UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
VALÉRIA ALVES FERNANDES
Avaliação do efeito do ácido úsnico sobre o perfil redox no
coração de mamíferos e em parâmetros da função cardíaca
SÃO CRISTÓVÃO
2013
VALÉRIA ALVES FERNANDES
Avaliação do efeito do ácido úsnico sobre o perfil redox no
coração de mamíferos e em parâmetros da função cardíaca
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de Sergipe como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Orientadora: Profa. Dra. Sandra Lauton Santos
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
F363a
Fernandes, Valéria Alves
Avaliação do efeito do ácido úsnico sobre o perfil redox no coração de mamíferos e em parâmetros da função cardíaca /
Valéria Alves Fernandes ; orientadora Sandra Lauton Santos. –
São Cristovão, 2013. 92 f. : il.
Dissertação (mestrado em Ciências Fisiológicas) –
Universidade Federal de Sergipe, 2013.
1. Coração. 2. Chagas, Doença de. 3. Antioxidantes. 4. Ácido úsnico. I. Santos, Sandra Lauton, orient. II. Título.
___________________________________________________ Profa. Dra. Sandra Lauton Santos
(Presidente da banca)
___________________________________________________ Prof. Dra. Carla Maria Lins de Vasconcelos
(Membro externo)
___________________________________________________ Prof. Dr. Enilton Aparecido Camargo
(Membro interno - PROASA)
Dedico essa dissertação a todos os professores que participaram, direta ou indiretamente, da minha formação. Especialmente, à minha primeira professora, Fátima, da escola infantil Carrossel. Certamente, ela jamais lerá essa dissertação, mas foi essa professora a responsável pelo meu primeiro contato com a educação.
AGRADECIMENTOS
Acredito que agradecer é mais que um ato de humildade e reconhecimento à ajuda prestada, é uma forma de expressar, em palavras e ações, o quanto a ajuda foi importante. Pequenas ajudas prestadas, por pessoas bem intencionadas, podem passar despercebidas e o agradecimento nunca é feito. Acontece todo o tempo e, muitas vezes, nos esquecemos de simplesmente dizer ‘obrigado’. No meu caso, muitas pessoas contribuíram de forma direta e indireta para que esta dissertação ficasse pronta e eu anseio conseguir me lembrar de todos e expressar minha sincera gratidão.
A ajuda de alguns foi tão importante que em muitos momentos se tornou essencial e indispensável. Sem muitos dos meus amigos e colaboradores essa dissertação jamais ficaria pronta e eu jamais estaria escrevendo tais agradecimentos. Assim sendo, gostaria de agradecer enormemente a todas as pessoas listadas abaixo, ansiando sempre, não deixar sequer uma pequena ajuda passar despercebida.
Aprendi desde criança que as ações ensinam mais do que palavras, por causa disso agradeço, primeiramente, a minha mãe, que sempre enfrentou os problemas com coragem, sem se omitir ou fugir, e com isso me ensinou a ser forte e corajosa. Sempre a vi trabalhar muito, sendo sempre preocupada com a qualidade do seu trabalho e, por isso, agradeço muito por me ensinar a ser um pouquinho parecida com você nesse aspecto. Muito obrigada também pelo seu apoio incondicional e por sempre acreditar em mim. Obrigada por me incentivar e por confiar nas minhas decisões e julgamentos sem interferir, mesmo quando se sente ansiosa e preocupada com as minhas escolhas.
Agradeço, principal e especialmente, a minha amiga e orientadora Sandra Lauton Santos pela oportunidade de trabalho em conjunto ao longo desses anos, pela paciência e por tanto me ensinar. Agradeço pelos conselhos, pelas conversas, pela amizade e por todas as oportunidades de discutir não só sobre esse trabalho, mas também as discussões sobre ciência, sobre as decisões futuras e a carreira acadêmica. Certamente sempre vou me lembrar de todos os conselhos, mas principalmente me lembrarei de tudo que não foi dito e sim observado por mim no dia a dia do laboratório, durante a realização dos experimentos e principalmente na forma como fui orientada. Não tenho dúvidas de que sua orientação me guiou a fazer o melhor mestrado possível e com certeza tudo que aprendi me auxiliará nas minhas próximas escolhas no meio acadêmico. Muito Obrigada.
Agradeço enormemente aos professores e pesquisadores Dr. Jader dos Santos Cruz, Dr. Paulo Sérgio Lacerda Beirão, Dr. Steiner Côrtez, Dra. Virgínia Lemos Dr. Jorge Luís Pesquero e Dra. Silvia Guatimosim do ICB – UFMG (Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais), por me acolherem em seus laboratórios e permitirem a realização dos experimentos descritos nessa dissertação. Agradeço pela ajuda nos experimentos, pela presteza, pelos conselhos, pelas conversas e pela oportunidade de discutir meus resultados em seus grupos de pesquisa.
Agradeço muito ao professor Dr. Luciano Capettini, pela imensa ajuda durante a realização de boa parte dos experimentos, pelas conversas, por todas as perguntas respondidas prontamente, pela presteza, pela amizade e pela ajuda durante a análise e discussão de muitos dos meus resultados.
Agradeço ao professor e pesquisador Dr. Adriano Antunes da Universidade Federal de Sergipe pela preparação do complexo de inclusão de ácido úsnico/ -ciclodextrina utilizado nessa pesquisa.
Agradeço ao professor e pesquisador Dr. André Talvani da Universidade Federal de Ouro Preto pela concessão dos animais utilizados nessa pesquisa, pela paciência, pelos conselhos, pela presteza e disponibilidade de ajudar e me socorrer todas as vezes que liguei desesperada pedindo mais animais para um experimento extra.
Agradeço aos professores Dr. Thales Nicolau Prímola e Dr. José Antônio Natali da Universidade Federal de Viçosa por permitir a realização dos experimentos de contratilidade celular em seu laboratório.
Agradeço muitíssimo a aluna de doutorado Aline Lara, por todas as noites de experimentos no confocal, pelos finais de semana no ICB, pela presteza, pelos conselhos, pela oportunidade de discutir meus resultados e pela amizade. Certamente sem sua ajuda, em todos os momentos que precisei essa dissertação não estaria pronta. Muito obrigada.
Agradeço a todos os queridos colegas do Eletrocel, LAMEX e Farmacologia que sempre me ajudaram e me ensinaram durante os meses que realizei os experimentos no ICB - UFMG
Agradeço ao Centro de Aquisição e Processamento de Imagens – CAPI – ICB/UFMG. Agradeço aos professores e queridos colegas do Laboratório de Biofísica do Coração, no Departamento de Fisiologia – UFS, pela receptividade, pela amizade, por me acolherem no laboratório e pelo apoio.
Agradeço aos meus colegas de mestrado Thássio Ricardo Ribeiro Mesquita e José Evaldo Meneses Filho e ao aluno de Iniciação Científica Michel Santana pela ajuda no início
dos experimentos em Belo Horizonte, pelas conversas, pela amizade e principalmente pela paciência durante quase todas as minhas crises de TPM.
Agradeço ao meu amigo Lucas Ferreira da Silva pela amizade de tantos anos, pelas conversas intermináveis, pelos conselhos, por sempre me ouvir e principalmente pela criação do programa de análise de imagem, sem o qual as análises dos experimentos no confocal teriam sido imensamente penosas e complicadas.
Agradeço aos amigos de longa data: Camila, Carolina, Tamires, Leandro e Michelle que tanto auxiliaram com sua amizade e companheirismo ao longo de minha formação pessoal e acadêmica. Obrigada por sempre se fazerem presentes, mesmo com a distância, a minha falta de tempo e às vezes a minha falta de bom humor e assuntos interessantes.
Agradeço ao meu padrasto Romério Ferreira de Assis, que sempre me socorre, não importa a que hora do dia ou da noite. Obrigada por estar sempre presente e sempre disposto a me ouvir, mesmo sem entender bem do que se trata.
Agradeço aos meus professores e colegas de mestrado do PROCFIS pelo apoio, pela hospitalidade em Aracaju e pelos ensinamentos. Aprendi muito com todos e só tenho a agradecer.
Agradeço ao programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas (PROCFIS) da Universidade Federal de Sergipe (UFS) por permitir e me auxiliar na realização deste projeto.
Agradeço a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação do Amparo à Pesquisa do Estado de Sergipe (FAPITEC) por terem financiado este trabalho.
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original. ” Albert Einstein
RESUMO
Avaliação do efeito do ácido úsnico sobre o perfil redox no coração de mamíferos e em parâmetros da função cardíaca. Valéria Alves Fernandes. São Cristovão, Sergipe. 2013
O ácido úsnico (AU) é um metabólito secundário de liquens, descrito na literatura como um componente com efeito antibiótico, antifúngico, antiviral, anti-inflamatório, antiproliferativo e antiparasitário. Sendo essa substância apontada na literatura como um composto capaz de ter atividade anti Tripanosoma cruzi. Neste trabalho o AU foi utilizado com o objetivo de estudar o potencial efeito antioxidante bem como potenciais efeitos sobre a contratilidade cardíaca e dinâmica do cálcio intracelular. Para isso, após exposição, in vitro, ao AU, foram realizados experimentos para avaliar a viabilidade celular via MTT em células endoteliais humanas. Em células cardíacas isoladas foram analisados o transiente intracelular de cálcio, a contratilidade celular, a produção de peróxido de hidrogênio (H2O2), ânion superóxido e óxido nítrico (NO).
O efeito do tratamento oral com AU em camundongos C57Bl6J foi avaliado pela mensuração da peroxidação lipídica, experimentos para a análise da função cardíaca (utilizando-se a técnica de Langendorff), cinética enzimática a fim de avaliar a atividade total da superóxido dismutase (SOD) e catalase. Para avaliar a expressão das enzimas: óxido nítrico sintase (NOS), superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase (GPx) e NADPH oxidase foi utilizada a técnica de western blot. Para avaliar se o tratamento oral com AU alteraria os parâmetros da função cardíaca e o perfil redox em camundongos infectados com
Tripanosoma cruzi, foram utilizadas a técnica de Langendorff, a mensuração da atividade
total da SOD e a peroxidação lipídica. Os resultados de viabilidade celular mostraram que o AU não foi citotóxico nas concentrações estudadas (1 nM, 10 nM, 100 nM, 1
, após 24 horas de exposição. A contratilidade celular e o transiente celular de cálcio não foram alterados após exposição, in vitro, ao AU. Por outro lado, o AU em cardiomiócitos isolados promoveu a diminuição dos níveis de H2O2 (CTR = 564.3 ± 72, n=88 e AU = 514,3 ±
60, n=87), ânion superóxido (citoplasma: CTR = 231,7 ± 42 e AU = 144,2 ± 56,3, n=67; ***P<0,001; núcleo: CTR = 675,8 ± 101,5 e AU = 614,2 ± 133,4, n=60; *P<0,05) e NO (CTR = 591,8 ± 63,7, n=85 e AU = 514,3 ±72,3, n=94). O tratamento oral não influenciou os parâmetros cardíacos avaliados dos camundongos hígidos e chagásicos. Entretanto, o tratamento com AU se mostrou antioxidante, induzindo a diminuição da peroxidação lipídica (No coração: CTR 0,0438 ± 0,011 nmol MDA min-1.mg proteína-1, n=9 e AU = 0,0180 ± 0,011 nmol MDA min-1.mg proteína-1, n=8. e no fígado CTR= 0,0145 ± 0,021 nmol MDA min-1.mg proteína1, n=8 e AU = 0,004 ± 0,022 nmol MDA min-1.mg proteína-1, n=9) e foi também detectado aumento da atividade da SOD (CTR = 7,98 ± 2,5 unidades/mg de proteína e AU =25, 02 ± 4,5 unidades/mg de proteína) aumento da expressão da SOD e GPx e diminuição da expressão da eNOS e NADPH oxidase no coração. A atividade da catalase (CTR = 1,37 ± 0,77 AE. min-1.mg proteína-1 e AU = 0,45 ± 0,22 AE. min-1.mg proteína-1) se mostrou diminuída e sua expressão não foi alterada no coração. A expressão da nNOS também não foi alterada no coração. Em conclusão nossos resultados sugerem que o AU é uma substância capaz de promover a redução do perfil oxidativo, tanto em células isoladas expostas a ele, in vitro, bem como, após o tratamento por via oral. E, do ponto de vista cardíaco, o AU não promove alterações nos parâmetros contráteis analisados (tensões sistólica e diastólica), bem como, na frequência cardíaca e na mobilidade do cálcio, o que indica que o essa substância pode ter potencial terapêutico como substância antioxidante no coração e potencial terapêutico na doença de Chagas.
ABSTRACT
Evaluation of usnic acid effects on redox profile and cardiac function parameters in the mammalian heart. Valéria Alves Fernandes. São Cristovão, Sergipe. 2013
The usnic acid AU is a secondary metabolite of lichens described as a component with antibiotic, antifungal, antiviral, anti-inflamattory, antiproliferative and antiparasitic effects. Previous studies reported that this substance has anti Tripanosoma cruzi activity. Therefore, the aim of this study was evaluate the antioxidant potential on heart, intracellular calcium dynamic and cardiac contractility effects of the usnic acid. After exposure, in vitro, to the AU, experiments were performed to assess cell viability in human endothelial cells In isolated cardiomyocytes of rats were analyzed the intracellular calcium transient, cell contractility and the production of hydrogen peroxide (H2O2), superoxide and nitric oxide (NO). After oral
treatment in C57Bl6J mice with AU, were performed lipid peroxidation tests, contractility experiments (Langendorff technique), western blot to nitric oxide synthase (NOS), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) e NADPH expressions. Enzyme kinetics was used to measure total activity of superoxide dismutase and catalase. Oral treatment with AU was performed in infected mice with Trypanosoma cruzi. The results of cell viability showed that AU was not cytotoxic, after 24 hours exposure. The cellular contractility and intracellular calcium transient were not altered after exposure in vitro to AU. Moreover, usnic acid in isolated cardiomyocytes promoted decrease in the levels of H2O2 (CTR = 564.3 ± 72, n=88 e
AU = 514,3 ± 60, n=87), superoxide and NO superóxido (citoplasm: CTR = 231,7 ± 42 e AU = 144,2 ± 56,3, n=67; ***P<0,001; nuclei: CTR = 675,8 ± 101,5 e AU = 614,2 ± 133,4, n=60; *P<0,05) e NO (CTR = 591,8 ± 63,7, n=85 e AU = 514,3 ±72,3, n=94). Oral treatment had no effect on cardiac contractility of healthy and chagasic mice. However, treatment with AU showed antioxidant, inducing decrease in lipid peroxidation (heart: CTR 0,0438 ± 0,011 nmol MDA min-1.mg protein-1, n=9 and AU = 0,0180 ± 0,011 nmol MDA min-1.mg protein-1, n=8. In liver CTR= 0,0145 ± 0,021 nmol MDA min-1.mg protein1, n=8 and AU = 0,004 ± 0,022 nmol MDA min-1.mg protein-1, n=9) and increased SOD activity in the heart and liver (CTR = 7,98 ± 2,5 unity/mg protein and AU =25, 02 ± 4,5 unity/mg protein), increased SOD and GPx expression and decreased eNOS and NADPH oxidase expression in a heart. The catalase activity showed decreased (CTR = 1,37 ± 0,77 AE. min-1.mg protein-1 and AU = 0,45 ± 0,22 AE. min-1.mg protein-1) and has no change in expression in a heart. The nNOS expression was not altered in a heart. In conclusion data showed suggest the AU was able to promote antioxidant effects in both experiments (in vitro and in vivo). In cardiac parameters, the AU have no changes in contract values (systolic and diastolic tension), hear rate and calcium mobility. Therefore, the AU have an antioxidant action in a heart and therapeutic potential in a Chagas disease.
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Acoplamento Excitação Contração 3
Figura 2. Esquema da geração de espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio
5
Figura 3. Reação de Fenton e interação Haber-Weiss 7
Figura 4. Representação esquemática de uma célula cardíaca sobre ação de
ROS
8
Figura 5. Ciclo natural do T. Cruzi 15
Figura 6. Estrutura química do ácido úsnico (C18H16O7) 19
Figura 7. Representação esquemática da difusão do ácido úsnico (AU)
através da matriz mitocondrial e a formação de ânion usniato (AU-)
21
Figura 08. Viabilidade Celular 37
Figura 09. Contratilidade celular 38
Figura 10. Transiente intracelular de cálcio em cardiomiócitos isolados de
ratos
39
Figura 11. Transiente intracelular de cálcio em cardiomiócitos isolados de
camundongos
40
Figura 12. Medida da produção de óxido nítrico 41
Figura 13. Produção de espécies reativas de oxigênio 42
Figura 15. Níveis peroxidação lipídica medida por TBARS em Fígado de
camundongo
44
Figura 16. Expressão de Oxido Nítrico sintases (NOS). 45
Figura 17. Atividade e expressão da superóxido Dismutase (SOD). 46
Figura 18. Expressão da NADPH oxidase no miocárdio de camundongos
controle (CTR) e tratados com ácido úsnico (AU) e abaixo as imagens representativas de western blot.
46
Figura 19. (A) Atividade total da enzima catalase, (B) expressão da
enzima catalase e (C) expressão da Glutationa peroxidase (GPx) no coração de camundongos controles e tratados com AU.
47
Figura 20. Avaliação da função cardíaca em coração isolado de
camundongos. (A) Variação da tensão diastólica, (B) Variação da tensão sistólica, (C) Avaliação da frequência cardíaca e (D) Avaliação da pressão de perfusão.
49
Figura 21. Avaliação da função cardíaca em coração isolado de
camundongos chagásicos. (A) Variação da tensão diastólica, (B) Variação da tensão sistólica, (C) Avaliação da frequência cardíaca e (D) Avaliação da pressão de perfusão.
50
Figura 22. Níveis de peroxidação lipídica. (A) C oração de camundongos
chagásicos tratados com ácido úsnico (AU) e (B) fígado de camundongos chagásicos tratados com AU.
51
Figura 23. Atividade da enzima superóxido dismutase total (A) no coração
de camundongos chagásicos e tratados com AU (n=6) e (B) no fígado de camundongos controles e tratados com AU
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
[Ca]i: concentração de cálcio intracelular
Acetil-CoA: acetil-coenzima A Acil-CoA: acil-coenzima A
AEC: acoplamento excitação contração ATP: adenosina trifosfato
AU: ácido úsnico
BG-250: Coomassie brilliant blue Cai: cálcio intracelular
CaMII: calmodulina cinase II CAT: catalase
Cav-3: caveolina-3 CTR: controle
DAF-AM: 3-Amino, 4-aminomethyl-2′,7′-difluorofluoresceina DCF: 2,7-diclorofluoresceina
DCFH: 2,7-Dichlorofluoresceina diacetato DHE: dihidroetidio
DMSO: dimetil sulfoxido DNA: ácido desoxiribonucleico DNP: 2,4-dinitrofenol
ECG: ecocardiograma
eNOS: óxido nítrico sintase endotelial ET-1: endotelina 1 GPx: glutationa peroxidase GR: glutationa redutase GSS: s-glutationilação GSSH: glutationa dissulfeto H2DCFH-DA: 2,7-diclorodihidrofluoresceína-diacetato IC50: Concentração inibitória de 50%
LPS: lipopolissacarídeo MMP: metaloproteinase MMP-2: metalloproteinase 2
MTT: [3-(4,5-dimethyl thiazol-yl) 2,5-diphenyl tetrazolium bromide] NADPH: Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina
Nai: sódio intracelular
NCX: trocador sódio-cálcio
nNOS: óxido nítrico sintase neuronal NOS: óxido nítrico sintase
NOX 1: isoforma 1 da Nadph oxidase NOX 2: isoforma 2 da Nadph oxidase NOX 4: isoformas 4 da Nadph oxidase OMS: organização mundial de saúde PA: potencial de ação
PBN: fosfolamban
PBS: solução salina tamponada com fosfato PKA: proteína cinase A
PLB: fosfolambam
PMSF: fluoreto de fenilmetilsilfonila RNS: espécies reativas de nitrogênio ROS: espécies reativas de oxigênio RPM: rotações por minuto
RS: retículo sarcoplasmático RyR 2: receptor de rianodina SDS: dodecil sulfato de sódio
SERCA2A: cálcio-ATPase do subtipo 2A SNO: s-nitrosilação
SOD: superóxido dismutase
T. cruzi: Trypanosoma cruzi
TBA: ácido tiobarbitúrico
TBARS: substâncias reativa ao ácido tiobarbitúrico TBS: solução tampão tris
TTH: tampão Tyrode-HEPES XOR: xantina oxidorredutase
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1 O coração e seu funcionamento ... 1
1.2 Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio ... 4
1.3 Estresse oxidativo e modulação redox no coração ... 7
1.4 Modulação Redox em Modelos de Doenças Cardíacas. ... 12
1.5 A doença de Chagas e no coração ... 13
1.6 O estresse oxidativo na doença de Chagas ... 16
1.7 Ácido Úsnico ... 18
2. OBJETIVOS ... 24
2.1 Objetivo geral ... 24
2.1 Delineamento Experimental ... 24
3. MÉTODOS ... 26
3.1 Hidrossolubilização do ácido úsnico ... 26
3.2 Cultura de células e viabilidade celular ... 26
3.3 Animais utilizados ... 27
3.4 Grupos experimentais ... 27
3.5 Obtenção do coração isolado ... 28
3.6 Obtenção das células ventriculares cardíacas ... 28
3.7 Contratilidade celular ... 29
3.8 Medidas do transiente de cálcio intracelular ... 30
3.9 Medida dos níveis intracelulares do óxido nítrico ... 30
3.10 Medida dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio ... 31
3.11 Medida dos níveis intracelulares do radical ânion superóxido ... 31
3.12 Contratilidade cardíaca (órgão isolado) ... 32
3.13 Preparação do tecido para as análises enzimáticas ... 32
3.14 Determinação da concentração total de proteínas ... 33
3.15 Determinação da atividade da catalase ... 33
3.16 Determinação de peroxidação lipídica pelos níveis de TBARS ... 34
3.17 Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD) ... 34
3.18 Determinação da expressão proteica por western blot ... 35
3.19 Análise estatística ... 36
4. RESULTADOS ... 37
4.2 Contratilidade celular e transiente intracelular de cálcio ... 38
4.2 Medidas das espécies reativas de nitrogênio e oxigênio ... 41
4.3 Peroxidação lipídica ... 43
4.4 Expressão das NOS totais no tecido cardíaco ... 44
4.5 Medida do perfil redox no tecido cardíaco ... 45
4.6 Experimentos com camundongos chagásicos ... 47
4.6.1 Avaliação de parâmetros cardíacos em sistema de Langendorff ... 47
4.6.2 Peroxidação lipídica ... 51
4.6.3 Atividade total da SOD ... 51
5. DISCUSSÃO ... 53
7. CONCLUSÃO ... 62
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 63
1. INTRODUÇÃO
1.1 O coração e seu funcionamento
O coração pode ser definido como uma bomba muscular oca, provida de válvulas dinâmicas, que move o sangue através de um circuito contínuo. Este é dividido em duas partes: o ápice, que contém as paredes ventriculares e a base, a qual contém a maioria das artérias e veias que permitem a entrada e saída de sangue (BERNE e LEVY, 2000).
A função contrátil cardíaca é regulada e mantida graças à geração e condução do estímulo elétrico, o qual permite regular a força e a frequência dos batimentos cardíacos (BERS, 1991). O sistema excitocondutor cardíaco é composto pelo nodo sinoatrial, pelas vias atriais internodais, pelo nodo atrioventricular, pelo feixe de His e suas ramificações, e pelo sistema de Purkinje. O nodo sinoatrial é responsável pelo início do sinal elétrico, e os demais componentes são responsáveis por conduzir tal sinal pelo coração (KATZ, 1992; FUSTER et
al., 1998; BERNE e LEVY, 2000).
A contração cardíaca permite impulsionar o sangue através do corpo, promovendo o transporte e a distribuição de nutrientes e outras substâncias para todos os tecidos e o direcionamento de resíduos do metabolismo para os sistemas excretores (BERNE e LEVY, 2000). O fenômeno da contração cardíaca pode ser mais bem compreendido a partir do conhecimento da fisiologia contrátil dos cardiomiócitos e dos componentes estruturais envolvidos neste processo.
A alteração brusca na permeabilidade de íons através da membrana plasmática permite que ocorram mudanças significativas no potencial de repouso da célula cardíaca, gerando o potencial de ação (PA) e consequente contração celular (BERS, 1991). A contratilidade celular cardíaca é regida por um rígido controle da concentração de cálcio intracelular ([Ca]i).
O mecanismo básico de ativação da maquinaria contrátil celular pelo PA ocorre, inicialmente, pela ativação dos canais iônicos sensíveis à voltagem presentes na membrana plasmática celular, sendo que a abertura de canais para cálcio de tipo L permite o influxo de cálcio (Ca2+) no miócito cardíaco (BERS, 1991).
A principal organela que estoca o cálcio intracelular (Cai) é o retículo sarcoplasmático
(RS). No RS são encontrados receptores, canais e proteínas, que regulam a entrada e a saída de Ca2+ desse compartimento. O efluxo de Ca2+ do RS durante a contração celular ocorre através do canal para cálcio denominado receptor de rianodina (RyR), presente na membrana da organela (BERS, 1991).
Na membrana do RS também é encontrada uma bomba, denominada cálcio-ATPase do retículo sarcoplasmático, conhecida como SERCA, sendo, nas células do coração, do subtipo 2A (SERCA2A). Esta promove, com gasto de ATP, a recaptação de Ca2+ para dentro do RS durante o processo de diástole. A SERCA possui 10 domínios transmembrana e um sítio que é alvo de uma fosfoproteína denominada fosfolamban (PLB), que regula a sua atividade (BERS, 1991). O PLB é um inibidor endógeno da SERCA. Essa fosfoproteína pode ser fosforilada pela proteína cinase A (PKA) ou pela calmodulina cinase II (CaMII). A fosforilação da PLB promove a sua dissociação da SERCA, tornando a atividade da bomba e a recaptação de Ca+2 aceleradas, enquanto a desfosforilação da PLB é capaz de inibir a SERCA (JONES e FIELD, 1993).
Na membrana da célula cardíaca existe também um transportador iônico, que trabalha sem gasto de ATP, denominado trocador sódio-cálcio (NCX). O trocador Na+/Ca2+ é um transportador que pode ser regulado, tanto pelo [Ca]i quanto pela [Na]i, em sítios específicos.
Em situações fisiológicas, este trocador transporta Ca2+ para o lado de fora da célula e Na+ para o interior da membrana da célula cardíaca. (BERS, 1991; BOUCHARD, 1993).
O fenômeno em que o PA é capaz de induzir a célula cardíaca à contração é denominado de acoplamento excitação contração (AEC). Este acoplamento eletromecânico é um dos principais mecanismos responsáveis pelo funcionamento adequado da contratilidade celular (BERS, 2002). (figura 1).
Figura 1. Acoplamento Excitação Contração. O esquema mostrado representa uma célula
ventricular cardíaca, onde vemos representados componentes moleculares e organelas envolvidos no processo de contração celular. O cálcio (Ca+2) que entra pelos canais de cálcio do tipo L (ICA) sensibiliza os receptores de rianodina (RyR) presentes no retículo
sarcoplasmático (SR). Esse Ca+2 se liga a proteínas presentes nos miofilamentos (Myofilaments) e promove a contração celular. Após os miofilamentos perderem a sensibilidade o cálcio, este é recaptado pela cálcio-ATPase, denominada SERCA, representada pelas duas subunidades (ATP + PLB). O fosfolamban (PLB) é subunidade que regula a atividade da SERCA. Vemos também representados o trocador sódio-cálcio (NCX) e as ATPases de membrana (bomba de sódio e potássio), bem como a mitocôndria, essas três estruturas também auxiliam na do cálcio citoplasmático após a contração. Observa-se também o gráfico do decurso temporal do potencial de ação cardíaco (AP (Em)), representado em
traçado preto, o aumento da concentração intracelular de cálcio ([Ca]i), representado em
traçado azul e a contração cardíaca (Contraction), representado pelo traçado pontilhado vermelho. (adaptado de BERS, 2002).
O AEC é o processo onde, durante o potencial de ação cardíaco, ocorre o influxo de Ca2+ pelos canais iônicos para Ca2+ tipo L, sensíveis à voltagem. O Ca2+ que entra na célula sensibiliza os RYRs, liberando os estoques de Ca2+ do RS. A combinação do influxo e a liberação de Ca2+ faz aumentar a [Ca2+]i. Esse Ca2+ livre se liga aos miofilamentos (troponina
C) ativando a maquinaria contrátil da célula (BERS, 2002).
Para que o relaxamento ocorra é necessário que o Ca2+ se desligue da troponina C e que a [Ca2+]i decline. O que ocorre é uma dessensibilização natural da troponina C ao Ca2+ e à
medida que esse íon passa a estar novamente livre no citoplasma, ele é recaptado pela SERCA e removido pelo NCX e sistemas lentos (ATPase do sarcolema) e mitocôndrias. A quantidade de Ca2+ removido do citosol celular durante o relaxamento deve ser a mesma que a quantidade de Ca2+ que entra na célula a cada batimento cardíaco, caso contrário, a célula teria um ganho ou uma perda de Ca2+ a cada contração celular (BASSANI, 1994; BERS, 2002).
A atividade da SERCA é maior no ventrículo de rato que no ventrículo do coelho (devido a uma maior concentração de moléculas da bomba no coração do coelho), o que resulta no fato que, em corações de ratos, a SERCA é responsável por recaptar 92% do cálcio, sendo o NCX responsável por remover 7% do cálcio e o 1% restante é removido do citosol pelos sistemas lentos (BASSANI, 1994; BERS, 2002).
É bem conhecido na literatura que todos os componentes do AEC, bem como o metabolismo celular cardíaco podem ser modulados por espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS) (ZENG et al., 2008; AKKI et al., 2009; SANTOS et al., 2011). O aumento ou diminuição do perfil oxidativo, bem como a diminuição das espécies reativas de oxigênio e nitrogênio podem induzir efeitos deletérios, protetores ou efeitos de remodelamento cardíaco pós-injúria (WANG et al., 2005; SANTOS et al., 2011). Assim sendo, é interessante compreender como o estresse oxidativo e a modulação redox influenciam os componentes celulares no coração.
1.2 Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio
Em condições fisiológicas, as espécies reativas de oxigênio (ROS) e as espécies reativas de nitrogênio (RNS) são produzidas através das reações de transferência de elétrons no metabolismo aeróbico e atuam nas mais diversas funções das células eucarióticas (CLARK e LAMBERTSEN, 1971; CRYSTAL, 1991; KOWALTOWSKI, 2009).
Dentre os principais metabólitos do oxigênio estão o radical ânion superóxido (•O2-), o
peróxido de hidrogênio (H2O2), o radical hidroxila (OH), o oxigênio singlet (1O2) e o ácido
hipocloroso (HOCl). As RNS são derivadas diretamente do óxido nítrico (NO) e as mais significantes em sistemas biológicos são o peroxinitrito (ONOO-) e o ácido peroxinitroso (ONOOH) (PRYOR, 1986; HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999; GRIENDLING E FITZGERALD, 2003).
A produção de ROS e RNS no coração, bem como, em qualquer outro tecido, pode ser relacionada à atividade de diversas enzimas, dentre estas, podem ser afetadas enzimas tanto pró-oxidantes quanto as antioxidantes. Podemos observar na figura 2, um esquema mostrando a geração de ROS E RNS, bem como as enzimas antioxidantes e pró-oxidantes envolvidas na produção dessas espécies reativas (GRIENDLING e FITZGERALD, 2003).
Figura 2. Esquema da geração de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Podemos
observar a conversão do oxigênio (O2) em ânion superóxido (•O2-) pelas enzimas NADPH
oxidase (processo que ocorre principalmente na mitocôndria). O •O2- é dismutado pela
superóxido dismutase (SOD), formando peróxido de hidrogênio (H2O2), que pode ser
convertido em uma molécula de água (H2O) + O2 pela catalase (CAT) e/ou glutationa
peroxidase (GPx). O H2O2 pode formar radical hidroxila (•OH) após reação reagir com o ferro
(Fe+2) na reação de Fenton. A glutationa peroxidase (GPx) reduz todos os hidroperóxidos utilizando glutationa reduzida (GSH), um doador de hidrogênio. Outra enzima, a glutationa redutase (GR), mantêm o equilíbrio entre GSH e glutationa oxidada (GSSG). O óxido nítrico (NO) é formado por ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS), a partir do aminoácido L-arginina que produz NO e L-citrulina. O •O2- também pode reagir com o NO para formar
peroxinitrito (OONO-) (Adaptado de GRIENDLING e FITZGERALD, 2003).
Como exemplo de enzimas pró-oxidantes, pode-se citar a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase (NADPH oxidase), e as enzimas óxido nítrico sintase (NOS). A NADPH oxidase participa da cascata respiratória celular e durante o processo oxidativo do NADPH catalisa a redução de um elétron do oxigênio molecular e origina o •O2-. Já as
enzima NOS, a isoforma endotelial (eNOS), a neuronal (nNOS) e a induzida (i-NOS). A eNOS e a nNOS são constitutivas e suas atividades são reguladas por aumentos nas concentrações intracelulares de cálcio. Todavia, a iNOS independe das variações de cálcio celular (GRIENDLING e FITZGERALD, 2003).
São exemplos de enzimas antioxidantes, a superóxido dismutase (SOD), a enzima glutationa peroxidase (GPx) e a enzima catalase. A SOD catalisa a conversão (dismutação) de dois moles de •O2- a um mol de O2 e um mol de H2O2, sendo que esta enzima possui três
isoformas: a cobre-zinco SOD (SOD-Cu/Zn), que tem caráter constitutivo presente no citosol celular. A isoforma manganês SOD (SOD-Mn), é comumente expressa nas mitocôndrias, em caráter induzido, geralmente em resposta a situações de estresse celular ou inflamação. Já a isoforma SOD extracelular (EC-SOD) se localiza constitutivamente na matriz extracelular (GRIENDLING e FITZGERALD, 2003).
A GPx é responsável pela degradação do H2O2 em uma reação em que utiliza,
especificamente, a glutationa reduzida (GSH) como doadora de elétrons. Nesse processo, há a formação de glutationa dissulfeto (GSSH) que é, consequentemente, reduzido à GSH utilizando o NADPH como doador de elétrons. A catalase também é responsável pela degradação do H2O2, e, também, pode atuar na degradação de pequenas quantidades de
hidroperóxidos (GRIENDLING E FITZGERALD, 2003).
As ROS também podem ser geradas sem o auxílio de enzimas como, por exemplo, nas reações de Fenton e Haber Weiss (figura 3). Na reação de Fenton, através da adição de um elétron ao H2O2 são formados dois radicais HO, a reação pode ser catalisada pelo sistema
Fe+2/Fe+3 ou Cu+2/Cu+3. Na reação de Haber Weiss ocorre a interação do H2O2 com o •O2- e
também são formados dois radicais •OH (HALLIWELL, 1991).
Figura 3. Reação de Fenton: interação do peróxido de hidrogênio (H2O2) com o ferro (Fe2) e
O radical OH é extremamente reativo e pode causar, dentre outros efeitos, danos à membrana celular (GARDNER, 1995). As reações de Fenton e Haber-Weiss não são as únicas que ocorrem sem a interferência de enzimas. Várias outras reações, principalmente entre as espécies reativas livres ocorrem, frequentemente, sem auxílio de catalisação enzimática. O O2 livre precisa ser removido rapidamente, quando isso não ocorre, ele pode
reagir com o NO formando ONOO-. Outro exemplo é a reação do •O2- com o NO livre
formando ONOO- (SANTOS et al., 2011).
Fatores como o aumento de hormônios também podem induzir a produção de ROS e RNS pelas células eucarióticas. A angiotensina II (Angio II), por exemplo, pode gerar alterações na mobilidade de Ca2+ e quadros inflamatórios, e com isso, induzir estresse oxidativo (RODRIGUES-MACHADO, 2008).
A própria disponibilidade de O2 livre pode induzir a formação de ROS e RNS, pois, o
O2 exerce um papel central na célula, atuando diretamente sobre enzimas e estruturas ligadas a
produção de espécies reativas (AKKI et al., 2009). O coração, dentre todos os outros órgãos, tem o maior consumo de O2 do corpo e em condições de carga máxima pode aumentar esse
consumo em até oito vezes ou mais (KEITH et al., 1998). Assim sendo, no coração existem diversos mecanismos de balanço redox modulando o aporte e o consumo de O2. Mecanismos
complexos de sinalização intracelular estão centralmente envolvidos no balanço entre a geração e a neutralização das espécies oxidativas (AKKI et al., 2009; SANTOS et al., 2011).
1.3 Estresse oxidativo e modulação redox no coração
Neste tópico, veremos algumas vias de sinalização que, no cardiomiócito, podem conduzir a uma oxidação branda ou a uma oxidação severa (SANTOS et al., 2011). As ROS e RNS podem atuar como segundo mensageiros para efeitos deletérios como alterações patológicas dos níveis de cálcio, hipertrofia cardíaca severa, morte celular programada e falência cardíaca. Entretanto, em um processo de oxidação brando, podem ocorrer efeitos não deletérios, como por exemplo, a modulação do AEC e respostas adaptativas a hipóxia que podem contribuir para o bom funcionamento do coração (SANTOS et al., 2011). Podemos
visualizar de forma esquemática, na figura 4, como as ROS atuam sobre estruturas importantes do cardiomiócito.
Figura 4. Representação esquemática de uma célula cardíaca sobre ação de espécies reativas
de oxigênio (ROS). Na membrana celular as ROS podem atuar sobre os canais de Ca2+, canais de K+ e canais de Cl-, bem como, sobre a metaloproteinases de membrana (MMPs). Intracelularmente, as ROS podem atuar no retículo sarcoplasmático (RS) e também modular a liberação de cálcio induzida por cálcio (CICR). As ROS também geram disfunções mitocondriais e contráteis. E a atuação de ROS sobre ASK1 (kinase reguladora de sinal de apoptose), Ras (pequenas GTPases), MAPks (proteínas Kinase ativadas por mitógeno) e PKA/B/C/G (proteínas kinase A, B, C e G) induz a transcrição de NF-kB (fator nuclear kB), AP-1 (ativador de proteína-1), HIF-1 (fator induzível por hipóxia-1) STAT (sinal transdutor e ativador de transcrição), o que pode induzir crescimento, hipertrofia, fibrose e apoptose (Adaptado de AKKI et al., 2009).
O AEC, e consequentemente a contratilidade celular, pode ser regulado por alterações na modulação redox celular. Na membrana celular, as ROS podem atuar sobre os canais de Ca2+. Um dos mecanismos pelo qual os canais de Ca2+ do tipo L podem ser modulados é pela via de ativação da endotelina-1 (ET-1). Esta via pode ser ativada, dentre outros mecanismos, pelo aumento de •O2- produzido pela enzima NADPH oxidase. A ET-1, por sua vez, induz a
ativação dos canais de Ca2+ do tipo L, aumentando assim, o influxo de Ca2+ para o interior do cardiomiócito (ZENG et al., 2008).
Ainda na membrana celular cardíaca as ROS podem atuar sobre o NCX, os canais para K+, os canais para Cl- e as metaloproteinases de membrana (MMPs) (AKKI et al., 2009). A atividade do NXC diminui significativamente quando há estresse oxidativo (LEHOTSKÝ et
al., 1999). A diminuição da atividade do NCX pode levar ao desequilíbrio na remoção do
Ca2+ presente no citosol da célula cardíaca após a contração celular. Por consequência os níveis de Ca2+ citoplasmáticos aumentam devido à deficiência da atividade do NCX, o que pode levar a arritmias cardíacas, principal causa de morte dentre as doenças cardiovasculares (HILGE, 2012).
A corrente dos canais para K+ também diminui quando há aumento no estresse oxidativo no cardiomiócito. A diminuição da entrada de K+ na célula pode ser associada ao aumento da produção de •O2- via NADPH oxidase. Nesse sentido, tanto a inibição da NADPH
oxidase quanto o aumento da atividade da SOD, diminuem os níveis de •O2-, o que leva a
ativação dos canais para K+ e consequentemente um aumento da corrente de K+ (SHIMONI et
al., 2005).
Quanto aos canais para Cl-, a literatura mostra que, as ROS são capazes de modular seu funcionamento via receptor de angiotensina tipo I (AT1) (SANTOS et al., 2011). A
modulação dos canais para Cl- ocorre a partir do momento que o aumento de ROS ativa o receptor AT1, e, este induz a ativação dos canais para Cl-. A ativação ou inativação dos canais
para Cl- está relacionada ao equilíbrio iso-osmótico celular. Em modelos de cardiomiopatia dilatada, os canais para Cl- encontram-se permanentemente ativados. A ativação persistente da corrente Cl- também ocorre na hipertrofia ventricular, falência cardíaca, diabetes e hipertensão (REN et al. 2007).
A inibição das enzimas NADPH oxidase (NOX) pode levar a diminuição das correntes de Cl-. Nesse sentido, a diminuição de •O2- via atividade da SOD deveria induzir o aumento
das correntes de Cl-, entretanto, durante a dismutação do superóxido é gerado H2O2, que é
considerado um potente agonista dos canais para Cl- cardíacos (REN, et al., 2007). A presença do H2O2 gerado durante a dismutação do superóxido ativa os canais Cl-. Outro
mecanismo que pode levar à diminuição na ativação dos canais para Cl- é a presença da enzima catalase. A catalase é considerada uma potente sequestradora de H2O2, e a diminuição
A metaloproteinase-2 (MMP-2) está presente na membrana do cardiomiócito e é responsável por degradar substratos como o colágeno tipo IV, a elastina e a endotelina, dentre outros substratos da matriz extracelular. Alterações na expressão ou ativação da MMP-2 estão relacionadas a patologias, como a falência cardíaca. Em modelos de isquemia e reperfusão é possível visualizar um aumento na ativação da MMP-2, sugerindo que esta proteína estaria agindo beneficamente no remodelamento cardíaco pós-injúria (WANG et al., 2005).
A MMP-2 tem sua atividade regulada pela geração de ROS (SANTOS et al., 2011). É interessante notar que a literatura demonstra que as ROS geradas pelas NOX (exceto NOX2) são responsáveis pela ativação da MMP e o estímulo provocado pelo aumento de ROS derivado da NADPH oxidase pode aumentar a expressão da MMP-2 (CAVE et al., 2006). Nesse sentido a ativação da MMP-2 seria benéfico para a célula, sendo provavelmente um mecanismo pelo qual o cardiomiócito poderia minimizar os efeitos deletérios gerados pelo aumento de ROS.
Intracelularmente, as ROS podem atuar no RS (AKKI et al., 2009). É bem descrito na literatura que o RyR e também a liberação de Ca2+ induzida por cálcio (CICR) são inibidos pela atividade endógena da NADPH oxidase no RS (HOOL et al., 2007; AKKI et al., 2009). A inibição da NADH induz a liberação de Ca2+ pelo RS e, consequentemente, o aumento de NADH induz a diminuição da atividade do RYR e a diminuição da liberação de Ca2+ pelo RS (CHEREDNICHENKO et al., 2004).
A SERCA, também pode sofrer a ação das ROS e RNS. É bem estabelecido que pequenas quantidades de ROS possam atuar aumentando a atividade da SERCA, e grandes quantidades de ROS podem causar a inativação desta ATPase de forma irreversível (SHAROV et al., 2006; SANTOS et al., 2011). A recaptação de Ca2+ pela SERCA é importante, não somente para o relaxamento muscular, mas também na regulação de processos como apoptose e proliferação celular (MISQUITTA, MACK e GROVER,1999). A diminuição de NO intracelular pode influenciar na atividade da SERCA, acelerando a recaptação de Ca2+, entretanto, o NO é considerado um oxidante fraco. Contudo, essa espécie reativa pode reagir com proteínas e sofrer s-nitrosilação (SNO) ou s-glutationilação (GSS) de tióis reativos, essas reações podem ocorrer por meio da geração secundária de RNS, incluindo NO2, N2O3, NO- ou ONOO- (SAMIE et al., 2009).
A influência da modulação redox na mitocôndria e nos mecanismos contráteis é de fundamental importância, pois se relaciona com a função celular e, a depender do aumento das ROS, também pode se relacionar com a vida ou a morte celular. (AKKI et al., 2009). As mitocôndrias ocupam 30% do volume total do cardiomiócito e está localizada, intracelularmente, de forma a ocupar espaços regulares entre os miofilamentos e o RS (PIZZO e POZZAN, 2007, SANTOS et al., 2011).
A literatura propõe que existe uma relação entre o NADH e o Ca2+ na regulação do perfil energético do cardiomiócito. Essa relação foi estabelecida pois o aumento de Ca2+ ativa as desidrogenases mitocondriais que são essenciais para o aumento dos níveis de NADH e, portanto, uma das responsáveis pela demanda de energia na célula cardíaca (CHEREDNICHENKO et al., 2004).
Ao atuar sobre a mitocôndria, o O2 pode induzir a formação de •O2-. Esse radical livre
pode reagir com o NO (produzido pelas NOS) e formar o ONOO- (SANTOS et al., 2011). O ONOO- é gerado, principalmente, quando há um aumento de NO intracelular e é produto de uma reação rápida entre NO e •O2-, sendo considerado um potente oxidante que é capaz de
oxidar e nitrosilar várias biomoléculas. Danos como, por exemplo, a nitrosilação da enzima polimerase poli-ADP-ribose (PARP), podem contribuir para disfunção endotelial e falência cardíaca (FLOREA e ANAND, 2012).
Já a ação do O2 sobre as NOX pode induzir a geração do H2O2, que também pode ser
gerado pelas NOX que atuam no metabolismo celular (por exemplo, a NOX4). O radical OH que pode ser gerado a partir do H2O2, juntamente com o •NO2 (gerado a partir do ONOO-)
causa danos ao DNA celular, bem como, oxida proteínas metabólicas, o que contribui para a geração de déficit energético no miócito cardíaco (AKKI et al., 2009; SANTOS et al., 2011).
O estresse oxidativo causado pelo excesso de produção de ROS e RNS está envolvido em diversos processos fisiopatológicos. Geralmente a geração de espécies reativas não é a causa da doença e sim parte do processo patológico já instalado. Em pequenas quantidades, tanto as ROS como as RNS são parte do metabolismo celular cardíaco. Contudo em grandes quantidades, estão relacionadas a doenças cardíacas como a hipertrofia ventricular, doenças cardiometabólicas como o diabetes mellitus, dentre outras patologias (GREIENDLING e FITZGERALD, 2003; ANSLEY e WANG, 2013).
1.4 Modulação Redox em Modelos de Doenças Cardíacas.
O estresse oxidativo cardíaco pode resultar, resumidamente, em três processos: adaptação (aumento das defesas antioxidantes), lesão tecidual (dano ao DNA, peroxidação lipídica e oxidação de proteínas) e morte celular (necrose ou apoptose). No caso da adaptação do sistema de defesa, diferentes respostas são geradas como proteção completa contra o dano, ou proteção incompleta contra a lesão, ou seja, as células resistem aos oxidantes (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).
A lesão tecidual ocorre quando a célula não consegue contrabalancear a produção excessiva de ROS e estruturas celulares importantes são oxidadas (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999). A morte celular, que ocorre através da necrose ou apoptose, gera estresse oxidativo e consequentemente dano tecidual. Na necrose a célula incha se rompe, liberando seu conteúdo, o que afeta as células adjacentes, já que o produto liberado contem oxidantes, impondo agressão às células vizinhas e amplificando a lesão tecidual. No processo de apoptose, comumente o dano tecidual para as células vizinhas é menor, pois o cardiomiócito, por exemplo, libera mediadores que promovem a morte celular programada internamente, sem liberar seu conteúdo citoplasmático para as células vizinhas, o que diminui o dano adjacente (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999; HALLIWELL, 2000).
A alteração do equilíbrio redox celular está presente na instalação e desenvolvimento de muitas doenças cardíacas, ou doenças que afetam o coração, como por exemplo, a hipertrofia cardíaca ventricular, o diabetes, a aterosclerose e a doença de Chagas, dentre outras (WANG et al., 2005; AKKI et al., 2009 GUTIERRES et al., 2009; SANTOS et al., 2011).
A hipertrofia ventricular é caracterizada por um aumento de fibrose intersticial que está relacionado à produção de •O2- pelas NOX. A literatura demonstra que principalmente a
NOX-2 está centralmente envolvida na indução de fibrose no cardiomiócito (SANTOS et al., 2011; BURGOYNE et al., 2012). O remodelamento que ocorre durante o aumento de fibrose intersticial envolve interação entre os cardiomiócitos, células endoteliais e células inflamatórias (BURGOYNE et al., 2012).
Uma vez que tanto o diabetes quanto a aterosclerose são fortemente prevalentes em indivíduos também portadores de síndrome metabólica, e seria plausível conceber que o
estresse oxidativo também atue como uma variável biológica relacionada a esse distúrbio. O diabetes está associado ao estresse oxidativo mitocondrial, que apresenta mudanças pró-oxidativas no estado redox sistêmico.
A aterosclerose pode ser caracterizada como uma doença inflamatória sistêmica, onde a deposição de placa ocorre, essencialmente, por meio de um desbalanço entre a resposta imune e a deposição lipídica na camada subendotelial e a alterações nas vias de síntese ou metabolismo do NO. Os monócitos são os principais agentes efetores na formação do ateroma, e são excessivamente estimulados pela atividade da NADPH oxidase.
A literatura relaciona a doença de Chagas com o estresse oxidativo, onde as ROS e RNS são geradas pelas células de defesa do hospedeiro, como agente microbicida (SAEFTEL
et al., 2001). Na doença de Chagas o processo inflamatório é complexo e extensamente
estudado e este processo está diretamente relacionado à produção de ROS e RNS.
É interessante entender, primeiramente, que a doença de Chagas é uma doença sistêmica e não afeta só o coração, entretanto, abordaremos como essa patologia afeta o coração e como o estresse oxidativo se relaciona com o desenvolvimento da doença.
1.5 A doença de Chagas e no coração
A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase, é uma zoonose causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Programas de controle profiláticos tem diminuído substancialmente o número de pessoas infectadas com T. cruzi. Eram entre 16 e 18 milhões de infectados no início de 1990 e em uma estimativa recente o número de doentes está em 10 a 12 milhões, entretanto, aproximadamente 100 milhões de pessoas ainda continuam a estar em risco de adquirir a infecção. Essa doença, atualmente, acomete principalmente residentes da Americana Latina, onde a doença é endêmica (ACQUATELLA, 2007; RAMÍREZ et al., 2012).
O agente etiológico (T. cruzi) é transmitido ao homem, principalmente por seu hospedeiro invertebrado hematófago, conhecido popularmente como barbeiro. As principais espécies associadas à transmissão de T. cruzi, são Triatoma infestans, Panstrongylus
sordida, sendo que o primeiro é considerado o mais importante e de maior incidência no
Brasil (BRENER et al., 2000; RASSI et al., 2012).
No ciclo natural do T. cruzi (figura 5) estão evolvidos o inseto infectado e o homem. O inseto, membro da subfamília Triatominae, se alimenta do sangue do hospedeiro vertebrado, eliminando durante o repasto, fezes próximas ao local da picada. As fezes que contêm T.
cruzi, na forma epimastigota e tripomastigota metacíclica alcançam o tecido conjuntivo e a
corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado através da ferida aberta durante a picada do inseto (RASSI et al., 2012).
Dentro do hospedeiro, o T. cruzi em sua forma tripomastigota é capaz de parasitar diferentes células, inicialmente infecta os macrófagos. (RASSI et al., 2012). No interior das células, os parasitos se diferenciam em amastigotas, iniciando o processo de replicação. Em seguida, após determinado número de ciclos de crescimento, de forma sincronizada, as formas amastigotas se transformam em tripomastigotas, causando a lise da célula infectada e liberando, no interstício ou na circulação sanguínea, o T. cruzi em sua forma tripomastigota (BRENER et al., 2000; RASSI et al., 2012)
As formas tripomastigotas são capazes de infectar outras células, ou reiniciar o ciclo quando um inseto Triatominae não infectado pica o hospedeiro vertebrado infectado (ANDRADE e ANDREWS, 2005; BRENER et al., 2000; RASSI et al., 2012).
Figura 5. Ciclo natural do T. Cruzi. O vetor reduviidae elimina o T. cruzi, na forma
epimastigota e tripomastigota metacíclica que dentro do hospedeiro se transforma na forma tripomastigota, que é capaz de parasitar diferentes células. No interior das células, os parasitos se diferenciam em amastigotas, iniciando o processo de replicação, após determinado número de ciclos de crescimento as formas amastigotas se transformam em tripomastigotas, causando a lise da célula infectada e liberando, na circulação sanguínea, o T.
cruzi em sua forma tripomastigota. As formas tripomastigotas são capazes de infectar outras
células, ou reiniciar o ciclo quando um vetor não infectado pica o hospedeiro vertebrado infectado (Adaptado de Andrade e Andrews, 2005).
A doença de Chagas é uma doença sistêmica, entretanto abordaremos as fases aguda e crônica no coração. Na fase aguda, ocorre uma grande expansão do número de parasitos na circulação sanguínea, bem como um aumento do número de ninhos de amastigotas observados no tecido cardíaco (RUBIN e SCHENKMAN, 2012). A fase crônica da doença se inicia após o controle da parasitemia, que ocorre devido aos processos de imunidade inata e adaptativa, onde pode ser observada uma redução significativa do número de parasitos circulantes, sendo difícil sua detecção na circulação sanguínea (RASSI et al., 2010).
Considerando os aspectos cardíacos durante a fase aguda da doença de Chagas, pode-se obpode-servar a ocorrência de um infiltrado inflamatório mononuclear (DOS SANTOS et al., 2001). A principal consequência do intenso infiltrado inflamatório é a indução de uma intensa miocardite difusa, que pode originar danos aos cardiomiócitos, bem como, danos ao sistema de vasos e inervação do coração (TALVANI e TEIXEIRA, 2011). A literatura demonstra que, na fase aguda, pode ser observada uma desenervação do sistema autonômico cardíaco, que está relacionada à destruição dos neurônios parassimpáticos e simpáticos no coração (MACHADO e RIBEIRO, 1989).
A correlação entre o número de parasitos e a miocardite pode parecer óbvia, entretanto, diferentes dados da literatura demonstram que não existe uma relação clara nesse aspecto. Essa falta de correlação pode ser atribuída às diferenças existentes durante a resposta imune no hospedeiro. O tropismo do T. cruzi por tecidos específicos e as diferenças entres as cepas de T. cruzi também podem ser responsáveis pela variabilidade na resposta imune e consequentemente à falta de correlação entre o número de parasitos e a miocardite (SOUZA
et al., 1996).
As manifestações clínicas características da doença de Chagas, na fase aguda, são a taquicardia, a ligeira hipertrofia ventricular, alternância de onda P, distúrbios de repolarização, arritmias diversas, dentre outras. Entretanto, a mortalidade associada à fase
aguda é reduzida (BRENER et al., 2000). As manifestações cardíacas observadas durante a fase crônica da doença de Chagas podem ocorrer anos ou décadas após a infecção com o T.
cruzi. Contudo, essas manifestações são consideradas os principais problemas decorrentes da
infecção por T. cruzi. Cerca de 30 a 40% das pessoas infectadas irão desenvolver, ao longo dos anos, o quadro sintomático e fisiopatológico da fase crônica. Nessa fase da doença, a detecção do parasito no hospedeiro se torna difícil, sendo realizada principalmente com o auxílio de técnicas de biologia molecular (BRENER et al., 2000; RASSI et al., 2010).
As alterações cardíacas durante a fase crônica da doença de Chagas são a hipertrofia cardíaca em função da dilatação de ambas as câmaras cardíacas, mas principalmente a dilatação do ventrículo direito, com hipertrofia do músculo cardíaco. A presença de infiltrado inflamatório é predominantemente mononuclear difuso, e é observado tanto na interface quanto nos cardiomiócitos e sistema condutor, a presença de fibrose, que compromete a função das células cardíacas (SCANAVACCA e SOSA, 1994; POSTAN et al., 1986; ANDRADE et al. 1978; MACHADO e RIBEIRO, 1989; MACHADO et al., 1987).
Na fase crônica também são observadas alterações no sistema condutor do coração, bem como alterações das propriedades elétricas no miócito cardíaco, que contribuem de forma conjunta para a taquicardia ventricular sustentada e as arritmias. Além disso, o infiltrado inflamatório encontrado ao longo de todo o tecido excitocondutor cardíaco pode contribuir para as constantes alterações elétricas encontradas nessa fase da patologia, como bloqueio total/parcial de ramo direito e parcial do ramo esquerdo, bem como atrofia do nodo sinusal e destruição difusa do nodo átrio-ventricular (BRENER et al., 2000; ANDRADE et al., 1978).
Durante o desenvolvimento da resposta inflamatória ocorre o aumento da produção de ROS e RNS. Além disso, as espécies reativas são consideradas essenciais na resposta imune, gerada contra diversos patógenos intracelulares, como os vírus, bactérias, fungos e protozoários (FUKAI, 2009). Durante a infecção por T. cruzi, ocorre um aumento generalizado de ROS e RNS com o objetivo de eliminar o parasito (ALVAREZ et al. 2004).
1.6 O estresse oxidativo na doença de Chagas
A literatura descreve o NO, o •O2-, e o H2O2 como as espécies reativas que participam
ativamente na defesa do hospedeiro contra o T. cruzi, e por isso se encontram aumentadas durante a infecção pelo parasita (BENDALL et al., 2002; FUKAI, 2009; GUTIERRRES, et
al., 2009). Entretanto, o aumento exagerado das espécies reativas pode desempenhar efeitos
deletérios nas células do próprio hospedeiro (FUKAI, 2009).
Durante a infecção por T. cruzi a NOS2 é expressa pelos macrófagos e a produção de NO aumentada pode modular a atividade destas células de defesa que são fagócitos ativos no controle e morte de parasitas por mecanismos oxidativos e não oxidativos. Entretanto, o excesso de produção de NO pelas células de defesa pode gerar dano tecidual ao coração (GAZZINELLI et al., 1992).
Durante a evolução da doença de Chagas a produção de ROS se encontra aumentada, tanto nas células de defesa, como por exemplo, células Natural Killer (NK) e macrófagos quanto nas células cardíacas com o objetivo de eliminar o parasita (VYATKINA et al., 2004; FISHER, 2009). A literatura demonstra que, com a evolução da infecção por T. cruzi, ocorre um remodelamento na matriz mitocondrial nas células cardíacas e com isso, uma redução nos níveis de ATP, atribuída principalmente a um escape de elétrons da cadeia transportadora de elétrons, que são transferidos para o O2 molecular, contribuindo para uma produção constante
de •O2- (VYATKINA et al., 2004).
A ação do •O2- e do H2O2 é modulada pela presença de diferentes proteínas
antioxidantes, como a SOD, catalase e a GPx. Entretanto, além de ser observado um aumento na produção das ROS na infecção por T. cruzi, também é observado uma redução das enzimas antioxidantes, como a GSH e a MnSOD, indicando a ocorrência de um desbalanço entre produção e neutralização das ROS (VYATKINA et al., 2004; GUPTA et al., 2009).
A importância de se controlar o estresse oxidativo durante a infecção por T. cruzi é demonstrada em estudos, onde o tratamento com antioxidante ou a privação de antioxidantes promoveu respectivamente a melhora ou a piora dos danos cardíacos (CARVALHO et al., 2006; WEN et al., 2006; MACAO et al., 2007). Um exemplo de aumento de danos cardíacos causados por estresse oxidativo foi demonstrado por Carvalho et al. (2006), onde, utilizando ratos chagásicos, a privação de vitamina-E agravou o dano cardíaco e a inervação cardíaca durante a fase aguda da doença de Chagas.
Wen et al. (2006) demonstraram que, camundongos infectados com T. cruzi e tratados com Fenil-N-tert-butilnitrona (PBN), uma substância antioxidante, apresentaram melhora na atividade da cadeia respiratória, contribuindo para melhora dos danos cardíacos observados na fase aguda da doença de Chagas. Nesse sentido, Macao et al. (2007), em um estudo com
humanos, também observaram redução no estresse oxidativo de indivíduos tratados com vitamina A.
Somadas às informações já apresentadas, é interessante acrescentar que os tratamentos disponíveis para a fase aguda da doença de Chagas, como o Benzonidazol e o Nifurtimox provocam aumento de estresse oxidativo, pois o mecanismo de ação destes dois fármacos é via geração de ROS, capaz de matar o T. cruzi (MONCADA et al., 1989; PEDROSA et al., 2001).
Neste contexto, o ácido úsnico é descrito na literatura como uma molécula capaz de produzir efeito anti T. cruzi, pois ele atua promovendo a redução da proliferação de formas epimastigotas do T. cruzi (DE CARVALHO et al., 2005). O interessante dessa molécula é que vários estudos recentes têm demonstrado que o ácido úsnico tem potencial antioxidante (ODABASOGLU et al., 2006; RABELO et al., 2012).
1.7 Ácido Úsnico
O ácido úsnico [2,6-diacetil-7,9-dihidroxi-8,9b-dimetil-1,3-(2H, 9H)-dibenzofurano] (figura 6) é um metabólito secundário de líquens, sendo descrito na literatura como um componente com efeito antibiótico (FRANCOLINI et al., 2004; SAFAK et al., 2009; GUPTA
et al., 2012), antifúngico (CONOVER et al. 1992; CARDARELLI et al., 1997;
COCCHIETTO et al., 2002) antiviral (COCCHIETTO et al., 2002; SOKOLOV et al., 2012), anti-inflamatório (COCCHIETTO et al., 2002; HUANG, 2011), antiproliferativo (COCCHIETTO et al., 2002; DA SILVA, 2006) e antiparasitário (COCCHIETTO et al., 2002; DE CARVALHO et al., 2005). O ácido úsnico (AU) é uma substância de fácil obtenção e a sua extração envolve baixos custos financeiros. Desde o seu isolamento, em 1844, tornou-se o metabólito de líquen mais extensamente estudado e um dos poucos comercialmente disponíveis (INGÓLFSDÓTTIR, 2002).
Figura 6. Estrutura química do ácido úsnico (C18H16O7)
Alguns artigos apresentam o AU como um potente agente hepatotóxico (PRAMYOTHIN et al., 2004; KRISHNA et al., 2011), entretanto, a toxicidade dessa substância tem sido questionada em vários estudos (ODABASOGLU et al., 2006; JU-QING, CUI-QIN e LANG-CHONG, 2008; RABELO et al., 2012). O AU é utilizado em vários países na formulação de cosméticos como cremes, produtos com fator de proteção contra raios ultravioletas, perfumes, desodorantes, creme dental e antisséptico bucal (RANCAN et
al., 2002; ENGEL et al., 2007; NUNES et al., 2011). Também tem sido relatada a utilização
do AU em suplementos alimentares com a finalidade de ajudar na perda de peso, embora a literatura aponte que a utilização do AU como emagrecedor pode causar hepatotoxicidade, os dados indicam que essa substância é utilizada, mesmo sem orientação médica, com essa finalidade (HSU et al., 2005; BUNCHORNTAVAKUL e REDDY, 2013).
Vários estudos relatam que o AU, em altas doses, induz o desacoplamento da cadeia transportadora de elétrons (ABO-KHATWA, AL-ROBAI E AL-JAWHARI, 1999; HAN, et
al., 2004; JOSEPH et al., 2009). Joseph et al. (2009), demonstraram ainda que o AU pode
modular a expressão de vários genes, dentre eles, os genes que regulam a expressão dos complexos que constituem a cadeia transportadora de elétrons. A fosforilação oxidativa é produzida pelo gradiente de prótons em toda a membrana interna da mitocôndria, e é crucial para a geração de ATP. A cadeia transportadora de elétrons é constituída por quatro complexos nomeados complexos I, II, III e IV. O complexo V é responsável pela síntese de ATP. Todos os cinco complexos possuem várias subunidades de proteínas que são codificadas pelos genomas mitocondriais e nucleares, exceto as proteínas do complexo II, que são codificadas apenas pelo DNA nuclear (LEHNINGER, NELSON e COX, 2007).
No estudo realizado por Joseph, et al. (2009) foi mostrado que o AU apresentou efeito sobre a expressão genética dos quatro complexos da cadeia de transportadora de elétrons (complexos I - IV), enquanto a expressão de genes relacionados ao complexo V foi menos afetada pelo tratamento com AU. Dos 82 genes associados com a fosforilação oxidativa mitocondrial foram analisados neste estudo 30 genes, dentre esses, a maioria foi regulada positivamente pelo AU.
Devido ao seu caráter lipofílico o AU, atravessa facilmente a membrana celular e mitocondrial. Entretanto, para atravessar estas membranas na matriz da mitocôndria, o AU libera um próton H+ e se transforma em um ânion usniato (AU-). O AU- pode difundir de volta para espaço intramembranar, onde pode se ligar a um próton H+ para se transformar novamente em AU (figura 7).
O ciclo resultante da constante entrada e saída do AU provoca uma fuga de prótons que, eventualmente, pode dissipar o gradiente de prótons através da membrana, o que explica o motivo pelo qual não há prótons suficientes para ativar o complexo V e, portanto, pode resultar no desacoplamento da cadeia transportadora de elétrons (JOSEPH et al., 2009).
