Purificação de anticorpos monoclonais utilizando IMAC em membranas de fibra oca de PEVA : c : omparação dos agentes quelantes IDA, CM-Asp e TREN

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO:

DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS

PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS UTILIZANDO IMAC EM MEMBRANAS DE FIBRA OCA DE PEVA: COMPARAÇÃO DOS AGENTES

QUELANTES IDA, CM-ASP E TREN ~

Eng. Químico lgor Tadeu Lazzarotto Bresolin

Prof' Dr" Sônia Maria Alves Bueno

Orientadora

Disseriação apresentada à Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisrtos exigidos para a obtenção do titulo de Mestre em Engenharia Química.

Campinas - São Paulo

Julho de 2006

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BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA E ARQUITETURA - BAE - UNICAMP

B754p

Bresolin, Igor Tadeu Lazzarotto

Purificação de antiocorpos monoclonais utilizando IMAC em membranas de fibra oca de PEV A: comparação dos agentes quelantes IDA, CM-Asp e TREN I lgor Tadeu Lazz.arotto Bresolin.--Camp:inas, SP: [s.n.], 2006.

Orientador: Sônia Maria Alves Bueno

Dissertação (mestrado) -Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química.

1. Anticorpos monoclonaias. 2. Imunoglobulina G. 3. Cromatografta de afinidade. 4. Íons metálicos. 5.

Quelantes. L Bueno, Sônia Maria Alves. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Quimica. III. Título.

Titulo em Inglês: Purification of monoclonal antibodies using IMAC in PEV A hollow fiber membranes: comparison of chelating agents IDA, CM-Asp and TREN

Palavras-chave em Inglês: Monoclonal antibodies, IgG1, IMAC, Iminodiacetic acid (IDA), Carboxymethyl aspartic acid (CM-Asp), Tris-2 (aminoethyi)amine) TREN

Área de concentração: Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Titulação: Mestre em Engenharia Química

Banca examinadora: Gisella Maria Zanin e Paulo de Tarso Vieira e Rosa Data da defesa: 11/07/2006

Dissertação de Mestrado defendida por lgorTadeu Lazzarotto Bresolin e aprovada em 11 de julho de 2006 pela banca examinadora constituída pelos doutores:

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Profa. Dra. Sônia Maria Alves Bueno Orientadora - FEQ/UNICAMP

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Prola. Dra. Gisella Maria Zanin DEQ/UEM

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Prol. Dr. Paulo de T arso Vieira e Rosa IQ/UNICAMP

Este exemplar corresponde

à

redação final da Dissertação de Mestrado em Engenharia Química defendida por Jgor Tadeu Lazzarotto Bresolin e aprovada pela comissão julgadora em 11 de julho de 2006.

7

À memória

cto

meu querido pai Tadeu Alexandre Bresolin

Agradecimentos

A Deus, criador onipotente e onipresente.

A minha mãe Jud~e paio incentivo dado durante toda a vida.

A professora Ora. Sônia Maria Alves Bueno pela orientação e presença amiga no decorrer de todo este trabalho.

Aos professores Ora. Wi~a M. S. C. Tamashiro, Dr. Everson Alves Miranda e Ora. Ângela Maria Moraes pelas sugestões apresentadas no exame de qualificação e por disponibilizarem as instalações de seus laboratórios.

A professora Ora. Elisabeth de Fátima Pires Augusto do Laboratório de Biotecnologia Industrial do IPT /SP pelo fornecimento de material e análises.

Aos amigos e colegas de laboratório pela convivência, críticas, sugestões, trocas de idéias e muitos cafezinhos: Amaro, Ana Paula, Alessandra, Cristiane, Érika, Fabiana, Geórgia, Goran, lsa, lvanildo, João Paulo, Leonardo, Luciana, Lucimara, Mariana, Moysés, Oselys, Paula, Raquel e Tashima.

Ao grupo de estudo das disciplinas: Edgar, Gabriel, João Paulo e Lu.

As amigas da graduação Marina e Francine, pela grande ajuda e amizade.

Ao pessoal do 18 pelo auxilio, presteza e dedicação em todos os momentos: Ca~a. Dirce, Loren e Ellen.

Aos amigos sempre presentes em todos os momentos: Mareio, Ana Gláucia, Leonardo, Patrícia, Erico, Ana Elisa e Enéas.

Ao professor Lisbôa e seu aluno Paulinho pala grande estima e amizade.

A todos meus grandes amigos, aos que fiZ durante esta jornada, amigos de trabalho, do dia a dia, amigos realmente imprescindíveis em minha vida.

A todos os professores e funcionários da FEQ que, de uma forma ou outra, contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho.

Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudo.

"Todos têm alguma missão. Mesmo que você não a tenha, ela surgirá um dia e você saberá qual. Até lá, faça o que tem que ser feito agora com dedicação, seriedade e entusiasmo. Tudo o que você fizer agora será útil na sua vida futura, contribuindo com conhecimento e capacidade. Nada é inútil."

Sumário viii SUMÁRIO Sumário viii Lista de Figuras xi Lista de Tabelas xv Resumo xvii Abstract xviii Capítulo 1: Introdução 1

1.1. Anticorpos monoclonais e sua relevância 1

1.2. Cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados 2

1.3. Objetivo 3

Capítulo 2: Revisão Bibliogrâfica 5

2.1. Anticorpos monoclonais 5

2.2. Purificação de anticorpos monoclonais 11

2.3. Cromatografia de Afinidade por Íons Metálicos Imobilizados (IMAC) 16

2.3.1. Química de coordenação 17

2.3.2. Escolha do íon metálico 19

2.3.3. Escolha do agente quelante 20

2.3.4. Mecanismos de adsorção e dessorção 24

2.3.5. Aplicações de IMAC 26

2.4. Membranas de Afinidade 27

Sumário

Capitulo 3: Materiais e Métodos 3.1. Materiais

3.1.1. Reagentes

3.1.2. Anticorpos Monoclonais

a) Sobrenadante de Cultura Celular b) Fluido ascítico

3.1.3. Membrana de fibras ocas de PEVA

3.2. Métodos

3.2.1. Ativação das membranas com epicloridrina

3.2.2. Imobilização de agentes quelantes nas membranas ativadas com epicloridrina

a) Imobilização do IDA

b) Síntese e imobilização do CM-Asp c) Imobilização do TREN

3.2.3. Determinação da quantidade de metal imobilizado

3.2.4. Preparação do sobrenadante de cunura celular contendo anticorpos

ix 33 33 33 33 33 34 34 35 35 36 36 36 37 37 monoclonais 38

3.2.5. Experimentos cromatográficos com membranas finamente cortadas 39

3.2.6. Quantificação de proteína total 41

3.2.7. Eletroforese SDS-PAGE 41

3.2. 8. Westem blotting 42

3.2.9. Quantificação da lgG1 43

3.2. 1 O. Titulação da lgG, 44

3.2.11. Purificação de lgG, em gel de Sepharose-proteina G 45

3.2.12. lsotermas de Adsorção 45

3.2.13. Determinação das Curvas de Ruptura 46

a) Construção do módulo de filtração 46

b) Ativação e imobilizaçao dos agentes quelantes nas membranas de PEVA

contidas no módulo 47

c) Experimentos de filtração do sobrenadante de cultura celular precipttado e

Sumário X

Capítulo 4: Resultados e Discussão 51

4.1. Preparação do sobrenadante de cultura celular precipitação e diálise 51

4.2. Influência do agente quelante na purificação de lgG,: níquel imobilizado 52 4.2.1. Utilização do tampão Tris-HCI como agente competidor 52 4.2.2. Efeito da adição de NaCI no tampão de adsorção Tris-HCI 56 4.2.3. Utilização do tampão fosfato com imidazol como agente competidor 59

4.3. Influência do agente quelante na purificação de lgG,: zinco imobilizado 61 4.3.1. Utilização do tampão Tris-HCI como agente competidor 61 4.3.2. Efeito da adição de NaCI no tampão de adsorção Tris-HCI 66

4.4. Influência do agente quelante na purificação de lgG,: cobalto imobilizado 69 4.4.1. Utilização do tampão Tris-HCI como agente competidor 69

4.5. Atuação dos agentes quelantes IDA, CM-Asp e TREN como grupos ionogênicos: purificação de lgG, por troca iônica

4.6. Experimentos com anticorpos monoclonais anti-IL6

4. 7. lsotermas de Adsonção

4.8. Determinação da curva de ruptura 4.8.1. Experimentos de filtração 4.8.2. Euição

Capítulo 5: Conclusões

Capítulo 6: Sugestões para Trabalhos Futuros Capítulo 7: Referências 71 76 79 86 66 89 91 93 94

Lista de Figuras xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 2-1. Estrutura da imunoglobulina G (lgG) e seus fragmentos gerados pelas

enzimas proteoliticas papaína e pepsina. 6

Figura 2-2. Esquema da produção e seleção de células de hibridomas e posterior cultivo dessas células para obtenção de anticorpos monoclonais em animais (in vivo) ou em cultura celular (in vftro), a partir da técnica desenvolvida por Kõhler e

Milstein em 1975. 8

Figura 2-3. Agentes quelantes e íons metálicos: especificidade em função da

capacidade de adsorção. 22

Figura 2-4. Estrutura dos agentes quelantes: (a) IDA; (b) CM-Asp; (c) TREN. 22

Figura 3-1. Esquema do sistema cromatográfico de baixa pressão, utilizado nos

experimentos. 39

Figura 3-2. Esquema do módulo de fibras ocas de PEVA. 46

Figura 3-3. Esquema dos modos de lavagem das fibras ocas de PEVA contidas no

módulo de filtração. 47

Figura 3-4. Esquema da montagem utilizada na ativação das membranas de

PEVA contidas no módulo de filtração. 48

Figura 3-5. Esquema da montagem do experimento de filtração. 49

Figura 4-1. Eletroforese SDS-PAGE característica das precipitações de sobrenadante de cultura celular com sulfato de amônia a 50% de saturação,

seguida de diálise. 51

Figura 4-2. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em Tris-HCI 50 mM

Usta de Figuras XÍÍ

Figura 4-3. Cromatografia de sobrenadante de cu~ura celular em Tris-HCI 50 mM

pH 7,0, em coluna contendo PEVA-CM-Asp-Ni2•. 53

Figura 4-4. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em Tris-HCI 50 mM,

pH 7,0, em coluna contendo PEVA-TREN-Ni2•. 54

Figura 4-5. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em Tris-HCI 50 mM,

NaCI1M, pH 7,0, em coluna com PEVA-IDA-Ni2•. 56

Figura 4-6. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em Tris-HCI50 mM, NaCI1 M, pH 7,0, em coluna com PEVA-CM-Asp-Ni2•. 57 Figura 4-7. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em Tris-HCI 50 mM, NaCI1 M, pH 7,0, em coluna com PEVA-TREN-Nj>+. 57

Figura 4-8. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em tampão fosfato 50 mM, NaCI 0,25 M, imidazol 2 mM, pH 7,0, em coàma contendo

PEVA-TREN-~- 00

Figura 4-9. Cromatografia de sobrenadante de cu~ura celular em Tris-HCI 50 mM

pH 7,0, em coluna com PEVA-IDA-Zn2•. 61

Figura 4-10. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em Tris-HCI50 mM

pH 7,0, em coluna com PEVA-CM-Asp-Zn2•. 62

Figura 4-11. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em Tris-HCI 50 mM, pH 7,0, em coluna contendo PEVA-TREN-Zn2•. 62

Figura 4-12 - (a} Eletroforese SDS-PAGE sob condições não redutoras e (b} Westem blotting referente ao experimento de purificação de lgG, utilizando

PEVA-CM-Asp-Zn2•. 65

Figura 4-13. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em Tris-HCI 50 mM, NaCI1 M, pH 7,0, em coluna com PEVA-IDA-Zn2._ 67

Figura 4-14. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em Tris-HCI 50 mM, NaCI1 M, pH 7,0, em coluna com PEVA-CM-Asp-Zn2._ 67

Usta de Figuras xiii Figura 4-15. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em Tris-HCI 50 mM, NaCI1 M, pH 7,0, em coluna com PEVA-TREN-zn2+. 68

Figura 4-16. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em Tris-HCI 50 mM

pH 7,0, em coluna contendo PEVA-CM-Asp-Co2+. 70

Figura 4-17. Cromatografia de sobrenadante de cunura celular em PEVA-IDA. 71

Figura 4-18. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em PEVA-CM-Asp. 72

Figura 4-19. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular em PEVA-TREN. 72

Figura 4-20. (a) Eletroforese SDS-PAGE sob condições não redutoras e (b) Westem blotting referente ao experimento de purificação de lgG1 utilizando

PEVA-IDA-sem metal. 75

Figura 4-21. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular do anticorpo monoclonal anti-IL6 em Tris-HCI 50 mM, pH 7,0, em coluna contendo

PEVA-CM-Asp-Zn2+ 77

Figura 4-22. Cromatografia de sobrenadante de cultura celular do anticorpo monoclonal anti-IL6 em Tris-HCI 50 mM, pH 7,0, em coluna contendo

PEVA-IDA-sem metal. 77

Figura 4-23. lsoterma de adsorção de lgG, pré-purificada em membranas PEVA-IDA-sem metal: ajuste não~inear dos parâmetros segundo modelo de Langmuir. 79

Figura 4-24. lsoterma de adsorção de lgG1 pré-purificada em membranas PEVA-CM-Asp-Zn2+: ajuste não-linear dos parâmetros segundo modelo de Langmuir. 80

Figura 4-25. Gráfico de Scatchard para os dados de adsorção de lgG1 pré-purificada em membranas (o) PEVA-IDA-Zn2+,

r"

=

0,397 (SERPA, 2002), (D) PEVA-CM-Asp-Zn2+,

r"=

0,989 e (Ll) PEVA-IDA-sem metal,

r"=

0,736. 81 Figura 4-26. lsoterma de adsorção de lgG, pré-purificada em membranas PEVA-IDA-sem metal: ajuste não-linear dos parâmetros segundo modelo de

Usta de Figuras xiv Figura 4-27. lsoterma de adsorção de lgG, pré-purificada em membranas PEVA-IDA-sem metal: ajuste não~inear dos parâmetros segundo modelo de Temkin. 84 Figura 4-28. lsoterma de adsorção de lgG1 pré-purificada em membranas PEVA-CM-Asp-Zn2+: ajuste não~inear dos parâmetros segundo modelo de Temkin. 84 Figura 4-29. lsoterma de adsorção de lgG, pré-purificada em membranas IDA-Zn2+: ajuste não-linear dos parâmetros segundo modelo de Temkin. 85

Figura 4-30. Curva de ruptura do experimento em módulo PEVA-IDA-sem metal. 87

Figura 4-31. Curva de ruptura do experimento em módulo PEVA-CM-Asp-Zn2+. 88

Figura 4-32. Perfil cromatográfico típico obtido nas etapas de lavagem e eluição dos experimentos de filtração realizados com o módulo contendo PEVA-IDA-sem

metal. 89

Figura 4-33. Perfil cromatográfico típico obtido nas etapas de lavagem e eluição dos experimentos de filtração realizados com o módulo contendo PEVA-CM-Asp-90

Usta de Tabelas XV

LISTA DE TABELAS

Tabela 2-1. Alguns agentes quelantes utilizados em IMAC 23

Tabela 3-1. Características da membrana de PEVA 34

Tabela 4-1. Balanço de massa das cromatografias utilizando tampão de equilíbrio Trts-HCI a pH 7,0 e dessorção por gradiente degrau de aumento da concentração de Trts-HCI, utilizando o íon metálico Ni2+ quelatado aos agentes quelantes IDA,

CM-Asp e TREN 54

Tabela 4-2. Balanço de massa das cromatografias utilizando tampão de equilíbrio Tris-HCI, NaCI 1M a pH 7,0 e dessorção por gradiente degrau de aumento da concentração de Tris-HCI, NaCI 1M, utilizando o íon metálico Ni2+ quelatados aos

agentes quelantes IDA, CM-Asp e TREN 58

Tabela 4-3. Balanço de massa da cromatografia utilizando tampão de equilíbrio fosfato contendo 0,25 M de NaCI e 2 mM de imidazol, a pH 7,0 e dessorção por gradiente degrau de

quelatado com TREN.

aumento da concentração de Trts-HCI, utilizando Ni2+ 60

Tabela 4-4. Balanço de massa das cromatografias utilizando tampão de equilíbrio Tris-HCI a pH 7,0 e dessorção por gradiente degrau de aumento da concentração de Trts-HCI, utilizando o íon metálico Zn2+ quelatado aos agentes quelantes IDA,

CM-Asp e TREN. 63

Tabela 4-5. Purificação de anticorpos monoclonais (lgG,) a partir de sobrenadante de cultura celular, precipitado e dialisado, em coluna contendo

PEVA-CM-Asp-Zn'+_ 65

Tabela 4-6. Balanço de massa das cromatografias utilizando tampão de equilíbrio Trts-HCI a pH 7,0 e dessorção por gradiente degrau de aumento da concentração de Tris-HCI, utilizando o íon metálico Zn2+ quelatado aos agentes quelantes IDA,

Usta de Tabelas xvi Tabela 4-7. Balanço de massa das cromatografias utílizando !ampão de equilíbrio Tris-HCI a pH 7,0 e dessorção por gradiente degrau de aumento da concentração de Tris-HCI, utilizando o íon metálico Co2• quelatado ao agente quelante CM-Asp 70

Tabela 4-8. Balanço de massa da cromatografia utilizando tampão de equilíbrio Tris-HCI a pH 7,0 e dessorção por gradiente degrau de aumento da concentração de Tris-HCI, utilizando os agentes quelantes IDA, CM-Asp e TREN, sem íon

metálico imobilizado 73

Tabela 4-9. Purificação de anticorpos monoclonais (lgG,) a pariir de sobrenadante de cultura celular, precipitado e dialisado, em coluna contendo PEVA-IDA-sem

metal. 76

Tabela 4-10. Balanços de massa das cromatografias para a purificação do anticorpo monoclonal anti-IL6: utilizando tampão de equilíbrio Tris-HCI a pH 7,0 e dessorção por gradiente degrau de aumento da concentraçao de Tris-HCI, utilizando os adsorventes PEVA-CM-Asp-Zn2• e IDA sem íon metálico imobilizado 78 Tabela 4-11. Parâmetros obtidos a partir do ajuste não-linear do modelo de Langmuir aos dados de adsorção de lgG, em membranas de PEVA-CM-Asp-zn2+,

PEVA-IDA-sem metal e PEVA-IDA-Zn2• 80

Tabela 4-12. Parâmetros obtidos a partir do ajuste não-linear do modelo de Langmuir-Freundlich aos dados de adsorção de lgG, em membranas de

PEVA-IDA-Zn2• e PEVA-IDA-sem metal 82

Tabela 4-13. Parâmetros obtidos a partir do ajuste não-linear do modelo de Temkin aos dados de adsorção de lgG1 em membranas de PEVA-CM-Asp-Zn2•,

Resumo xvii RESUMO

Anticorpos monoclonais são imunoglobulinas secretadas por clones de

linfóc~os B, normais, tumorais ou obtidos pela tecnologia de hibridomas. Os anticorpos monoclonais têm sido utilizados nas áreas analítica e terapêutica, o que implica na necessidade de sua obtenção com pureza superior a 95%. Muitos estudos têm sido realizados visando

à

purificação de anticorpos monoclonais, destacando-se as técnicas de adsorção seletiva, como as cromatografias de troca iônica, hidrofóbica e de afinidade. Neste trabalho aplicou-se a cromatografia de afinidade em membranas de álcool polietileno-vinílico (PEVA), comparando o desempenho dos agentes quelantes (AQ) ácido iminodiacético (IDA), ácido aspártico carboximetilado (CM-Asp) e tris-2(aminoetil)amina (TREN) com íons metálicos imobilizados na purificação de anticorpos monoclonais anti-TNP, isotipo lgG1 a partir de sobrenadante de cultura celular precipitado e dialisado. Para determinar as melhores condições de adsorção e eluição na presença de

diferentes sistemas tamponantes, foram testados os quelatos AQ-Ni2+, AQ-Zn2+ e AQ-Co2+, bem como os agentes quelantes sem metal imobilizado como grupos

ionogênicos. De acordo com eletroforeses SDS-PAGE e análises ELISA das frações dos picos de proteína obtidos, as melhores condições utilizadas para a purificação foi o uso de membranas PEVA-IDA-sem metal e PEVA-CM-Asp-Zn2•, em presença de tampão Tris-HCI 50 mM a pH 7,0 e eluição por aumento de concentração de Tris, atingindo fatores de purificação de 138,9 e 103,8 e pureza de 92,3% e 68, 1%, respectivamente. A partir das isotermas de adsorção, determinou-se a capacidade máxima de adsorção e a constante de dissociação dos complexos IDA-IgG, e CM-Asp-Zn2• -lgG, que, de acordo com o ajuste dos parâmetros pelo modelo de Langmuir, mostraram alta capacidade de adsorção e constantes de dissociação características de sistemas de afinidade média. Com o módulo de fibras ocas, construído em nosso laboratório, determinaram-se as curvas de ruptura por meio de experimentos de filtração para os processos propostos, e os resultados obtidos demonstraram que os sistemas de fibras ocas PEVA-IDA e PEVA-CM-Asp-Zn2• são factíveis para a purificação de anticorpos monoclonais do isotipo lgG,.

Absoact xviii

ABSTRACT

Monoclonal antibodies are immunoglobulins produced by nonnal, tumoral or hyblids lymphocytes B obtained by hiblidoma technology. Hyblidomas are resulted from lhe fusion of lymphocytes B with malignant myeloma cells which express bolh lhe lymphocyte's propeliy of specific-antibody production and lhe immortal charactelistic of lhe myeloma oells. Monoclonal antibodies have been used in analytic and therapeutic areas. This application needs highly pure antibodies. Many techniques have been studied focusing monoclonal antibodies purification. These techniques include ion exchange, hydrophobic and affinity chromatography. In this study, we applied polyethylenevinyl alcohol (PEVA) membranas in lhe pulifcation of monoclonal antibody from cell culture supematant comparing the chelating agents lminodiaoetic Acid (IDA), Carboxy-methyl Aspartic Acid (CM-Asp) and Tlis-2(aminoethyl)amine) (TREN) with different immobilized metal ios, Ni2•, Zn2• and Co2•, and wilh different buffers. We also evaluated the adsorption and purification of monoclonat antibodies using the chetating agents as ionogenic groups. According to SDS-PAGE electrophoresis and ELISA analysis, lhe higher selectivity was obtained in lhe presenoe of 50 mM Tris-HCI buffer, pH 7,0 and wilh elution by increasing Tris concentration, with CM-Asp-Zn2• and IDA as ionogenic group, which provided the pulifcation of lgG w~h traces of albumin, reaching pulifcation factors of 138.9 and 103.8 and purities of 92.3% and 68.1, respectively. The adsorbent capacity and lhe dissociation constant of lhe complexas IDA-IgG1 e CM-Asp-Zn2•-lgG1 were detenninate from adsorption isothenns. According to Langmuir model, lhe results indicated that lhe matlix presents high adsorption capac~y and a dissociation constant characteristic for intennediate affinity systems. We also evaluated lhe breaktrough curves for the proposed processes. These breaktrough curves are important to scale up procedure.

capitulo 1 - Introdução 1

CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO

1.1. ANTICORPOS MONOCLONAIS E SUA RELEVÂNCIA

Anticorpos monodonais são imunoglobulinas secretadas por clones de linfócttos 8, normais, tumorais ou obtidos pela tecnologia de hibridomas. O desenvolvimento da tecnologia de hibridomas por KÕHLER e MILSTEIN (1975) tomou possível a obtenção in vftro de quantidades ilimitadas de anticorpos monoclonais de especificidade conhecida. Estes hibridomas são obtidos pela fusão de uma célula normal produtora de anticorpos (linfócito 8) com uma célula tumoral da mesma linhagem (mieloma). Para se obter os anticorpos monoclonais, o antígeno contra o qual se pretende produzir anticorpos específicos, é injetado em camundongos e deconrido o tempo necessário de imunização, as células esplênicas do animal são isoladas e fundidas com células tumorais de rato ou camundongo (mielomas). Esta operação é necessária porque a duração de vida

dos linfócitos que produzem os anticorpos não é maior do que uma semana em

cultura. Com a fusão são formados os hibridomas, que são linhagens de células virtualmente imortais que, além de serem produtoras do anticorpo monoclonal desejado, têm a capacidade de ser replicada indefinidademte, (KÕHLER e MILSTEIN, 1975).

Os anticorpos monoclonais obtidos pela tecnologia de hibridomas podem ser produzidos in vivo, método no qual os hibridomas são injetados na cavidade intraperitoneal de um animal histocompatível, de modo que, para obter os anticorpos, os animais precisam ser sacrificados. Podem também ser produzidos in vitro, onde os hibridomas são cultivados em meios sintéticos ou acrescidos de soro fetal bovino, que fornecem os nutrientes necessários ao crescimento celular. A expansão in vitro muitas vezes não é tão produtiva quanto a expansão in vivo, mas é a melhor alternativa para produção de anticorpos monodonais em grande escala. A baixa concentração de anticorpos obtida em muitos biorreatores na produção in vftro, juntamente com a complexidade do meio de onde o anticorpo é recuperado, dificultam as etapas de purificação. Além disso, o alto grau de pureza

capítulo 1 -Introdução 2 requerido (acima de 95%), uma vez que a sua aplicação se dá na área terapêutica e de diagnóstico, exige o uso de técnicas de alta seletividade.

Uma variedade de têcnicas tem sido utilizada na purificação de anticorpos monoclonais, muitas delas aliando a precipitação à cromatografia. Apesar de muito utilizada, a cromatografia de troca iônica não apresenta alta seletividade (LÜTKEMEYER et ai., 1993), sendo necessárias etapas adicionais na purificação. Outros tipos de cromatografias de adsorção seletiva, como a de bioafinidade, foram desenvolvidas e também são utilizadas na purificação de anticorpos monoclonais. As proteínas A e G têm sido utilizadas como ligantes em cromatografias de afinidade, contudo, a contaminação do produto com traços do ligante, devido à hidrólise ou desprendimento deste em presença de lgG sob condições de pH extremos de eluição, representa um sério problema quando as soluções protéicas são destinadas a ap~cações terapêuticas (VERDOLIVA et a/., 2002). Além disto, o alto custo dos ligantes e sua inativação com as condições de eluição e regeneração da coluna, tomam este método impraticável em larga escala.

Para contornar os problemas relativos à utilização dos ligantes bioespecíficos, outras alternativas têm sido utilizadas. Ugantes que não possuem interação biológica, porém que apresentam a capacidade de se ligar às proteínas por meio de interações do tipo hidrofóbicas, eletrostáticas ou de ligações de coordenação, são utilizados. íons metálicos também são utilizados como ligantes em cromatografia, técnica que é baseada na interação entre proteínas e íons metálicos imobilizados, os quais têm a capacidade de ligar-se a elas por meio de ligações de coordenação, em uma interação reversível.

1.2. CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE POR ÍONS METÁLICOS IMOBILIZADOS

A têcnica de Cromatografia de Afinidade por Íons Metálicos Imobilizados (IMAC - lmmobilized Metal-lon Affinity Chromatography) aplicada à purificação de biomoléculas foi introduzida pela publicação de PORATH e colaboradores em

Capitulo 1 - Introdução 3

1975. Baseia-se na afinidade que ions metálicos quelatados em uma matriz sólida apresentam por certos grupamentos situados na superfície de uma molécula em solução (por exemplo, grupos imidazol da histidina, tiol da cisteína e indol do triptofano). Estes grupamentos se ligam de maneira reversível aos íons metálicos, por meio de ligações de coordenação, doando elétrons para o íon metálico (WONG et ai., 1991).

Em IMAC os agentes quelantes desempenham um papel muito importante, pois átomos doadores de elétrons (como, por exemplo, O, N, S) presentes em suas estruturas são capazes de coordenar íons metálicos formando quelatos metálicos (GABERC-POREKAR e MENART, 2001 ). A escolha do melhor agente quelante deve ser fe~a de modo que ele proporcione estabilidade do complexo com o metal e disponha de sítios livres de coordenação para ligar-se

à

proteína. Muitos compostos são empregados como agentes quelantes em IMAC, sendo que o mais utilizado é o tridentado ácido iminodiacético (IDA). Por outro lado, agentes quelantes tetradentados, como o ácido aspártico carboximetilado (CM-Asp) e o tris-2(aminoetil)amina (TREN) ocupam quatro sítios de coordenação, deixando apenas dois sítios livres para a ocorrência da ligação com a proteína, podendo ser mais seletivos no processo de purificação.

Os agentes quelantes são imobilizados a uma matriz sólida, comumente géis de agarose. Contudo, a utilização destes géis como suporte para estas cromatografias toma inviável a utilização de altas vazões, o que dificulta o seu escalonamento. Com isso, toma-se necessário a utilização de matrizes com maior capacidade hidrodinâmica, como, por exemplo, as membranas, nas quais podem ser imobilizados os íons metálicos.

1.3. OBJETIVO

O objetivo desta pesquisa foi o estudo da eficiência dos agentes quelantes IDA, CM-Asp e TREN na purificação de anticorpos monoclonais do isotipo lgG1 a partir de sobrenadante de cultura celular, utilizando a técnica de cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados em membranas de fibra oca de PEVA.

Para atingir o objetivo proposto, este projeto de pesquisa constou das seguintes etapas:

1) Ativação das membranas com epiclortdrtna, seguida da imobilização dos agentes quelantes IDA, CM-Asp e TREN.

2) Ensaios cromatográficos com anticorpos monoclonais do isotipo lgG1 (anti-TNP) a partir do sobrenadante de cu~ura celular, em colunas cromatográficas contendo as membranas de afinidade finamente cortadas, com o intuito de vertficar o perfil de eluição da proteína em diversos sistemas tamponantes e determinar as melhores condições de eluição, utilizando os íons metáUcos Ni2•, Zn2• e co2+.

3) Ensaios com anticorpos monoelonaiS isotipo lgG, anti-IL6 nas melhores condições obtidas com anticorpos anti-TNP visando comparar a seletividade dos adsorventes utilizados na purificação de anticorpos anti-TNP.

4) Determinação das isotermas de adsorção por meio de ensaios em tanques agitados, utilizando membranas dertvatizadas com IDA e CM-Asp-Zn2• e anticorpos monoelonais pré-purificados em gel de proteína G, para determinação dos parâmetros de adsorção de acordo com os modelos de Langmuir, Langmuir-Freundlich e Temkin;

5) Ensaios de filtração, conduzidos em modo tangencial, utilizando um módulo contendo as fibras ocas com IDA e CM-Asp-zn2+, em escala laboratorial, a fim de determinar as curvas de ruptura e o ponto a partir do qual iniciou a saída de

Capitulo 2- Revisão Bibliográfica 5

CAPÍTULO 2: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. ANTICORPOS MONOCLONAIS

Quando uma substância estranha entra no organismo de um animal ou de um ser humano, ou nele é injetada, um aspecto da resposta imune que pode ser ativado é a secreção de anticorpos pelos linfócitos B do sangue. Estes linfócitos produzirão moléculas de anticorpos (imunoglobulinas) apresentando sítios de ligação que reconhecem um determinante particular na estrutura da substância estranha (antígeno) e a ele se liga. A combinação do anticorpo com o antígeno desencadeia um processo que pode neutralizar e eliminar a substância estranha (MILSTEIN, 1980).

Anticorpos são glicoproteínas que conferem imunidade humoral, e constituem a maior parte das defesas imunológicas contra infecções provocadas por microrganismos. Um dos grandes obstáculos

à

elucidação da natureza e estrutura dos anticorpos era a enorme heterogeneidade dos anticorpos naturais, pois são formados por diversos clones diferentes de células, sendo por isso chamados de anticorpos policlonais. Mesmo anticorpos formados contra um único determinante antigênico (epítopo) são muito heterogêneos. Todos são específicos em maior ou menor grau para o detenninante, mas têm estruturas químicas diferentes, e se ligam ao mesmo, porém com diferentes graus de afinidade. Desde sua descoberta eles vêm sendo produzidos em laboratórios, quase sempre pela imunização de animais apropriados (camundongos, ratos, coelhos, entre outros) (AUGUSTO E OLIVEIRA, 2001).

As imunoglobulinas pertencem a um grupo relacionado às glicoproteínas compostas de 82% a 96% de proteínas e 4 a 18% de carboidratos. A estrutura básica da imunoglobulina (apresentada na Figura 2-1) consiste de quatro cadeias polipeptídicas: duas cadeias pesadas (H), cuja massa molecular varia de 55 a 75 kDa, e duas cadeias leves (L), de massa molecular de 25 kDa (VLUG e VAN REMORTEL, 1989).

Capitulo 2-Revisão Bibliográfica 6

Papaín/

_lgG

'\;

in

a

Fab Fab F(ab') ₂

--

-F c pFc' pFc'

Figura 2·1. Estrutura da imunoglobulina G (lgG) e seus fragmentos gerados pelas

enzimas proteolíticas papaína e pepsina

(adaptado de IMGT Marie·Paule page • http://imgt.cines. fr)

As quatro cadeias são mantidas juntas por ligações dissulfídicas. As enzimas proteolíticas papaína e pepsina clivam as imunoglobulinas em diferentes

fragmentos característicos, conforme ilustrado na Figura 2-1. A papaína produz

dois fragmentos Fab (região amino terminal; ab, "antigen-binding") idênticos, cada

um contendo um sítio que se liga ao antígeno e um fragmento Fc (região carboxila terminal; c, "crystallizabte"), que não possui atividade de anticorpo, mas está

envolvido na transferência placentária, na fixação de complemento, na ligação à várias células e outras atividades biológicas (JAWETS et ai., 1998). Por sua vez, a

pepsina produz um fragmento F(ab')2 (constituído de dois fragmentos F(ab)

ligados covalentemente) e o restante da molécula é clivada em fragmentos

capítulo 2-Revisão Bibliogláfica 7

As cadeias leves que fazem parte da região F ab podem ser do tipo K ou '/.. e são formadas por dois domínios, um variável (VL) e outro constante (CL). As cadeias pesadas são características dos tipos de lgs e diferem entre si a partir da estrutura das cadeias pesadas: lgG (y), lgM {!1), lgA (a), lgD (o) e lgE (e) (VLUG e VAN REMORTEL, 1989). As cadeias pesadas possuem uma parte variável (VH) e três partes constantes C"'' CH2 e C"'· sendo que as lgM e lgE possuem um domínio constante extra (CH4). Um fragmento Fv corresponde a dois domínios VL e V" associados não-covalentemente. Os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas constttuem os sítios ligantes de antígeno.

Para a obtenção de anticorpos monoclonais de especificidade única, antígenos contra os quais se pretende produzir anticorpos são injetados em camundongos e, decorrido o tempo necessário de imunização, as células do baço do animal (células esplênicas) são isoladas e fundidas com linfócitos tumorais (mielomas) de rato ou camundongo. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos in vivo, método no qual os hibridomas são injetados na cavidade intraperitoneal de um animal histocompatível, de modo que, para obter os

anticorpos, os animais precisam ser sacrificados. Podem também ser produzidos ín vitro, onde os hibridomas são cultivados em meios sintéticos ou acrescidos de soro fetal bovino, que fornecem os nutrientes necessários ao crescimento celular.

Um esquema desta técnica está apresentada na Figura 2-2.

A expansão in vitro muitas vezes não é tão produtiva quanto a expansão in vivo, mas é a melhor alternativa para produção de anticorpos monoclonais em

grande escala. Os hibridomas cultivados in vitro possuem exigências nutricionais elevadas, necessitando de meios de cultura apropriados, acrescidos de soro fetal bovino (SFB). O soro merece especial atenção por ser composto de um complexo de proteínas ideais para nutrição celular, adesão e crescimento de linhagens dependentes de suporte, para a proteção biológica (antioxidantes, antitoxinas, etc.) e proteção mecânica em sistemas agitados e a era dos. O soro contribui ainda para o transporte de glicose, fosfato e aminoácidos, além de aumentar a permeabilidade celular (BUTLER, 1988; STIEB e KRÜGER, 1993).

Dependendo do sistema de cultura utilizado podem-se obter concentrações de anticorpos desde valores menores que 100 ~g/mL até maiores

Capitulo 2- - Blbfográflca 8

que 10 mg/mL (JACKSON

et

a/., 1996). Os estudos de produção de anticorpos são voltados ao aumento da produtividade, principalmente em decorrência do advento de novos biorreatores, que permitem manter a cultura de forma contínua. A baixa concentração de anticorpos obtida em muKos biorreatores na produção in

vitro, em adição

à

complexidade do meio de onde o anticorpo é recuperado, dificultam as etapas de purificação. Além disso, o atto grau de pureza requerido exige o uso de técnicas de alta seletividade (VOIGT e ZINTL, 1999).

Meio Clonagem Aeclonagem in vitro Ensaio para anticorpo

:. :o

=·

Fusão em polietileno glicol Análise

,.,_

para variantes

·li?'!!'

Anticorpo

• •

gO 'gO

•

-- gG . Indução de JumOiliS

I

. .

Rui do ascrtico tn VIVO

.,k.

AntiCorpo

FiguJa 2-2. Esquema da produção e seleção de células de hiblidomas e postelior cu~ivo dessas células para obtenção de anticorpos monoclonais em animais (in vivo) ou em cultura celular (in vítro), a partir da técnica desenvolvida por Kõhler e Milstein em 1975 (adaptado de AUGUSTO e OLIVEIRA, 2001 ).

capitulo 2-Revisão B1bHográfica 9

Segundo PAVLOU e REICHERT (2004), já existem mais de 150.000 diferentes anticorpos monoclonais disponíveis, a maioria deles produzidos para finalidades de pesquisa básica. Estes anticorpos vêm sendo utilizados como ferramentas muito efetivas no desenvolvimento e na aplicação de terapias e diagnósticos. Sua importância vem aumentando à medida que têm sido utilizados como carreadores de agentes terapêuticos (RITZ e SCHLOSSMAN, 1982), na reversão da rejeição aguda de transplantes; como sondas radioativas para delimitação de tumores, quando marcados com elemento radioativo (MORO e RODRIGUES, 2001; JOHNSTON et ai., 1996; KOBAYASHI et ai., 1998) e como ligantes em processos de separação por afinidade, devido à sua alta especificidade, principalmente para purificação de outros anticorpos utilizados nas áreas terapêuticas (CATTY, 1989; LORENZEN, 1992).

Entre os diversos métodos imunoquímicos, o ELISA ("enzyme linked immunosorbent assay") geralmente é o ensaio escolhido para a detecção de antígenos presentes em solução. Neste teste, um anticorpo monoclonal pode ser

utilizado como reagente de captura. Outro anticorpo monoclonal específico para

um diferente epítopo de um mesmo antígeno é freqüentemente ligado à biotina e usado como segundo anticorpo. Subseqüentemente, a reação antígeno-anticorpo é revelada pela adição de um conjugado preparado com avidina e peroxidase e

uma solução contendo substrato para a enzima e um cromógeno. Neste caso, os

anticorpos monoclonais anti-TNP podem ser utilizados em substituição ao complexo biotina-avidina, na qual o conjugado antígeno específico-anticorpo foi previamente ligado ao trinitrofenil (TNP). Além desta aplicação, os anticorpos anti-TNP podem ser utilizados como controle isotípico para lgG1 de cadeia leve "· uma vez que o TNP é uma molécula não biológica (LÉO et. ai, 2000). Recentemente, anticorpos anti-TNP foram utilizados na construção de biosensores utilizados para detecção de TNT, tendo sensibilidade em uma faixa de detecção na ordem de ppb (MATSUMOTO et ai., 2005).

O uso terapêutico de anticorpos monoclonais durante muitos anos foi restrito devido ao seu grande potencial imunogênico, geralmente produzidos em

Capítulo 2 - Revisão Bibliográfica 10

na terapia de interesse, e ainda causar uma hipersensibilidade (CABILLY e! a/., 1984 e ROTHSTEIN

e

VASTOLA, 1984). No entanto, com a possibilidade da humanização de anticorpos, preservando sua atividade biológica e eliminando ou reduzindo seu potencial imunogênico, este problema foi eliminado (TSURUSHITA e VASQUEZ, 2004). A estratégia de humanização de anticorpos consiste em substituir as regiões constantes das cadeias leves e pesadas dos anticorpos monoclonais murinos por regiões constantes humanas, originando um anticorpo quimérico que permanecerá com a região variável (sítio combinatório) de ligação com o antígeno de interesse, não perdendo sua atividade biológica.

A IL6 é uma citocina pleiotrópica, que desempenha um papel central no sistema imune, influencia as respostas imune antígeno-específicas e as reações inflamatórias, sendo um dos mais importantes mediadores da chamada reação de fase aguda iniciada no fígado. A atividade fisiológica da IL6 é complexa, estando envolvida em processos antiinflamatórios e pró-inflamatórios. A elevação da produção de IL6 é provavelmente um dos principais fatores envolvidos em inúmeras patogêneses, tais como: doenças auto-imunes, como a artrite reumatóide (SANY, 2006), mal de Alzheimer, mieloma múltiplo, certos linfomas, doenças cardíacas, cirrose hepática, osteoporose, tumores sólidos, câncer de próstata e bexiga, bem como em certos processos infecciosos (HEINRICH et ai., 2003).

REICHERT e PAVLOU (2004) mostram que, até a data de publicação do artigo, havia 17 anticorpos monoclonais de aplicação terapêutica já aprovados pela FDA (Food e Drug Administration) dos Estados Unidos, nove dos quais também aprovados pela União Européia.

Mais recentemente, microrganismos e plantas transgênicas têm sido utilizadas como biorreatores na produção de anticorpos monoclonais. Nesta técnica, seqüências de DNA, responsáveis pela produção de determinado anticorpo ou fragmento de anticorpo, são adicionadas a um plasmídeo que, por sua vez, é inserido por meio de técnicas de engenharia genética, nas células dos microrganismos que, desta forma, produzirão o anticorpo desejado, ou em células de agrobactérias que posteriormente transferem o gene produtor do anticorpo para as plantas produtoras (HIATT et a/., 1989; STRACHAN et a/., 1998; SENA e

Capítulo 2-Revisão Bibliográfica 11

GOLDMAN, 2001 ). Estes microrganismos ou plantas transgênicas são facilmente cultivados e representam uma alternativa promissora para a produção dos anticorpos monoclonais, principalmente em grande escala.

2.2. PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS

Uma variedade de técnicas tem sido utilizada na purificação de anticorpos monoclonais e a escolha correta do método depende da necessidade de pureza do produto final. Compostos destinados a aplicações terapêuticas e diagnósticas, requerem alto grau de pureza e necessitam de técnicas de purificação mais seletivas. Outro fator importante a ser levado em conta é o custo de cada processo. Segundo LABROU e CLONIS (1994), o fator chave para o desenvolvimento da biotecnologia são os processos de recuperação e purificação que, freqüentemente, chegam a não menos que 50% do custo total de produção.

Os anticorpos monoclonais são necessariamente recuperados a partir de meios complexos (fluído ascítico ou sobrenadante de cultura celular), constituídos

de várias proteínas e células. Assim, após a remoção das células por meio de

centrifugação e filtração, norrralmente pode-se dividir o processo de purificação em duas etapas: etapas preliminares ou de pré-purificação e a etapa de purificação propriamente dita.

Na etapa de pré-purificação utilizam-se técnicas não muito seletivas, visto

que esta etapa tem como objetivo eliminar partículas e sais ou concentrar a solução protéica. Técnicas de precipitação, ultrafiltração e microfiltração, têm sido utilizadas na etapa de pré-purificação de anticorpos monoclonais. Na etapa de purificação, tradicionalmente utilizam-se cromatografias de adsorção seletiva para

remover as impurezas existentes.

Para o tratamento de grandes quantidades de solução protéica ou ainda quando se pretende concentrá-la, norrralmente utiliza-se a técnica de precipitação, na qual os precipitados protéicos são forrrados por agregados de moléculas de proteínas. Anticorpos monoclonais são norrralmente precipitados pela adição de uma solução saturada de suWato de amônia no sobrenadante de cultura celular ou no fluido ascitico centrifugados e fi~rados. EL-KAK e

capitulo 2 - Revlsllo SlbHogl'linca 12

VIJAYALAKSHMI (1991) utilizaram precipttação com sulfato de amônia a 50% de saturação na pré-purificação de anticorpos monoclonais lgG2• obtidos a partir de sobrenadante de cuttura celular. Para pré-purificar anticorpos monoclonais do tipo lgG, a partir de fluído ascítico, ALEANZI

et

a/., (1998), utilizaram suWato de amônia a 33% de saturação. Em ambos os casos, o objetivo era preparar o material para cromatografias seguintes, para que o excesso de impurezas não prejudicasse o processo, além da redução do volume a ser tratado nas cromatografias.

PreCipitação em presença de alta concentração salina seguida de purificação por cromatografia de troca iônica é, tradiCionalmente, o método mais utilizado para o isolamento de anticorpos monoclonais. No entanto, os adsorventes de troca iônica não apresentam atta seletividade, sendo necessárias etapas adiCionais para eliminação dos contaminantes, como por exemplo, a cromatografia de perrneação em gel. Uma vez que outras proteínas podem interfelir nas reações imunológicas, as impurezas devem ser removidas, principalmente se os anticorpos forem destinados

à

realização de ensaios imunoenzimáticos ou em terapia e diagnósticos

in vivo

(evitar fiscos de alergias).

Outras técnicas cromatográficas têm sido desenvolvidas para a purificação dos anticorpos monoclonais, as quais evitam a etapa de precipitação devido

à

alta especificidade do ligante acoplado

à

fase estaCionária. A purificação de anticorpos por cromatografia de afinidade segue basicamente duas estratégias, a primeira explora a capacidade de reconhecimento e ligação com antígenos, que são caracleristicas relativas

à

região F ab do anticorpo, a segunda explora as partes constantes e a região Fc do anticorpo, que apresentam capacidade de interação com várias proteínas. aminoácidos e outras moléculas específicas, que são imobilizados na matriz cromatográfica para a interação com a proteína (HUSE

et

a/., 2002; VERDOLIVA et ai., 2002).

Cromatografias de imunoafinidade, que utilizam antígenos ou anticorpos imobilizados na matriz, são mutto específicas e apresentam ótimos valores de recuperação e purificação, mas a sua grande limitação é a necessidade de se obter ligantes purificados em quantidades relativamente attas, para serem acoplados à matriz. Este tipo de cromatografia também necesstta de condições drásticas de eluição, uma vez que as interações entre a proteína e o ligante são

capttulo 2-Revisão Bibliográfica 13

muito fortes, com constante de dissociação (I<.) entre 10-<> e 10-15 M. Estas condições de eluição, muitas vezes comprometem a atividade dos ligantes imobilizados, diminuindo o tempo de vida útil da coluna, também podendo afetar a atividade dos anticorpos purificados.

Como alternativa

à

cromatografia de imunoafinidade, tem-se utilizado a cromatografia de afinidade com proteínas A, G, ou L imobilizadas para a purificação de anticorpos de várias fontes (LEIBL et ai., 1993; LÜTKEMEYER et ai., 1999; FAHRNER e BLANK, 1999; DUARTE et ai., 2005).

A proteína A, secretada pela maioria das linhagens de bactérias

Staphylococcus aureus, tem sido utilizada na purificação de imunoglobulinas G com finalidades terapêuticas e testes clínicos. Ela possui afinidade por lgG, ligando-se à região Fc das mesmas com diferentes intensidades, dependendo da subclasse1 e da origem (humana, murina, ... ). No caso de anticorpos de camundongo, a proteína A apresenta pouca afinidade pela subclasse lgG, enquanto que as subclasses lgG,., lgG2b e lgG, possui afinidade média. SCHNEIDER (1998) mostrou que a proteína A imobilizada possui uma capacidade muito baixa de adsorver lgG, de origem humana. GOTISCHLICH e KASCHE (1997) utilizaram gel de agarose com proteína A imobilizada em um sistema de le~o móvel simulado (LMS) para purificar anticorpos monoclonais a partir de cultura de hibridomas, com o qual conseguiram eliminar mais de 99% das impurezas. Em trabalho recente, ISHIHARA et a/. (2006) otimizaram a concentração de sal na eluição visando reduzir a quantidade de proteína A desprendida do suporte durante a pUiificação de um anticorpo monoclonal humano lgG,. Os autores conseguiram obter uma recuperação de 87 a 89% do anticorpo com a redução de um terço na quantidade de proteína A desprendida do suporte.

Um outro ligante que possui afinidade pela parte Fc de imunoglobulinas, a proteína G (isolada das linhagens do grupo G streptococca~, interage com a subclasse lgG, humana, a qual não é adsorvida em proteína A (MANDARO et ai.,

1

subclasse: classificação também relacionada à pequenas diferenças na estrutura da cadeia pesada da imunoglobulina de uma mesma classe (por exemplo: lgG1, lgG23 , lgG2b, lgG3)

CSpltuiO 2-- s l o B/1>1/ognlfh:a 14

1987). Em contraste com a proteína A, a proteína G apresenta afinidade média por anticorpos de camundongos da subclasse lgG1 e alta af.nidade pelas subclasses

lgGa,., lgG,. e lgGs. AYBAY e IMIR (2000) utilizaram proteína G imobilizada para purificar anticorpos monoclonais murinos do isotipo lgG, a partir de sobrenadante de cuttura celular, obtendo pureza maior que 95%.

A proteína L, isolada da bactéria Peptostteptococcus magnus, liga-se especificamente

ã

região variável da cadeia leve de imunoglobulinas do tipo kappa, sem interferir no sítio de ligação antígeno-anticorpo (NILSON et a/., 1993). Esta proteína foi identificada em 1985 por Myhre e Esntell e, desde então, vários pesquisadores têm estudado o seu emprego como ligante em cromatografia de afinidade visando a purifiCação de imunoglobulinas e seus fragmentos Fv e Fab (NILSON et a/., 1993; DUARTE et a/., 2005; DAS et a/., 2005). VOLA e colaboradores (1995) utilizaram um sistema de cromatografiB liquida de alta eficiência com proteínas L e LG2 imobilizadas na purificação de lgG murina monoclonal e de seus fragmentos mostrando que o ligante proteína LG apresentou afinidade por todos os fragmentos enquanto 75% dos fragmentos testados se ligaram a proteína L.

Embora seja mutto utilizada, a cromatografia de afinidade com proteínas A, G ou L imobilizadas apresenta problemas de perda da capacidade da coluna por desprendimento do ligante após ciclos repetidos de utilização do processo cromatográfico (BLANK et ai., 2001). Este desprendimento do ligante imobilizado leva

à

contaminação das proteínas purificadas e representa um problema quando as imunoglobulinas são destinadas à aplicação terapêutica, pois estes ligantes servem como potenciais causadores de alergias. Em adição, o alto custo desta técnica toma impraticável o seu uso em larga escala (ANSPACH et ai., 1996).

Para contornar os problemas relativos

à

utilização dos ligantas bioespecíficos (antígenos, anticorpos, proteína A, G e L), outras alternativas têm sido utilizadas. Ligantes que não possuem interação biológica, porém que apresentam a capacidade de se ligar às proteínas por meio de interações do tipo hidrofóbicas, eletrostáticas ou de ligações de coordenação, são utilizados, sendo

2

Capitulo 2- Revisão Bibliográfica 15

chamados de ligantes pseudobioespecíficos (VIJAYALAKSHMI, 1989). Estes ligantes são compostos de origem biológica ou não e interagem com a proteína por meio de uma afinidade estrutural, sendo capazes de adsorvê-la na matriz

cromatográfica. Estas interações são mais fracas do que as ocorridas nas

cromatografias de afinidade (I<.! de 1 O_, a 1 O_. M), porém se bem escolhidos, os ligantes pseudobioespecíficos podem proporcionar uma seletividade tão alta quanto aquela obtida com os bioespecíficos.

A cromatografia tiofílica, introduzida por PORATH e colaboradores (1985), é uma técnica que emprega ligantes que contém o grupo -SH imobilizados em suportes ativados com divinilsulfona ou epicloridrina. Estes ligantes são moléculas simples e de baixo custo que têm a especificidade por imunoglobulinas, conferindo a estas a possibilidade de purificação a partir de sobrenadante de cultura celular ou amostras séricas. A afinidade entre ligantes tiofílicos e imunoglobulinas, promovida ou não em presença de sais, é baseada na interação entre regiões tiofílicas das proteínas com o grupo sulfona ou tioéter de adsorventes tiotnicos. Assim, o seu baixo custo, estabilidade química e especificidade fizeram destes

ligantes uma alternativa promissora para a purificação de anticorpos policlonaís e

monoclonais (OSCARSSON e PORATH, 1989, FINGER et ai., 1996, KREUTZ et ai., 1998, BOSCHETTI, 2001).

A adsorção de anticorpos monoclonais em matrizes tiofílicas foi inicialmente estudada por SERRES et a/. (1995) e FINGER et a/. (1996). Estes

autores mostraram que anticorpos monoclonais das subclasses \gG1, lgG2b e lgG3

são preferencialmente adsorvidos quando comparados com o anticorpo monoclonal da subclasse lgG;,.. BOSCHETTI (2001) apresentou um estudo comparativo entre a utilização de ligantes tiofflicos e de proteína A para a purificação de lgG1 monoclonal a partir do sobrenadante de cultura celular livre de proteínas. Neste trabalho, o autor concluiu que a capacidade do adsorvente tiofílico é cerca de quatro vezes maior que a proteína A, atingindo, em ambos os casos, até 98% de pureza.

A cromatografia de pseudobioafinidade com peptídeos e aminoácidos imobilizados também é uma alternativa utilizada na purificação de anticorpos monoclonais. Histidina e histamina foram utilizadas como ligantes por EL-KAK e

Capítulo 2 - Revisão Bibliográfica 16 VIJAYALAKSHMI (1991). L-histidina imobilizada em membranas de fibra oca de PEVA foi utilizada na separação de lgG a partir de amostras séricas (BUENO et ai., 1995; HAUPT et ai., 1995). VERDOLIVA e colaboradores (2002) usaram proteína A mimetizada (PAM), um peptídeo tetramérico, como ligante de afinidade para a purificação de imunoglobulinas a partir do soro de diversas fontes.

íons metálicos também são utilizados como ligantes em cromatografia, técnica que é baseada na interação entre proteínas e íons metálicos imobilizados, os quais têm a capacidade de ligar-se a elas por de ligações de coordenação, em uma interação reversível. Esta característica levou à utilização de IMAC na purificação de várias proteínas, inclusive anticorpos de diversas fontes (PORA TH e OLIN, 1983; BODEN et ai., 1995; HARI et a/., 2000; VANÇAN et a/., 2002; SERPA et ai., 2005; DAS et ai., 2005).

2.3. CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE POR ÍONS METÁLICOS IMOBILIZADOS (IMAC)

A técnica de Cromatografia de Afinidade por íons Metálicos Imobilizados (IMAC - lmmobilized Metal-lon Affinity Chromatography) aplicada à purificação de biomoléculas foi introduzida pela publicação de PORATH e colaboradores em 1975. Baseia-se na afinidade que íons metálicos quelatados em uma matriz sólida apresentam por certos grupamentos situados na superfície de uma molécula em solução, tais como os grupos imidazol da histidina, tio! da cisteína e indo! do triptofano. Estes grupamentos se ligam de maneira reversível aos íons metálicos, por meio de ligações de coordenação, doando elétrons para o íon metálico, ou seja, atuando como base de Lewis (PORATH, 1988, WONG etal., 1991).

A interação entre metal e proteína depende da disponibilidade de resíduos de aminoácidos na superfície das proteínas, além de outras forças envolvidas, tais como van der waals, hidrofóbicas e eletrostáticas. Geralmente todos os tipos de interação devem ser considerados, no entanto, nem sempre é possível determinar suas contribuições relativas (SHARMA e AGARWAL, 2002; UEDA et ai., 2003).

Há muitas vantagens na utilização de IMAC como técnica de purificação. De uma forma geral, dfferentes metais podem ser imobilizados na mesma matriz e

Capftulo 2 - Revisão Bibliográfica 17

podem ser removidos pela da adição de agentes competidores fortes, como o EDT A, sem que haja perda da capacidade da matriz. Métodos de separação específicos podem ser empregados para cada tipo de proteína, apenas com a escolha adequada do metal e das condições cromatográficas, tais como pH, força iônica, tipo de tampão, velocidade superficial, etc (WONG et ai., 1991 e CHAGA,

2001 )- A estabilidade dos ligantes em uma ampla faixa de temperaturas e condições da fase líquida pode ser considerada uma vantagem, pois propicia a reutilização dos mesmos, sem que haja perda de desempenho (ARNOLD, 1991).

2.3.1. Química de coordenação

Em meio aquoso, os íons metálicos são solvatados por moléculas de

água. Neste caso, o íon metálico atua como ácido de Lewis e a água como base

de Lewis_ Contudo, quando a molécula de água é substituída por uma base mais forte, forma-se um complexo de coordenação. Quando esta base contiver um único doador de elétrons, forma-se um ligante monodentado, que irá resultar em um complexo metálico. Por outro lado, se a base contiver dois ou mais átomos doadores de elétrons, haverá a formação de um quelato metálico (WONG ef a/., 1991 ). O termo quelato tem origem do latim científico cheia ou do grego khêlê, que

signWica "pinça"_ Neste caso, o doador de elétrons passa a ser chamado de agente quelante.

Em solução, os íons metálicos formam um híbrido sp3d2 com os doadores de elétrons podendo resultar em uma geometria octaedral de coordenação. Cada ligante ou doador de elétrons ocupa um dos vértices e a formação do quelato ocorre quando uma base de Lewis (forte doador de elétrons) coordena um único íon metálico com vários pares de elétrons (BEITLE e ATAAI, 1992). Assim, quando um composto quelatado se liga a um suporte estacionário, a fase sólida retém o metal, originando aquele que será o centro de adsorção em IMAC (PORATH et ai., 1975). De acordo com WONG et ai. (1991), estas reações

ocorrem devido à polarizabilidade das espécies envolvidas, eletronegatividade, estado de oxidação, tamanho, tipos de ligações (iônica ou covalente), e disponibilidade do doador de elétrons.

Capitulo 2-Revisão Bibliográfica 18

Quando quelatados, os metais apresentam diferentes reatividades que podem ser preditas pelo prtncípio dos Ácidos e Bases Fortes e Fracos (HSAB -Hard and Soft Acids and Bases). Este prtncípio assume que há três tipos prtncipais de bases (doadores de elétrons): fortes (prtncipalmente átomos de oxigênio carboxilato, nitrogênio alifático e fósforo); intermediárias (principalmente átomos de nitrogênio aromático) e fracas (prtncipalmente átomos de enxofre). Os metais divalentes intermediários (Cu2•, Zn2•, Ni2• e Co2•) formam ligações de coordenação estáveis com bases intermediárias e fracas (WONG et ai., 1991;

UEDA et a/., 2003).

Para os metais de transição (Cu2•, Zn2•, Ni2• e Co2•), a histidina

é

considerada o aminoácido responsável pela interação entre a proteína e o íon metálico. SULKOWSKI (1989) demonstrou que o par de elétrons presente no nitrogênio do anel imidazol da histidina é o prtncipal contrtbuinte na interação entre a proteína e o íon metálico e que a presença de múltiplas histidinas expostas na superfície da proteína a ser separada aumenta o grau desta interação.

O nitrogênio do anel imidazol de histidina se coordena ao metal sob a sua forma desprotonada, geralmente em tomo de pH neutro. No entanto, nas proteínas, o pKa de cada resíduo histidina pode vartar em função dos resíduos de aminoácidos vizinhos e modificar o pH de adsorção. Com o intuito de impedir interações eletrostáticas e aumentar a seletividade e estabilidade das ligações de coordenação metal-proteína, adiciona-se sal (geralmente NaCI) a uma concentração de 0,1 a4 M no tampão de adsorção (SULKOWSKI, 1989).

Os avanços da Engenharta Genética têm possibilitado a incorporação de caudas de proteínas ou peptídeos na proteína de interesse. Por exemplo, a fusão de uma seqüência de seis histidinas na porção C ou N-terminal da proteína alvo tem sido bastante utilizada e confere à mesma a possibilidade de purtficação por IMAC (FLASCHEL e FREIHS, 1993; CHAGA et ai., 1999). Este tipo de cauda

acoplada

à

proteína alvo é pequena, pouco imunogênica, não carregada a pH

fisiológico e raramente interfere na estrutura ou função da proteína de interesse

Capitulo 2 - Revisão Bibliográfica 19

A cisteína também afeta a retenção da proteína em IMAC, pois grupos tiol têm a capacidade de interagir fortemente com íons metálicos. Aminoácidos aromáticos, como o triptofano, também são importantes na retenção de proteínas. Contudo, a contribuição de um resíduo de triptofano pode ser considerada pequena quando comparado ao efe~o que a histidina apresenta na retenção de proteínas em IMAC (BEITLE e ATAAI, 1992).

A coordenação de resíduos adjacentes de aminoácidos pode a~erar significativamente a retenção de proteínas. A cooperação envolve a ligação de duas ou mais cadeias de resíduos de aminoácidos a um único íon metálico (coordenação polidentada). Alternativamente, aminoácidos que não se ligam ao metal contnbuem indiretamente para a coordenação, pois proporcionam uma geometria local correta (BEITLE e ATAAI, 1992). Além dos resíduos de aminoácidos, as extremidades N-terrninal das proteínas também participam diretamente na interação com o metal imobilizado.

2.3.2. Escolha do íon metálico

Um fator fundamental na técnica de IMAC é a escolha do íon metálico a ser imobilizado. De um modo geral, qualquer metal capaz de interagir com

proteínas pode ser utilizado em IMAC, porém, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Al3+ e Ca2+, são os íons metálicos mais comumente empregados. Os íons metálicos

Cu2+, Ni2+, Co2+ e Zn2+ são utilizados na purificação de proteínas que possuam

resíduos de hislidina, tríptofano e cisteína, onde os metais interagem com os grupamentos imidazol, indol e tiol, respectivamente, de cada aminoácido (SULKOWSKI, 1989). Os íons Fe3• e Af'+ ligam-se a fosfato e fosfoésteres primários podendo ser utilizados para separar fosfoproteínas (ANDERSSON e PORATH, 1986 e SULKOWSKI, 1988) e o íon Ca2• coordena o átomo de oxigênio presente em grupos carboxílicos dos resíduos dos aminoácidos ácidos aspártico e glutâmico, podendo ser utilizado para purificação de proteínas ricas em grupamentos carboxílicos (MANTOVAARA et ai., 1991 ).

Em 1989, SULKOWSKI, utilizando tampão fosfato 20 mM a pH 7,0 e 1,0 M

NaCI, mencionou a importância dos resíduos de histidina acessíveis presentes em

Capftulo 2-Revisão BibHográfica 20

entre estes resíduos com agarose contendo IDA-Cu2•, IDA-Ni2•, IDA-Co2•, IDA-Zn2+, que são as seguintes:

I. a presença de pelo menos um resíduo de histidina disponível para a

coordenação é suficiente para a retenção da mesma em um gel de IDA-Cu2+;

11. a presença de dois resíduos de histidina disponíveis para a coordenação resulta em uma mais forte retenção da proteína em um gel de

IDA-Cu2+. '

111. a presença de dois resíduos histidina disponíveis para a coordenação é requerida para a retenção em um gel de IDA-Ni'•;

IV. a presença de dois resíduos histidina espacialmente localizadas em

uma a.-hélice e separadas por dois ou três aminoácidos é necessária para a

retenção em géis de IDA-Zn2• e de IDA-Co2+

V. a retenção de uma proteína que possui dois resíduos histidina vicinais (efeito quelato) será mais forte, em todos os géis IDA-Me'·. que a retenção de uma proteína que possui dois resíduos histidina bem espaçados na

estrutura tridimensional.

Com o resultado da regra, pode-se determinar uma ordem crescente de força de retenção de proteínas contendo histidinas acessíveis, em géis IDA-Me,.,

da seguinte forma: Cu2+ > Ni2+ > Zn2+;::: Co2+.

2.3.3. Escolha do agente quelante

Na técnica de IMAC os agentes quelantes desempenham um papel muito importante, pois átomos doadores de elétrons (como, por exemplo, O, N, S)

presentes em suas estruturas são capazes de coordenar íons metálicos formando

quelatos metálicos. Os sítios de coordenação remanescentes são normalmente ocupados por moléculas de água e são trocados por grupos doadores de elétrons presentes na superfície da proteína (GABERC-POREKAR e MENART, 2001 ).

As propriedades do centro de adsorção dependem fortemente do agente quelante utilizado. Em geral, quanto mais polidentado for o agente quelante, mais