ii
iv “Se as fibras nervosas do cérebro fossem esticadas uma ao lado da outra, alcançariam a Lua e voltariam à Terra. É por não estarem assim que o homem chegou lá. O emaranhado dentro de nossa cabeça é
que nos faz humanos.” Colin Blakemore “Faz-se ciência com os fatos, como se faz uma casa com pedras; mas uma acumulação de fatos não é ciência, assim como um monte de pedras não é uma casa.”
Henri Poincaré “Avalia-se a inteligência de um indivíduo pela quantidade de incertezas que ele é
capaz de suportar.” Immanuel Kant
v
Dedicatória
Dedico este trabalho ao querido mestre Francesco Langone,
foi ele quem primeiro despertou meu interesse na área de Neurociências desde as aulas da Graduação. Como reconhecimento por sua competência e seriedade foi escolhido como Patrono da minha turma da Biologia da UNICAMP em 2009. Dando continuidade aos trabalhos realizados durante a Iniciação Científica, iniciou com entusiasmo minha orientação de mestrado e certamente está satisfeito ao ver esta dissertação concluída. Guardarei em minha memória muitas lembranças de nossa convivência amigável e por vezes engraçada. As características marcantes de sua personalidade como seriedade, profissionalismo, integridade, perseverança e humildade serão sempre lembradas como exemplo a ser seguido.
Muito Obrigada pela amizade e por ter sido esta pessoa extremamente dedicada ao trabalho e preocupada com a trajetória acadêmica de seus alunos. Sempre esteve presente no dia-a-dia do laboratório com disposição para fazer longas reuniões, discutir relatórios, artigos, corrigir resumos de congressos. Sem dúvida, seus ensinamentos foram de extrema importância para minha formação profissional e espero sempre segui-los com dedicação.
vi
Agradecimentos
A Deus por me dar saúde e serenidade, indispensáveis para a realização deste trabalho.
Aos meus avós e a todos da minha família que estiveram sempre por perto, me apoiando incondicionalmente durante este período de aprendizado profissional.
De maneira especial aos meus pais, Franco Ignarro e Shirlei Silvestre Ignarro que, mesmo morando longe, sempre estiveram presentes e acompanharam todos os meus passos desde a época da Iniciação Científica. O incentivo e o amparo nos momentos difíceis foram essenciais para o bom andamento e término desta etapa da minha formação profissional. Certamente abdicaram de muitas coisas para que eu tivesse a oportunidade de ingressar em uma Universidade de qualidade e de desenvolver o presente trabalho. Agradeço à minha irmã Isabella Silvestre Ignarro pela compreensão, amizade e preocupação constante com o andamento da dissertação. Espero conseguir retribuir à altura todo este carinho e dedicação que sempre tiveram comigo. Amo muito vocês.
Aos amigos do Laboratório de Neurobiologia e estudos da dor, e do Laboratório de Sistemas Neurais e Comportamento, André Schwambach Vieira, César Renato Sartori, Carlos Vinícius Almeida de Assis (Goiano), Alexandre César Santos de Rezende, Gustavo Facchini, Karina Mie Furuzawa, Janice Rodrigues do Nascimento, Priscila do Amaral Ferreira, Elayne Vieira Dias, Dionéia Araldi, Juliana Maia, Ivan Bonet, Filipi Cesar do
vii Prado (Fipo), Henrique Prado, Paula Marião, Ana Almeida, Larissa Oliveira Melloni de Faria, Jéssica Ianof, Fernando Canova, Alina Vilar, Grazielle Fraga, pela sincera amizade, união, por somar conhecimentos, experiências e por tornar o cotidiano do laboratório extremamente agradável para o desenvolvimento dos experimentos científicos. Certamente todos são não apenas colegas de trabalho, mas sim amigos que levarei para a vida toda.
Especialmente ao André Schwambach Vieira e César Renato Sartori que sem dúvida foram fundamentais na redação do projeto de mestrado, na realização de muitos experimentos, na discussão de artigos da literatura e me fizeram acreditar que a realização deste projeto seria possível, mesmo quando nada mais parecia ter sentido, logo após o falecimento do professor Francesco.
Ao Dr. Fábio Rogério pela orientação, paciência, solicitude e dedicação durante a correção da dissertação e também na discussão de alguns métodos a serem adotados neste trabalho. Obrigada por ter aceitado o desafio de terminar um trabalho que já havia sido iniciado, me ajudar a construir os argumentos e interpretar os resultados obtidos. Tenho certeza que sua presença me fez crescer muito profissionalmente.
Ao co-orientador Prof. Carlos Amilcar Parada por todo o suporte dado nos momentos difíceis, pela disposição de seu laboratório e pelos incrementos em relação à infra-estrutura, como a aquisição do microscópio de fluorescência e do fotodocumentador, indispensáveis para agilizar as coletas de dados.
Ao Prof. Gilberto Fernando Xavier da USP por abrir as portas de seu laboratório para a realização do método de estereologia, de fundamental importância para a interpretação dos resultados obtidos.
viii Aos amigos da graduação, Fábio Montico, Karina Mie Furuzawa, Larissa Yokota Rizzo, Sílvio Roberto Consonni, Janice Rodrigues do Nascimento, Adilson Pereira Domingues Júnior, Carlos Agena, pela amizade, companheirismo e conselhos durante todo este processo e especialmente nos momentos difíceis.
À Profa. Dra. Elenice Aparecida de Moraes Ferrari, ao Prof. Dr. Roger Frigério Castilho, à Profa. Dra. Ana Paula Couto Davel, à Profa. Dra. Liana Lins Melo pelas observações e sugestões no exame de qualificação, que foram de extrema importância para o término da tese.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de Mestrado que sem dúvida foi decisiva para o desenvolvimento deste trabalho.
ix
S
UMÁRIO
Lista de Abreviaturas...1 Resumo ... 3 Abstract ... 4 1. Introdução ... 5 2. Objetivos ... 26 2.1. Geral ... 26 2.2. Específicos ... 26 3. Material e Métodos ... 27 3.1. Animais ... 273.2. Lesão unilateral do estriado ... 27
3.3. Inibição da via de sinalização JAK2/STAT3 e sacrifício dos animais ... 28
3.4. Obtenção de cortes histológicos e armazenamento ... 29
3.5. Avaliação estereológica ... 29
3.6. Imunoistoquímica para astrogliose e neurogênese no estriado ... 34
3.7. Quantificação da área doublecortina positiva ... 35
3.8. Extração de proteínas e Western Blotting para GFAP ... 36
3.9. Avaliação da atividade física voluntária ... 40
4. Resultados ... 41
4.1. Avaliação histológica e estereológica ... 41
4.2. Imunoistoquímica para a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) ... 46
4.3. Análise da expressão de GFAP através de Western Blotting ... 49
4.4. Imunoistoquímica para a proteína doublecortina ... 50
4.5. Atividade física espontânea após lesão do estriado ... 54
5. Discussão ... 56
5.1. Modelo experimental da Doença de Huntington (DH) ... 56
5.2. Astrogliose ... 58
5.3. Sobrevivência Neuronal ... 59
5.4. Neurogênese no estriado ... 66
5.5. Atividade física voluntária... 70
6. Conclusões ... 73
1
L
ISTA DE
A
BREVIATURAS
AMPA - Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid (Ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propiônico)
APRE - Acute-phase Response Element (Elemento de Resposta de Fase Aguda) APRF - Acute-phase Response Factor (Fator de Resposta de Fase Aguda) Akt - Serine/Threonine Protein Kinase (Proteína Serina/Treonina Quinase) AQ - Quinolinic Acid(Ácido Quinolínico)
Bcl2 - B-Cell Leukemia/Lymphoma 2 (Célula-B Leucemia/Linfoma 2) BrdU- 5-Bromo-2-Deoxyuridine (5-Bromo-2-Deoxiuridina)
CNTF – Ciliary Neurotrophic Factor (Fator Neurotrófico Ciliar)
CNTFRα - Ciliary Neurotrophic Factor Receptor Alfa (Receptor Alfa do Fator Neurotrófico Ciliar)
CT-1 – Cardiotropin 1 (Cardiotropina 1) DCX – Doublecortin (Doublecortina) DH – Doença de Huntington
DMSO - Dimethyl Sulfoxide (Dimetilsulfóxido)
EDTA - Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético) ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio Imunoenzimático) PBS-Phosphate Buffered Saline (Tampão Fosfato Salino)
GABA-γ-Aminobutyric acid(Ácido Gama-Aminobutírico)
GAP-43 - Growth Associated Protein 43 (Proteína Associada ao Crescimento 43) GFAP - Glial Fibrillary Acidic Protein (Proteína Ácida Fibrilar Glial)
GFP - Green Fluorescent Protein (Proteína Fluorescente Verde) gp130 – Glycoprotein 130 (Glicoproteína 130)
iNOS - Inducible Nitric Oxide Synthase (Óxido Nítrico Sintase Induzível) IL-6 – Interleukin 6 (Interleucina 6)
JAK – Janus Kinase (Janus Quinase) JAK2 – Janus Kinase 2 (Janus Quinase 2)
2 LIFRß - Leukemia Inhibitory Factor Receptor Beta (Receptor Beta do Fator Inibidor de Leucemia)
MAP - Mitogen-Activated Protein (Proteína Ativada por Mitógeno) NMDA - N-Methyl-D-aspartic acid (Ácido N-metil D-aspartato)
MPTP - 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (1-metil-4-fenil-1,2,3,6 tetraidropiridina)
NOS - Nitric oxide synthase (Sintase de Óxido Nítrico)
PCNA -Proliferating Cell Nuclear Antigen(Antígeno Nuclear de Proliferação Celular)
PSA-NCAM - Polysialylated-neural cell adhesion molecule (Molécula de Adesão Celular Neuronal Polisialilada)
ROS - Reactive Oxygen Species (Espécies Reativas do Oxigênio) RNS – Reactive Nitrogen Species (Espécies Reativas do Nitrogênio)
RT-PCR - Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase via Transcriptase Reversa)
SNC – Sistema Nervoso Central
SDS – Sodium Dodecyl Sulfate (Dodecil Sulfato de Sódio)
STAT – Signal Transducer and Activator of Transcription (Transdutora de Sinal e Ativadora de Transcrição)
STAT3 - Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (Transdutora de Sinal e Ativadora de Transcrição 3)
3
R
ESUMO
A injeção de ácido quinolínico (AQ), um agonista glutamatérgico do receptor N-metil-D-aspartato, no estriado de roedores induz morte seletiva de neurônios espinhosos médios, gliose reativa e neurogênese na zona subventricular, acompanhada da migração dos neurônios recém-gerados para o estriado lesado. Tais achados são também descritos na doença de Huntington (DH). Há indícios de que a via de sinalização JAK/STAT esteja envolvida no mecanismo de ação do AQ, bem como na patogênese da DH. A interação das citocinas da família da IL-6 com seus receptores desencadeia a ativação de enzimas da família das Janus-Quinases (JAKs), que por sua vez permitem o recrutamento e a ativação de fatores de transcrição da família das proteínas transdutoras de sinais e ativadoras da transcrição (STATs). Embora as principais características da DH sejam a presença da coréia e déficits na execução de movimentos voluntários, poucos testes são realizados abordando o comportamento locomotor dos animais no modelo de lesão por AQ. Neste trabalho, estudamos o efeito do AG490, um inibidor da JAK2, na gliose, perda neuronal e neurogênese no estriado de camundongos adultos C57BL/6J após a administração estereotáxica unilateral de AQ (30nmol). Imediatamente após a lesão, os animais receberam uma injeção subcutânea de AG490 (10mg/kg) ou veículo (PBS+DMSO), e injeções diárias por 6 dias adicionais. Além disso, investigamos o possível efeito da lesão por AQ na atividade física voluntária diária (AFVD) em rodas de atividade. A distância percorrida pelos camundongos foi monitorada por 28 dias após a injeção unilateral de QA (30nmol) ou PBS no estriado. Cortes coronais do cérebro (40μm) obtidos em criostato foram utilizados para quantificação de neurônios por estereologia e para a análise de expressão protéica, através de imunoistoquímica e Western Blotting para GFAP e doublecortina, marcadores de gliose e neuroblastos, respectivamente. A área total de células doublecortina-positivas (ACDP) e o número de neurônios (NN) no lado lesado (L) e contralateral à lesão (CL) foram avaliados. O Índice de Neurogênese (IN=ACDP(L)/ACDP(CL)) e o Índice de Sobrevivência Neuronal (ISN=NN(L)/NN(CL)) foram calculados. Após a administração de AQ, o estriado ipsilateral apresentou intensa gliose e células doublecortina positivas com características de células migratórias. O Western Blotting para GFAP mostrou uma redução ipsilateral de 19% nos animais tratados com AG490, em comparação aos animais do grupo tratado apenas com veículo (0.82±0.05; 1.010±0.06, n=9, p<0.05). O ISN foi 25% maior nos camundongos que receberam AG490 em comparação aos animais controles (0.75 ± 0.07; 0.60 ± 0.03; n=8, p<0.05). O IN mostrou uma diminuição de 21% no grupo AG490 em relação ao grupo de animais tratados apenas veículo de diluição (1.08±0.06; 1.37±0.09, n=5, p<0.05). A AFVD média, medida em quilômetros por dia, não se alterou nos animais que receberam injeção intra-estriatal de QA (30nmol) em comparação aos animais do grupo controle (3.97±0.34; 3.90±0.21, n=8, p>0.05). Portanto, nossos resultados suportam um papel para a JAK2 na morte neuronal, gliose, e neurogênese estriatais após lesão com AQ. O tratamento com o inibidor AG490 causou neuroproteção e diminuição da gliose, sugerindo que a reação astrocitária pode prejudicar a sobrevivência neuronal neste modelo experimental.
4
A
BSTRACT
Injection of quinolinic acid (QA), a N-methyl-D-aspartate receptor agonist, in murine striatum induces death of medium spiny neurons, gliosis and neurogenesis in the subventricular zone with migration of newly synthesized neurons to damaged striatum. Such findings are also described in Huntington’s disease (HD). The Janus-kinase (JAK) pathway would take part in QA mechanism of action and HD pathogenesis as well. The interaction of interleukin-6 family of cytokines with its receptor triggers the activation of enzymes of the family of JAKs, which in turn allow the recruitment and activation of transcription factors, known as signal transducers and activators of transcription (STATs).Although the main features of HD are the presence of chorea and deficits in performing voluntary movements, few tests are realized regarding locomotor behavioral on QA model. We studied the effect of AG490, an inhibitor of JAK isoform 2 (JAK2), on gliosis, neuronal loss and neurogenesis in the striatum of adult C57BL/6J mice after unilateral estereotaxic administration of QA (30 nmol). Immediately after injury, animals received a subcutaneous injection of AG490 (10 mg/kg) or vehicle (PBS + DMSO), and then once daily injections for 6 days. Furthermore, in a parallel experiment, we investigated the possible effect of the lesion by AQ on the voluntary daily physical activity (VDPA) in running wheels. The distance traveled by mice was monitored daily for 28 days after unilateral injection of QA (30 nmol) or PBS into the striatum. Frozen brain sections (40µm) were used for neuronal stereological quantification and immunohistochemical and Western Blotting analyses for GFAP and doublecortin, markers of gliosis and neuroblasts, respectively. The total area of doublecortin-positive cells (ADPC) and the number of neurons (NN) in the lesioned (L) and contralateral (CL) sides were evaluated. Neurogenesis index (NI = ADPC in L/ ADPC in CL) and neuronal survival ratio (NSR = NN in L/ NN in CL) were calculated. After QA administration, ipsilateral striatum showed intense gliosis and doublecortin-positive cells with few processes and ovoid bodies, morphological features corroborating a migratory activity. Western Blotting for GFAP showed an ipsilateral decrease of 19% in AG490- vs vehicle-treated animals (0.82 ± 0.05 vs 1.010 ± 0.06; n=9, p<0.05). NSR was 25% higher in mice given AG490 vs controls given vehicle (0.75 ± 0.07 vs 0.60 ± 0.03; n=8, p<0.05). NI showed a decrease of 21% in AG490- vs vehicle-treated mice (1.08 ± 0.06, 1.37 ± 0.09; n=5, p<0.05). The average VDPA, measured in kilometers per day for 28 days, has not changed in animals that received intrastriatal injection of QA (30nmol) compared to animals that received PBS (3.97 ± 0.34, 3.90 ± 0.21, n = 8, p> 0.05). In conclusion, our results support a role for JAK2 in striatal neuronal death, gliosis and neurogenesis determined by QA. AG490 caused neuroprotection and reduced gliosis suggesting that astrocytic reaction may impair neuronal survival in the present experimental model.
5
1. I
NTRODUÇÃO
1.1 Morte neuronal por excitotoxicidade
A morte neuronal por excitotoxicidade causada pelo glutamato está envolvida em diversas doenças tais como epilepsia, Doença de Huntington e isquemia (Acharya e cols., 2008; Filippo e cols., 2008; Sánchez e cols., 2008). A concentração extracelular de glutamato é regulada por seus transportadores Na+ - dependentes, de alta afinidade, localizados tanto em neurônios, como em células da glia. Qualquer falha nos mecanismos homeostáticos de controle do glutamato pode promover seu acúmulo na fenda sináptica e subseqüente ativação sustentada dos seus receptores. Neste caso, pode ser desencadeado o processo de morte neuronal por excitotoxicidade, particularmente em situações de limitação de ATP (Sánchez e cols., 2008).
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do Sistema Nervoso Central (SNC). A ativação de receptores glutamatérgicos ionotrópicos do subtipo NMDA (N-metil D-aspartato) permite o influxo neuronal de íons Na+ e Ca+2. Tal receptor apresenta propriedades únicas como o fato de que a abertura do canal requer, além do glutamato, a presença de um co-agonista (glicina). Além disso, o íon Mg+2 bloqueia o canal quando a membrana celular se encontra hiperpolarizada. A entrada dos íons Na+ e Ca+2 através deste receptor neuronal ocasiona a despolarização da membrana celular, gerando um potencial excitatório pós-sináptico (Purves e cols., 2005). Por sua vez, a morte neuronal por excitotoxicidade ocorre principalmente devido ao excesso de ativação dos receptores NMDA e ao rápido influxo de Ca+2 na célula pós-sináptica. Como conseqüência, vias oxidativas são estimuladas resultando na produção de radicais reativos do oxigênio e do nitrogênio (ROS e RNS, respectivamente). Além disso, enzimas
6 ativadas por Ca+2, tais como proteases, endonucleases e fosfolipases, contribuem com a degradação de diferentes componentes celulares e, conseqüentemente, para a morte neuronal. Há evidências de que a geração de ROS pode levar à disfunção mitocondrial e subseqüente ativação da morte celular por apoptose ou necrose. Vias apoptóticas podem ser ativadas devido ao colapso do potencial de membrana mitocondrial, causando a abertura de poros na membrana desta organela, que permitem a liberação do citocromo c para o citoplasma. Deste modo, o citocromo c no citoplasma se acopla ao fator indutor de apoptose (AIF), que subseqüentemente leva a ativação da cascata de caspases, culminando com a ativação da caspase 3 e a morte celular (Wang e cols., 2005; Sánchez e cols., 2008).
1.2 Excitotoxicidade, Doença de Huntigton e ácido quinolínico
A partir do melhor conhecimento do mecanismo de morte por excitotoxicidade foram desenvolvidos diversos modelos animais para estudo de doenças como epilepsia e doença de Huntington (DH) (Sharma e cols., 2007; Sánchez e cols., 2008). A DH, descrita em 1872, é uma doença neurodegenerativa hereditária originada pela mutação do gene que codifica a proteína “huntingtina” (htt); cuja função ainda não está bem estabelecida. A expressão desta proteína mutante leva à morte seletiva de neurônios espinhosos médios GABAérgicos nos núcleos caudado e putâmen, conjuntamente denominados de corpo estriado. Além disso, há atrofia progressiva intensa e gliose estriatais. A característica clínica mais distinta da DH é a presença de movimentos coréicos involuntários, presentes em 90% dos indivíduos afetados. Observa-se também comprometimento dos movimentos voluntários, alterações comportamentais como irritação, ansiedade, impulsividade, agressividade e déficits cognitivos (Haddad e Cummings 1998; Sánchez e cols., 2008).
7 Por sua vez, a administração direta de ácido quinolínico (AQ) no estriado de roedores causa morte de neurônios espinhosos médios e reproduz algumas alterações bioquímicas e comportamentais da DH (Beal e cols., 1986; Sánchez e cols., 2008). O AQ é um metabólito endógeno derivado da degradação do triptofano (via da quinurenina), agonista do receptor NMDA, e há estudos que o colocam como uma substância potencialmente envolvida na excitotoxicidade observada em pacientes portadores da DH (Sánchez e cols., 2008).
Estudos recentes tentam explicar a relação causal entre a mutação do gene da “huntingtina” e a morte neuronal típica da DH (Schwarcz e cols., 2010). Em pacientes em fases inicias da doença, em modelos genéticos da DH, e em manipulações genéticas de inserção do gene da htt em leveduras, a via da quinurenina parece estar desregulada. Conseqüentemente, a produção de AQ e de outro metabólito do triptofano (3-hidroxiquinunerina, 3-HK), gerador de radicais livres, está aumentada. Sendo assim, foi proposto que os neurônios que possuem a mutação da htt teriam a via da quinurenina excessivamente ativada, além de uma disfunção mitocondrial, gerando excesso de produção de radicais livres. O meio pró-inflamatório ativaria células microgliais, macrófagos residentes no Sistema Nervoso Central (SNC), que provavelmente são a principal fonte de produção do 3-HK e do AQ. Estes compostos, por sua vez, atuariam nos neurônios causando sua morte devido à excessiva produção de radicais livres e a ativação sustentada dos receptores NMDA, respectivamente (Schwarcz e cols., 2010).
Além do mecanismo clássico de ação do AQ como agonista do receptor NMDA, Behan e cols. (1999) sugeriram que sua ação neurotóxica também envolva a interação química direta com constituintes celulares, causando oxidação e conseqüente dano neuronal. Neste estudo, após injeção de AQ no hipocampo de ratos adultos, o tratamento
8 com melatonina, substância com reconhecida ação antioxidante, apresentou potente atividade neuroprotetora e reduziu a peroxidação lipídica in vitro causada pelo AQ. Por outro lado, o fato de a melatonina não ter reduzido a morte neuronal por injeção de NMDA no hipocampo, indicaria que as espécies reativas do oxigênio, geradas como resultado da ativação do receptor NMDA, não seriam suficientes para explicar completamente a toxicidade causada pelo AQ. Deste modo, o mecanismo alternativo, de interação direta do AQ com componentes celulares, sem o envolvimento do receptor NMDA, parece ser um mecanismo provável (Behan e cols., 1999). A produção aumentada de radicais livres como mecanismo participante dos efeitos neurotóxicos do AQ foi confirmada por experimentos in vitro, demonstrando que seus efeitos citotóxicos envolvem a indução da sintase de óxido nítrico (NOS) e os conseqüentes danos celulares devidos à formação de radicais livres, tanto em neurônios quanto em astrócitos (Braidy e cols., 2009).
Recentemente verificou-se também que o AQ administrado no estriado de ratos inibe a atividade da proteína Ca+2-ATPase do retículo endoplasmático, facilitando o acúmulo deste íon no citoplasma da célula e, conseqüentemente, ativando os processos de morte celular por excitotoxicidade (Fernandes e cols., 2008).
1.3 Infusão de ácido quinolínico no estriado e astrogliose
Além da morte seletiva de neurônios do estriado, a administração de AQ desencadeia ativação de astrócitos, processo denominado astrogliose, gliose reativa ou reação astrocitária (Dihné e cols., 2001). A ativação de astrócitos após dano ao SNC resulta em alterações na morfologia, fenótipo imunológico e atividade proliferativa destas células (Sofroniew, 2005). Algumas características da astrogliose são: proliferação dos astrócitos e hipertrofia dos processos celulares, acompanhada de aumento na expressão
9 de proteínas constituintes dos filamentos intermediários do citoesqueleto, tais como a proteína ácida fibrilar glial (GFAP), a vimentina e a nestina (Pekny e Nilsson, 2005).
A maioria dos estudos tem apontado funções essenciais dos astrócitos reativos na proteção do tecido neural após insultos ao SNC. Tal proteção seria obtida, ao menos em parte, através do papel destas células em restaurar a homeostase de substâncias potencialmente citotóxicas, como o glutamato e os íons potássio. Além disso, os astrócitos seriam importantes em estabelecer uma separação entre as áreas lesadas e não lesadas, restringindo a presença de moléculas tóxicas e de células inflamatórias ao local lesionado (Sofroniew, 2005; Herrmann e cols., 2008; Rolls e cols., 2009). Por outro lado, os astrócitos reativos são também conhecidos por inibir a regeneração axonal e produzir algumas espécies reativas do oxigênio, culminando com a morte de neurônios e de células da glia (Sofroniew, 2005; Rolls e cols., 2009). Especificamente, evidenciou-se que o efeito neuroprotetor do piruvato após lesão do estriado de ratos com AQ, estava associado à diminuição de expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e da nitrotirosina (marcador indicando formação de RNS) pelos astrócitos e micróglia ativados. Os autores então sugeriram um papel da glia como mediadora do estresse oxidativo, contribuindo com a morte dos neurônios neste modelo (Ryu e cols.; 2004). Assim, já que em decorrência da gliose reativa, podem ocorrer tanto eventos neuroprotetores como neurotóxicos, sua função exata ainda não está bem estabelecida e pode variar de acordo com o tempo pós-lesão (Rolls e cols., 2009).
Dihné e cols. (2001) investigaram o perfil temporal da reação astroglial após injeção intraestriatal de AQ em ratos. Um dia após a lesão foi observada redução na densidade da proteína GFAP, considerada marcadora de astrócitos, no estriado ipsilateral à lesão. Após períodos mais longos (3, 5, 10 dias), através de análise imunoistoquímica,
10 verificou-se uma densa astrogliose com astrócitos em proliferação no estriado dorsal e medial. Já após 30 dias da lesão, todas as regiões do estriado apresentavam intensa astrogliose. Ainda com relação à ativação de células gliais, observa-se, além da ativação de astrócitos, a ativação de micróglia, tanto em modelos animais de lesão com AQ, como em humanos portadores da DH (Dihné e cols., 2001; Ryu e cols.; 2004; Pavese e cols., 2006).
1.4 Infusão de ácido quinolínico no estriado e neurogênese
Outro aspecto relevante da administração experimental de AQ é a estimulação da proliferação de células progenitoras e a formação de novos neurônios. As células-tronco neurais apresentam elevada capacidade auto-proliferativa e possuem a habilidade de se diferenciar em células gliais, como astrócitos e oligodendrócitos, e neurônios. No cérebro de mamíferos adultos estas células estão restritas a duas regiões do Sistema Nervoso Central: à camada subgranular do hipocampo (SGZ), com a integração dos novos neurônios formados à camada granular, e à parede dos ventrículos laterais (zona subventricular, SVZ), com seus progenitores neurais que migram para o bulbo olfatório e se integram à circuitaria desta estrutura (Mu e cols., 2010). A proteína citoplasmática doublecortina (DCX) tem sido amplamente utilizada como marcadora de neurogênese, especialmente, de neuroblastos migrantes (Brown e cols., 2003; Tattersfield e cols., 2004; Collin e cols., 2005; Gordon e cols., 2007). Confirmando a identidade neural das células doublecortina positivas, observou-se que elas não expressavam marcadores típicos de astrócitos, oligodendrócitos, ou micróglia (Yang e cols., 2004; Tattersfield e cols., 2004).
A função mais conhecida da doublecortina é a de interagir com os microtúbulos e participar de diversos eventos dependentes do citoesqueleto durante a migração celular, como
11 a translocação do núcleo, de outras organelas, vesículas e a adição de nova membrana celular aos processos em crescimento. A importância da doublecortina para o processo de migração de neuroblastos é evidenciada em condições de malformação cortical. Particularmente, a lisencefalia é determinada por mutação do gene que codifica esta proteína. Esta malformação é caracterizada pela migração anormal de neurônios durante o desenvolvimento e pela conseqüente formação defeituosa do córtex, o qual apresenta poucos giros e sulcos (Brown e cols., 2003; Friocourt e cols., 2003).
Neurogênese aumentada, bem como a migração de células progenitoras, têm sido observadas em inúmeros modelos animais de epilepsia, isquemia, trauma, doença de Alzheimer, Parkinson e Huntington (Parent, 2003). Observaram-se achados semelhantes em cérebros humanos de portadores da doença de Huntington. Estes pacientes apresentaram um aumento significativo na proliferação celular na camada subependimária adjacente ao núcleo caudado, detectado através de imunoistoquímica para o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA). Este aumento da proliferação celular, bem como o aumento da espessura da camada subependimária, foi proporcional ao grau de morte neuronal no estriado. Além disso, células marcadas para PCNA co-expressavam a proteína βIII-tubulina ou GFAP demonstrando a geração de novos neurônios e células gliais, respectivamente, na camada subependimária. Sendo assim, estes autores levantaram a hipótese da existência de um potencial regenerativo do cérebro humano, cujos mecanismos devem ser mais bem compreendidos, para permitir possíveis aplicações terapêuticas (Curtis e cols., 2003; Curtis e cols., 2007).
Em 2004, Tattersfield e cols. demonstraram que a perda de neurônios estriatais GABAérgicos de projeção após lesão do estriado com AQ em ratos foi acompanhada do aumento da neurogênese na SVZ e da migração de neuroblastos para as regiões lesadas do estriado. Estudos subseqüentes confirmaram estes dados anteriores e acrescentaram
12 informações importantes (Collin e cols., 2005; Gordon e cols., 2007). Collin e cols. (2005) observaram que 80% dos neurônios recém-gerados puderam ser observados no estriado 6 semanas após a lesão e expressavam o NeuN, marcador para neurônio maduro. Além disso, os neurônios gerados em conseqüência da lesão expressavam marcadores fenotípicos tanto de neurônios espinhosos médios estriatais (DARPP-32), como de interneurônios (parvalbumina ou neuropeptído Y) (Collin e cols., 2005). Através de marcação das células progenitoras da SVZ com vetores retrovirais expressando a proteína fluorescente verde (GFP), Gordon e cols. (2007) observaram, em ratos adultos, que a maioria das células doublecortina - positivas presentes no estriado lesado eram geradas a partir de células progenitoras da SVZ, que se proliferaram imediatamente antes ou após à lesão com AQ. Em contrapartida, células que se dividiram dois ou mais dias após a lesão, também migravam para o estriado, mas exibiam um fenótipo glial. Tais resultados demonstraram pela primeira vez que a migração de células doublecortina - positivas, derivadas da SVZ, em direção ao estriado lesado, acontece em um intervalo de tempo limitado. A natureza transitória da migração possivelmente ocorre em virtude da capacidade reduzida dos neuroblastos em responder ao ambiente pós-lesão ao longo do tempo, devido à perda ou inibição de estímulos migratórios (Gordon e cols., 2007).
1.5 Infusão de ácido quinolínico no estriado e alterações comportamentais
Embora muitos experimentos histológicos e bioquímicos suportem o uso do AQ como modelo para a DH, poucos experimentos comportamentais conclusivos foram realizados até o presente momento. O corpo estriado, que se encontra degenerado na DH, é conhecido por sua função na modulação do movimento, controlando seu início e execução. É uma estrutura fundamental na circuitaria dos núcleos da base, considerando
13 que 80% de suas sinapses são aferências corticais aos seus neurônios espinhosos médios. Do estriado partem projeções para outras estruturas dos núcleos da base, como o globo pálido e a substância negra. Destes pontos, as projeções expandem-se para os núcleos talâmicos ventral anterior e ventral lateral e novamente para o neocórtex. Em síntese, os núcleos da base influenciam o movimento por regular a atividade dos neurônios motores superiores (Mello e Villares, 1998).
Neste contexto, alguns testes são utilizados no modelo de lesão por AQ para se detectar alterações de atividade locomotora e verificar se o efeito de substâncias neuroprotetoras também abrange a redução das anormalidades locomotoras. Sanberg e cols., 1989 observaram que ratos submetidos à lesão bilateral com AQ apresentavam hiperatividade locomotora espontânea. Mais recentemente, a grande parte dos testes existentes é realizada após lesões unilaterais com AQ em ratos e demonstra um desequilíbrio da utilização das patas ipsilaterais e contralaterais à lesão. As últimas são menos utilizadas pelos animais em atividades exploratórias simples e de captura de alimento. O grau deste desequilíbrio na utilização das patas é utilizado como método de quantificação do dano neuronal ao estriado (Emerich e cols., 1996; Vazey e cols., 2006; Jørgensen e cols., 2011).
Outra avaliação para abordagem da função motora em animais com lesão unilateral do estriado causado pela administração de AQ é o teste de rotação induzido pela administração periférica de apomorfina. Como os ratos lesados apresentam um desequilíbrio da quantidade de receptores para a dopamina entre os hemisférios, o uso deste agonista dopaminérgico causa aumento do número de rotações ipsilaterais à lesão com AQ. A quantificação destas rotações se correlaciona com o grau de morte celular no estriado (Emerich e cols., 1996; De Almeida e cols., 2001; Vazey e cols., 2006; Schwarcz e cols., 2010).
14 1.6 Via de sinalização JAK/STAT em lesões do SNC
Várias evidências indicam que as citocinas da família da IL-6 possam estar envolvidas na regulação dos fenômenos de morte celular, neurogênese e gliose reativa no curso de processos degenerativos, como os desencadeados pela administração de ácido quinolínico. As citocinas pertencentes a esta família são: interleucina-6 (IL-6), interleucina 11 (IL-11), fator inibidor de leucemia (LIF), oncostatina M (OSM), fator neurotrófico ciliar (CNTF) e cardiotropina 1 (CT-1), e sinalizam através de uma subunidade comum do receptor chamada gp130. Estas proteínas desempenham importante papel na regulação de complexos processos celulares como ativação gênica, proliferação, sobrevivência, crescimento e diferenciação (Heinrich e cols., 1998; Bowman e cols., 2000).
Os receptores desta família de citocinas são estruturalmente parecidos. Especificamente, o receptor para CNTF (CNTFR) é formado por três componentes: uma subunidade específica alfa (α), o CNTFRα, e duas outras subunidades beta (β) transdutoras de sinal, conhecidas como gp130 e LIFRβ. O receptor para LIF possui uma subunidade gp130 e uma LIFRβ e o receptor de IL-6 possui duas subunidades gp130 (Davis e cols., 1991 e Heinrich e cols., 1998). O componente específico α está presente nos receptores para CNTF e IL-6 (gp80), mas é ausente no receptor para LIF. A sinalização através destes receptores apresenta muitas semelhanças e envolve a ativação de enzimas Janus-Tirosina Quinases (JAKs/TYK) e fatores de transcrição da família das proteínas transdutoras de sinais e ativadoras da transcrição (STATs) (Heinrich e cols., 1998).
A seqüência de eventos que culmina com a mudança da expressão gênica em resposta a uma determinada citocina, inicia-se com a ligação desta ao seu respectivo receptor; como por exemplo, o CNTF se ligando ao CNTFRα. O complexo CNTF/CNTFRα se liga, em seguida, ao gp130 e ao LIFRβ formando um heterodímero (Davis e cols., 1993). A formação do
15 heterodímero (CNTF/CNTFRα/gp130/LIFRβ) atrai as proteínas tirosina-quinase da classe das Janus Quinases (JAKs) que estão previamente associadas à porção citoplasmática das subunidades β dos receptores. Esta aproximação desencadeia a autofosforilação e ativação das JAKs, além da fosforilação de tirosinas das subunidades intracelulares do complexo receptor (Ip e Yancopoulos.,1996). As tirosinas fosforiladas nas subunidades β servem como sítios de recrutamento de monômeros das proteínas STATs. Uma vez associadas ao complexo, as STATs são fosforiladas pelas JAKs, desencadeando assim a dimerização das primeiras e sua subseqüente translocação para o núcleo, onde atuam como fatores de transcrição regulando a expressão de diversos genes (Figura 1) (Ip e Yancopoulos.,1996; Heinrich e cols., 1998).
16
FIGURA 1. Via de sinalização JAK/STAT comum às citocinas da família da IL-6. Neste
esquema, esta via é exemplificada através da citocina IL-6. O complexo receptor para a proteína IL-6 é composto por duas subunidades β (gp130), transdutoras de sinal, e uma subunidade específica para esta citocina (gp80). Inicialmente ocorre a ligação da IL-6 ao seu receptor específico (gp80). O complexo IL-6/gp80 se liga, em seguida, às duas subunidades gp130 ocasionando a dimerização das subunidades gp130. As proteínas tirosina-quinase da classe das Janus Quinases (JAKs) que estão previamente associadas à porção citoplasmática das subunidades β dos receptores são então atraídas. Tal aproximação desencadeia a autofosforilação e ativação das JAKs, além da fosforilação de tirosinas das subunidades intracelulares do complexo receptor (resíduos de tirosina são indicados por Y e P indica fosforilação). As tirosinas fosforiladas nas subunidades β servem como sítios de recrutamento de monômeros das proteínas STATs. Uma vez associadas ao complexo, as STATs são fosforiladas pelas JAKs, desencadeando assim a dimerização das primeiras e sua subseqüente translocação para o núcleo, onde atuam como fatores de transcrição regulando a expressão de diversos genes. APRF: acute-phase response factor ou STAT3; APRE, acute-phase response element. Adaptado de Heinrich e cols., 1998.
17 Atualmente sabe-se que a produção de CNTF é pós-natal e se restringe às células de Schwann no Sistema Nervoso Periférico e à subpopulações de astrócitos no Sistema Nervoso Central (SNC). Em condições fisiológicas, sua expressão em ratos adultos é elevada em nervos periféricos como o nervo ciático, medula, bulbo olfatório, nervo óptico e baixa em outras estruturas como estriado, hipocampo, córtex (Stöckli e cols., 1991; Dobrea e cols., 1992). Já o seu receptor específico, o CNTFRα é expresso durante todas as fases do desenvolvimento e é amplamente distribuído por todo o SNC, incluindo neurônios e astrócitos em diversas regiões, tais como: bulbo olfatório, córtex cerebral, cerebelo, hipotálamo, hipocampo, zona subventricular, medula, núcleos motores cranianos; além da musculatura esquelética (Ip e cols., 1993; Lee e cols., 1997; Dallner e cols., 2002; Emsley e cols., 2003).
Há muito tempo sabe-se que as citocinas IL-6 e LIF, além de seu reconhecido papel em diversos processos biológicos como reações imunológicas, hematopoiese e inflamação, também devem desempenhar algumas funções no sistema nervoso. De fato, esta hipótese é fundamentada considerando-se que estas proteínas e seus receptores estão distribuídos por todo o encéfalo em animais saudáveis. Mais especificamente, experimentos de RT-PCR e hibridização in situ em ratos demonstraram a presença da IL-6 e seu receptor em células da glia e neurônios de diversas áreas cerebrais, tais como: hipocampo, córtex, hipotálamo, estriado e camada ependimária do ventrículo lateral (Schöbitz e cols., 1993; Gadient e Otten 1994). De maneira semelhante ao CNTF e à IL-6, a citocina LIF e seu receptor apresentam-se distribuídos em diversas regiões, tais como: hipocampo, hipotálamo, mesencéfalo, córtex e cerebelo. Interessantemente, a expressão do LIF e seu receptor parece se restringir a neurônios, uma vez que estudos com
18 hibridização in situ e imunoistoquímica não encontraram sua presença em astrócitos (Lemke e cols., 1996; Yamakuni e cols., 1996).
É importante notar que a expressão destas citocinas em condições fisiológicas normais, é grandemente aumentada após diversos insultos ao SNC seguindo padrões típicos de cada citocina e de cada tipo de lesão (Asada e cols., 1995; Schiefer e cols., 1998; Jankowsky e cols., 2001; Minami e cols., 2002; Haas e cols., 2004; Sriram e cols., 2004; Satriotomo e cols., 2006). Apesar da distribuição neuronal e glial destas citocinas no SNC de animais saudáveis, as células da glia ativadas e células do sistema imune provavelmente são as principais produtoras destas citocinas após lesão do SNC (Banner e cols., 1997; Schiefer e cols., 1998; Jankowsky e cols., 2001; Choi e cols., 2004; Haas e cols., 2004; Satriotomo e cols., 2006).
1.7 Via de sinalização JAK/STAT e sobrevivência neuronal
Os efeitos neuroprotetores da STAT3, bem como das citocinas que a ativam, estão sendo investigados em diversos modelos experimentais. A STAT3 fosforilada (pSTAT3) em neurônios tem sido implicada na sobrevivência celular após lesão traumática da medula espinhal, axotomia nervosa periférica e em alguns modelos de isquemia (Dziennis e Alkayed, 2008). Um possível mecanismo neuroprotetor da pSTAT3 parece ser a ativação de genes anti-apoptóticos, como por exemplo o gene bcl-2, e/ou o gene que codifica a proteína GAP-43, importante no crescimento e reparo de neurônios lesados (Dziennis e Alkayed, 2008). Tanto o CNTF quanto a IL-6 é capaz de proteger neurônios hipocampais em cultura contra o efeito excitotóxico causado pelo glutamato (Semkova e cols., 1999; Sun e cols., 2002; Yamada e Hatanaka, 1994). Particularmente, o CNTF reduziu a degeneração de neurônios quando administrado 6 e 24 horas antes da indução de dano pelo glutamato;
19 tendo permanecido em contato com as células até a avaliação da neurodegeneração. No entanto, esta citocina falhou em proteger os neurônios hipocampais quando adicionado imediatamente após o término da exposição ao glutamato (Semkova e cols., 1999).
Em 1996, Anderson e cols. mostraram que a administração intraestriatal de CNTF através de minipumps a ratos que receberam injeção de AQ no estriado, diminuiu a morte dos neurônios GABAérgicos dessa estrutura. Vários autores reportaram também efeitos neuroprotetores quando lentivírus, ou células modificadas para expressar CNTF, foram aplicados no estriado ou nos ventrículos laterais de roedores e primatas que posteriormente tiveram o estriado lesado por AQ (Emerich e cols., 1996, 1997a,b; De Almeida e cols., 2001; Jørgensen e cols., 2011). Nesse sentido, também foi demonstrada a ação neuroprotetora da IL-6 quando expressa através de vetores lentivirais no estriado de animais lesados através da injeção de AQ nesta mesma estrutura (Bensadoun e cols., 2001). É importante ressaltar que em tais estudos a administração de CNTF ou IL-6 foi anterior à lesão com AQ, não tendo sido avaliado o possível efeito neuroprotetor destas citocinas quando aplicadas posteriormente ao dano celular (Anderson e cols., 1996; Emerich e cols., 1996, 1997 a,b; Bensadoun e cols., 2001; De Almeida e cols., 2001; Jørgensen e cols., 2011).
De fato, observou-se em experimentos com neurônios estriatais in vitro, que o efeito neuroprotetor do CNTF ao dano excitotóxico causado pelo NMDA só era detectado quando este fator neurotrófico era aplicado anteriormente ao agonista glutamatérgico. Além disso, a presença de um inibidor de síntese protéica abolia seu efeito de redução da morte neuronal. Sendo assim, sugeriu-se que o efeito neuroprotetor do CNTF sobre os neurônios do estriado pode envolver a transcrição de genes que aumentam a resistência neuronal à morte por excitotoxicidade (Petersén e Brundin, 1999).
20 1.8 Via de sinalização JAK/STAT e regulação da neurogênese
Embora não se conheça os fatores endógenos reguladores da proliferação das células precursoras neurais no cérebro adulto, acredita-se que as citocinas possam estar envolvidas neste processo. Minami e cols. (2002) sugeriram a existência de um papel da citocina neuropoiética LIF na neurôgenese hipocampal observada após crises epilépticas causadas pela administração de ácido caínico, um agonista glutamatérgico. Estes autores ressaltaram o fato de existir intensa expressão do mRNA do LIF no giro denteado do hipocampo. Esta é a região onde a neurogênese encontra-se aumentada após as crises. Além disso, tem sido reportado na literatura que o LIF promove neurogênese de células progenitoras neurais olfatórias em cultura (Satoh e Yoshida, 1997).
Em condições fisiológicas, Emsley e Hagg (2003) mostraram que a administração central de CNTF em camundongos adultos aumenta o número de células em proliferação, marcadas com 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU), tanto na zona subventricular (SVZ), como no giro denteado do hipocampo. Por sua vez, a administração intraventricular de anticorpos anti-CNTF reduziu significativamente o número de células marcadas com BrdU na SVZ. Além disso, no giro denteado o CNTF parece aumentar a diferenciação de células precursoras em neurônios, aumentando a proporção de células duplamente marcadas para NeuN e BrdU de 14 para 29%. É importante ressaltar que, nas regiões neurogênicas, o receptor para CNTF (CNTFRα) estava presente em astrócitos. Tal fato sugere um mecanismo indireto do CNTF na neurogênese através de sua ação nestas células, ou que os próprios astrócitos constituam uma linhagem precursora neural, conforme será mencionado adiante (Emsley e Hagg., 2003). Além disso, um estudo mais recente descreveu efeitos análogos no hipocampo de camundongos knockouts adultos para CNTF e em mutantes condicionais para STAT3, isto é, portadores de deleção do gene da STAT3 apenas em células que expressavam GFAP.
21 Observou-se nestes animais uma diminuição do pool de células-tronco neurais, da proliferação celular e, conseqüentemente, da neurogênese na zona subgranular do hipocampo (Müller e cols., 2009). Desta maneira, estes autores conseguiram associar os efeitos do CNTF na neurogênese à via de sinalização JAK/STAT3 e não a outras vias também ativadas pelo CNTF, como a via das MAP quinases e Akt (Müller e cols., 2009).
Estes trabalhos reforçam a hipótese de que algumas citocinas podem atuar como reguladores endógenos da neurogênese em animais adultos. Adicionalmente, Lim e Alvarez-Buylla (1999) observaram através de estudos in vitro que os astrócitos usados como substratos para células adultas da SVZ são capazes de estimular a neurogênese. Particularmente, este estudo levantou a hipótese da necessidade de haver contato intercelular in vivo entre os astrócitos e as células precursoras neurais da SVZ para que ocorra a neurogênese nessa região. Entretanto, estudos mais recentes têm colocado os próprios astrócitos da SVZ e da zona subgranular do hipocampo como sendo as prováveis células-tronco neurais responsáveis pela geração de novos neurônios no cérebro adulto. Mais especificamente, na SVZ de mamíferos, células astrócito-símile (células tipo B, GFAP positivas), com ciclo celular lento, são as células-tronco que geram os neuroblastos (células tipo A, DCX e PSA-NCAM positivas), através de outros tipos celulares intermediários, de divisão rápida, as células do tipo C. É interessante observar que, nos répteis e aves, a glia radial, ausente em mamíferos adultos, é a responsável pela neurogênese na vida adulta, demonstrando a identidade glial das células-tronco neurais ao longo da evolução. A identificação dos astrócitos da SVZ como precursores da linhagem neural levantou a surpreendente hipótese de que estas células, ou pelo menos algumas de suas subpopulações, exerçam a função de células-tronco latentes no cérebro adulto (Doetsch e cols., 1999; Doetsch 2003; Zhao e cols., 2008).
22 1.9 Via de sinalização JAK/STAT e ativação glial
Conforme mencionado anteriormente, outro aspecto relevante da excitotoxicidade causada pelo ácido quinolínico é a ativação das células gliais. A hipótese do envolvimento da via de sinalização JAK/STAT na astrogliose surgiu com a descoberta de que a diferenciação in vitro de células embrionárias neuroepiteliais em astrócitos pode ser induzida por diversas citocinas, tais como: IL-6, LIF, CNTF e OSM (Bonni e cols., 1997; Yanagisawa e cols., 1999; Yanagisawa e cols., 2001). É importante ressaltar também que muitos aspectos da astrogliose, como hipertrofia de astrócitos e aumento da expressão de GFAP, podem ser induzidos pela injeção intracerebral de citocinas como o CNTF em animais saudáveis (Winter e cols., 1995; Levison e cols., 1996). Em contrapartida, os astrócitos reativos por si mesmos são uma rica fonte de citocinas após insulto. Muitos dos fatores produzidos por astrócitos, incluindo CNTF, IL-6, TGFβ, LIF e IL-1, podem agir de maneira autócrina para afetar sua proliferação, migração, morfologia e adesão. Além disso, muitas destas citocinas podem também atuar de maneira parácrina podendo influenciar a fisiologia de neurônios vizinhos (Jankowsky e cols., 2001).
Penkowa e cols. (2001) mostraram que camundongos knockout para IL-6 são mais susceptíveis a crises convulsivas induzidas por ácido caínico, um agonista de receptores para glutamato, como o AMPA e o cainato. Além disso, foram observados no hipocampo dos camundongos knockouts, uma diminuição da reação astrocitária e da ativação de micróglia, bem como o aumento do estresse oxidativo e da morte neuronal por apoptose. De maneira semelhante, Holmberg e Patterson (2006) propuseram que o LIF pode ser um regulador chave das respostas astrocitárias e microgliais após crises convulsivas induzidas por pilocarpina, um agonista colinérgico muscarínico. Após sua administração em camundogos knockouts para LIF, verificou-se diminuição da ativação
23 tanto de astrócitos como de micróglia no hipocampo. Logo, algumas citocinas da família da IL-6 parecem desempenhar papel fundamental na indução da astrogliose hipocampal após convulsões.
Embora o papel das citocinas da família da IL-6 na reação astrocitária venha sendo estudado em outros modelos animais, há poucos trabalhos empregando o modelo de excitotoxidade causado pela administração de ácido quinolínico no estriado. Em 1998, Schiefer e cols. detectaram um aumento transitório do mRNA para a citocina IL-6 que iniciou-se 3 horas após a injeção de AQ, atingiu um pico de expressão máxima 6 horas após e praticamente desapareceu após 24 horas. Segundo os autores, a micróglia ativada seria a fonte principal da IL-6, uma vez que a ativação microglial ocorre poucas horas após a lesão. Estes autores também propuseram que a IL-6 poderia estar envolvida na indução da reação astrocitária, que ocorre neste modelo mais tardiamente à ativação da micróglia.
Adicionalmente a este pico de expressão de IL-6 relatado por Schiefer e cols. 1998, Haas e cols. (2004) observaram aumento expressivo dos níveis da proteína CNTF no estriado de ratos 29 dias após a lesão com AQ. Além disso, através de imunoistoquímica, observaram que as células positivas para CNTF tinham características morfológicas de astrócitos; sugerindo, que o aumento de CNTF verificado neste estudo se correlaciona com a formação da cicatriz glial.
Através da lesão de terminais nervosos dopaminérgicos estriatais pela administração sistêmica da neurotoxina MPTP, Sriram e cols. (2004) demonstraram que a ativação da via de sinalização JAK2/STAT3 nos astrócitos provavelmente apresenta papel importante na indução da reação astrocitária. Além disso, verificaram aumento de mRNA no estriado para várias citocinas como oncostatina M, IL-6 e LIF anterior à ativação da STAT3 e
24 indução da expressão de GFAP, sugerindo um papel destas citocinas na astrogliose. Corroborando esta hipótese, os mesmos autores verificaram que o inibidor farmacológico in
vivo para a proteína tirosina-quinase JAK2, chamado AG490 (tirfostina B42), diminuiu
significativamente a expressão da proteína GFAP, quantificada através de ELISA. Ainda, o mesmo grupo, utilizando cortes espessos de estriado in vitro, relatou a ocorrência de fenômenos semelhantes: aumento da fosforilação da STAT3, do mRNA para LIF, IL-6 e oscostatina M, e inibição da fosforilação da STAT3 pelo AG490. Tais resultados mostraram que a abordagem in vitro também pode ser utilizada para se estudar fenômenos relacionados à indução da astrogliose (Damiani e O’Callaghan, 2007).
Os inibidores sintéticos de quinases são amplamente utilizados em estudos oncológicos. De fato, a fosforilação de tirosina aumentada é considerada uma característica marcante de muitas neoplasias e, em última análise, aumenta a ativação de proteínas regulatórias, levando à proliferação celular desregulada. Tirfostinas são inibidores de quinases sintetizados a partir da estrutura do erbstatin, um inibidor de proteína tirosina-quinase produzido por bactérias do gênero Streptomyces. Nesse sentido, vários estudos detectaram a capacidade do AG490 de inibir a proliferação de diversos tipos de células cancerosas (Caceres-Cortes, 2008). No entanto, não há dados na literatura utilizando o AG490 em modelo de excitotoxicidade por injeção de ácido quinolínico.
1.10 Justificativa
Embora diversos trabalhos utilizem o modelo de excitotoxicidade induzida pelo AQ para o estudo da neurodegeneração no estriado, há poucos dados sobre o papel da via da JAK2/STAT3 nesta condição experimental. No presente estudo, pretendemos investigar as possíveis repercussões da inibição da JAK2 pelo AG490 sobre a regulação da morte celular,
25 neurogênese e astrogliose no estriado de camudongos adultos após administração de AQ. Além disso, considerando-se o número reduzido de trabalhos publicados abordando o comportamento motor de camudongos adultos após administração de AQ, analisamos também o volume de atividade física espontânea diária nestes animais. Acreditamos ainda que este estudo possa fornecer subsídios relevantes para o melhor entendimento de doenças neurodegenerativas humanas que envolvem processos excitototóxicos como a Doença de Huntington.
26
2. O
BJETIVOS
2.1 Geral
Investigar a participação da via JAK2/STAT nos processos de morte celular, astrogliose e neurogênese no estriado de camundongos adultos após a administração de ácido quinolínico.
2.2 Específicos
Avaliar a sobrevivência neuronal no estriado de camundongos adultos após a administração de ácido quinolínico associado ou não ao inibidor da JAK2 AG490;
Analisar morfologicamente e semiquantificar a reação astrocitária no estriado de camundongos adultos após a administração de ácido quinolínico associado ou não ao inibidor da JAK2 AG490;
Analisar morfologicamente e semiquantificar a população de neurônios imaturos no estriado de camundongos adultos após a administração de ácido quinolínico associado ou não ao inibidor da JAK2 AG490;
Investigar a repercussão da lesão do estriado induzida pela administração de ácido quinolínico sobre o volume de atividade física espontânea diária de camundongos adultos.27
3. M
ATERIAL E
M
ÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos adultos C57BL/6J machos pesando entre 20 e 30 gramas, fornecidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB-UNICAMP). Durante todo o período experimental os animais foram mantidos em condições controladas de luz, com ciclo de doze horas de claro e escuro, e temperatura (21oC), recebendo água e ração ad libitum. Todos os procedimentos experimentais de manipulação dos animais estão de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), tendo sido aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA/Unicamp (Protocolo 2083-1).
3.2 Lesão unilateral do estriado
Para realização da lesão do estriado esquerdo dos camundongos foi empregada a técnica descrita por Hansson e colaboradoes (1999) com modificações. Inicialmente os camundongos foram anestesiados com solução de 2-2-2-tribromoetanol (20 mg/ml; Avertin, cat. nº T48402, Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO) na dose de 0,6 mg/g, intraperitoneal. Após anestesia foram posicionados em um aparelho estereotáxico (Insight modelo EFF331) e, com o auxílio de uma broca odontológica, o crânio foi perfurado nas coordenadas 0,5 mm anterior ao bregma e 2 mm lateral à esquerda da linha média. A seguir, a ponta de uma agulha 32G acoplada a uma seringa de 10µl foi posicionada na
28 coordenada 3,9 mm ventral ao bregma (Franklin e Paxinos, 1997). O volume de 0,5µl de ácido quinolínico (AQ) na concentração de 60 mM (diluído em tampão fosfato salina, PBS), ou seja, 30 nmol, foi administrado a uma velocidade de 0,5µl/minuto utilizando-se uma bomba de microinfusão (Insight modelo EFF311). Após a infusão, a pele foi suturada (Monofilamento preto, Nylon 5-0, Shalon® suturas) e os animais então retornaram para suas gaiolas para recuperação.
3.3 Inibição da via de sinalização JAK2/STAT e sacrifício dos animais
Imediatamente após à lesão unilateral do estriado, os animais foram tratados subcutaneamente com um inibidor da fosforilação da JAK2 chamado, AG490 (Tyrphostin, B42, cat. nº T-9142, LC Laboratories, Woburn, MA, USA) na dose de 10 mg/kg, diluído em uma solução de PBS contendo 5% de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma) (Sriram e cols., 2004). Após esta administração inicial, os animais receberam uma dose diária de 10 mg/kg durante 6 dias. Os animais do grupo controle foram tratados com volume correspondente do veículo (PBS + 5% DMSO). Após 24 horas do término do tratamento, os camundongos foram anestesiados com uma solução 1:1 (v/v) de cloridrato de ketamina (100 mg/ml) e cloridrato de xilazina (23 mg/ml), na dosagem de 1,5 ml/kg de massa corporal (i.p.) e submetidos à toracotomia e perfusão através do ventrículo cardíaco esquerdo com solução salina 0,9% até a completa remoção do sangue. Em seguida foram perfundidos com paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7.4). Os cérebros foram então dissecados, mantidos durante um dia no paraformaldeído 4% a 4ºC, e por mais um dia em solução crioprotetora de sacarose 30% na mesma temperatura.
29 Após esse período, os cérebros foram embebidos em resina para congelamento (Tissue-Tek®) e armazenados a -20ºC até o processamento histológico ou Western Blotting.
3.4 Obtenção de cortes histológicos e armazenamento
Para todos os procedimentos histológicos e de avaliação de expressão protéica foram confeccionadas séries de cortes coronais dos cérebros, cortados em criostato (Leica CM1850). A região do estriado foi inteiramente seccionada serialmente em cortes de 40 μm, sendo todos os cortes (cerca de 120 por animal) coletados individualmente em placas de 96 poços, contendo tampão fosfato-salina (PBS; pH 7,4), azida sódica (0,05%) e armazenados a 4ºC até sua utilização.
3.5 Avaliação estereológica
Uma amostragem sistemática foi realizada para a seleção dos cortes a serem utilizados nas contagens. Para tal, um corte foi selecionado aleatoriamente entre os quatro primeiros obtidos. A partir de então, um a cada quatro cortes foi selecionado até completar o total de 20 cortes para cada animal. Os cortes foram posicionados em série sobre lâminas gelatinizadas, corados com Cresil Violeta (Sigma) e montados com Permount (Fischer) (Galvin e Oorschot, 2003) (Figura 2).
Para a contagem foi utilizada a técnica de Optical Fractionator (Software Stereo Investigator® 2000, MicroBrightField, Colchester, VT, USA), com número amostral de 8 animais do grupo controle (VEÍCULO) e de 7 animais do grupo tratado com inibidor da JAK2 (AG490). Os neurônios foram identificados morfologicamente através de seu núcleo
30 grande, central e com nucléolo evidente, além de citoplasma fortemente corado, contendo corpúsculos de Nissl. Em cada corte selecionado, a área do estriado foi delimitada utilizando-se objetiva panorâmica (4X). Uma grade composta por quadrados de 900 X 900 μm foi aleatoriamente sobreposta ao corte. Em cada ponto de intersecção da grade que estivesse sobre o estriado foi posicionada uma janela de contagem (frame) de 40 X 40 μm. A contagem dos neurônios foi realizada empregando-se uma ferramenta estereológica definida como disector óptico, através da qual estruturas podem ser contadas diretamente em uma região tridimensional com um volume definido. O volume do disector é determinado através da multiplicação da área do frame pela altura do
disector (h) (Figura 3A). Para a contagem utilizou-se objetiva de 100X (imersão em óleo)
em um microscópio que possui controle motorizado do movimento da platina ao longo do eixo Z (Nikon, Eclipse 1000). Antes do início da contagem foi medida a espessura do corte em cada frame. Para isso, a face superior do corte foi definida pela primeira célula que entrasse em foco à medida que o mesmo fosse deslocado no eixo Z. Da mesma forma, a face inferior foi definida pela última célula que entrasse em foco. Para o início da contagem o plano de foco foi posicionado 2 μm abaixo da superfície do corte, não se considerando assim a região que pudesse ter perdido parte das estruturas a serem contadas durante o processo de obtenção dos cortes. A partir desta profundidade, foram contados todos os neurônios que estivessem nitidamente identificáveis à medida que o plano de foco fosse aprofundado ao longo dos próximos 4 μm da espessura do corte. Tal espessura (4 μm) foi definida como a altura do disector (h). Foram excluídos da contagem todos os neurônios dispostos sobre a linha vermelha do frame (Figura 3B) (West e cols., 1991).
31 C = ƩQ- . t/h . 1/asf . 1/ssf , onde ƩQ- é a somatória do número de neurônios contados; t é a espessura do corte medida em cada frame; h é altura do disector (4μm);
asf é a fração de área amostrada, calculada como área da janela de contagem (40 x 40 =
16000 μm2) dividida pela área do quadrante do grid de contagem (900 x 900 = 810000 μm2
); ssf é a fração de cortes em que foram amostradas as células. Como foi selecionado um corte a cada quatro, o valor de ssf foi 1/4. Os neurônios do estriado contralateral, não lesado, também foram contados utilizando-se a mesma técnica descrita. Após a obtenção da estimativa do número de neurônios por estereologia foi calculado um índice, denominado índice de sobrevivência neuronal (ISN) que consistiu na divisão do número de neurônios do lado lesado pelo número de neurônios contralaterais à lesão. Desta forma, cada animal teve o lado contralateral como seu controle interno, eliminando possíveis influências de variabilidade do número de neurônios de cada animal e/ou planos de corte diferentes entre os animais.
O volume do estriado ipsi e contralateral à injeção de ácido quinolínico foi estimado pelo método de Cavalieri. A área do estriado em cada corte selecionado foi mensurada e o volume foi calculado através da equação V(ref)= Ʃa X t, onde V(ref) é o volume calculado, Ʃa é soma das áreas em cada corte e t é a distância entre os cortes coletados (40 μm X 4 = 160 μm) (Gundersen e cols., 1988). Utilizou-se o teste t não pareado de Student (GraphPad Prism 5) para se analisar os ISNs, e o volume total do estriado de ambos os lados de animais pertencentes a grupos diferentes. Já o volume total do estriado ipsi e contralateral de animais de um mesmo grupo foi comparado através do teste t pareado de Student (GraphPad Prism 5). Considerou-se diferença estatisticamente significativa p<0.05.
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FIGURA 2.Cortes histológicos utilizados para a avaliação estereológica. (A) Cortes coronais
de cérebros de camundongos emblocados em resina para congelamento (Tissue-Tek®). Asterisco corresponde ao hemisfério lesado com ácido quinolínico, que apresenta despigmentação (seta de cor preta), em comparação ao lado oposto não lesado. A diferença entre os hemisférios também pode ser observada em B e C. (B e C) Vinte cortes de 40µm montados seqüencialmente em duas lâminas gelatinizadas para posterior coloração com Cresil Violeta. A distância entre cada corte é de 160 µm. A partir da extremidade superior à esquerda da figura B, os cortes estão apresentados em linhas horizontais dispostos no sentido ântero-posterior do cérebro. Observar que a lesão do estriado apresenta-se como área hemisférica de coloração mais clara (setas amarelas).
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FIGURA 3. Esquema do método de quantificação neuronal por estereologia (Optical Fractionator). (A) Cortes seriados espessos (40 µm) da estrutura a ser avaliada (aqui
representada em cinza e indicada por seta) foram analisados de forma sistemática e aleatória. A área do estriado foi delimitada em cada corte e uma grade (A, eixos x,y) composta por quadrados de 900 X 900 μm foi aleatoriamente sobreposta ao corte. Em cada ponto de intersecção da grade que estivesse sobre o estriado foi posicionada uma janela de contagem, denominada frame (a, quadrados pretos) de 40 X 40 μm. No canto inferior à direita da figura está a representação tridimensional de um disector óptico, ferramenta de três dimensões construídas pelo computador em cada área onde o número de neurônios deve ser estimado. A letra t representa a espessura do corte e h a altura do disector (4 µm) (adaptado de West e cols., 1991). (B) Representação do frame de contagem com linhas em vermelho e em verde. Foram considerados para contagem apenas neurônios em foco, nitidamente identificáveis nos 4 µm de altura do disector e que não estivessem em contato com as linhas vermelhas. No esquema, os neurônios contados estão indicados com asterisco. Coloração com cresil violeta.
