram consideradas resistentes à platina. A quantidade, uniformidade e organização das fibras de colágeno foram analisadas em lâminas de tissue microarray (TMA) construídas a partir dos blocos de tecido parafinado, através da microscopia óptica não linear por Geração de Segundo Harmônico (GSH). Os parâmetros do colágeno foram comparados entre as pacientes resistentes e sensíveis utilizando t-test e correlação de coeficientes. A sobrevida livre de progressão (SLP) e sobrevida global (SG) das pacientes foi comparada em relação aos valores medianos dos parâmetros do colágeno usando riscos proporcionais de Cox. Resultados: Em média, a SLP e a SG das pacientes foi de 28,2 (variação central 50% de 4,2 a 29,3) e 51,7 (variação central 50% de 24,5 a 68,9) meses, respectivamente. Pacientes sensíveis à platina apresentaram maior sobrevida em relação às pacientes resistentes (SLP: 49,5 vs. 11,4 meses, respectivamente, p<0,001; SG: 69,6 vs. 37,5 meses, respectivamente, p<0,001). Nenhum parâmetro do colágeno (quantidade, uniformidade ou organização) apresentou relação com a resistência à platina, SLP e/ou SG. Conclusão: Embora estudos experimentais laboratoriais tenham demonstrado relação entre a expressão gênica de colágeno e resistência à platina em linhagens celulares ovarianas, os dados clínicos obtidos neste estudo não demonstraram relação entre parâmetros quali-quantitativos do colágeno tumoral e resistência à platina, SLP e SG em pacientes com CSAGO.
Introduction: Overall survival of women with high-grade serous ovarian cancer
(HGSOC) is highly compromised in those who develop resistance to platinum-based chemotherapy. Exciting genomic evidence recently emerged, showing that several collagen-related genes are overexpressed in tumor cells resistant to chemotherapy. However, clinical studies describing the relationship between collagen and resistance to chemotherapy for HGSOC are missing. Aim: We evaluated the association of tumor collagen fiber parameters with platinum resistance in HGSOC patients. Methods: Clinical follow-up data (from 1996 to 2016) and tumor samples from 59 stage III-IV HGSOC patients were retrieved. Per standard clinical oncology criteria, 26 women were deemed platinum sensitive; the remainder were classified as platinum-resistant. Tumor regions of interest were analyzed using Second-harmonic Generation non-linear optical microscopy images for collagen fiber quantity, uniformity and organization. Collagen parameters were compared in resistant vs. sensitive tumors using t-tests and correlation coefficients. Cox-proportional hazards were used to determine progression-free and overall survival as related to collagen parameters.
Results: Patients had mean progression-free (PFS) and overall survival (OS) of 28.2
(50%CR 4.2-29.3) and 51.7 (50%CR 24.5-68.9) months, respectively. Patients with platinum sensitive tumors survived far longer than their counterparts with platinum-resistant tumors (PFS: 49.5 vs. 11.4 months, respectively, p<0.001; OS: 69.6 vs. 37.5 months, respectively, p<0.001). Neither collagen quantity, uniformity nor organization were related to resistance to platinum-based therapy, PFS and OS. Conclusion: Despite encouraging experimental laboratorial evidence suggesting a link between collagen-related gene expression and resistance to chemotherapy, our study analyzing collagen in actual human HGSOC specimens and following patients clinically did not show an association between collagen parameters and the development of resistance to platinum-based chemotherapy.
Key words: High-grade serous ovarian cancer, platinum resistance, collagen,
CAISM – Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti – Centro de Atenção
Integral à Saúde da Mulher CR – Central Range
CSAGO/ HGSOC – Carcinoma seroso de alto grau de ovário/ High-grade serous ovarian cancer
GSH/ SHG – Geração de Segundo Harmônico/ Second Harmonic Generation FIGO – Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia
MEC/ECM – Matrix Extracelular/ Extracellular matrix SG/ OS – Sobrevida global/ Overall survival
SLP/ PFS – Sobrevida livre de progressão/ Progression-free survival
STIC – Serous tubal intraepithelial carcinoma TMA – Tissue Microarray
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1. Câncer de ovário ... 1
1.2. Carcinoma seroso de alto grau de ovário (CSAGO) ... 2
1.3. Resistência ao tratamento com platina ... 3
1.4. Matriz extracelular e resistência à platina ... 4
1.5. Microscopia não linear por Geração de Segundo Harmônico ... 6
1.6. Justificativa ... 7 2. OBJETIVOS ... 8 2.1. Objetivo Geral ... 8 2.2. Objetivos Específicos ... 8 3. METODOLOGIA ... 9 3.1. Desenho do estudo ... 9
3.2. Seleção dos sujeitos ... 9
3.3. Critérios de inclusão e exclusão ... 9
3.4. Avaliação de resistência ao tratamento ... 10
3.5. Avaliação clínico-patológica ... 11
3.6. Microscopia não linear por Geração de Segundo Harmônico (GSH) .. 12
3.7. Análise das imagens ... 13
3.8 Análise estatística ... 13 3.8. Aspectos éticos ... 14 4. RESULTADOS ... 15 4.1. Artigo ... 15 5. DISCUSSÃO GERAL... 30 6. CONCLUSÃO ... 33 7. REFERÊNCIAS ... 34 8. ANEXOS ... 40
1. INTRODUÇÃO
1.1. Câncer de ovário
O câncer de ovário é o câncer ginecológico mais letal com aproximadamente 152.000 mortes por ano 1 e a terceira neoplasia ginecológica mais incidente, com 238.719 casos ao ano 2. Segundo a última estimativa do Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA), 6.150 novos casos de câncer de ovário são estimados em 2016 no Brasil com sobrevida média de 40% em 5 anos 3. No Estado de São Paulo a incidência desta doença é de 7,03 casos a cada 100 mil mulheres 3.
A doença apresenta um prognóstico ruim, pois a maioria dos casos são diagnosticados em estádio avançado. Além disso, recentemente, foram realizados dois grandes estudos clínicos os quais concluíram que o rastreamento utilizando métodos disponíveis (ultrassom e nível sérico de CA125) não reduzem a mortalidade do câncer de ovário 4,5. O carcinoma de ovário é raramente hereditário, somente 10 a 20% dos casos possui esse caráter. Além de que, mulheres com mutações genéticas nos genes BRCA1 e BRCA2 apresentam um risco de até 46% de desenvolver o câncer de ovário ao longo da vida 6,7.
Do ponto de vista fisiopatogênico, a carcinogênese ovariana ainda é controversa, embora haja evidência substancial indicando que, a depender do tipo histológico do tumor, mecanismos diversos estão envolvidos, como por exemplo diferentes mutações germinativas, mutações adquiridas, diversas cascatas de sinalização alteradas, entre outros 8,9,10,11. Portanto, o câncer de ovário deve ser entendido como uma série de distintas doenças que têm em comum essencialmente o mesmo sítio anatômico, mas diferem em suas características moleculares e etiológicas 12. O câncer de ovário é subdividido em relação a sua histologia, em tumores epiteliais (90%), de células do estroma sexual (8%) e de células germinativas (3%). Os tumores metastáticos no ovário (5 a 15%) são geralmente provenientes de tumores primários do trato gastrointestinal, mama ou endométrio 13. Levando em consideração a provável origem dos tumores e suas lesões precursoras, os tumores epiteliais foram classificados em dois grupos: do tipo 1 e tipo 2 14. Carcinomas serosos de baixo
grau, endometrioides de baixo grau, células claras, mucinosos e tumores de Brenner são classificados como tipo 1, totalizam 25% dos tumores epiteliais e causam 10% dos óbitos 14. Eles apresentam característica de crescimento indolente, são geralmente restritos ao ovário 14 e as mutações genéticas neles encontradas ocorrem nos genes KRAS, BRAF, ERBB2, PTEN e PIK3CA 15. Os carcinomas do tipo 2 correspondem aos serosos de alto grau, tumores indiferenciados e carcinossarcomas. Este grupo contém os carcinomas mais agressivos, os quais totalizam 75% dos tumores epiteliais e 90% dos óbitos 14. Eles apresentam crescimento rápido, normalmente são bilaterais, e geralmente não são restritos ao ovário 14.
Estudos patológicos indicam que muitos carcinomas de ovário não são derivados de tecidos provenientes do próprio ovário, ou seja, a doença se inicia em outros órgãos e as células tumorais se implantam posteriormente na superfície do ovário 16. Os carcinomas serosos de alto grau, por exemplo, apresentam células derivadas da região distal das tubas uterinas 17,18,19. No entanto, a importância da tuba uterina em relação ao tecido epitelial de superfície do ovário na gênese da doença ainda é bastante debatida 12. Há evidências relacionando os carcinomas de células claras e endometrioides com a endometriose, uma vez que todas essas patologias apresentam alta frequência de mutação somática da subunidade catalítica PIK3CA e alta interação no domínio proteico ARID1A 20,21,22. Outrossim, a maioria dos carcinomas mucinosos são provenientes de metástases para o ovário 23,24. A melhora na classificação dos subtipos utilizando marcadores imunológicos e estudos genéticos evidenciaram ainda que muitos carcinomas que tinham sido designados como endometrioides de alto grau deveriam ser classificados como carcinomas serosos 25,26.
1.2. Carcinoma seroso de alto grau de ovário (CSAGO)
O subtipo seroso de alto grau é o mais comum e responsável por 70% a 80% das mortes dos carcinomas epiteliais de ovário. Nas últimas décadas, não houve mudanças significativas na sobrevida global das pacientes 16. No presente estudo, priorizamos este subtipo não somente pela sua alta letalidade, bem como pela sua alta incidência.
Adicionalmente, vale ressaltar que os CSAGO possuem grande similaridade com o subtipo molecular triplo-negativo de carcinomas de mama 27. Entre outras semelhanças, ambos apresentam mutações no oncogene supressor de tumor TP53. Esta mutação é o evento molecular chave descrito há mais tempo nos casos de CSAGO, que também é frequentemente encontrada em carcinoma seroso intraepitelial da tuba (STIC) 28,29.
Mutações genéticas nos genes TP53, BRCA1 e BRCA2, ainda que com baixa frequência nos CSAGO, representam bons marcadores moleculares. Entretanto, vale ressaltar, que há pouco conhecimento sobre quaisquer outras mutações em oncogenes ou em genes supressores tumorais que determinam os demais tumores 29,30, prejudicando a aplicação de estratégias de predição e prevenção.
A origem do CSAGO ainda é bastante debatida. Uma das hipóteses diz que os tumores surgem devido ao deslocamento de células epiteliais das fímbrias tubárias para o epitélio de superfície do ovário, formando as lesões precursoras. Outra hipótese é que a formação do tumor se deva à semeadura de células neoplásicas provenientes de lesões precursoras das fímbrias da tuba uterina, diretamente na superfície do ovário 31,32.
1.3. Resistência ao tratamento com platina
O tratamento do CSAGO é feito basicamente pela cirurgia citorredutora e quimioterapia com agentes a base de platina, associados a taxanos 33. Um dos fatores prognósticos mais relevantes para a sobrevida das pacientes é a realização da citorredução completa, ou seja, sem doença residual, combinada com a quimioterapia com platina, podendo ser tanto adjuvante como neoadjuvante 34.
Pacientes diagnosticadas em estádios avançados apresentam baixa sobrevida global devido à dificuldades na realização da cirurgia com citorredução completa e também devido à resistência à platina 16. Estudos recentes propõem que a resistência à platina se deva à: (1) eventos moleculares que precedem a ligação da platina com os seus respectivos alvos, podendo ser no DNA ou nas estruturas citoplasmáticas; (2) alterações que estão diretamente relacionadas com o dano molecular provocado pela própria platina; (3) alterações em vias de
sinalização letais as quais desencadeiam lesões moleculares; ou ainda (4) alterações as quais são influenciadas por circuitos moleculares que não estão intimamente associados com a platina 35.
Inicialmente, as pacientes com CSAGO respondem bem à platina, porém a maioria delas apresenta recidivas e os tumores se tornam resistentes, piorando significativamente a sobrevida dessas mulheres 36. Pacientes resistentes à platina apresentam baixa taxa de resposta a outras linhas de tratamento, sobrevida global em média de 12 meses e sobrevida livre de progressão de apenas 3 a 4 meses 36. Os outros subtipos histológicos dos carcinomas de ovário respondem diferentemente à quimioterapia com platina, por exemplo, subtipos serosos de baixo grau, endometrioides de baixo grau, células claras, mucinosos e tumores de Brenner não respondem bem à platina nem sequer inicialmente, ainda que estes apresentem melhor prognóstico 36.
Em tese, no momento do diagnóstico, populações de células resistentes já estariam presentes no tumor e, apesar da quimioterapia inicial destruir as células sensíveis, ela acaba selecionando as células resistentes. A resposta à platina foi dividida recentemente em quatro categorias: 1) mulheres consideradas refratárias são aquelas onde há progressão da doença enquanto a paciente ainda está em quimioterapia ou há progressão clínica e nível de CA125 alto durante todo este tratamento; 2) aquelas consideradas primariamente resistentes são as que apresentam progressão da doença nos primeiros 6 meses após o último ciclo de quimioterapia; 3) as primariamente sensíveis são aquelas que não apresentam indício de progressão da doença nos primeiros 6 meses após o fim da quimioterapia, ou ainda que apresentam normalização ou diminuição de 50% no nível sérico de CA125 (desde de que tenha sido observado um aumento inicial de CA125); e o último grupo 4) são das mulheres com resistência adquirida as quais respondem à platina na quimioterapia inicial, mas não respondem mais na doença recidivada 37.
1.4. Matriz extracelular e resistência à platina
É sabido que as células tumorais interferem na biossíntese da matriz extracelular (MEC) do tecido normal, podendo assim modificar a estrutura e a composição da mesma 38. O principal componente da MEC é o colágeno do tipo
I, que é a proteína mais abundante no corpo humano, porém outros tipos de colágeno (III, V, VI) fazem parte da arquitetura normal da MEC 39 e estes podem aparecer modificados nos tumores epiteliais 38. Em geral, a remodelação do colágeno ocorre em todos os carcinomas, em alguns tipos específicos podem ocorrer alterações na estrutura proteica do colágeno e em outros podem ocorrer mudanças na morfologia das fibras 39.
Estudos recentes com carcinoma de ovário sugerem que a remodelação da MEC está envolvida não somente no desenvolvimento da doença, mas também no aparecimento da resistência à quimioterapia 40,41,42. Foi descrito que a MEC do carcinoma de ovário é caracterizada pela baixa densidade celular, é composta por um colágeno de alta densidade e apresenta alta regularidade das fibras 40. Diferentes padrões da MEC foram descritos em comparações entre os carcinomas serosos e mucinosos de ovário, demonstrando que a modificação do colágeno pode interferir na agressividade da doença 42.
Análises com culturas de células indicam ainda que o crescimento de células cancerígenas em microambiente tumoral pode diferir a depender dos tipos específicos de colágeno às quais as células estão ligadas. Outrossim, estas células podem responder à quimioterapia de formas distintas; por exemplo, células tumorais de ovário que crescem em um ambiente com colágeno do tipo VI são mais resistentes à platina do que células que crescem em um ambiente com colágeno do tipo III 43. Tendo como base estudos como este, foi sugerida a hipótese de que células tumorais associadas à uma densa estrutura de fibras de colágeno poderiam ser resistentes à quimioterapia 41. Essas células tendem a persistir durante o tratamento e, no momento em que a doença recidiva, elas são as principais células da nova população do tumor, tornando a paciente resistente à quimioterapia 41.
Análises de expressão gênica em larga escala (microarray), seguida de validações adicionais com, por exemplo, reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) mostraram que houve aumento de expressão do gene do colágeno do tipo XI alpha 1 (COL11A1) em casos de carcinomas de ovário. Este gene apresentou relação com a resposta quimioterápica uma vez que altos níveis de RNA mensageiro foram associados à pior resposta à quimioterapia e prognóstico 44. Além disso, estudos com cultura de células envolvendo resistência à outras drogas como topotecan e/ou paclitaxel, também detectaram
aumento na expressão dos genes e das proteínas relacionadas com o colágeno 45.
O colágeno pode ser avaliado de diferentes maneiras, sendo uma delas a avaliação das fibras estruturais. Para o estudo destas fibras, é necessário considerar a quantidade de fibras depositadas no tecido, a uniformidade das fibras, ou seja, como elas estão depositadas umas em relação às outras e a organização das fibras estruturais, de que maneira elas estão dispostas em relação ao tecido como um todo. Com isso, são determinados os três principais parâmetros para avaliação das fibras estruturais de colágeno: quantidade, uniformidade e organização.
1.5. Microscopia não linear por Geração de Segundo Harmônico
Nos últimos 30 anos, a microscopia óptica apresentou grandes avanços introduzindo métodos de imagens à base de fluorescência, como a microscopia confocal e a microscopia baseada em multi-fótons 46. O interesse em utilizar ferramentas como estas vem crescendo cada vez mais, já que elas fornecem uma análise quantitativa de componentes biológicos intrínsecos 46. A microscopia por Geração de Segundo Harmônico (GSH) é uma dessas ferramentas e consiste em uma técnica óptica não linear que detecta o colágeno no tecido extracelular de tumores sólidos, como os carcinomas de ovário 47. Esta microscopia não requer marcação ou processamentos especiais das amostras, ou seja, não destrói ou modifica, quaisquer estruturas celulares das mesmas. O material pode ser observado tanto em lâminas histológicas, submetidas a coloração ou não, em peças cirúrgicas, ou até mesmo in vivo, variando com uma profundida/espessura entre 800 a 1000 µm. A técnica permite avaliar, em alta resolução, a fibra do colágeno, sem a necessidade de reações de antígeno-anticorpo e sem danificar ou degradar a amostra 48,49.
O sinal emitido pela GSH é sensível à estruturas compostas por moléculas do tipo não centroassimétricas, tal como o colágeno, possibilitando também a detecção das mudanças associadas ao mesmo, tornando essa ferramenta importante para o entendimento da remodelação das fibras de colágeno que ocorre durante a carcinogênese 46.
Nos últimos anos, a GSH vem sendo utilizada também em carcinomas de ovário. Por exemplo, em estudos que fazem associação entre as fibras de colágeno e metástase/agressividade da doença 42, ou em estudos que descrevem esta microscopia como um possível método de diagnóstico através das imagens geradas 50.
1.6. Justificativa
Apesar dos avanços na compreensão de alterações genéticas e da fisiopatologia do carcinoma de ovário, a falta de conhecimento em relação à heterogeneidade histológica e a baixa taxa de sobrevivência são fatores desencorajadores quando comparados com os carcinomas de mama ou de próstata, por exemplo. Um dos fatores que contribuem para as baixas taxas de sobrevida é o desenvolvimento de resistência à quimioterapia. Apesar dos mecanismos genéticos, que podem vir a contribuir para a resistência à quimioterapia, o microambiente tumoral e a MEC, em particular, estão emergindo nos últimos anos como possíveis marcadores para o melhor entendimento da resistência. Portanto, acredita-se que este estudo seja o primeiro a ser realizado em mulheres diagnosticadas com CSAGO utilizando-se da microscopia por GSH para avaliar a relação entre as fibras de colágeno presentes na MEC e a resistência à platina.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Avaliar a quantidade, uniformidade e organização das fibras de colágeno através da microscopia óptica não linear por GSH em relação à resistência à platina, sobrevida livre de progressão e sobrevida global em pacientes com CSAGO.
2.2. Objetivos Específicos
2.2.1 Descrever as características clinico-patológicas em relação às diferentes respostas à platina em pacientes com CSAGO;
2.2.2 Avaliar os parâmetros do colágeno através da microscopia óptica não linear por GSH em relação às diferentes respostas à platina em pacientes com CSAGO;
2.2.3 Avaliar os parâmetros do colágeno através da microscopia óptica não linear por GSH em relação à sobrevida livre de progressão e sobrevida global em pacientes com CSAGO.
3. METODOLOGIA
3.1. Desenho do estudo
Trata-se de um estudo de coorte retrospectiva.
3.2. Seleção dos sujeitos
Foram selecionadas 59 pacientes diagnosticadas com carcinoma seroso de alto grau de ovário, em estádios III ou IV, submetidas à quimioterapia com platina, entre janeiro de 1996 a novembro de 2012 e acompanhadas até 2016. A seleção ocorreu a partir de um banco de dados previamente feito pelos alunos do grupo de pesquisa na Divisão de Oncologia do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti – Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM), da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
3.3. Critérios de inclusão e exclusão
Os critérios de inclusão foram:
Mulheres tratadas no CAISM-UNICAMP;
Obtenção de material do tumor antes do início da quimioterapia;
Pelo menos três ciclos de quimioterapia baseada em platina;
Os critérios de exclusão consistiram em:
Diagnóstico de outro câncer anterior ou concomitantemente.
O fluxograma a seguir (Figura 1) detalha a seleção dos sujeitos deste estudo:
Figura 1. Fluxograma da seleção dos sujeitos do presente estudo.
3.4. Avaliação de resistência ao tratamento
As pacientes selecionadas foram separadas em quatro grupos levando em consideração o momento em que ela apresentou, ou não, a recidiva da doença. Os grupos se deram a partir de métodos estabelecidos na literatura 37 da seguinte maneira:
Primariamente sensíveis: Pacientes sem indícios de progressão da doença nos primeiros 6 meses após o fim da quimioterapia. Pacientes com normalização do CA125 ou ainda com diminuição de pelo menos 50% no nível sérico de CA125, desde que este tenha sido alto no início, também são classificadas como primariamente sensíveis. .
Primariamente resistentes: Pacientes com indício de progressão da doença nos primeiros 6 meses após o fim da quimioterapia inicial.
135 pacientes com carcinoma seroso de ovário
13 pacientes foram
excluídas por câncer anterior ou concomitante
110 pacientes com carcinoma seroso de alto grau de ovário
84 blocos feitos antes do início da quimioterapia
96 pacientes realizaram pelo menos 3 ciclos de platina no CAISM
71 pacientes com CSAGO estádio I, II, III e IV
Refratárias: Pacientes com indícios de progressão da doença enquanto ainda estavam em quimioterapia ou dentro de um mês após o fim deste tratamento. Além disso, progressão clínica e alto nível de CA125 durante toda a quimioterapia são também parâmetros para classificação deste grupo.
Resistência adquirida: Pacientes que responderam à quimioterapia inicial, porém não responderam a este tratamento quando a doença recidivou.
De acordo com a divisão acima estabelecida, 26 pacientes (44,1%) foram classificadas como primariamente sensíveis, 17 pacientes (28,8%) como primariamente resistentes, 4 pacientes (6,8%) como refratárias e 12 pacientes (20,3%) adquiriram resistência à platina.
As pacientes primariamente resistentes, refratárias e aquelas que adquiriram a resistência ao longo da quimioterapia foram consideradas um grupo de mulheres resistentes (33 pacientes – 55,9%) e as primariamente sensíveis compõem o outro grupo de pacientes (26 pacientes – 44,1%).
3.5. Avaliação clínico-patológica
Neste estudo, foram utilizados blocos de parafina das pacientes que estavam armazenados no blocário do Hospital das Clínicas da UNICAMP e os seus respectivos prontuários que estavam armazenados no Serviço de Auxílio Médico e Estatística do CAISM. Todas os blocos foram provenientes de cirurgia citorredutora, sendo que 27 pacientes apresentaram citorredução completa, enquanto que 32 pacientes apresentaram citorredução incompleta.
Os espécimes foram analisados seguindo os critérios da Organização Mundial de Saúde – Classificação Internacional de Tumores de Ovário 51 e estadiamento FIGO 52 pela patologista responsável do estudo.
Para a montagem das lâminas de TMA, primeiramente, foram selecionadas as lâminas correspondentes de cada caso a partir das originais do tumor coradas rotineiramente com hematoxilina e eosina. Duas áreas representativas do tumor foram marcadas sobre as lâminas histológicas com tinta permanente em vidro. Para esta seleção evitou-se áreas perivasculares, elastose, infiltrados inflamatórios e artefatos de corte uma vez que estas são áreas predispostas a alteração das fibras de colágeno. Após a seleção, foi realizada a perfuração das duas áreas marcadas nos blocos de parafina
correspondente com uma das agulhas do aparelho de TMA (Beecher Instruments Microarray Technology, Silver Spring, CA, USA), na espessura de 2,0 mm. Estes tecidos retirados foram ordenados sobre o bloco receptor do aparelho de TMA com distância de 0,2 mm entre si. Após a confecção dos blocos de TMA foram realizados cortes histológicos em lâminas de vidro.
As lâminas de TMA foram então coradas com hematoxilina e eosina e para isso, inicialmente foi feita a desparafinização deixando as lâminas por 30 minutos em estufa à 110ºC, e em seguida foram feitos dois banhos em xilol. As lâminas foram hidratadas em, primeiramente, dois banhos de álcool e depois em água corrente por 5 minutos. Posteriormente, elas foram imersas na hematoxilina por 30 segundos, lavadas em água corrente por 2 minutos, imersas em eosina por 1 minuto e lavadas em água corrente por 30 segundos. Por fim, os cortes foram desidratados em banhos de álcool etílico em concentrações crescentes e diafanizadas em três banhos de xilol para, em seguida, as lâminas serem montadas com uma lamínula e resina (Entellan).
3.6. Microscopia não linear por Geração de Segundo Harmônico (GSH)
A microscopia não linear por Geração de Segundo Harmônico (GSH) foi realizada em um sistema confocal Zeiss LSM 780 NLO (Carl Zeiss, Göttingen, Alemanha), disponível no Instituto Nacional de Ciências e Tecnologia no laboratório de Fotônica aplicada à Biologia Celular (INFABiC, UNICAMP). A objetiva usada neste estudo foi de 20x/0.5 EC Plan-Neopfluar. A abertura numérica de 0,5 foi utilizada para fornecer maior resolução espacial para observar as fibras de colágeno. O campo de visão desta objetiva foi de 400µm x 400µm, porém, com o objetivo de evitar os limites da imagem, onde poderia haver distorção, um zoom digital de 1,3 foi utilizado, resultando em um campo de visão de 303µm x 303µm. O sistema de laser Mai-Tai® Ti:Safira (Spectra-Physics, Irvine, CA, EUA) foi utilizado para geração das ondas de excitação cujo comprimento foi de 800 nm, com uma largura de pulso de aproximadamente 100-fs e uma taxa de repetição de 80 MHz.
O sinal da GSH foi de 400 nm, capturado por uma lente condensadora de abertura numérica de 0,55 e distância focal entre 26 mm até ∞. O sinal do SHG foi detectado por um tubo fotomultiplicador (PMT), enquanto a autofluorescência,
por um tubo non-descanned (NDD). Foi utilizado filtro cúbico: (1) SP690 à 90 graus (Omega Filters, Brattleboro, VT, USA) o qual foi utilizado para purificar os sinais de autofluorescência e SHG, eliminando o sinal do laser de 800 nm; (2) LP490 à 45 graus, a fim de dividir os sinais do autofluorescência e SHG; e (3) SP405 posicionado à 0 graus, para detecção somente do sinal do SHG. Para iniciar os experimentos, um observador aplicou um limiar comum à todas as imagens com o intuito de distinguir os pixels do colágeno e os pixels de fundo da imagem, fazendo com que fossem eliminadas possíveis reações falso-positivas.
3.7. Análise das imagens
Os sinais da GSH foram estratificados de acordo com a estrutura das fibras de colágeno e organização no estroma usando métodos de análise padrão de imagem. Utilizou-se o programa ImageJ 53 com o OrientationJ de plug-in 54 para analisar as imagens no presente estudo; avaliando a quantidade, uniformidade e organização das fibras de colágeno presentes nas amostras. As imagens obtidas apresentaram resolução de 1024 x 1024 pixels. Na análise dos parâmetros do colágeno, 16 áreas representativas de cada imagem foram selecionadas para cobrir toda ela (256 x 256 pixels). 118 imagens foram obtidas a partir da duplicata das amostras. Para cada imagem, a média das 16 áreas foi considerado o valor final dos parâmetros do colágeno. A quantidade de sinal produzida pela GSH foi analisada indiretamente pelo software ImageJ 53, através da densidade integrada. Já a uniformidade e a organização foram analisadas através do plug-in OrientationJ 54.
3.8 . Análise estatística
A análise estatística deste estudo foi realizada pelo programa R Project for Statistical Computing version 3.1.1 55. Os valores da quantidade e da uniformidade das fibras de colágeno foram transformados para logaritmo na base e. Primeiramente, o teste de Shapiro-Wilk foi realizado para verificar a normalidade dos dados. Os parâmetros do colágeno foram comparados em resistentes versus sensíveis utilizando teste t e coeficientes de correlação. O teste ANOVA foi utilizado quando mais de dois grupos foram considerados. O
modelo proporcional de Cox foi utilizado para analisar progressão livre de doença e sobrevida global, de acordo com os parâmetros do colágeno. Os valores de p foram corrigidos pelo teste de Bonferroni, ajustando e minimizando os erros α. Valores de p menores que 0,05 foram considerados significativos.
3.8. Aspectos éticos
Este estudo é um aprofundamento do projeto já aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da UNICAMP sob o número de 1086/2009 intitulado “Correlação entre a expressão da P53, KI67, WT1, B-catenina e receptores hormonais em relação aos aspectos morfológicos e clínicos dos tumores epiteliais borderline e invasivo de ovário” sob responsabilidade do pesquisador Dr. Luis Felipe Trincas Assad Sallum e, portanto, teve a dispensa do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido uma vez que não foi realizado nenhum procedimento que fosse necessária à presença da paciente (e.g. exames laboratoriais ou coleta de material biológico), nem a publicação de dados que poderiam identificá-las.
4. RESULTADOS
4.1. Artigo
Evaluation of collagen fiber parameters as predictors of platinum resistance in patients with high-grade serous ovarian cancer by optical
second harmonic generation
Authors: Marina Pavanello 1
; Rodrigo de Andrade Natal 2; Susana Ramalho 1; Luiz Felipe Trincas Assad Sallum 1; Liliana Aparecida de Angelo Andrade 3; Carlos Lenz Cesar 4; Sophie Derchain 1; Luis Otavio Sarian 1
1. Department of Obstetrics and Gynecology – Faculty of Medical Sciences – State University of Campinas. Rua Tessália Vieira de Camargo, 126, Zip code: 13083-970 – Campinas, São Paulo, Brazil.
2. Laboratory of Investigative and Molecular Pathology, CIPED – Faculty of Medical Sciences – State University of Campinas. Rua Tessália Vieira de Camargo, 126, Zip code: 13083-970 – Campinas, São Paulo, Brazil.
3. Department of Pathology – Faculty of Medical Sciences – State University of Campinas, Campinas. Rua Tessália Vieira de Camargo, 126, Zip code: 13083-970 – Campinas, São Paulo, Brazil.
4. Department of Quantum Eletronics – “Gleb Wataghin” Institute of Physics – State University of Campinas. Rua Sérgio Buarque de Holanda, 777, Zip code: 13083-859 – Campinas, São Paulo, Brazil.
Correspondence to:
Prof. Luis Otavio Sarian, Department of Obstetrics and Gynecology – Faculty of Medical Sciences – State University of Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil. e-mail: sarian@unicamp.br
Telephone: +55 19 35219305 Fax: +55 19 35219516
Conflict of interest
The authors have no conflicts of interest to disclose.
Abstract
Introduction: Overall survival of women with high-grade serous ovarian cancer
(HGSOC) is highly compromised in those who develop resistance to platinum-based chemotherapy. Exciting genomic evidence recently emerged, showing that several collagen-related genes are overexpressed in tumor cells resistant to chemotherapy. However, clinical studies describing the relationship between collagen and resistance to chemotherapy for HGSOC are missing. Aim: We evaluated the association of tumor collagen fiber parameters with platinum resistance in HGSOC patients. Methods: Clinical follow-up data (from 1996 to 2016) and tumor samples from 59 stage III-IV HGSOC patients were retrieved. Per standard clinical oncology criteria, 26 women were deemed platinum sensitive; the remainder were classified as platinum-resistant. Tumor regions of interest were analyzed using Second-harmonic Generation non-linear optical microscopy images for collagen fiber quantity, uniformity and organization. Collagen parameters were compared in resistant vs. sensitive tumors using t-tests and correlation coefficients. Cox-proportional hazards were used to determine progression-free and overall survival as related to collagen parameters. Results: Patients had mean progression-free (PFS) and overall survival (OS) of 28.2 (50%CR 4.2-29.3) and 51.7 (50%CR 24.5-68.9) months, respectively. Patients with platinum sensitive tumors survived far longer than their counterparts with platinum-resistant tumors (PFS: 49.5 vs. 11.4 months, respectively, p<0.001; OS: 69.6 vs. 37.5 months, respectively, p<0.001). Neither collagen quantity, uniformity nor organization were related to resistance to platinum-based therapy, PFS and OS. Conclusion: Despite encouraging experimental laboratorial evidence suggesting a link between collagen-related gene expression and resistance to chemotherapy, our study analyzing collagen in actual human HGSOC specimens and following patients clinically did not show an association between collagen parameters and the development of resistance to platinum-based chemotherapy.
Key words: High-grade serous ovarian cancer, platinum resistance, collagen,
Second-harmonic Generation.
Introduction
Survival among harbors of high-grade serous ovarian cancer (HGSOC) ranges 30-40% in five years 1,2. Even though women with HGSOC initially responds well to platinum-based chemotherapy, disease progression and early relapses are common events, since resistance to platinum-based treatments may occur in over 50% of the patients 3. The mechanisms underlying resistance to platinum treatment are still not well understood.
Recent studies suggest that extracellular matrix (ECM) has a pivotal role in epithelial ovarian cancer development and acquisition of platinum chemoresistance 4,5,6. It is known that ECM in malignant ovaries is characterized by lower cell density, denser collagen, as well as higher regularity at both the fibril and fiber levels 4,5,6. This further suggests that ECM assembly in cancer may be done though newly synthesized collagen, as opposed to modification of existing collagen 4,5,6. Different patterns in ECM microstructure also appeared when distinct histologic subtypes of ovarian carcinomas (serous and mucinous subtypes) compared, which suggests that identifying pathological changes in collagen could be useful to understand and even predict cancer aggressiveness 6. Recent evidence shows that tumor cells attached to densely packaged collagen fibrils in ECM are resistant to chemotherapy 5. These cells tend to persist during treatment and repopulate the tumor giving rise to platinum resistant ovarian cancer 5.
Recently, exciting laboratorial evidence showed that some collagen-related genes are overexpressed in epithelial ovarian cancer cells resistant to platinum and other drugs currently used for treatment 7,8. This finding is in full alignment with the theory that ECM changes related to cancer development may be harbinger of resistance to currently available cytotoxic agents. Microarray analysis showed that collagen type XI alpha 1 (COL11A1) is a chemotherapy response associated gene, since high COL11A1 mRNA levels were significantly associated with poor chemoresponse and clinical outcome 7. In addition, a recent
study on cell lines detected significantly increased expression levels of collagen genes and proteins in cell lines resistant to either topotecan and/or paclitaxel 8, two major players in the treatment of ovarian cancer.
Second-harmonic generation (SHG) microscopy has been shown to be a powerful tool to analyze collagen in extracellular tissue in solid cancers, such as ovarian cancer 9. SHG technique allows evaluating, at high resolution, the collagen structure without antigen-antibody reactions, photodamage, or photobleaching 10,11. Based on the premises shown above, we felt prompted to evaluate whether collagen fiber parameters, evaluated through SHG, might be associated with resistance to platinum-based treatments in patients with HGSOC. Should these properties of collagen be proven of predictive and prognostic significance in the clinical scenario, these can evolve into affordable, relatively easy to obtain prognostic and predictive markers for patients with HGSOC, with potential to help tailored treatment choices.
Material and methods
a) Case selection
This is a retrospective cohort study. We retrieved formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue from 59 patients with stage III or IV HGSOC, treated at the Women’s Hospital of the State University of Campinas, São Paulo, Brazil, (CAISM-Unicamp) from January, 1996 to November, 2012 and followed up through 2016. All patients included were diagnosed with advanced stage (stage III or IV, International Federation of Gynaecology and Obstetrics) HGSOC and received platinum-based chemotherapy as part of first line of treatment. Twenty-six (44.1%) patients were deemed primary platinum sensitive patients, because they had no evidence of disease progression within 6 months of the end of first treatment, or had at least a 50% decrease in CA125 levels after chemotherapy 12. Seventeen (28.8%) women were considered primary platinum resistant, since they presented progression within 6 months from the end of first-line treatment. Four (6.8%) patients were refractory and had disease progression while on first treatment, or within one month after the end of first treatment, supported by clinical progression or persistently elevated CA125 12. Finally, twelve (20.3%)
patients were considered to have acquired resistance, since they were sensitive to first line chemotherapy (considering the same classification of primary platinum sensitive patients), but did not respond to platinum-based treatment when disease relapsed 12. For statistical purposes, with the exception of the twenty-six women who were deemed platinum sensitive, all other patients (33 women) were classified as platinum-resistant.
b) Pathology Review
An expert gynecological pathologist (LAA) analyzed the pathological specimens using the guidelines of the World Health Organization International Classification of Ovarian Tumors 13 and FIGO staging 14. Hematoxylin and eosin-stained whole-tissue microarray cores were designed by the same pathologist and she selected two areas of each case to be analyzed with SHG microscopy. The pathologist avoided perivascular areas, elastosis, inflammatory infiltrates and sectioning artifacts. She was blinded to the SHG data, therefore removing the possibility that collagen visualization influenced how the tissues were reviewed and interpreted. This study was approved by the local institutional ethics committee (CEP 1086/2009).
c) Second-harmonic generation microscopy (SHG) imaging
Multiphoton laser-scanning microscopy was performed on a Zeiss LSM 780-NLO confocal system (Carl Zeiss AG, Göttingen, Germany) available at the National Institute of Sciences and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABiC, UNICAMP). The objective used on this study was a 20x/0.5 EC Plan-Neofluar. The numerical aperture (0.5) was necessary to provide the spatial resolution to observe the fibrils. The field of view of this objective was of 400 x 400 μm but to avoid the edges of the picture, where the fluorescence is weaker, we used a digital zoom of 1.3 to choose an area of 303 x 303 μm, which performed quite similar. The excitation wavelength was provided by a Mai-Tai ® Ti:Sapphire laser (Spectra-Physics, Irvine, CA, USA) and the values were 800nm, with an approximately 100-fs width pulse at an 80-MHz repetition rate.
A blinded observer applied a common threshold to all images to distinguish collagen pixels from background pixels to eliminate these. 118 images were suitable for analysis. SHG forward signal at 400nm was composed with a 0.55 NA – WD 26mm condenser lens and detected by a non-descanned (NDD) photomultiplier tube (PMT). A short-pass SP690 (Omega Filters, Brattleboro, VT, USA) was tuned to an excitation wavelength of 800nm followed by a filter cube, composed of a LP490 dichroic mirror at 45 degrees and an SP405 filter at 0 degrees, to isolate the backscattered Second-harmonic generation signal 15.
d) Evaluation of collagen fibers and image analysis
SHG signals were stratified according to collagen fiber structure and organization in stroma using image pattern analysis methods. ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) and OrientationJ plug-in were used in SHG images to evaluate the quantity, uniformity and organization of collagen fiber. Individual images of 1024 x 1024 pixels were acquired, it was subtract a common factor in all images to exclude entire background. To analyze collagen fiber quantity, uniformity and organization, 16 representative areas in each image were chosen to cover entire image (256 x 256 pixels). For each image, the final collagen parameter value considered was the mean of the 16 areas. For each region of each sample, the mean of each three final collagen parameters values was considered. The quantity of collagen fibers was indirectly analyzed by the ImageJ software, which performed Integrated Density to evaluate the quantity of SHG signal. Using the OrientationJ plug-in 16, we quantified uniformity and organization (Figure 1).
e) Statistics analysis
All statistical analyses were performed using the R Project for Statistical Computing version 3.1.1 (http://www.r-project.org/). Log-transformation in base e was used to analyze collagen fiber parameters. Shapiro-Wilk test was used to assess data normality. Collagen parameters were compared in resistant vs. sensitive tumors using t-test and correlation coefficient. Anova test was used when more than 2 groups were considered. Cox-proportional hazards were used to determine progression-free and overall survival as related to collagen
parameters. p-values were corrected using the Bonferroni test adjustment to minimize α errors, and adjusted p-value <0.05 were considered significant.
Results
Clinicopathological features
Table 1 shows the clinicopathological features of the women as related to
sensitivity to platinum-based treatments. On average, patients were 58.9 (50% central-range (CR) 50.5 to 66.0) years old, and roughly 74% were postmenopausal. Age, menopausal status and CA125 levels were not associated with resistance to platinum. Patients had mean progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) of 28.2 (50%CR 4.2-29.3) and 51.7 (50%CR 24.5-68.9) months, respectively. However, patients with platinum sensitive tumors survived far longer than their counterparts with platinum-resistant tumors (PFS: 49.5 vs. 11.4 months, respectively, p<0.001; OS: 69.6 vs. 37.5 months, respectively, p<0.001).
Evaluation of collagen parameters and platinum resistance in HGSOC
Figure 2 represents the boxplots of the distribution of collagen fibers quantity,
uniformity and organization as related to resistance to platinum-based therapy. None of these parameters were shown to differ in relation to resistance to platinum.
Evaluation of collagen parameters and patient survival
Table 2 depicts the survival analysis results for patient PFS and OS as related
to collagen quantity, uniformity and organization. None of the studied collagen parameters was associated with PFS or OS.
Discussion
Our study shows that, in spite of previous laboratorial evidence of the relationship between collagen-related gene expression and resistance to platinum-based treatments, direct measurement of collagen parameters in HGSOC may not help predict chemoresistance. We studied collagen quantity,
uniformity and organization, therefore covering the three major parameters used to describe collagen in animal tissues. All these characteristics, however, seemed to behave similarly in women with platinum-resistant or platinum-sensitive tumors. To the extent of our knowledge, there are no published data on the relationship between collagen structure and chemoresistance in HGSOC, and we are pioneer in this analysis.
In addition to the relevant laboratorial evidence linking ovarian cancer resistance to platinum and collagen-related gene expression, previous studies on collagen structure, using SHG microscopy, also documented a relationship between ECM alterations and solid tumor aggressiveness or metastatic outcomes 6,9. Evaluating nonlinear optical microscopy techniques (NLO), the group of microscopy techniques to which SHG belongs, Adur et al. 6 imaged 34 ovarian biopsies from patients with ovarian tumors ranging from benign masses to HGSOC, and found significant differences in the content, distribution and organization of collagen fibrils in the stroma as well as in the morphology and fluorescence lifetime from epithelial ovarian specimens. These results provided a roadmap for the further use of NLO techniques in ovarian pathology, and laid the basis for us to evaluate resistance to platinum through the quantity, uniformity and organization of collagen using SHG. Another study worthy to mention, Burke et al. 9, evaluating breast and colorectal tumors with SHG, noted a significantly worse survival profile for patients harboring tumors with increased ration of the forward-to-backward emitted SHG signals, meaning that tumors with collagen showing higher quantity, uniformity and organization have worse survival.
Very recent studies have detected a possible connection between collagen and drug resistance 7,8. However, these studies were experimental, in vitro, and did not provide any evidence of a differential clinical behavior of these tumors when exposed in vivo to these anticancer drugs. Junuchowski et al. 8, for instance, described that COL1A1, COL5A2, COL12A1 and COL17A1 genes had a less than 50-fold increase in mRNA expression in drug resistant specimens, whereas the COL1A2, COL5A1, COL21A1 genes had a greater than 50-fold increase in mRNA expression in drug-resistant specimens. However, those authors warned that these changes in expression provide only a preliminary view
into the role of these proteins in cytostatic drug resistance of cancer cells and that the issue needs further investigation. Another attempt to evaluate collagen gene expression in the ECM vs. chemoresistance was made by Wu et al. 7, who detected using immunoprecipitation and immunofluorescence that in resistant cells, anticancer drugs enhanced binding activity between COL11A1 and PDK1. It is also worth mentioning the study by Yu et al. 17, who described the knockdown of the microRNA miR-29/a/b/c, which increased the ability of cells to escape cisplatin-induced cell death partly through upregulation of collagen type alpha 1 (COL1A1). All these attempts provided a solid theoretical base for our experiments, since it seems clear from these data that collagen metabolism is in some way involved, or at least affected, by the mechanisms leading to the development of drug resistance.
Our study builds upon that knowledge, and innovates in that we tried to directly measure collagen parameters through state-of-the-art – although consecrated – collagen evaluation technique. We examined whether these parameters relate to chemoresistance in the clinical, not laboratorial scenario, searching for information that could eventually illustrate the clinical decision of, e.g. deciding whether to continue a chemotherapeutic regimen or not. Should our study reveal any relationship between the studied collagen parameters and chemoresistance development, the importance of the data would be obvious. However, our data suggests that our approach using SHG in HGSOC specimens may not be successful, although further attempts to reexamine the question using similar approaches may still be valid, e.g. by expanding sample size and/or evaluating a larger set of collagen parameters. We emphasize that the previous laboratorial evidence linking the expression of collagen-associated genes and the development of chemoresistance is strong. Studies demonstrated that levels of COL11A1 gene continuously increase during ovarian cancer progression, with the highest expression in recurrent metastases 18. Although, this type of collagen cannot be detected through SHG 19, therefore innovative approaches using e.g. mass spectroscopy may be valid to test whether the detection of this type of collagen may display some practical value in the clinical scenario.
Figure 1: Quantity, uniformity and organization of collagen fibers in the same
patient with high-grade serous ovarian carcinoma. A is hematoxylin and eosin-stained image (20x), B is autofluorescence image (40µm) C is collagen fibers image (40µm) and D is an overlap image with autofluorescence and collagen fibers (40µm).
Figure 2: Boxplots representing the distribution of collagen fibers parameters: (A)
quantity; (B) uniformity; and (C) organization, comparing resistant and sensitive tumors.
B
Table 1: Clinicopathological features of all the patients. Platinum sensitive (n=26) Platinum resistant (n=33)
p value All cases
Age (years) Mean 59.0 58.8 0.967 58.9 50% CR 49.7 – 66.0 51.0 – 65.0 50.5 – 66.0 Menacme Yes 6 (27.3%) 5 (16.1%) 0.521 11 (26.2%) No 16 (72.7%) 26 (83.9%) 42 (73.8%)
CA125 serum level (U/mL) Mean 2476 1558 0.529 1969 50% CR 193-1994 334-1802 263-2048 Progression-free survival (months) Mean 49.5 11.4 <0.001* 28.2 50% CR 17.7 – 81.7 2.3 – 8.1 4.2 – 29.3 Overall survival (months) Mean 69.6 37.5 <0.001* 51.7 50% CR 32.9 – 93.7 21.0 – 49.6 24.5 – 68.9 50% CR = 50% Central Range.
Table 2: Quantity, uniformity and organization of collagen fibers and patient
survival.
PFS (HR) p OS (HR) p
Quantity
>Mean 1.69 (0.94 to 3.04) 0.074 1.65 (0.85 to 3.21) 0.130
<Mean Ref. Ref.
Uniformity
>Mean 1.60 (0.89 to 2.86) 0.110 1.39 (0.72 to 2.70) 0.310
<Mean Ref. Ref.
Organization
>Mean 1.14 (0.64 to 2.03) 0.650 0.90 (0.46 to 1.76) 0.770
<Mean Ref. Ref.
PFS= Progression-free survival; OS= Overall survival; HR= Hazard Ratio; Ref. = referential.
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5. DISCUSSÃO GERAL
Este estudo procurou averiguar se evidências obtidas em experimentação laboratorial, sugerindo a associação entre a expressão de genes relacionados à produção de colágeno e a aquisição de resistência à quimioterápicos, teriam tradução em um contexto eminentemente clínico-patológico. Desta forma, em lugar de avaliar diretamente a expressão de genes relacionados ao colágeno, optou-se por caracterizar a estrutura das fibras de colágeno em si, ou seja, sua quantidade, uniformidade e organização, e a relação destes parâmetros com a resistência à quimioterapia com platina em mulheres com CSAGO. Avaliou-se também a associação destes parâmetros com sobrevida livre de progressão e sobrevida global das pacientes. Em essência, as evidências laboratoriais que nos motivaram a realizar o estudo não encontraram expressão no contexto clínico-patológico.
Embora recentes estudos in vitro tenham demonstrado que a expressão dos genes relacionados ao colágeno é maior em células ovarianas resistentes à platina, este resultado não é reproduzível quando a mesma associação é feita diretamente com a avaliação quantitativa das fibras de colágeno no próprio microambiente tumoral do ovário em mulheres, evidenciando que estudos que avaliam expressão gênica devem ser validados por técnicas adicionais. Quantidade, uniformidade e organização das fibras de colágeno são os três principais parâmetros utilizados para descrever colágeno em tecidos animais. No entanto, em nosso estudo, essas três características ocorreram de maneira semelhante em pacientes com carcinoma de ovário resistentes e sensíveis à platina.
A microscopia óptica não linear por GSH vem sendo bastante aplicada à estudos como este, uma vez que esta técnica não envolve a necessidade de reações de antígeno-anticorpo e não danifica ou degrada a amostra. A GSH já foi utilizada previamente em carcinomas de ovário e demonstrou que as fibras de colágeno apresentam relação com metástase e agressividade da doença 42,47. Adur e colaboradores 42, aplicando a técnica da GSH em 34 biópsias de ovário, sendo essas provenientes de tecido não-tumoral e dos subtipos histológicos seroso e mucinoso, destacou a diferença significativa na quantidade e
organização das fibras de colágeno do estroma destes tumores. Resultados como este nos encorajaram a refinar a utilização da técnica de GSH em casos de carcinoma de ovário relacionando o colágeno com um possível entendimento da resistência à platina. Vale ressaltar ainda que a aplicação da GSH já foi realizada para outros carcinomas; como exemplo, Burke e colaboradores 47 avaliaram câncer de mama e câncer de colo retal e constataram que pacientes com maior quantidade, uniformidade e organização das fibras de colágeno apresentavam pior sobrevida 47.
Recentes pesquisas envolvendo cultura de células foram ainda mais estimulantes para que se realizasse este estudo. Estudos in vitro detectaram uma possível relação entre o colágeno e a resistência à quimioterapia em carcinoma de ovário 44,40. Junuchowski e colaboradores 45, por exemplo, descreveram que havia diferença de expressão em genes relacionados ao colágeno em células tumorais de ovário resistentes ao tratamento com platina (diminuição de expressão dos genes: COL1A1, COL5A2, COL12A1 e COL17A1; e aumento de expressão dos genes COL1A2, COL5A1 e COL21A1). Outrossim, Wu e colegas 44 determinaram a relação entre as fibras de colágeno presentes na MEC e resistência a platina uma vez que detectaram que, na presença de quimioterápicos, as células resistentes reforçam a ligação entre COL11A1 e PDK1. Porém, estes estudos são apenas in vitro e não fornecem nenhuma evidência de diferente comportamento clínico desses tumores quando expostos in vivo à platina. Além disso, estes autores deixam claro em seus estudos que essas mudanças de expressão gênica fornecem apenas uma visão preliminar do microambiente tumoral sendo necessários mais estudos para aprofundar o conceito que relaciona colágeno e resistência à platina.
Estudos que envolvem microRNA também foram feitos em carcinoma de ovário com o objetivo de refinar o entendimento da relação entre colágeno e resistência. Yu e seus colegas 56, descreveram que a baixa expressão de miR-29/a/b/c aumenta a habilidade das células de escapar da indução da morte celular dada pelo quimioterápico através do aumento da expressão de colágeno tipo alfa I (COL1A1). Estudos como estes fizeram com que nos baseássemos em evidencias sólidas para a realização desta pesquisa, uma vez que aparentemente o metabolismo do colágeno parece estar envolvido de alguma forma com os mecanismos que desenvolvem a resistência à quimioterapia.
