MYCOPLASMA GALLISEPTICUM
–
UMA DOENÇA EMERGENTE
Stanley H. Kleven
University of Georgia Department of Avian Medicine
Athens, Georgia 30602-4875
Esforços para controlar Mycoplasma gallisepticum (MG) nos Estados Unidos da América (EUA) começaram nos anos 1960, iniciando-se como uma resposta à alta condenação por aerossaculite verificada pelo serviço de inspeção do United States Department of Agriculture (USDA). Em seguida, tanto M. synoviae (MS) quanto M. meleagridis (MM) foram adicionados ao programa. Desde então, progressos significativos tem sido obtidos no controle de infecções causadas por Micoplasma em planteis básicos de galinhas e perus. Programas voluntários de controle de MG nos EUA são conduzidos com o National Poultry Improvement Plan (NPIP); as normas e protocolos para os testes são fornecidos em publicação oficial (1). A maior parte da produção de aves nos EUA é livre de micoplasmas, entretanto, infecções por MG e MS são comuns em planteis de produção de ovos para consumo. Infelizmente, mesmo com crescentes esforços de controle, novos surtos continuam a aparecer.
Mudanças que afetam o controle de MG têm ocorrido tanto nos EUA como em outros países. Entre estas situam-se mudanças ocorridas na própria indústria avícola, na melhoria dos métodos de detecção, o melhor entendimento do patógeno, sua virulência e o aperfeiçoamento dos métodos de controle.
Mudanças da indústria avícola que afetam o controle de Micoplasmas
Na maioria das áreas produção industrial de aves, a ênfase no controle de infecções por Micoplasmas tem sido dada na manutenção de lotes de linhas puras e avós e matrizes livres do patógeno e evitando-se a infecção de matrizes e lotes da produção final pela utilização de lotes de idades únicas, alojados em granjas de boa biosseguridade com o sistema all-in all-out. Esta prática tem sido um sucesso em muitos países e a maioria da produção de frangos, perus e ovos é livre da infecção. Em contraste, áreas com indústria avícola menos desenvolvida tende a ter níveis elevados de contaminação com MG e MS; este é um desafio para empresas que desejam instituir métodos modernos de produção.
Com o rápido crescimento na produção avícola no mundo, tem havido grande concentração de aves em pequenas áreas, levando à riscos maiores de exposição a Micoplasmas patogênicos. Em algumas áreas, a produção é tão concentrada que do ponto de vista epidemiológico pode ser considerada como uma grande granja de múltiplas idades. Também, melhorias no controle de doenças têm resultado às vezes em redução dos esforços de biosseguridade, aumentando assim as chances de difusão das infecções por Micoplasmas (15).
Tem havido uma tendência de mudança da produção do sistema all-in all-out para concentrar a produção em granjas de múltiplas idades. Isto tem sido especialmente verificado na produção de ovos – a maioria da produção de ovos nos EUA é feita em granjas de múltiplas idades, e esta tendência está se difundindo a outros países. A
maioria destas granjas é positiva para MS, e muitas são também positivas para MG (29), mesmo que as avós e matrizes sejam geralmente livres de ambos MG e MS.
Em muitos lugares, há também a criação de matrizes pesadas ou frangos em granjas de múltiplas idades. Na produção de perus, granjas que concentram a produção em vários estágios nas quais duas ou três idades diferentes são mantidas começam a ser freqüentes.
Portanto, apesar dos enormes esforços obtidos com biosseguridade e na melhoria do conhecimento sobre a sobrevivência dos Micoplasmas fora do hospedeiro, novos surtos de infecções por Micoplasmas continuam a ocorrer.
Melhorias nos Métodos de Detecção
A base para programas de controle de Micoplasmas tem sido centrada em métodos sorológicos tais como a a soroaglutinação e a inibição da hemaglutinação, seguidos da confirmação pelo isolamento do organismo. Mais recentemente, kits comerciais de ELISA foram disponibilizados (IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine, EUA; Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, EUA) e estão senso amplamente usados. Estes kits tem excelentes sensibilidade e especificidade, porém reações não específicas podem ainda ocorrer. Melhorias na especificidade dos testes de ELISA podem resultar da utilização de antígenos purificados, ou do uso de um ELISA competitivo (blocking ELISA) baseado em um anticorpo monoclonal específico.
Amostras de MG de baixa virulência acarretam geralmente baixa resposta de anticorpos, e o isolamento do agente de amostras clínicas pode ser difícil (36). Este fenômeno é especialmente aplicável quando a constituição antigênica da amostra infectante e daquela utilizada para a produção de antígenos de diagnóstico não tem boa identidade. Variabilidade em cepas e respostas clínicas têm também sido observada com MS. Nós temos encontrado casos de lotes com baixa resposta de anticorpos e com baixo percentual de positivos em PCR. Estes lotes têm também sido negativos na tentativa de isolamento do agente. Tem sido possível transferir esta positividade a aves SPF sentinelas mantidas em contato com os infectados. Isto sugere a existência de amostras atípicas que não têm sido detectadas pelos métodos tradicionais de diagnóstico.
A reação em cadeia de polimerase (PCR) representa uma alternativa rápida e sensível aos métodos tradicionais de cultura, os quais são lentos e requerem meios e reagentes especiais. Pelo menos uma empresa (IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine, EUA) produz kits comerciais de PCR, os quais são largamente usados. Um protocolo de PCR desenvolvido pelo Dr. Lauerman da Auburn University (20) é também largamente usado.
Tais melhorias nos métodos sorológicos e a rápida detecção permitida pela PCR têm facilitado o diagnóstico rápido e preciso das infecções causadas por MG.
Variabilidade entre M. gallisepticum e M. synoviae e entre Cepas
É conhecido o fato de que amostras de MG e MS variam em antigenicidade e patogenicidade (16, 18). Variação de patogenicidade entre cepas de MG tem sido identificada há algum tempo (36). Variações antigênicas significativas entre amostras
dependendo da amostra infectante e daquela usada para preparar o antígeno. Existem também diferenças significativas na virulência de amostras de MS. Recentemente, foi encontrada em perus uma amostra de MS que não induziu a resposta de anticorpos mesmo em aves que permitiram isolar o agente do trato respiratório superior (19). Tentilhões (Carpadacus mexicanus) com conjuntivite causada por MG tem sido largamente identificados nos EUA. (22, 23, 27). Esta cepa foi identificada como relativamente não virulenta e de deficiente transmissão entre galinhas (31). Uma cepa de MG semelhante foi isolada de perus com doença clínica de baixo impacto (9).
A diferenciação de cepas tem sido possível com o uso de técnicas de RFLP (Restriction Length Polymorphism) aplicadas ao DNA total extraído de células de MG (18). Entretanto, os métodos de RFLP são demorados e trabalhosos, transformando a identificação de cepas específicas em um procedimento laborioso Mais recentemente, a RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) foi desenvolvida para identificar amostras especificas (5, 8, 10). Esta técnica é simples e rápida, e tem se transformado em um procedimento de rotina para a identificação rápida de cepas de MG. Este método tem se mostrado útil para estudos epidemiológicos e para a identificação de cepas específicas de MG em surtos de campo. Mais recentemente, nós temos utilizado uma PCR para os genes PvpA (25), mgc1 (gapA) (11, 14) e lipoproteína (30), seguido de RFLP ou seqüenciamento do produto amplificado na PCR para identificar especificamente cepas de MG. NO momento nós estamos avaliando este método sob condições de campo utilizando-se primers do gene mgc2 (13). Usando este método nós fomos capazes de definir mais precisamente a identidade de cepas vacinais ou amostras de campo.
Estudos de Western blots utilizando-se anticorpos monoclonais tem mostrado uma grande variabilidade na expressão de antígenos superficiais entre amostras de MG; muitas dessas proteínas são expressas de forma variada (2, 3, 28). Isto levou a grandes esforços na caracterização da expressão variável de antígenos superficiais e na demonstração de que a variação de fase também ocorre in vivo. Variação similar também tem sido demonstrada entre amostras de MS. Por exemplo, clones de MS que são negativos para hemaglutinação são menos virulentos que clones positivos na hemaglutinação. O significado da variabilidade na expressão de antígenos superficiais não está bem compreendida, entretanto, parece lógico que este fenômeno é importante para a patogenia, resposta sorológica e evasão do sistema imune dos hospedeiro.
Vacinação para M. gallisepticum
Com o aparecimento de complexos de postura comercial com múltiplas idades, o controle por vacinação passou a ser desejável.
As primeiras vacinas comerciais disponíveis para MG foram bacterinas oleosas (12). Bacterinas protegem bem contra aerossaculite e perdas na produção de ovos, mas conferem pouca proteção contra a colonização por amostra de campo de MG, sendo assim de pouca utilidade em programas de erradicação. A maior desvantagem das bacterinas é a necessidade de duas doses para a proteção ideal e seu custo de administração.
Vacinas de MG vivas incluem a cepa F (4, 26), a qual tem estado disponível há algum tempo e através de vários fabricantes, a cepa 6/85 da Intervet America,
Millsboro, Delaware (6, 7), e a cepa ts-11, desenvolvida e largamente usada na Austrália e disponibilizada nos EUA pela Merial Select, Gainesville, Georgia (34, 35).
A cepa F tem moderada virulência para galinhas (é virulenta para perus), coloniza o aparelho respiratório superior eficientemente, se dissemina relativamente de forma lenta entre lotes, e oferece proteção contra perdas na produção de ovos. Esta cepa protege de forma excelente contra a colonização pelas cepas de desafio, e substitui as cepas selvagens presentes em granjas de produção de ovos de consumo de múltiplas idades. Infelizmente, a cepa F tem sido implicada em infecções de perus comerciais (21).
As cepas 6/85 e ts-11 tem vantagens sobre a cepa F. Ambas oferecem proteção contra o desafio, mas são avirulentas e tem limitado potencial para disseminação de ave para ave (24), apresentando assim menor risco aos lotes vizinhos. A cepa F foi mais eficiente do que as cepas 6/85 e ts-11 na substituição de cepas selvagens em estudos realizados em gaiolas (17), mas experiências de campo em um complexo de produção de ovos para consumo humano sugerem que a cepa ts-11 pode substituir a cepa F . Após a vacinação com a cepa ts-11 ter sido descontinuada, o lote se manteve livre de MG (33). Resultados similares não estão disponíveis para a cepa 6/85, mas há complexos de produção que usaram a cepa 6/85 e agora estão soronegativos, sugerindo que a substituição de cepas selvagens é também possível com a cepa 6/85. Se a cepa selvagem for muito virulenta, talvez seja necessário vacinar com a cepa F por um ou mais ciclos de produção e então mudar para as cepas 6/85 ou ts-11.
A maior preocupação com relação a vacinas vivas de MG é sua segurança. Tem havido muitos casos de doença respiratória clínica causada pela cepa F em outros lotes; esta cepa não deve ser usada se há a possibilidade de disseminação para perus, mesmo sendo a cepa mais eficiente para galinhas. Tem se verificado por várias vezes o isolamento de cepas semelhantes à cepa 6/85 (6/85-like) de MG de perus com sinais clínicos. Em alguns casos havia histórico de vacinação recente de galinhas ou perus nas redondezas. Recentemente tem havido detecção de isolados 6/85-like de MG em poedeiras comerciais alojadas próximas a aves vacinadas com 6/85 (32). A cepa ts-11 tem sido detectada em pelo menos duas ocasiões em galinhas de lotes não vacinados. Em ambos os casos havia histórico da possibilidade do uso de equipamento de vacinação contaminado e em um dos casos, houve subseqüente disseminação para lotes de matrizes pesadas nas proximidades. Sabe-se também que a cepa ts-11 pode ser disseminada por machos de reposição vacinados introduzidos em lotes de fêmeas não vacinadas. Estas experiências sugerem que mesmo que as vacinas modernas sejam seguras elas têm o potencial de se disseminarem, e questões de segurança devem ser avaliada antes de se decidir pela vacinação. Uma regra importante a ser considerada para o uso destas vacinas, é que altos títulos vacinais devem ser usados e a vacina administrada adequadamente para evitar a disseminação entre as aves. A Tabela 1 resume a experiência do autor com e as características das diferentes cepas vacinais.
Vacinas de MG tem sido menos usadas em perus. A cepa F é muito patogênica para ser considerada, mas as cepas 6/85 e ts-11 podem ter potencial de uso em situações limitadas. Em um experimento com vacinação conduzido por nós, a administração de 6/85 ou ts-11 não resultou em lesões ou sinais respiratórios em perus. Houve pouca ou nenhuma resistência observada contra a aerossaculite após desafio por aerossol, mas houve alguma proteção detectada contra lesões do trato
Tabela 1. Comparação entre as cepas vacinais de MG.
F 6/85 ts-11
Forma Liofilizada Liofilizada Congelada Via de administração Várias Spray Gota ocular Virulência Moderada Nenhuma Nenhuma Persistência Excelente ??? Boa Resposta de
anticorpos Moderada Nenhuma Baixa Transmissão Moderada Pouca Pouca Substituição de
cepas Excelente ??? Boa
Experiências de campo utilizando vacinas vivas tem sido favorável e poedeiras comerciais, e experiências de campo com granjas de matrizes pesadas de múltiplas idades tem também sido favorável. Estas experiências sugerem que vacinas vivas podem ser ferramentas úteis para a erradicação de MG em granjas de poedeiras comerciais de múltiplas idades.
Pouco trabalho tem sido feito com vacinas de MS. Uma bacterina de MS está disponível nos EUA, mas parece ter sido de pouco uso no campo. Uma cepa mutante termosensível de MS foi permitida para uso na Austrália e está sendo largamente usada. Esta vacina foi também aprovada para uso no México a alguns outros países mas não está disponível nos EUA.
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Agradecimento
Ao Dr. Laurimar Fiorentin, pesquisador da Embrapa Suínos e Aves pela tradução dessa palestra.
