VIVIANE TANNURI FERREIRA LIMA FALCÃO
"IMPORTÂNCIA DO CONTATO INTERCELULAR NO
PÂNCREAS ENDÓCRINO MEDIADO PELAS JUNÇÕES
CELULARES E SEU PAPEL NA PATOGÊNESE DA
DIABETES MELLITUS TIPO 2."
RESUMO
As junções intercelulares (JIs) e suas proteínas estruturais estão envolvidas em vários processos celulares tais como adesão e comunicação celular, diferenciação, proliferação e homeostase celular em diversos órgãos. No pâncreas endócrino, JIs parecem estar envolvidas na regulação da citoarquitetura das ilhotas pancreáticas, bem como na biossíntese e secreção de insulina. O objetivo desta tese foi investigar o possível papel do contato intercelular mediado pelas junções intercelulares e suas proteínas estruturais na disfunção das células beta pancreáticas na patogênese do Diabetes mellitus tipo 2 (DMT2). Para tanto, investigamos a distribuição e expressão celular de proteínas juncionais (a saber, E-, N-, VE-caderinas, ZO-1, β- e α - cateninas) no pâncreas endócrino de camundongos C57BL/6/JUnib alimentados com uma dieta rica em gorduras (dHL) durante 8 meses. Inicialmente, foi feita uma caracterização metabólica dos animais e uma análise estrutural e morfométrica do pâncreas endócrino, já que estudos avaliando o efeito da administração de dHL por tempo prolongado são escassos. Os animais do grupo dHL (alimentados com ração contendo 21%g lipídios por 8 meses) tornaram-se obesos, mostrando importante aumento do ganho de peso (170%) em relação ao grupo controle (que recebeu ração padrão com 4,5%g lipídios pelo mesmo período de tempo). Ainda, os camundongos obesos exibiram distúrbios metabólicos característicos e indicativos dos estágios iniciais do estabelecimento da DMT2, como resistência periférica a insulina, com um aumento (de 27,34%, p=.0,0005) da área sob a curva de ITT, bem como marcada hiperglicemia em jejum (52%, p<0,0001) e hiperinsulinemia pós-prandial (88%, p=0,0058) em relação ao grupo controle. Ilhotas pancreáticas isoladas de camundongos alimentados com dHL mostraram uma deficiência significativa da secreção de insulina estimulada por glicose (p<0,05), associada a um aumento da expressão do gene da insulina (isoformas 1 e 2), analisado por qPCR. A histologia do pâncreas endócrino não revelou alterações marcantes na morfologia e citoarquitetura das ilhotas entre os grupos de animais. Entretanto, os animais dHL apresentaram um aumento significativo do volume relativo de células β por pâncreas total (aumento de 57,1%, p<0,036) e da área relativa de células β por ilhota em relação ao grupo controle (p<0,003), indicando uma expansão compensatória da massa de célula β, associada com uma significativa diminuição (p<0,003) da área ocupada pelas células α em relação à área total da ilhota (30%, p<0,003). Com relação à distribuição celular das proteínas juncionais nas ilhotas pancreáticas, a N-caderina, E-caderina, ZO-1 e cateninas estão distribuídas na região de contato intercelular das células endócrinas pancreáticas, enquanto que a VE-caderina está limitada ao endotélio. Verificou-se, por imunoistoquímica, uma diminuição na marcação intercelular das células β para N-caderina (p<0,0001), E-caderina (p<0,0001) e α-catenina (p<0,0001) e um aumento na imunoreação para VE-caderina (p<0,004) nas ilhotas de camundongos diabéticos em relação ao grupo controle. No caso particular da imunofluorescência para N-caderina, verificou-se um aumento na marcação difusa do interior das células β, indicando uma redistribuição dessa
proteína da região de contato intercelular para o citoplasma. Entretanto, não observamos diferenças significativas no grau do conteúdo celular dessas proteínas juncionais, analisado por Western Blot, em homogeneizados de ilhotas isoladas entre os grupos experimentais. Conforme revelado por qPCR, um aumento na expressão gênica da VE- e N-caderinas, bem como de ZO-1, foi observado em ilhotas isoladas de camundongos diabéticos em comparação com os controles. Em conclusão, as proteínas juncionais estudadas são expressas por células endócrinas e endoteliais das ilhotas pancreáticas e, em particular, a distribuição/expressão de N-, E- e VE-caderinas, bem como α-catenina nas ilhotas é significativamente alterada em camundongos obesos e diabéticos, o que pode ter repercussão no desenvolvimento da DMT2.
ABSTRACT
Intercellular junctions (IJs) and their cell adhesion molecules (CAMs) participate in important cellular processes such as adhesion, growth/death and signaling. In the endocrine pancreas, IJs play a role in regulating islet cytoarchitecture, insulin biosynthesis and secretion. In this PhD thesis, we investigated the islet histology and cellular distribution and content of CAMs (E-, N-, VE-cadherins, ZO-1, α- and β-catenins) in the endocrine pancreas of C57BL/6/JUnib mice fed a high fat (HF) diet for a prolonged time period (8 months). After HF diet exposure, mice became obese and displayed marked metabolic disturbances indicative of type 2 diabetes mellitus, such as marked peripheral insulin resistance and hyperglycemia, and moderate hyperinsulinemia. Isolated pancreatic islets of HF-fed mice showed a significant impairment of glucose-stimulated insulin secretion associated with an increase in insulin (isoforms 1 and 2) gene expression as revealed by qPCR. Histology of the endocrine pancreas revealed no marked changes in islet morphology and cytoarchitecture between animal groups, although HF-fed mice showed a 57% increase in the relative β cell volume (per total pancreas) in comparison with controls. As shown by immunohistochemistry, ZO-1, E-, N-cadherin and catenins, were expressed at the intercellular contact site of pancreatic endocrine cells while VE-cadherin was restricted to the islet vascular compartment. A cellular redistribution of N- and E-cadherins and α-catenin (from the contact region to the cytoplasm in endocrine cells) and an increase in VE-cadherin islet content were seen in diabetic mice as compared to controls. No significant differences in islet immunoreaction for the other CAMs were observed between the animal groups. As revealed by qPCR, an increase in gene expression of VE- and N-cadherins as well as of ZO-1, not accompanied by significant changes in islet protein content, was observed in isolated islets of diabetic mice as compared to the controls. In conclusion, CAMs are expressed by endocrine and endothelial cells of pancreatic islets and, in particular, the islet distribution/content of N-, E- and VE-cadherins as well as α-catenin are significantly altered in obese and diabetic mice.
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1
1. INTRODUÇÃO... 25
1.1 ESTRUTURA DA PRESENTETESE... 25
1.2 INTRODUÇÃO AO TEMA DESSA TESE... 25
1.2.1 JUNÇÕES CELULARES... 25
1.2.2 PÂNCREAS ENDÓCRINO: MORFOLOGIA E FUNÇÃO... 29
1.2.3 DIABETES MELLITUS TIPO 2 E DISFUNÇÃO DA CÉLULA β... 34
1.3OBJETIVOS E RELEVÂNCIA DESSA TESE... 33
CAPÍTULO 2 2. MATERIAL E MÉTODOS... 41
2.1 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS... 41
2.2 ANIMAIS... 42
2.3 DIETA HIPERLIPÍDICA... 42
2.4 AVALIAÇÃO METABÓLICA DO ANIMAL... 43
2.5 ISOLAMENTO DE ILHOTAS PANCREÁTICAS... 43
2.6 SECREÇÃO ESTÁTICA DE INSULINA... 44
2.7 AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA E MORFOMÉTRICA DO PÂNCREAS ENDÓCRINO... 44
2.8 IMUNOISTOQUÍMICA PARA INSULINA... 45
2.9 AVALIAÇÃO DA CITOARQUITETURA DAS ILHOTAS PANCREÁTICAS... 46
2.10 IMUNOLOCALIZAÇÃO E ANÁLISE DO GRAU DE MARCAÇÃO DAS PROTEÍNAS JUNCIONAIS EM CORTES DE PÂNCREAS ENDÓCRINO... 47
2.11 AVALIAÇÃO DO GRAU DE MARCAÇÃO POR IMUNOFLUORESCÊNCIA... 48 2.12 WESTERN BLOT... 49 2.13 PCR EM TEMPO REAL... 50 2.14 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 56 CAPÍTULO 3 3. ARTIGO CIENTÍFICO... 57 3.1 INTRODUÇÃO... 57 3.2 MATERIAL E MÉTODOS... 60 3.3 RESULTADOS... 64 3.4 DISCUSSÃO... 70 3.5 FIGURAS... 81 CAPÍTULO 4 4.1 CONCLUSÕES... 99 4.2 CONCLUSÃO ESQUEMÁTICA... 101 CAPÍTULO 5 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 103 ANEXOS... 119
Aos meus filhos, fonte da minha inspiração: Felipe, Thiago, Marcela e Germana e Duda que tem um espaço especial em meu coração,
À Marcelo, Meu amor, meu companheiro...
“O sonho é ver as formas invisíveis Da distância imprecisa, e, com sensíveis
Movimentos da esperança e da vontade, Buscar na linha fria do horizonte A árvore, a praia, a flor, a ave, a fonte --- Os beijos merecidos da Verdade”.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus que é o Senhor de todas as coisas e nos guia por caminhos que por vezes não conseguimos entender, e que sempre nos levam ao crescimento.
A Marcelo, Felipe, Thiago e Marcela, marido e filhos que souberam entender meus momentos longos de ausência, de muito trabalho, de alegrias, de saudades. Se vocês não estivessem sempre do meu lado, apoiando, cuidando, amando, não sei se teria conseguido transpor os desafios. Sem o amor de vocês, nada seria possível!
A meus pais Nemyr e Marilene por me mostrarem, que todos os momentos da vida, mesmo aqueles mais difíceis, nos trazem grandes ensinamentos e que portanto, é preciso respeitá-los sempre. Amo vocês!
Aos meus irmãos, Eliane, Janine e Flávio e meus cunhados e cunhada, Mauro, Rodolfo e Adriana e minha irmã de coração, Verônica, vocês são especiais, toda a alegria e torcida, mesmo que de longe, foi sempre sentida muito de perto...
A minha orientadora Professora Dr Carla Beatriz Collares Buzato, a quem eu gostaria de agradecer especialmente e muito carinhosamente, sua competência, gentileza e generosidade em atos e palavras me ensinaram muito. Ensinar é um exercício de imortalidade. Como disse Cora Coralina Coralina “Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina”.
Aos meus queridos Ricardo, Dani e Carol, conviver com vocês nestes 4 anos foi para mim uma grande experiência! Vocês não podem imaginar a importância que têm em minha vida e como são especiais para mim, companheiros de bancada, de alegrias, as vezes de tristezas, de desafios...saudades sempre!!!
A minha doce Célia, sua generosidade me encanta! Cada mimo, cada palavra, cada gesto, vêm sempre carregado da sua nobre delicadeza. Só tenho a agradecer a convivência nestes anos que me fez aprender muito, muito...
A Mariane, Vanessa, Max, Letícia, e Mariana, agradeço pelo carinho, pelo companheirismo, pelas horas na bancada, no biotério, pelos momentos de descontração, comendo as delícias da Dani e ou da Célia...muito obrigada!
A Leandro, Bárbara e mais recentemente Valquíria, queria agradecer pelos bons momentos, boas conversas, pelo ótimo trabalho no laboratório...
Gostaria de agradecer aos professores do DINTER em nome da professora Sarah Arana e do professor Paulo Juazeiro, vocês foram muito importantes em minha formação. Os ensinamentos passados foram valiosos...
A todos os professores do DHE, que estiveram sempre disponíveis em auxiliar nos momentos de necessidade.
A Cíntia, D. Raquel, Natália, Stephanie, técnicas do DHE que em todos os momentos estavam sempre prontas a contribuir e ajudar.
A todos os estudantes e funcionários do DHE, especialmente os colegas do laboratório da profa Maria Alice, que estiveram sempre presentes e disponíveis a ajudar quando necessário.
A Adriana, Nara e Helena que participaram comigo dos momentos difíceis para realização da técnica do PCR em tempo Real, e que estiveram firmes, apoiando e ensinando sempre! Meu agradecimento especial.
A todos os técnicos e estudantes do Laboratório do Centro de Onco-hematologia Pediátrica (HUOC-UPE), fundamentais em meu aprendizado, o meu agradecimento!
A professora Dra Maria Tereza Cartaxo Muniz, minha co-orientadora, pela ajuda, apoio e conhecimento compartilhado. Muito obrigada!!
A professora Dra Anna Carolina, que me acolheu, me ensinou, me acompanhou, pegou na minha mão, trabalhou junto me ensinando não apenas a técnica do qPCR, mas principalmente a importância de ser solidário. Se existem anjos no universo, certamente você foi um deles nessa jornada!!! Muito obrigada por tudo.
Ao Professor Dr Marcos Morais – Departamento de Genética da UFPE – Universidade Federal de Pernambuco, que gentilmente me cedeu o laboratório, para que eu pudesse desenvolver o qPCR. Muito obrigada!
A todos que fazem a Direção da Faculdade de Enfermagem Nossa Senhora das Graças pelo apoio, amizade, e compreensão nos períodos em que a ausência foi necessária. Muito obrigada por tudo!!!
A professora Deuzany Leão, companheira de todas as horas, pela criatividade, carinho, compreensão e paciência nos momentos longos de ausência.
A professora Vera Gregório que me incentivou e foi muito importante na minha decisão em cursar o doutorado. Muito obrigada por tudo!!!
As professoras Amparo, Katiúscia, Sandra, Fábia, Betânia, Claúdia e Jael, por conduzirem brilhantemente a FENSG nos meus períodos de ausência, buscando sempre fazer o melhor.
Ao corpo administrativo da FENSG, a quem agradeço em nome de Léa, Eliete, Madalena, Sandra, Nadir, Fátima e Vera, todos vocês foram muito importantes no caminhar desta etapa, meu agradeceimento especial!
A professora Laurecir, a quem admiro, pelo conhecimento, carinho, apoio, dedicação para que tudo acontecesse no momento certo e a contento. Só tenho a agradecer pela amizade e acolhimento. Você foi muito importante em todo este processo!!!
A Universidade de Pernambuco pelo apoio nestes quatro anos a quem gostaria de agradecer em nome da Professora Dra Viviane Colares, pró-reitora de pós-graduação e pesquisa.
As minhas queridas amigas e companheiras Neves e Izabel, sem o apoio de voês não sei se teria conseguido. A amizade e o aprendizado construído ficarão para sempre!!! Agradeço de coração a oportunidade de conviver com vocês e agora enfim...chegou o momento de podermos dizer...conseguimos!!!
A turma do DINTER com quem aprendi muito, fiz amigos sólidos...estamos todos na reta final, os momentos que passamos juntos serão sempre lembrados. Parabéns a todos!!!
A Eduardo pelas aulas de Bioquímica tão importantes para o nosso aprendizado!
A Andréa pelo carinho, os lanches no final da tarde ficarão na lembrança!!
Meu agradecimento aos professores membros da banca examinadora, que gentilmente aceitaram o convite e que certamente terão contribuições valiosas para esta Tese.
A Líliam sempre tão disponível em atender, esclarecer incansavelmente! Obrigada pelo carinho!
À Universidade Estadual de Campinas e ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, pela oportunidade concedida.
Agradeço às agências de fomento CAPES-DINTER, CNPq e FAPESP pelo apoio financeiro concedido.
De tudo ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre começando... A certeza de que é preciso continuar... A certeza de que podemos ser interrompidos antes de terminar... Portanto façamos: Da interrupção, um caminho novo... Da queda, um passo de dança... Do medo, uma escada... Do sonho, uma ponte... Da procura, um encontro... (Fernando Sabino)
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
Tabela I - Composição das Rações Utilizadas... 42
Tabela II - Grau de Alteração da Citoarquitetura... 47
Tabela III - Diluição e Fabricante dos Anticorpos para Imunoistoquímica.. 48
Tabela IV - Diluição e Fabricante dos Anticorpos para Western Blot... 50
Tabela V - Concentração e Integridade do RNA... 51
Tabela VI - Primers Específicos Utilizados no qPCR... 52
LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 1
FIGURA 1 - Representação esquemática das proteínas integrantes e associadas às junções intercelulares... 27
CAPÍTULO 2
FIGURA 2 - Verificação da amplificação dos fragmentos por
RT-PCR... 53 FIGURA 3 - Verificação da amplificação dos fragmentos por
RT-PCR...
. 53
FIGURA 4 - Verificação da especificidade de amplificação dos
primers... 56
CAPÍTULO 3
FIGURA 5 - Camundongos C57BL/6J se tornam obesos e diabéticos após a alimentação com dieta hiperlipídica (dHL) por tempo prolongado... 81 FIGURA 6 - Ilhotas pancreáticas de camundongos diabéticos apresentam
diminuição da secreção de insulina estimulada por glicose... 83 FIGURA 7 - A exposição prolongada à dieta hiperlipídica (dHL) (8 meses)
induz a expansão da massa de células beta, sem alteração marcante na citoarquitetura da ilhota... 85 FIGURA 8 - A exposição prolongada (8 meses) à dieta hiperlipídica (dHL)
induz uma diminuição significativa no conteúdo juncional de E-caderina, que não é acompanhada por alterações na expressão dessa molécula de adesão em células β dos camundongos diabéticos...
FIGURA 9 - A exposição prolongada à dieta hiperlipídica (dHL) induz marcada redistribuição celular de N-caderina, que não é acompanhada por alteração significativa no conteúdo celular dessa molécula de adesão em células β dos camundongos diabéticos... 89 FIGURA 10 - Aumento na imunomarcação para VE-caderina em ilhotas
pancreáticas de camundongos diabéticos após a exposição prolongada a dieta hiperlipídica (dHL)... 91 FIGURA 11 - A exposição prolongada à dieta hiperlipídica (dHL) induz
diminuição do teor juncional de α-catenina, mas nenhuma mudança significativa na marcação de ZO-1 e β-catenina em células β de camundongos diabéticos... 93 FIGURA 12 - Nenhuma alteração significativa no conteúdo celular de ZO-1, α-
e β-cateninas foi visto em homogeneizados de ilhotas dos camundongos diabéticos em comparação com os controles... 95 FIGURA 13 - Efeito da exposição prolongada à dieta hiperlipídica (dHL) sobre
a expressão gênica de proteínas juncionais em estudo e insulina em ilhotas pancreáticas de camundongos diabéticos em comparação com os controles... 97 FIGURA 14 Conclusão Esquemática... 107
CAPÍTULO 1
1. INTRODUÇÃO
1.1 ESTRUTURA DA PRESENTE TESE
Essa tese está estruturada em cinco capítulos. O atual Capítulo apresenta uma visão geral do tema, descrevendo de forma sucinta o pâncreas endócrino com ênfase à célula β, bem como a importância das interações celulares mediada pelas junções celulares no processo de secreção de insulina e a repercussão da disfunção da célula β na patogênese da diabetes mellitus tipo 2. No Capítulo 2, há a descrição detalhada de todas a metodologias e procedimentos empregados no desenvolvimento dessa tese. O Capítulo 3, por sua vez, aborda, na forma de artigo científico escrito na língua portuguesa, os resultados obtidos e a discussão dos mesmos em face à literatura científica, destacando a relevância das descobertas desse estudo. No Capítulo 4, são apresentadas as conclusões gerais obtidas com o desenvolvimento desta tese. Por fim, no Capítulo 5, está a lista de referências citadas ao longo de toda a tese.
1.2 INTRODUÇÃO AO TEMA DESSA TESE 1.2.1 Junções Celulares
As células organizadas em tecidos e/ou órgãos se aderem e interagem entre si por meio de uma série de especializações da membrana plasmática denominadas junções intercelulares (Collares-Buzato, 2013; Diamond, 1977). Ultraestruturalmente são identificados quatro tipos de junções intercelulares: 1) a junção de oclusão (tight junction) (JO), local onde ocorre uma fusão aparente das membranas plasmáticas de células adjacentes; 2) a junção aderente (JA) (zonula ou fasciae adherens), região caracterizada pela aproximação e alinhamento de duas membranas adjacentes, delimitando um espaço intercelular de 15-20 nm, e onde, na sua face citoplasmática, ocorre ancoragem dos
microfilamentos do citoesqueleto; 3) o desmossomo (ou maculae adherens), onde as membranas adjacentes aparecem como duas placas lineares, paralelas e elétron-densas, às quais se associam os filamentos intermediários do citoesqueleto e 4) a junção comunicante (ou gap junction), região de íntima aproximação de membranas adjacentes onde se inserem uma coleção de canais intercelulares, que conectam os citoplasmas de duas células vizinhas (Collares-Buzato, 2013).
Funções específicas têm sido atribuídas a cada uma das junções intercelulares, tendo como base sua morfologia e composição bioquímica. Dentre as junções intercelulares, a junção comunicante foi uma das primeiras a ser estudada e caracterizada bioquimicamente. A função primordial desta junção é mediar a comunicação intercelular direta (Collares-Buzato, 2013; Mese et al., 2007; Musil, 1994). Atualmente, sabe-se que os canais intercelulares das junções comunicantes são formados por proteínas transmembranas pertencentes à super-família das conexinas, que são codificadas por vários genes e expressas de maneira animal- e célula- específica (Mese et al., 2007). As junções comunicantes formam a base morfo-funcional das sinapses elétricas no sistema nervoso central, permitindo a condução rápida do impulso nervoso (Rozental et al., 2000); participam do acoplamento celular importante na secreção hormonal pelas glândulas endócrinas (Meda et al., 1991); em células musculares, a junção comunicante permite que o músculo cardíaco funcione como um sincício e coordena a contração da musculatura lisa (Paul, 1995). Algumas doenças têm sido associadas à disfunção da junção comunicante, como por exemplo, a cardiopatia na Doença de Chagas (Campos de Carvalho et al., 1992), a Doença de Charcot-Marie-Tooth, uma neuropatia periférica ligada ao cromossomo X (Ressot & Bruzzone, 2000) e alguns tipos de catarata e surdez hereditárias (Lai-Cheong et al., 2007; Mathias et al., 2010; Mese et al., 2007).
As outras junções intercelulares, a saber, a JO, a JA e os desmossomos, estão envolvidas na adesão intercelular. Embora bioquimicamente bem distintas entre si, elas apresentam uma estrutura molecular análoga. Cada unidade juncional é formada por proteínas transmembranas específicas que interagem com o citoesqueleto através de um complexo protéico associado à região citoplasmática da junção (Madara, 1998) (Figura 1).
Fig. 1. Representação esquemática das proteínas integrantes e associadas às junções
intercelulares constituintes do complexo unitivo (junção de oclusão, aderente e desmossomos) e suas interações com componentes do citoesqueleto. Esquema adaptado de Collares-Buzato (2013).
A junção aderente e os desmossomos contém moléculas de adesão dependentes de cálcio, pertencentes à super-família das caderinas (Ebnet, 2008; Geiger & Ayalon, 1992). Tais moléculas são glicoproteínas de superfície que promovem a coesão de células adjacentes e interagem com o citoesqueleto por intermédio das cateninas (α-, β-, δ-cateninas e p120), alfa-actinina e vinculina, no caso da junção aderente, e do complexo desmoplaquina/placoglobina, nos desmossomos (Ebnet, 2008; Knudsen et al., 1995; Mathur et al., 1994). A formação e a manutenção da arquitetura tecidual são conseqüências da firme adesão entre células vizinhas promovida pela junção aderente e desmossomos
(Geiger & Ayalon, 1992). A junção aderente está também envolvida na formação e manutenção da estrutura de todas as junções intercelulares, na conservação da polaridade celular e no reconhecimento intercelular durante a organogênese (Eaton & Simons, 1995; Geiger & Ayalon, 1992). O comprometimento do mecanismo de adesão celular pode levar ao desencadeamento do processo tumoral, à dediferenciação e hipermotilidade celular no câncer e metástase (Collares-Buzato, 2007; Conacci-Sorrell et al., 2002). A importância dos desmossomos como estrutura de adesão é também apreciada pelo seu envolvimento no pênfigo, uma doença dermatológica crônica (pênfigo vulgar e pênfigo foliáceo) (Shimizu et al., 1995; Waschke, 2008).
A junção de oclusão, por sua vez, exerce um papel fundamental de barreira de difusão pela via paracelular, essencialmente em endotélios e epitélios de revestimento (Farquhar & Palade, 1963; Mitic et al., 2000). Além disto, este tipo de junção realiza a manutenção da distribuição assimétrica (polaridade) de proteínas e lipídios entre os domínios apical e basolateral da membrana de células epiteliais e funciona como dispositivo de adesão intercelular em outros tipos celulares (Gumbiner, 1987; Schneeberger & Lynch, 1992). As proteínas ocludina e claudinas são os principais constituintes da rede complexa de cordões de vedação que forma a junção de oclusão, responsáveis pelo contato íntimo entre células adjacentes (Furuse et al., 1993; 1998). Proteínas citoplasmáticas conhecidas como zonula occludens – ZOs (ZO-1, ZO-2, ZO-3) (Gumbiner et al., 1991), cingulina (Citi et al., 1988), antígeno 7H6 (Zhong et al., 1993) e simplequinas formam um complexo proteico que liga as proteínas transmembranas com o citoesqueleto na junção de oclusão (Anderson, 2001; Ebnet, 2008; Guillemot et al., 2008). A junção de oclusão está envolvida no processo de absorção intestinal de nutrientes (Madara, 1990), na espermiogênese (Byers & Pelletier, 1992) e no trânsito de moléculas através dos capilares cerebrais (Rubbin & Staddon, 1999). A função de barreira desempenhada pela junção de oclusão pode ser modulada em várias condições experimentais (Collares-Buzato et al. 1994, 1998; Peixoto & Collares-Buzato 2005) bem como estar comprometida em alguns estados patológicos como na transmigração de patógenos e/ou células através de epitélios e endotélios durante infecção bacteriana intestinal (Jepson et al., 1995; 2000) e inflamação (Evans et al., 1983).
Em adição à sua reconhecida função como dispositivos de adesão, pesquisas têm indicado que essas junções intercelulares e suas proteínas integrantes estão associadas a diferentes tipos de vias de transdução de sinais citoplasmáticos (Benmerah et al., 2003; Conacci-Sorrell et al., 2002; Matter & Balda, 2003). A ideia vigente é que as proteínas juncionais funcionariam como transdutores de sinais extra e intracelulares, transmitindo e convertendo tais sinais no interior da célula e, assim, modulando a expressão gênica e vários processos celulares tais como diferenciação, motilidade, proliferação e morte celular (Kim et al., 2009; Li et al., 2009; Luebke-Wheeler et al., 2009; Luther et al. 2005; Parnaud et al., 2011).
Tem sido demonstrado que as cateninas (em especial a β-catenina e a p120) da junção aderente interagem com receptores de fatores de crescimento (tais como EGF, FGF e HGF) e regulam a ação destes fatores na célula (Conacci-Sorrell et al., 2002). Adicionalmente, várias proteínas juncionais, como a beta- e p120-cateninas, as ZOs (ZO-1 e ZO-2), a simplequina e cingulina, podem migrar para o núcleo e ativar fatores de transcrição gênica (tais como o TCF/LEF-1 e a SAF-B proteína ligante ao DNA) (Benmerah et al., 2003; Ebnet, 2008; Guillemot et al., 2008; Matter & Balda, 2003).
Apesar do conhecimento que se tem acumulado nesta área da fisiologia celular, o estudo das junções intercelulares no que se refere à sua composição bioquímica e função em certos tipos celulares ainda é relativamente escasso. Um exemplo disto é o pâncreas endócrino.
1.2.2 Pâncreas endócrino: morfologia e função
No pâncreas endócrino, cinco tipos celulares (células β ou B, células α ou A, células δ ou D, células PP e células ε, produtoras de grelina) se arranjam em unidades morfológicas e funcionais denominadas ilhotas de Langerhans (Orci, 1976; Orci & Unger, 1975). Cada ilhota é constituída por cordões de células, estas de formato poliédrico, entremeados por uma rica rede de capilares sanguíneos do tipo fenestrado. Uma delicada cápsula de tecido
conjuntivo frouxo rico em fibras reticulares envolve as ilhotas e as separam do tecido pancreático exócrino adjacente. Esta organização histológica das ilhotas pode estar alterada em casos de disfunção pancreática, como na diabetes do tipo 2, onde alterações estruturais têm sido documentadas (Janssen et al., 2003; Hong et al., 2002).
A homeostase glicêmica depende do equilíbrio da liberação dos hormônios do pâncreas endócrino. Cada um deles tem uma função definida, como a insulina secretada pelas células β pancreáticas, tem função hipoglicemiante. A insulina é o regulador mais importante deste equilíbrio metabólico necessário para a manutenção da regulação da glicose, porém outras substâncias também estão envolvidas no processo de utilização da glicose, entre elas podemos citar o glucagon. Este hormônio é secretado pelas células α pancreáticas e quando os níveis sanguíneos de glicose e insulina são baixos, estimula a glicogenólise e a gliconeogênese pelo fígado e medula renal. No período pós-prandial, a carga de glicose induz a elevação na insulina e queda do glucagon dando origem a uma reversão destes processos.
O hormônio somatostatina é secretado pelas células δ (delta), que constituem cerca de 5% a 10% das células das ilhotas pancreáticas. A somatostatina inibe hormônios hipofisários, gastrointestinais e pancreáticos após a ingestão de alimentos, além disso, possui funções neuroendócrinas. Um dos efeitos da somatostatina é aumentar o período de absorção do alimento para o sangue; também é liberado para inibir a secreção de insulina e glucagon (Kailey et al., 2012; Strowski et al., 2000) e aumentar o uso pelos tecidos dos nutrientes absorvidos. Entretanto, não se sabe a real influência endócrina da somatostatina e raramente ela é quantificada na prática clínica (Strowski, et al., 2000). Os demais secretagogos do pâncreas endócrino parecem não ter sua função totalmente esclarecida: o polipeptídeo P parece exercer uma função inibidora na secreção do pâncreas exócrino, e a grelina, atualmente tem sido relacionada à inibição da secreção de insulina no homem e à proliferação das células β durante desenvolvimento fetal em roedores (Andralojc et al., 2009; Ekblad & Sundler, 2002; Kanno et al., 2002; Orci, 1976).
Com relação à disposição ou arranjo dessas células endócrinas na ilhota, temos no caso de várias espécies (incluindo a de roedores), as células β ocupando o centro e as
células α e delta, localizadas na periferia da ilhota (Brissova et al., 2005; Carvalho et al., 2006). As células PP, preferencialmente, também estão dispostas na periferia da ilhota (Orci, 1984). Esta citoarquitetura ou arranjo preferencial dos tipos celulares dentro da ilhota parece ser fundamental para o funcionamento deste órgão endócrino. Alterações da citoarquitetura normal das ilhotas são verificadas durante o desenvolvimento da diabetes experimental ou em experimentos in vitro: nesses casos, o padrão normal do arranjo das células endócrinas, conforme anteriormente mencionado, é perdido e células não-β, como por exemplo, as secretoras de glucagon, passam a ter distribuição aleatória ocupando inclusive o centro das ilhotas (Cirulli et al. 1993; Hong et al., 2002; Wong et al., 2003).
Em cada ilhota, as diferentes células endócrinas se conectam, homotipica ou heterotipicamente, por meio das junções intercelulares do tipo oclusão, comunicante, aderente e desmossomos, como demonstrado por microscopia eletrônica (In’t Veld et al., 1984; Orci et al., 1975). Tais contatos intercelulares parecem ser cruciais para o perfeito funcionamento deste órgão. Dentre as junções intercelulares, as junções comunicantes têm sido as mais estudadas no pâncreas endócrino, sendo documentada a presença de dois principais subtipos de conexinas expressas pelas células endócrinas pancreáticas, a conexina 43 (Cx43) e a conexina 36 (Cx36), dentre as quais a Cx36 parece ser a única expressa pelas células β (Carvalho et al., 2010; Charpantier et al., 2007; Meda et al., 1991; Nlend et al., 2006; Serre-Beinier et al., 2000, 2009; Vozzi et al., 1995). Há evidências da importância da adesão e do acoplamento das células β no controle da secreção de insulina. Células β, isoladas das ilhotas pancreáticas, mostram significante comprometimento da resposta secretora estimulada de insulina - secreção basal de insulina aumentada, baixa sensibilidade à glicose, diminuição na biossíntese de insulina. Entretanto, quando os contatos entre as células β são restabelecidos, há uma rápida reversão dessas disfunções (Bosco & Meda, 1997; Halban et al., 1982; Pipeleers et al., 1982, 1994). Diversos procedimentos experimentais conhecidos por induzirem significativa secreção pancreática de insulina, como exposição a altas concentrações de glicose, a certas drogas como glibenclamide e ao tratamento com o hormônio prolactina, induzem significante aumento na expressão de conexina e no acoplamento das células β mediado pelas junções comunicantes (Collares-Buzato et al., 2001; Meda et al., 1979; Sorenson et al., 1987). Tem
sido também demonstrado nas linhagens de células β, MIN6 e INS-1E, que um nível apropriado de interação intercelular e de expressão das conexinas é necessário para uma adequada secreção de insulina estimulada pela glicose ou por secretagogos não-metabolizáveis (Calabrese et al., 2003 e 2004; Le Gurun et al., 2003; Leite et al. 2005, Vozzi et al., 1995). Calabrese e colaboradores (2003) demonstraram que uma significativa redução da expressão da proteína Cx36 na linhagem MIN6, por meio da exposição ao oligonucleotídeo antisense desta conexina, induziu um comprometimento marcante na sincronização das oscilações da concentração intracelular de cálcio entre células adjacentes, e consequente redução na secreção de insulina. Mais recentemente, foi sugerida a participação dessas estruturas de membrana e de sua proteína constitutiva, a Cx36, no processo de disfunção secretora da célula β que ocorre durante a pré-diabetes experimental (Carvalho et al., 2012).
Com relação à junção de oclusão e à junção aderente, relatos sobre sua composição bioquímica, bem como sua regulação nas células endócrinas pancreáticas são escassos. A junção de oclusão parece ser regulada in vitro no pâncreas endócrino, uma vez que é observado, em criofraturas, um aumento no número de cordões de vedação da junção de oclusão entre células das ilhotas com aumento da concentração extracelular de glicose (Semino et al., 1987) e após tratamento de ilhotas com pronase (Orci et al., 1973). A estrutura molecular da junção de oclusão no pâncreas endócrino in situ ainda permanece desconhecida. Tem sido demonstrada a presença de moléculas de adesão associadas à junção aderente, como a E-caderina e a N-CAM (do inglês, Neural Cell Adhesion Molecule) entre as células endócrinas (Moller et al., 1992). Em adição, tem sido documentada uma distribuição diferencial da molécula de N-CAM nas células das ilhotas pancreáticas normais: uma expressão maior nas células localizadas na periferia da ilhota em comparação à das células β encontradas no cerne da ilhota (Cirulli et al., 1994). Acredita-se que essa expressão diferencial da N-CAM contribua para a manutenção da citoarquitetura celular da ilhota (Moller et al., 1992). Experimentos in vitro demonstraram que há uma relação direta entre o grau de expressão das proteínas de adesão E-caderina e PSA-NCAM com a secreção induzida de insulina pela glicose na linhagem de células β pancreáticas MIN6 e em populações de células β isoladas (Bernard-Kargar et al., 2001; Hauge-Evans et
al., 1999; Lilla et al., 2003; Meda, 2013). Dados do nosso grupo mostram que uma expressão aumentada de α- e β-cateninas está associada a uma resposta secretora aumentada de insulina em ilhotas de ratos recém-nascidos em condições in vitro (Collares-Buzato et al. 2004).
Ainda, recentemente demonstramos que os contatos intercelulares, mediados pelas proteínas associadas às junções intercelulares, parecem desempenhar um papel importante no processo de maturação funcional da célula β durante o desenvolvimento (Santos-Silva et al., 2012). Células β de fetos e recém-nascidos, que sabidamente apresentam baixa resposta secretora de insulina, mostram um baixo conteúdo celular de ZO-1, N-CAM, cateninas e F-actina em relação às células β de ratos jovens e adultos, que respondem adequadamente à glicose. Em adição, na ausência de contatos intercelulares, a secreção de insulina estimulada por glicose foi completamente bloqueada em ilhotas de ratos adultos isoladas, mas não afetada em ilhotas de recém-nascidos.
Embora, a participação das junções intercelulares na regulação da secreção de insulina, em condições in vitro, pareça notória, o papel destas especializações de membrana na fisiologia e disfunção da célula β pancreática ainda constitui um tema pouco explorado. Teoricamente, a adesão e reconhecimento intercelular mediadas pelas junções intercelulares poderiam influenciar a atividade secretora do pâncreas endócrino afetando vários processos celulares, à semelhança do que acontece em outros órgãos, tais como organização histológica e citoarquitetura (Yamagata et al., 2002), a comunicação intercelular mediada pelas junções comunicantes (Rogers et al., 2007; Yamasaki et al., 1999), o grau de diferenciação celular, e/ou a proliferação e morte celular, bem como na homeostase funcional da célula/tecido (Carvell et al., 2007; Conacci-Sorrell et al., 2002; Gumbiner, 1996; Morin, 1999; Steinberg & McNutt, 1999).
1.2.3 Diabetes mellitus tipo 2 e disfunção da célula β
O Diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) é uma doença multifatorial, caracterizada por um estado de hiperglicemia crônica decorrente de defeitos na produção ou na ação da insulina (Ferrannini, 1998; Pories et al., 2011; Acharjee et al., 2013), e corresponde a forma mais comum da doença (mais de 90% dos casos de diabetes) (Ashcroft et al., 2012; Sacks et al., 2011; American Diabetes Association, 2013). Segundo dados da Organização Mundial de Saúde, DMT2 está entre as doenças mais prevalentes do mundo, com a expectativa de atingir 350 milhões de pessoas em 2025 (American Diabetes Association, 2013). Essa doença está associada a complicações metabólicas, clínicas e sociais, relacionadas à urbanização crescente, sedentarismo, dieta inadequada e, sobretudo à obesidade (Ashcroft et al., 2012; Saini, 2010).
A DMT2 geralmente inicia-se na vida adulta, e é caracterizada inicialmente por hiperglicemia moderada associada à resistência periférica à insulina, a qual é parcialmente compensada por hiperplasia das células β. Em fases mais avançadas da doença, ocorre diminuição da massa e função secretora das células β levando à dependência de reposição hormonal com insulina (Prentki & Nolan, 2006; Rhodes, 2005; Tripathy & Chaves, 2010).
A patogênese da DMT2 ainda não é totalmente conhecida, contudo estudos apoiam a opinião da importância da adequada biossíntese de insulina. A insulina, como comentado anteriormente, é um hormônio com função hipoglicemiante, sintetizada inicialmente como um polipeptídio precursor com uma única cadeia com 86 aminoácidos chamada de pré-próinsulina, que após processamento proteolítico e clivagem, formam as cadeias A e B da insulina ligadas por pontes dissulfeto, e o peptídeo-C (Nelson & Cox, 2011). Tanto a insulina quanto o peptídeo–C remanescente são embalados em grânulos de armazenamento ligados a membrana, o estímulo da secreção de insulina resulta na liberação destas moléculas na circulação porta. Enquanto a insulina é intensamente metabolizada no fígado, o Peptídeo-C é mais lentamente depurado o que o tornará um marcador útil e preciso de
secreção endógena de insulina (Nelson & Cox, 2011). A glicose e outros nutrientes regulam a secreção de insulina pela célula β pancreática (Prentki & Nolan, 2006; Rhodes, 2005; Tripathy & Chaves, 2010). Ela é transportada por um transportador facilitador de glicose (GLUT1 em humanos, GLUT2 em roedores). O metabolismo subsequente da glicose pela célula β altera a atividade dos canais iônicos, levando a secreção de insulina. As incretinas liberadas pelas células neuroendócrinas do trato gastrintestinal, após a ingestão do alimento amplificam a secreção de insulina, bem como suprimem a secreção do glucagon (Khan et al., 2006; Prentki & Nolan, 2006). Um exemplo de incretina é o GLP-1 (peptídio I semelhante ao glucagon), liberado pelas células L do intestino delgado que estimula a secreção de insulina, quando a glicose sanguínea está acima do nível de jejum (Prentki & Nolan, 2006). Análogos de incretinas assim como o GLP-1 vem sendo usados para aumentar a secreção endógena de insulina (Khan et al., 2006; Prentki & Nolan, 2006). Depois que a insulina é secretada, é então lançada no sistema venoso portal, onde se liga a receptores específicos desencadeando eventos bioquímicos para que ocorra sua ligação a moléculas sinalizadoras intracelulares como os substratos do receptor de insulina (IRS). Estes iniciam uma cascata de reações de fosforilação e desfosforilação, resultando nos efeitos metabólicos e mitogênicos generalizados da insulina (Rhodes, 2006). Podemos citar como exemplo a ativação da via fosfotidilinositol-3’-quinase (PI-3-quinase), que estimula a translocação de um transportador de glicose (GLUT4) para a superfície celular afim de efetuar a captação da glicose (Rhodes, 2005; Guo et al, 2014). A homeostasia da glicose reflete um equilíbrio entre a produção hepática de glicose e captação e utilização periférica da glicose. Portanto, um declínio adicional na secreção de insulina e um aumento na produção hepática de glicose resulta na manifestação do diabetes mellitus tipo 2, que tem como primeiros sintomas a resistência periférica à insulina ditada pela ação prejudicada da insulina nos tecidos periféricos e órgãos, especialmente o músculo esquelético, o fígado e os adipócitos (Thipathy e Chaves, 2010).
Não está completamente determinado quais são os fatores que contribuem para a resistência periférica à insulina (Jonietz, 2012); sabe-se que o excesso de tiglicerídeos livres pode ser a uma das causas (Ding et al., 2010; Kahn et al., 2006). Outros fazem a relação com o excesso de peso ou obesidade, e o estímulo de citocinas inflamatórias liberadas a
partir do tecido adiposo e ainda outros fatores inflamatórios que podem promover a inflamação em tecidos cincunvizinhos, entre eles a ilhota pancreática (Shoelson et al., 2006; Lackey et al., 2013).
Na patogênese do DMT2, a célula β promove uma resposta adaptativa modificando sua função secretora (Sone & Kagawa, 2005; Liew & Andrews, 2008). Como resposta a esta função, a normoglicemia se mantém, mesmo que haja um quadro bem inicial de resistência periférica à insulina. Posteriormente, com o aparecimento da hiperglicemia, há o aumento compensatório da massa de célula β, e, consequentemente, aumento adicional de insulina (hiperinsulinemia) buscando manter os níveis normais de glicose sanguínea (Kahn et al., 2006; Prentki & Nolan, 2006). As células β pancreáticas, após um longo tempo expostas a condição de hiperglicemia e hiperinsulinemia, tem sua função secretora comprometida (Conget et al, 2001; Hollingdal et al, 2000), levando a um agravamento do quadro de sensibilidade diminuída à insulina e intolerância à glicose (Liu et al., 2010).
Tem sido bem documentada a associação entre obesidade e diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) (Kahn et al., 2006; Acharjee et al., 2013; Tripathy & Chaves, 2010). A gordura, principalmente a localizada na região abdominal, pode elevar o risco de desenvolver DMT2 em 10 vezes. Para cada aumento de 10% no peso corporal, há aumento de 2 mg/dL na glicemia em jejum(Jung, 1997). Cerca de 90% dos portadores de DM2 estão acima do peso ou são considerados obesos (Buchwald, 2009).
Parece haver um sinergismo entre exposição crônica aos ácidos graxos não esterificados, cuja concentração plasmática normalmente está aumentada na obesidade, e hiperglicemia, levando a um quadro comumente referido como "glicolipotoxicidade" da célula β (Del Prato, 2009; Kahn et al., 2006). O declínio da massa relativa de célula β pode estar relacionada à combinação de exaustão secretora desta célula e a glicolipotoxicidade, levando a apoptose. Essa disfunção resulta na progressão do DMT2 para um estado dependente de insulina exógena (Conget, 2001; Hollingdal, 2000; Liu, 2013).
Como mencionado anteriormente, informações relativas às junções intercelulares no pâncreas endócrino ainda são escassas. Portanto, o estudo dessas especializações da
membrana plasmática usando como modelo as células pancreáticas endócrinas parece consistir numa importante área de pesquisa. Estudos dessa natureza auxiliariam no estabelecimento da verdadeira função e relevância dos contatos intercelulares mediado pelas junções celulares na fisiopatologia do pâncreas endócrino, contribuindo para o conhecimento da variabilidade bioquímica e dos diferentes mecanismos de regulação destas especializações de membrana no organismo.
Diversos modelos in vivo e in vitro tem sido utilizados para estudar o Diabetes Mellitus tipo 2, podendo envolver o tratamento com dietas de alto teor de gordura, uso de animais geneticamente modificados e cultura de células especialmente a MIN6. Em nosso estudo, utilizamos como modelo experimental camundongos que podem desenvolver um quadro de Diabetes Mellitus tipo 2 como resultado da ingestão de ração com alto teor de lipídios (De Souza et al., 2005; Surwitt et al., 1988; Shafrir et al., 1999; Winzell and Ahren, 2004). Dentre as várias linhagens de camundongos, a linhagem C57BL/6J parece possuir uma vulnerabilidade metabólica maior, devido, possivelmente, a uma pré-disposição genética, que, quando desafiada por dieta ou outras manipulações, resulta em obesidade e severo distúrbio da homeostase glicêmica (Surwitt et al., 1988; Ronchi et al., 2013). Em camundongos C57 pré-diabéticos, o quadro inicial de hiperglicemia moderada é acompanhado por hiperinsulinemia e por um incremento significativo na massa de célula β como forma de compensar metabolicamente a resistência periférica à insulina (Carvalho et al., 2012). Entretanto, a repercussão na função pancreática endócrina da ingestão de dieta hiperlipídica por um período prolongado tem sido pouco investigada, bem como são escassos os trabalhos descrevendo alterações funcionais e estruturais do pâncreas endócrino neste modelo (Ahren et al., 1997; Sone & Kagawa, 2005).
1.3 OBJETIVOS E RELEVÂNCIA DESSA TESE
Nessa Tese de Doutorado, investigamos o possível papel do contato intercelular mediado pelas junções intercelulares e suas proteínas estruturais na disfunção das células β pancreáticas em modelo de diabetes mellitus tipo 2.
Para atender o objetivo proposto desenvolvemos as seguintes etapas: 1) a caracterização metabólica do modelo animal de diabetes tipo 2, avaliando-se o ganho de peso corpóreo, glicemia em jejum e pós-prandial, a concentração plasmática de insulina e a secreção estimulada de insulina por ilhota em camundongos C57 tratados com dieta hiperlipídica pelo período de 8 meses; 2) a avaliação do aspecto morfológico e morfométrico do pâncreas endócrino frente ao uso de dieta hiperlipídica no modelo animal empregado; 3) a investigação das possíveis alterações na distribuição celular de proteínas juncionais (a saber, E-, N-, VE-caderinas, ZO-1, β- e α - cateninas), por imunoistoquímica, em ilhotas pancreáticas de animais controles e tratados com a dieta hiperlipídica; e 4) a avaliação das possíveis alterações na expressão gênica e protéica das proteínas juncionais em estudo, por Western Blot e Real-Time qPCR, em ilhotas pancreáticas de animais controles e tratados com a dieta hiperlipídica.
A hipótese inicial dessa Tese é que o contato intercelular mediado pelas proteínas juncionais no pâncreas endócrino desempenharia um papel na patogênese da DMT2. Várias evidências experimentais, citadas anteriormente, demonstram que as junções intercelulares e suas proteínas estruturais participam do desenvolvimento e manutenção da estrutura e citoarquitetura das ilhotas pancreáticas, bem como da função secretora e proliferação/sobrevida da célula β pancreática em condições in vitro e em animais transgênicos ou nocaute para moléculas de adesão. A relevância da presente Tese reside no fato que investigamos a bioquímica e organização das junções associadas à adesão intercelular na célula β in vivo numa condição fisiopatológica como a diabetes. Trabalhos como este e os resultados obtidos, através do seu desenvolvimento, podem fornecer subsídios à investigação sobre terapia celular e genética da diabetes.
CAPÍTULO 2
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Protocolos experimentais
O quadro abaixo representa as etapas desenvolvidas no decorrer desta Tese.
Papel do contato intercelular mediado pelas junções intercelulares na disfunção da célula β
pancreática
Modelo experimental de Diabetes Mellitus tipo 2 Ingestão de dieta hiperlipídica (dHL)
Grupo Controle: camundongos C57BL/6 em dieta normal por 8 meses
Metodologias:
1. Avaliação metabólica do animal (peso, glicemia, conc. plasmática de insulina, secreção estática de insulina/ilhota;
2. Avaliação morfométrica do pâncreas endócrino;
3. Distribuição celular de proteínas juncionais no pâncreas endócrino (por imunoistoquímica);
4. Expressão gênica e proteica de proteínas juncionais em ilhotas pancreáticas (por qPCR e Western Blot).
Grupo Tratado: camundongos C57BL/6 em dHL
2.2 Animais
Camundongos, machos, da linhagem C57BL/6/J Unib, foram obtidos a partir das colônias de reprodução do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência para Animais de Laboratório (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP, Brasil). Os animais foram alojados a 22 ± 1 ° C, em ciclo claro/escuro de 12 h de luz, e tiveram livre acesso a água ad libidum e ração.
Os camundongos foram utilizados seguindo as diretrizes do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA- MCTI, Brasil). Todos os protocolos experimentais utilizados foram aprovados pelo Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Brasil) sob os protocolos nº1885-1 e 3122-1.
2.3 Dieta hiperlipídica (dHL)
Ao completar 6 a 8 semanas, os camundongos C57BL/6/J Unib foram divididos em dois grupos. Um grupo (controle) foi alimentado por 240 dias (8 meses) com uma dieta padrão para roedores (Nuvital CR1, Colombo, Paraná, Brasil) e o outro grupo (tratado) foi alimentado com uma dieta rica em gordura (dHL) (21% em peso) e hipercalórica, tendo o cuidado de, nesta ração, manter preservado o conteúdo de sais minerais e vitaminas necessários ao desenvolvimento do animal. A composição das rações está mostrada na
Tabela I.
Tabela I. Composição das rações utilizadas.
Componentes em g% Ração Padrão Ração Hiperlipídica
Proteínas 22,0 20
Carboidratos 53,0 50,0
Lipídeos 4,5 21,0
Outros* 20,5 8,0
Kcal/g 2,9 4,7
2.4 Avaliação metabólica do animal
Todos os animais foram pesados antes do início do período da dieta, e no final do mesmo; os valores foram expressos como a porcentagem de ganho de peso corporal em relação ao peso corporal inicial.
A glicemia foi determinada, através de um glicosímetro (Advantage II Accu-Chek, Roche Diagnostic ®, Mannheim, Alemanha), em amostras de sangue coletado da cauda de camundongos alimentados (pós-prandial) ou submetidos a 12 horas de jejum. O Teste de Tolerância à Insulina (ITT) foi realizado através de injeção intraperitoneal de insulina (0,5 U/kg de peso corporal de insulina humana - Biohulin ® R Biobrás, Montes Claros, MG, Brasil) em animais alimentados (Bonfleur et al., 2010). Subsequentemente, a glicemia foi medida em amostra de sangue coletado a partir da cauda, nos tempos 0, 10, 15, 30 e 60 minutos, após a administração deste hormônio. Os resultados da área sob a curva glicêmica foram estimados utilizando o software GraphPad Prism versão 5 for Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). A concentração plasmática de insulina (em animal alimentado) foi avaliada através da coleta de alíquotas de sangue da veia cervical em capilares heparinizados e, após centrifugação, as amostras de plasma foram estocadas a – 20°C. A dosagem de insulina plasmática foi determinada por radioimunoensaio. Todas as amostras de sangue foram coletadas no período compreendido entre 09:00 e 11:00 horas da manhã.
2.5 Isolamento de ilhotas pancreáticas
As ilhotas foram isoladas após injeção de 3 ml de solução de colagenase tipo V (EC 3.4.24.3, Sigma, St. Louis, MO, USA) (1,7 mg/mL em solução de Hank’s, pH 7,4; composição do Hank’s: NaCl 136mM, KCl 5,4mM, CaCl2.2H2O 1,26mM, MgSO4.7H2O
0,81mM, KH2PO4 0,44mM, Na2HPO4 0,34mM, NaHCO3 4,2Mm, suplementada com 5,6
mM de glicose e 1 mg/mL de albumina) no pâncreas, através da canulação do ducto pancreático, seguido de incubação a 37ºC por 11 min e lavagem das mesmas para remoção da colagenase com solução de Hank’s. Após a separação com Histopaque 1077 (Sigma), as
ilhotas pancreáticas foram coletadas individualmente sob lupa, sendo utilizadas tanto para a determinação da secreção estática de insulina, como homogeneizadas em coquetel anti-protease para immunoblotting ou em RNAlatter®Tissue Collection (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) para o uso em Real Time-PCR (como descrito a seguir).
2.6 Secreção estática de insulina
Para medir a secreção estática de insulina, após o isolamento, pools de 5 ilhotas foram colocados em microtubos e pré-incubados em solução de Krebs (composição: 139 mM Na+, 5 mM K+, 1 mM Ca2+, 1mM Mg2+, 123,6 mM Cl-, 24 mM HCO3- ) contendo 5,6
mM de glicose em banho-maria a 37°C durante 30 minutos. Após a aspiração cuidadosa do tampão, as ilhotas foram divididas em dois grupos, as que foram suplementadas com 2,8 mM de glicose e as suplementadas com 16,7 mM. Após incubação de 1h a 37°C, alíquotas de 500μl do sobrenadante foram retiradas e armazenadas a – 20ºC para dosagem da concentração de insulina no meio, determinada por radioimunoensaio (Carvalho et al., 2010).
2.7 Avaliação histológica e morfométrica do pâncreas endócrino
Para análise do aspecto histológico do pâncreas endócrino, os camundongos (n= 4 animais por grupo experimental) foram sacrificados em câmara de CO2, decapitados e o
pâncreas foi retirado, e fixado em solução de 4% de paraformaldeído (diluído em tampão fosfato-salina) durante 24 h. Os pâncreas foram seccionados em 5 fragmentos (1, correspondendo à cabeça e 4 à região da cauda); cada fragmento foi processado pelas técnicas rotineiras de embebição em parafina (Histosec pastilhas, Merck, Darmstadt, Germany). Foram obtidas secções semi-seriadas de 5 µm (com espaçamento de 100 µm entre cortes) até esgotamento total do bloco. As lâminas selecionadas foram coradas com Hematoxilina-Eosina ou processadas para imunoperoxidase indireta para insulina (Carvalho et al., 2012; Oliveira et al., 2014).
Para análise morfométrica do pâncreas, foi medido o volume total de células β em relação ao pâncreas total (Volume relativo VR células β/pâncreas) utilizando método estereológico descrito na literatura, com pequenas modificações (Inuwa e Mardi, 2005). Seis cortes histológicos foram analisados por pâncreas (dois cortes de cada bloco, 1, 3 e 5). Todos foram fotografados com objetiva panorâmica com o auxílio de uma câmera digital (Nikon FDX-35) acoplada a um microscópio de luz (Nikon Elipse E800), e as imagens capturadas por um sistema de análise de imagens (Image Pro Plus for Windows). A medida do volume relativo das células β (imunomarcadas para insulina) foi realizada utilizando o software livre ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html). Para tanto, a somatória das áreas dos perfis das ilhotas imunomarcadas para insulina foi dividida pela respectiva área da secção histológica do pâncreas, multiplicando-se por 100. Foram analisadas 126 ilhotas do grupo controle e 112 do grupo tratado, provenientes de 4 animais por grupo.
2.8 Imunoistoquímica para insulina
Após a remoção de parafina, os cortes foram reidratados e lavados com Tris-salina (TBS; Trisma base 0,01 M, NaCl 0,15 M), em seguida foi feito o bloqueio da peroxidase endógena com uma solução de 0,3% de peróxido de hidrogênio (em metanol) por 30 min seguido de incubação com 5% de leite em pó desnatado em solução de TBS/0,1% Tween 20 (TTBS) por 1h. Os cortes foram então incubados com anticorpo anti-insulina (Dako, diluição 1:50) por 12 horas a 4ºC e após lavagem com TBS, foram incubados com anti-IgG conjugado com peroxidase (Horseradish Peroxidase, HRP, Sigma, diluição 1:1500), por 1 hora e 30 min à temperatura ambiente (TA). A revelação do complexo antígeno-anticorpo foi feita com solução de diaminobenzidina a 10% (DAB) (Sigma) e 0,2% de H2O2 (Merck)
em TBS. Em seguida, os cortes foram lavados em água destilada e contra-corados com solução aquosa de Hematoxilina de Ehrlich (diluída 1:10 em água destilada), desidratados em soluções crescentes de etanol e, montados em Bálsamo Sintético do Canadá (Synth - Brasil) para observação ao microscópio de luz.
2.9 Avaliação do padrão de citoarquitetura das ilhotas pancreáticas
A análise da citoarquitetura das ilhotas pancreáticas foi realizada a partir de reações de imunofluorescência com dupla marcação para insulina e glucagon em cortes histológicos de pâncreas preparados conforme anteriormente descrito (seção 2.7). Os cortes foram incubados com o anticorpo primário policlonal anti-glucagon (Dako, Copenhagen, Denmark; diluição 1:75 em 3% de leite desnatado em Tris-salina (TBS; Trisma base 0,01 M, NaCl 0,15 M)) por 3h em temperatura ambiente (TA), seguida de lavagem dos cortes com tampão Tris-salina (TBS, pH 7,4) e posterior incubação overnight a 4°C com o anticorpo secundário específico conjugado com fluoresceína (Sigma, diluição 1:125 em 1% de leite desnatado em TBS). Os cortes foram novamente lavados com TBS e incubados overnight ou, por 3h à TA com o anticorpo primário anti- insulina (Dako, diluição 1:75 em TBS com 3% de leite desnatado), e em sequência, após nova lavagem com TBS, incubados com o anticorpo secundário específico conjugado com rodamina (Sigma, diluição 1:100 em 1% de leite desnatado em TBS) por 2h em TA. Por fim, as lâminas foram montadas em meio de montagem (Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) para observação em microscópio de fluorescência acoplado a um sistema de captura de imagens (Axio Observer-D1, Zeiss, Germany).
Considerando o padrão típico das ilhotas de roedores (Brissova et al., 2005; Carvalho et al., 2006), as análises das imagens foram classificadas de acordo com um sistema de scores que estabeleceu o grau de alteração da citoarquitetura conforme o número de células α deslocadas, ou não contíguas, do manto periférico formado por esse tipo celular, posicionado ao redor do core de células β na ilhota. Apenas as células α deslocadas, observadas a partir da terceira fileira de células endócrinas que constituem o manto, foram contadas, e foram categorizadas conforme a seguinte classificação descrita na Tabela II. Para cada ilhota analisada (um total de 138 ilhotas do grupo controle e 117 ilhotas do grupo tratado referentes a 4 animais por grupo experimental) foi atribuído um score e calculou-se o valor médio de alteração segundo essa classificação por grupo experimental.
Tabela II. Grau de alteração da citoarquitetura no pâncreas endócrino
Grau de alteração da citoarquitetura
Número de células deslocadas da periferia da ilhota 0 Nenhuma célula α deslocada da periferia da ilhota 1 1 a 3 células α deslocadas da periferia da ilhota 2 4 a 6 células α deslocadas da periferia da ilhota 3 Mais que 6 células α deslocadas da periferia da ilhota
A área relativa ocupada por células α e β pancreáticas também foi mensurada nessas imagens de ilhotas duplamente imunomarcadas. As medidas de área relativa das células α (glucagon-positivas) e β (insulina-positivas) pancreáticas foram realizadas pelo software livre ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html) e expressas em porcentagem em relação à área total da ilhota.
2.10 Imunolocalização e análise do grau de marcação das proteínas juncionais em cortes de pâncreas endócrino
A localização celular de proteínas juncionais (a saber, E-, N-, e VE-caderinas, α- e β-cateninas, e ZO-1) foi feita em cortes de congelamento de pâncreas por meio de imunofluorescência indireta, como previamente descrita (Collares-Buzato et al., 2004; Santos-Silva et al., 2012). Os cortes de pâncreas dos diferentes grupos experimentais foram incubados overnight a 4°C, com um dos seguintes anticorpos primários diluídos em 3% leite desnatado em TBS (diluições apresentadas na Tabela III): anti-E-caderina (ABCam, Cambridge, UK), anti- N-caderina (ABCam), anti-VE-caderina (ABCam), anti- ZO-1 (Zymed/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), anti-α-catenina (Sigma), ou anti-β-catenina (Zymed/Invitrogen). Posteriormente, procedeu-se a incubação dos cortes com o anticorpo secundário específico conjugado com FITC (Sigma). Quando necessário, foi feita a co-localização destas proteínas e insulina, realizando uma incubação adicional durante 1hora e 30 minutos com o anticorpo policlonal anti-insulina (diluição 1:100, Dako) seguida de seu anticorpo secundário policlonal específico conjugado com TRITC (Sigma). Por fim, as lâminas foram montadas com meio de montagem (Vectashield, Vector) e a localização da
fluorescência no espécime, detectada por um microscópio de varredura confocal a laser (TCS SP5 II, Leica, Wetzlar, Germany) e/ou por microscópio de fluorescência convencional acoplado a um sistema de captura de imagens (Axio Observer-D1, Zeiss, Hamburg, Germany).
Tabela III. Diluições e fabricantes dos anticorpos primários monoclonais utilizados para a
detecção das proteínas juncionais por meio da técnica de imunofluorescência indireta.
Anticorpo Primário Fabricante Cat number Animal Produzido Diluição
Primário
Diluição Secundário
ZO-1 Zymed/Invitrogen 617300 Coelho 1:200 1:200
Alfa-catenina Sigma C2081 Coelho 1:1000 1:800
Beta-catenina Zymed/Invitrogen 138400 Camundongo 1:200 1:800
N-caderina ABCam 18203 Coelho 1:50 1:150
E-caderina ABCam 11512 Coelho 1:50 1:150
VE-caderina ABCam 33168 Coelho 1:75 1:175
2.11 Avaliação do grau de marcação por imunofluorescência
Para avaliar a intensidade da fluorescência e garantir a comparação entre os grupos controle e dHL, as lâminas foram processadas e analisadas na mesma sessão de observação, utilizando parâmetros idênticos para a captura das imagens no microscópio confocal. Todas as imagens foram analisadas usando o software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Nas imunoreações para ZO-1 e β-catenina, os valores de fluorescência total da ilhota foram expressos como densidade integrada de pixels e normalizados pela área da ilhota. Nas imunoreações para E-caderina, N-caderina e α-catenina, a densidade integrada pixels de 50 pontos por ilhota, na região intercelular da célula β (co-imuno marcadas com insulina) foi medida em todas as imagens capturadas. Para a VE-caderina foi medida a área linear de imunoreação para essa proteína, expressa em unidade arbitrárias e normalizada pela área da ilhota. Para a N-caderina, foi utilizada a ferramenta “Grid” do ImageJ, determinando a área
