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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
PAULA BITTENCOURT VAGO
FUNGOS DO TRATO RESPIRATÓRIO DE EQUINOS:
DESTAQUE PARA O ISOLAMENTO DE ESPÉCIES DE CANDIDA
NÃO-ALBICANS
FORTALEZA
2012
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PAULA BITTENCOURT VAGO
FUNGOS DO TRATO RESPIRATÓRIO DE EQUINOS: UM
DESTAQUE PARA O ISOLAMENTO DE ESPÉCIES DE CANDIDA
NÃO-ALBICANS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, herbívoros, onívoros e aves.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha Co-Orientadora: Profa. Dra. Rossana de Aguiar Cordeiro
FORTALEZA
2012
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PAULA BITTENCOURT VAGO
FUNGOS DO TRATO RESPIRATÓRIO DE EQUINOS: UM
DESTAQUE PARA O ISOLAMENTO DE ESPÉCIES DE CANDIDA
NÃO-ALBICANS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de mestre em Ciências Veterinárias.
Aprovada em: 03/07/2012.
BANCA EXAMINADORA:
__________________________________________________ Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
Universidade Estadual do Ceará Orientador
__________________________________________________ Profa. Dra. Rossana de Aguiar Cordeiro
Universidade Federal do Ceará Examinadora
__________________________________________________ Prof. Dr. José Mário Girão Abreu
Universidade Estadual do Ceará Examinador
__________________________________________________ Dra. Débora Castelo Branco de Souza Collares Maia
Universidade Federal do Ceará
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES/PNPD Examinadora
4 À minha mãe, Ruth, por sempre ter sido a minha melhor amiga,
maior companheira e incentivadora, e por estar presente em todos os momentos da minha vida.
5 “Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim.” (Chico Xavier)
6 AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, da Faculdade de Veterinária, da Universidade Estadual do Ceará.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro.
Ao Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM), da Universidade Federal do Ceará. Ao professor Marcos Fábio Gadelha Rocha pela orientação, dedicação, ensinamentos, apoio e cobranças, visando sempre o aprimoramento dos seus orientados.
À professora Rossana de Aguiar Cordeiro, pela orientação, ensinamentos, paciência, disponibilidade, pelas palavras de incentivo e confiança.
À Professora Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante, pelos ensinamentos.
Ao Professor José Júlio Costa Sidrim, pelos alicerces do Centro Especializado em Micologia Médica.
Ao Professor André Jalles Monteiro, pela sua capacidade estatística.
A todos os colegas do CEMM que dividiram comigo as alegrias, sofrimentos e a busca pelo conhecimento nessa incrível jornada da pós-graduação. Um agradecimento especial a Kylvia Rocha de Castro e Silva, Lucas Pereira de Alencar, Francisca Jakelyne de Farias Marques e Débora Castelo Branco de Souza Collares Maia.
À Sabrina Tainah da Cruz Silva e ao Carlos Eduardo Cordeiro Teixeira pelo apoio incondicional tanto no desenvolvimento do projeto como nas viagens de coleta e, além de tudo, pela amizade sincera.
À Terezinha de Jesus Santos Rodrigues, ao Daniel Teixeira Lima e à Monalisa Cunha, por todo o suporte proporcionado para a realização de nossas pesquisas.
À Adriana Sales Albuquerque, secretária do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, da Universidade Estadual do Ceará, pela atenção e disponibilidade.
À minha mãe, Ruth Ribeiro Bittencourt, pelo amor incondicional, companheirismo, paciência e por ser o meu exemplo de vida!
Ao Artur Fonseca, pelo amor, pela cumplicidade, paciência e por estar ao meu lado em todos os momentos.
Aos meus tios, Ester Bittencourt e Marcos Licurgo, meus segundos pais, e Janaína Bittencourt, minha prima-irmã, por estarem, mesmo a distância, compartilhando seu amor, carinho e apoio.
7 Aos meus queridos amigos Goethe Carvalho, Lúcia Fernandes, Alaíde Poti, Ana Carolina Soares pelo apoio emocional.
Aos meus amigos de quatro patas: meu gato Saddan (in memorian), minha gata Jujuba, meus cavalos Prinz Royal e Mahamed, por me mostrarem sentimento puro e leal, e por sempre me lembrar da escolha da minha profissão.
8 RESUMO
Há muitos trabalhos abordando sobre patógenos bacterianos e virais que acometem o trato respiratório de equinos. No tocante aos fungos, entretanto, os estudos são limitados. Dessa forma, o objetivo inicial desta pesquisa foi identificar Candida spp. isoladas da cavidade nasal de equinos e determinar a sensibilidade in vitro destas leveduras ante a anfotericina B, fluconazol e itraconazol. Ademais, foi realizada uma investigação sorológica para histoplasmose e coccidioidomicose. Para a obtenção de Candida spp. foram coletadas amostras da cavidade nasal rostral e caudal de 97 equinos, escolhidos aleatoriamente, no Estado do Ceará, Nordeste do Brasil, por meio do uso de swabs de algodão, os quais eram acondicionados em solução salina acrescida de cloranfenicol. As leveduras obtidas foram identificadas por métodos manuais, como características macro e micromorfológicas, cultura em meio cromogênico CHROMagar-Candida e perfil bioquímico, e, excepcionalmente, pelo método automatizado VITEK 2. Dessa forma, foram recuperados 56 isolados de Candida spp., provenientes de 35 equinos (36,08%), sendo 18 (32,14%) C. famata, 14 (25%) C.
parapsilosis, 12 (21,42%) C. guilliermondii, 11 (19,64%) C. tropicalis e 1 (1,78%) C. pelliculosa. As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) foram determinadas de acordo com
o documento M27-A3, como descrito pelo CLSI. As CIMs variaram de 0,03125 a 1 µg/mL para anfotericina B; de 0,03125 a >16 µg/mL e 0,125 a >64 µg/mL para itraconazol e fluconazol, respectivamente, sendo observadas resistências para fluconazol e itraconazol em isolados de C. tropicalis (n=3) e C. guilliermondii (n=1). Por fim, o teste sorológico foi realizado em 177 cavalos saudáveis dos municípios de Fortaleza, Eusébio, Caucaia, Jaguaribe, Sobral e Santa Quitéria, no Estado Estado do Ceará, mediante a técnica de imunodifusão dupla com kit comercial para Coccidioides spp. e Histoplasma capsulatum. Todas as amostras apresentaram, no entanto, resultado negativo para histoplasmose e coccidioidomicose. Em suma, os dados demonstram um predomínio de Candida não-albicans na microbiota da cavidade nasal de equinos, inclusive com isolados resistentes a antifúngicos e que os equinos, investigados mediante a técnica de imunodifusão dupla, não são bons animais sentinela para histoplasmose e coccidioidomicose nesta região geográfica.
Palavras-chave: Equinos, Candida spp., antifúngicos, imunodifusão, histoplasmose, coccidioidomicose.
9 ABSTRACT
There are several studies focusing on bacterial and viral pathogens which attack the respiratory tract of horses. However, regarding fungi, the studies are limited. Thus, the initial goal of this research was to identify Candida spp. isolated from the nasal cavity of equines and to determine the in vitro susceptibility of these yeasts against amphotericin B, fluconazole and itraconazole. In addition, a serological investigation for histoplasmosis and coccidioidomycosis was held. In order to obtain Candida spp., samples from the caudal and rostral nasal cavity of 97 equines were collected through use of cotton swabs, which were put up in saline solution plus chloramphenicol. These animals were randomly chosen, in the State of Ceará, Northeastern Brazil, Yeast obtained was identified by manual methods (such as macro and micro morphological features, chromogenic culture media CHROMagar Candida, biochemical profile) and exceptionally through VITEK 2 automated system. Hence, 56
Candida spp. isolates from 35 horses (36.08%), of which 18 (32.14%) C. famata, 14 (25%) C. parapsilosis, 12 (21.42%) C. guilliermondii, 11 (19.64%) C. tropicalis and 1 (1.78%) C. pelliculosa. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) values were determined according to
the document M27-A3, as described by CLSI. The MICs ranged from 0.03125 to 1 µg/mL for amphotericin B; from 0.03125 > 16 µg/mL and from 0.125 to >64 µg/mL for itraconazole and fluconazole, respectively, and resistance to fluconazole and itraconazole was observed in isolates of C. tropicalis (n = 3) and C. guilliermondii (n = 1). Finally, the serological test was held in 177 healthy horses in the cities of Fortaleza, Eusébio, Caucaia, Jaguaribe, Sobral and Santa Quitéria, in the State of Ceará, through immunodiffusion with commercial kit for
Coccidioides spp. and Histoplasma capsulatum. However, all samples showed negative
results on the double immunodiffusion test for histoplasmosis and coccidioidomycosis. In short, the data show the predominance of non-albicans Candida in the microbiota of the nasal cavity of equines, including some cases of in vitro resistance to azole derivatives, and that horses, investigated through double immunodiffusion, are not good sentinels for histoplasmosis and coccidioidomycosis in this geographical region.
Keywords: Horses, Candida spp., antifungal, imunodiffusion, histoplasmosis, coccidioidomycosis.
10 LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA:
Figura 1: a) Placa contendo ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol, demonstrando o crescimento de colônias de Candida spp... 22 Figura 1: b) Tubo contendo ágar batata, apresentando crescimento de colônias de
Candida spp. 22
Figura 1: c) Microcultivo de C. albicans em ágar fubá acrescido de Tween 80. Observa-se a presença de clamidoconídio (seta)... 22 Figura 1: d) Placa contendo ágar cromogênico, permitindo a identificação presuntiva de Candida albicans (seta verde), C. krusei (seta preta) C.
parapsilosis (seta rosa) e C. tropicalis (seta azul)... 22
Figura 2: Microdiluição em placas de 96 poços em formato de U ... 24 Figura 3: Distribuição geográfica do Histoplasma capsulatum no Brasil. Estados marcados em vermelho demonstraram isolamento do fungo em animais... 27 Figura 4: a) Macromorfologia de Histoplasma capsulatum em sua forma micelial – Cultivo em ágar batata dextrose à 28ºC (20 dias), apresentando colônias brancas e algodonosas. b) Micromorfologia de H. capsulatum em sua forma micelial à temperatura de 28ºC, apresentando hifas hialinas, finas e septadas com macroconídios tuberculados, característicos do fungo (seta). Exame direto da colônia com lactofenol azul algodão... 29 Figura 5: a) Biópsia de tecido pulmonar corado com prata metenamina Grocott demonstrando leveduras ovais típicas do Histoplasma capsulatum. b) Aspecto microscópico de H. capsulatum corado pelo Giemsa a partir de creme leucocitário: visualização de células leveduriformes intracelulares (seta)... 32 Figura 6: Distribuição geográfica do Coccidioides posadasii. Estados marcados em vermelho são endêmicos para coccidioidomicose. Áreas coloridas correspondem a municípios do Estado do Ceará com casos confirmados da doença ... 36 Figura 7: a) Macromorfologia de Coccidioides spp. em agar batata dextrose, mostrando colônias brancas com textura algodonosa. b) Micromorfologia de
Coccidioides spp. revelando hifas maduras contendo artroconídios (seta)
espaçados por células disjuntoras. Montagens tipo lâmina-lamínula com lactofenol azul algodão... 38 Figura 8: Vegetação característica de caatinga, em Jaguaribe, cidade com casos humanos confirmados... 39 Figura 9: a) Aspecto micromorfológico da forma parasitária de Coccidioides spp. em tecido pulmonar de camundongos, visualizado em exame direto com KOH 10%. Histopatológico corado por PAS (b) e Grocott prata metenamina (c), com observação de endosporos liberados de esférula rompida... 42
11 Figura 10: Padrão da reação positiva no teste de Imunodifusão em gel de
agarose. Poço 1 – Antígeno; 2 e 5 – Soros controles positivos; 3,4,6 e 7 – Soros para teste ... 43 Figura 11: Reação de imunodifusão para detecção de anticorpos contra
Histoplasma capsulatum. Poço central – Antígeno; Nos poços 1 e 4 – Soros
12 LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1:
Tabela 1 - The numbers of various yeast species isolated from anatomical locations from upper respiratory tract of in 97 clinically normal horses………… 65 Tabela 2 - The minimal inhibitory concentrations (MIC) of amphotericin B, itraconazole and fluconazole effective in vitro against 56 isolates of Candida spp. isolated from two anatomical sites of clinically normal horses. Data in brackets represents the number of isolates for the indicated MIC value…………. 66
13 LISTA DE ABREVIADURAS E SIGLAS
AIDS – Acquired immunodeficiency syndrome BHI – Brain Heart Infusion
CFU – Colony-forming unit
CIM – Concentração Inibitória Mínima
CLSI – Clinical Laboratory Standards Institute GMS – Grocott prata metenamina
HE – Hematoxilina Eosina
HIV – Human immunodeficiency virus ID – Imunodifusão dupla em gel de agarose KOH – Hidróxido de Potássio
NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards PAS – Ácido periódico de Schiff
14 SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 15
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 17
2.1 Infecções respiratórias vs. Equinocultura ... 17
2.2 Candida spp. ... 18
2.2.1 Aspectos Históricos ... 18
2.2.2 Ecoepidemiologia gênero Candida... 18
2.2.3 Aspectos Clínicos ... 20
2.2.4 Diagnóstico ... 21
2.2.5 Avaliação da sensibilidade antifúngica in vitro... 23
2.3 Histoplasmose ... 25
2.3.1 Aspectos Históricos ... 25
2.3.2 Aspectos Epidemiológicos ... 25
2.3.3 Biologia do fungo Histoplasma capsulatum ... 28
2.3.4 Patogenia e Aspectos Clínicos ... 29
2.3.5 Diagnóstico ... 30
2.4 Coccidioidomicose ... 33
2.4.1 Aspectos Históricos ... 33
2.4.2 Aspectos Epidemiológicos ... 35
2.4.3 Biologia do fungo Coccidioides sp... 37
2.4.4 Patogenia e Aspectos Clínicos ... 39
2.4.5 Diagnóstico ... 41
2.5 Diagnóstico sorológico da Histoplasmose e Coccidioidomicose ... 42
3. JUSTIFICATIVA ... 45 4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS... 46 5. OBJETIVOS ... 47 5.1 Objetivo Geral ... 47 5.2 Objetivos Específicos ... 47 6. CAPÍTULO 1... 48 7. CONCLUSÕES... 67 8. PERSPECTIVAS... 68 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 69 10. ANEXOS ... 84
15 1. INTRODUÇÃO
A equinocultura aumentou nos últimos anos devido, em virtude da mudança na utilidade dos equinos, de animais de lida no campo para animais atletas. Diversas modalidades de esportes equestres estão presentes no Estado, como vaquejada, prova de três tambores, corrida e hipismo. Por conseguinte, com o aumento do investimento nesses animais, cresceu também a preocupação com a sua saúde, além de um maior convívio entre humanos e equinos. No tocante a saúde, várias enfermidades causam diminuição de performance e tornam os animais inaptos a desenvolver atividades atléticas, entre as quais, as infecções respiratórias.
As infecções fúngicas no trato respiratório são pouco estudadas em equinos, quando comparadas a agentes bacterianos e virais, o que ocasiona, muitas vezes, agravamento de quadros clínicos em decorrência de tratamentos indevidos. Assim, torna-se cada vez mais importante o conhecimento sobre os fungos que podem causar doenças em equinos, como, por exemplo, Candida spp., Coccidioides spp. e Histoplasma capsulatum var. capsulatum.
O gênero Candida é composto por leveduras que vivem como comensais na microbiota de homens e animais. Normalmente, não causam dano aos seus hospedeiros, entretanto, quando expostos a fatores de risco, que causam desequilíbrio em suas barreiras física, química ou imunológica, ocorre a infecção chamada de candidíase.
O fungo dimórfico Histoplasma capsulatum var. capsulatum é o agente causador da histoplasmose clássica, a qual já foi descrita em diversos países. A doença acomete principalmente o homem e algumas espécies animais como cães, gatos, equídeos, roedores, marsupiais. Exibe, como forma infectante, microconídeos presentes no solo, os quais são inalados pelo hospedeiro, que pode ou não mostrar sintomas. A sintomatologia varia desde pacientes assintomáticos, presença de uma simples tosse a quadros respiratórios graves e, ainda, desenvolvimento da forma disseminada da doença.
Os fungos dimórficos Coccidioides immitis e Coccidioides posadasii são causadores da coccidioidomicose, micose sistêmica exclusiva do Continente Americano. A primeira espécie é comumente isolada de Vale de São Joaquim, na Califórnia, Estados Unidos, sendo exclusivo daquela região. Enquanto isso, o C. posadasii se estende às outras regiões endêmicas do Continente Americano, do sul dos Estados Unidos até a Argentina. Atualmente, no Brasil, a coccidioidomicose é considerada endêmica nos Estados da Bahia, Ceará, Maranhão e Piauí. No Ceará, já foram relatados casos humanos em diversos municípios, como Aiuaba, Arneiroz, Boa Viagem, Catunda, Independência, Jaguaribe, Parambu, Santa
16 Quitéria, Sobral e Solonópole. O homem e diversas espécies animais são suscetíveis à infecção, a qual ocorre por inalação de artroconídeos presentes no solo contaminado. A sintomatologia clinica é variável desde pacientes assintomáticos a quadros respiratórios severos, além da forma disseminada.
Por fim, considerando o crescimento da equinocultura como prática esportiva e lazer e, consequentemente, o maior contato do homem com esta espécie animal, aliado à escassez de dados acerca dos fungos que podem ser encontrados nestes animais, com este estudo, buscou-se contribuir com esta temática, particularmente identificando as espécies de Candida isoladas da cavidade nasal de equinos, bem como realizando inquérito sorológico para as micoses endêmicas histoplasmose e coccidioidomicose, nas quais o pulmão é o sítio primário de infecção.
17 2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Infecções Respiratórias versus Equinocultura
O elevado número de animais, associado à necessidade de produção crescente, leva a um aumento na ocorrência de enfermidades. Dentre as que afetam os equinos, o segundo grupo com maior prevalência são as associadas ao trato respiratório (SILVA, VARGAS, 2006). Doenças respiratórias e anormalidades das vias áreas são uma das principais razões para queda de desempenho no cavalo atleta ou até mesmo afastamento das suas atividades esportivas, resultando em perdas econômicas (RICHARD et al., 2010). De acordo com Davidson e Martin (2003), de 40 a 42% dos cavalos de corrida com baixo desempenho demonstraram alguma forma de infecção respiratória.
A mucosa do trato respiratório superior é muitas vezes o principal ponto de entrada de agentes patogênicos e desempenha importante papel na patogênese de várias infecções respiratórias (VANDEKERCKHOVE et al., 2009). Diversos patógenos podem ocasionar quadros clínicos respiratórios em equinos, sendo infecções virais e bacterianas as mais comuns na clínica médica (AINSWORTH, BILLER, 2000). No tocante a infecções virais, os patógenos mais comumente envolvidos são herpes vírus equino do tipo 1 (EHV1), herpes vírus equino do tipo 4 (EHV4) e o vírus influenza (HARLESS, PUSTERLA, 2006). Já nas infecções bacterianas, as espécies Streptococcus equi e Streptococcus zooepidemicus são comumente encontradas (VANDEKERCKHOVE et al., 2009). O S. zooepidemicus é frequentemente isolado em casos clínicos de pneumonia e pleuropneumonia, sendo uma das bactérias mais importantes, associada com doença inflamatória das vias aéreas em cavalos jovens (BARQUERO et al., 2010).
Os patógenos fúngicos, por sua vez, são negligenciados no diagnóstico dessas enfermidades. A pneumonia fúngica como entidade primária não é comum, porém, quando presente, os microrganismos Candida spp., Histoplasma capsulatum e Coccidioides spp., devem ser investigados. O diagnóstico precoce de problemas respiratórios é essencial para o rápido retorno dos animais aos treinos, como também para prevenção de complicações secundárias que, por fim, podem encerrar prematuramente a carreira do animal ou levar ao óbito (AINSWORTH, BILLER, 2000).
18 2.2. Gênero Candida
2.2.1 Aspectos Históricos
O gênero Candida foi descrito pela primeira vez por Langenbeck, em 1839, ao observar lesões orais em pacientes com tifo, contudo, ele erroneamente descreveu o microrganismo como agente etiológico da doença. Em 1842, David Gruby definiu a patogenia da candidíase oral, classificando seu agente etiológico como pertencente ao gênero
Sporotrichum. Após detalhado estudo sobre o microrganismo, Berg, em 1846, estabeleceu
definitivamente sua relação com a ocorrência de candidíase oral. Em 1853, Charles Robin denominou esse microrganismo de Oidium albicans (SIDRIM, ROCHA, 2004; ODDS, 1998). Em 1861, Zenker relatou o primeiro caso de infecção cerebral por disseminação hematógena associada a Candida. Em 1862 e 1875, Mayer e Haussmann, respectivamente, descreveram casos de candidíase vaginal (ODDS, 1998).
Anos mais tarde, em 1890, Zopf renomeou o agente para Monilia albicans. Somente em 1923, entretanto, o microrganismo passou a ter a denominação utilizada até os dias atuais, quando Berkhout transferiu a espécie para o gênero Candida e criou a espécie Candida
albicans (SIDRIM, ROCHA, 2004). Em 1954, durante o VIII Congresso Europeu de
Botânica, o gênero foi definitivamente descrito e aceito como Candida, baseado nos estudos realizados por Robin (1853), Zopf (1890) e Berkhout (1923) (ODDS, 1988).
2.2.2 Ecoepidemiologia do gênero Candida
Taxonomicamente, as leveduras do gênero Candida pertencem ao reino Fungi, filo Ascomycota, subfilo Saccharomycotina, classe Saccharomycetes e ordem Saccharomycetales (NCBI Taxonomy, 2011).
Segundo De Hoog et al. (2000), levedura é um termo descritivo para qualquer fungo capaz de se reproduzir por brotamento, tendo como unidade funcional o blastoconídio. Alguns representantes do gênero são pleomórficos, os quais possuem a capacidade de se apresentarem sob diferentes formas morfológicas como pseudo-hifas, hifas verdadeiras, blastoconídios e clamidoconídios, de acordo com as condições às quais estão submetidos (OLIVEIRA, 2006).
Candida sp. são consideradas comensais da microbiota associada à pele e mucosas do
trato urogenital, gastrointestinal e respiratório superior do homem e de várias espécies animais (SKORIC et al., 2011; BENTUBO et al., 2010; CLEFF et al., 2005), havendo estudos visando à identificação da microbiota em diversos taxa animais, como aves (BRILHANTE et al., 2010), répteis (NARDONI et al., 2008), crustáceos (BRILHANTE et al., 2011),
19 mamíferos (SKORIC et al., 2011; BENTUBO et al., 2010; CARREGARO et al., 2010; BRITO et al., 2009b; KECK et al., 2009; COSTA et al., 2008), incluindo equinos (PIRRONE et al., 2011; BATISTA et al., 2008; REILLY, PALMER, 1994; PUGH et al., 1986).
Entre as 25 espécies de leveduras patogênicas consideradas emergentes, 20 são do gênero Candida. Em humanos, as espécies mais frequentemente encontradas são C. albicans,
C. parapsilosis, C. tropicalis e C. glabrata (PALACIO et al., 2009). Já em animais, além
dessas espécies, são isoladas com frequência as espécies C. guilliermondii, C. famata, C.
krusei, C. kefir (BRILHANTE et al., 2011; CARREGARO et al., 2010; BRILHANTE et al.,
2010; BRITO et al., 2009b; CLEFF et al., 2005).
Os estudos da microbiota fúngica direcionada às espécies de Candida pouco descrevem a cerca de mamíferos saudáveis quando comparados com relatos em humanos (WROBEL et al., 2008). Cleff et al. (2005) analisaram a microbiota vaginal de 14 cadelas sadias durante dez meses e encontraram influência pela fase do ciclo reprodutivo. As espécies isoladas foram C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. kefyr, C. albicans, C. glabrata e C.
krusei. Brito et al. (2009b) relataram uma incidência maior de C. tropicalis e C. parapsilosis
em relação a C. albicans, em 23 isolados proveniente de 203 cães saudáveis onde foram estudados a mucosa oral e vaginal bem como a região perianal e prepúcio. Bentubo et al. (2010) relataram elevada taxa de isolamento de C. albicans no pelame de 21 cães sadios que viviam em regime domiciliar.
Além de cães, existem trabalhos relatando o isolamento de Candida spp. como parte da microbiota de outras espécies animais. Costa et al. (2008) evidenciaram elevada taxa de isolamento de C. albicans em bovinos leiteiros. Em um estudo de microbiota de pele em suínos saudáveis, Carregaro et al. (2010) também encontraram alta prevalência de C.
albicans.
Em equinos, Pirrone et al. (2011) analisaram microbiota das mucosas orofaríngeas e retal de 21 potros sadios e 39 potros doentes. Não houve diferença estatística entre os grupos, sendo a espécie C. albicans a mais isolada. A prevalência de C. albicans em populações animais, todavia, ainda não é bem conhecida (WROBEL et al., 2008).
Nas aves, o isolamento de leveduras do gênero Candida é mais comum, quando comparado às outras classes animais. Diferentemente dos mamíferos, os relatos de isolamento de Candida spp. em aves sadias são frequentes, principalmente, com origem em espécimes obtidos do trato gastrintestinal (MANCIANTI et al., 2001). Brilhante et al. (2010) obtiveram 92 isolados de Candida spp. provenientes da cavidade oral, inglúvio e cloaca de calopsitas,
20 sendo encontradas seis espécies: Candida albicans, C. famata, C. glabrata, C. krusei, C.
parapsilosis, C. tropicalis.
Infecções por Candida spp. em mamíferos são pouco frequentes. Nos últimos anos, contudo, foi observado aumento considerável de relatos com diferentes manifestações clínicas e acometendo diversas espécies (BRITO et al., 2009a). De acordo com a literatura, a Candida
albicans é a espécie mais frequentemente envolvida em casos de candidíases em animais
(BENTUBO et al., 2010; COSTA et al., 2008). Outras espécies, contudo, são citadas como agentes dessas infecções como C. tropicalis e C. parapsilosis (CARREGARO et al., 2010; BRITO et al., 2009a; KOBAYASHI, 2008) além de C. guilliermondii (MUELLER et al., 2002).
2.2.3 Aspectos clínicos
Em geral, esses microrganismos não causam nenhum dano aos seus hospedeiros, entretanto, podem se tornar patogênicos quando ocorrem alterações nas barreiras físicas, químicas e imunológicas culminando em enfermidade denominada de candidíase. Os fatores predisponentes a infecções em animais incluem: idade, doenças autoimunes, Diabetes
Mellitus, uso prolongado de antibióticos e animais imunocomprometidos em razão da terapia
prolongada com corticocosteróides (SKORIC et al., 2011; BRITO et al., 2009b).
Nos mamíferos, os sítios anatômicos mais acometidos são pele e anexos, ouvido, trato urinário, trato gastrointestinal e sistema reprodutor (SKORIC et al., 2011; WROBEL et al., 2008; JADHAV; PAL, 2006;).
Cães podem apresentar diversas manifestações clínicas de candidíase tais como dermatomicose com alopecia, eritema, crostas e úlceras (MORETTI et al., 2004; MUELLER et al., 2002), estomatite (JADHAV, PAL, 2006) além de candidemia (SKORIC et al., 2011). Santos e Marin, (2005), informaram que a candidíase é a terceira maior causa de mastite em bovinos no Brasil.
Em equinos, mais especificamente em potros, as espécies de Candida são patógenos oportunistas que podem ocasionar ulcerações gastroesofágicas, diarreias, meningites, onfaloflebites e, menos frequentemente, infecções sistêmicas (PIRRONE et al., 2011; REILLY, PALMER, 1994). Em cavalos adultos, C. famata foi associada a um quadro de artrite séptica, enquanto C. albicans foi isolada de quadros de ceratites e de endometrite em éguas (RILEY et al., 1992; PUGH et al., 1986). De acordo com Aguiar et al. (2005), a espécie
21 2.2.4 Diagnóstico Laboratorial
A identificação das espécies de Candida baseia-se nas suas características fenotípicas, tais como macro e micromorfologia, além das características bioquímicas, como assimilação e fermentação de carboidratos, assimilação de nitrogênio e prova da enzima urease (BRITO, 2005).
O exame direto consiste na confecção de lâminas oriundas de amostras clínicas, com hidróxido de potássio, um clarificante que permite melhor visualização das estruturas fúngicas. A seguir realiza-se o processamento das amostras em meios de cultura clássicos, como ágar Sabouraud, ágar Sabouraud com cloranfenicol e ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol e cicloeximida (SIDRIM, ROCHA, 2004).
Em meios de cultivo, as colônias crescem bem dentro de 48 horas, com temperatura entre 25º e 37ºC (KOEHLER et al., 1999). As culturas de Candida demonstraram características macroscópicas semelhantes para todas as espécies, como colônias lisas, úmidas ou secas, de coloração branca ou creme (DE HOOG et al., 2000) (Figura 1a e 1b). Dessa forma, são necessárias técnicas que permitam melhor visualização das estruturas fúngicas, prova do microcultivo, como também testes bioquímicos, para, assim, realizar a diferenciação das espécies (KOEHLER et al., 1999). A utilização de meio cromogênico é a próxima etapa na identificação de Candida spp., o qual tem como objetivo identificar colônias mistas, além de realizar um diagnóstico presuntivo rápido (ARAÚJO et al., 2005; QUINDÓS et al., 2001). (Figura 1c).
As características micromorfológicas são observadas após realização de microcultivo em placas de Petri com ágar fubá ou ágar arroz acrescido de Tween 80 (Figura 1d). Para muitas espécies de Candida, este teste permite a identificação definitiva, uma vez que são formadas estruturas específicas, como hifas e pseudo-hifas, dispostas em padrões característicos para cada espécie (MILAN, ZAROR, 2004; DE HOOG et al., 2000).
Em muitos casos, a identificação pode não ser determinada por meio das características macro e micromorfológicas, sendo necessária a realização de testes bioquímicos, como a assimilação e fermentação de carboidratos, a assimilação de nitrogênio e a prova da enzima urease (BRITO et al., 2009b, KOEHLER et al., 1999).
Os métodos automatizados de identificação de microrganismos têm sido desenvolvidos nos últimos anos e, atualmente, estão sendo usados em diversos laboratórios de microbiologia médica. Estes sistemas permitem uma identificação precisa e mais rápida de leveduras clinicamente relevantes, melhorando a qualidade e a eficácia do cuidado ao paciente. O VITEK 2 (BioMérieux Vitek, Hazelwood, France) tem demonstrado ser um
22 instrumento confiável para a identificação de leveduras e, por isso, é o método automatizado mais comumente utilizados nos laboratórios de todo o mundo (ALBERTINE et al., 2006).
Fonte: CEMM 2012 Fonte: CEMM 2011
Fonte: CEMM 2009 Fonte: CEMM 2010
Figura 1: a) Placa contendo ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol, demonstrando o crescimento de colônias de Candida spp.
b) Tubo contendo ágar batata, mostrando crescimento de colônias de Candida spp.
c) Placa contendo ágar cromogênico, permitindo a identificação presuntiva de Candida
albicans (seta verde), C. krusei (seta preta) C. parapsilosis (seta rosa) e C. tropicalis (seta
azul).
d) Microcultivo de C. albicans em ágar fubá acrescido de Tween 80. Observa-se a presença de clamidoconídio (seta).
a b
23 2.2.5 Avaliação da sensibilidade antifúngica in vitro
Com a emergência da epidemia de AIDS na década de 1980, surgiu a necessidade do desenvolvimento de testes precisos de sensibilidade a antifúngicos in vitro, principalmente em razão do aumento no número de casos de candidíase nos indivíduos portadores dessa síndrome, os quais, muitas vezes, não eram responsivos ao tratamento antifúngico instituído (JOHNSON, 2008).
Nas últimas décadas, a incidência de micoses sistêmicas cresceu drasticamente. Isto decorre do aumento no número de indivíduos em risco, principalmente pacientes transplantados, com câncer e pacientes infectados com o vírus da imunodeficiência humana. É observado ainda um aumento no número de cepas resistentes aos derivados azólicos (SABATELLI et al., 2006). Com base nesses fatos, fica claro que o conhecimento do perfil de sensibilidade a drogas antifúngicas de determinada região é de grande importância para o estabelecimento de condutas terapêuticas e profiláticas adequadas.
Em 1985, o comitê da Área de Micologia do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), então conhecido como National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), publicou o seu primeiro relatório, no qual foram exibidos os resultados de um pequeno estudo colaborativo. Constatou-se que 20% dos laboratórios membros da instituição realizavam testes de sensibilidade a agentes antifúngicos, na maioria das vezes, com Candida spp., empregando o método de diluição em caldo, e obtinham resultados de concentração inibitória mínima (CIM) discrepantes. Assim, decidiu-se desenvolver e padronizar uma metodologia reprodutível e exequível para laboratórios de rotina. Em 1997, após extenso trabalho de padronização, foi aprovada a utilização dos métodos de microdiluição (documento M27-A) para a determinação da sensibilidade de Candida spp. a antifúngicos, especificando seus pontos de corte. Em 2002, a Norma M27-A2 padronizou as faixas de referência de CIM 24 e 48 horas, para drogas previamente estabelecidas (NCCLS, 2002). Em 2009, foi publicado o documento M27-A3, que traz como principal mudança a alteração na percentagem de leitura em relação aos derivados azólicos, onde a leitura para concentração inibitória mínima mudou de 80% de inibição para 50% em relação ao crescimento fúngico (CLSI, 2008).
O teste de microdiluição em caldo é realizado em placas acrílicas estéreis, com 96 poços em formato de U, e consiste na exposição de um inóculo definido de um determinado microorganismo a concentrações conhecidas das drogas testadas, sendo possível observar o efeito destas sobre o crescimento fúngico. A leitura final determina a menor concentração da
24 droga, capaz de inibir o crescimento do microorganismo, denominada de concentração inibitória mínima (CIM) (CLSI, 2008). (Figura 2).
Fonte: CEMM 2007
Figura 2: Microdiluição em placas de 96 poços em formato de U.
O teste de sensibilidade tem como objetivo prever uma resposta in vivo próxima daquela expressa in vitro. Vale salientar, todavia, que nas infecções fúngicas muitos fatores, além do perfil de sensibilidade in vitro, influenciam a resposta clínica, como sítio de infecção, imunidade do hospedeiro, farmacocinética da droga e tratamento correto realizado pelo paciente (HOSPENTHAL et al., 2004). Relatos na literatura, porém, indicam que os microrganismos que se mostram sensíveis na técnica de microdiluição respondem ao tratamento em 90% dos casos, e que infecções por microrganismo resistentes à resposta são de 60% (REX, PFALLER, 2002).
O grupo do qual se participa, no Ceará, com frequência, tem avaliado a sensibilidade
in vitro de cepas de Candida spp. isoladas de animais. Brito et al. (2007) desenvolveram teste
em cepas isoladas de cães e identificaram resistência a cetoconazol, fluconazol e itraconazol em dois isolados de C. albicans e três de C. tropicalis. Sidrim et al. (2010), em estudo com calopsitas, observaram fenômeno de resistência a fluconazol e itraconazol em isolados de C.
albicans. Brilhante et al. (2011) constataram o mesmo fenômeno em cepas de C. albicans
25 2.3 Histoplasmose
2.31 Aspectos Históricos
Em 1906, o patologista norte americano Samuel Taylor Darling descobriu a histoplasmose, quando estudava material de necropsia de um adulto nativo da Martinica, trabalhador da obra do canal do Panamá, que veio a óbito em decorrência de um quadro febril desconhecido. É por isso, também, denominada doença de Darling. Ao estudar o microrganismo, pensou tratar-se de um novo protozoário encapsulado que parasitava histiócitos e nomeou-o de Histoplasma capsulatum. Em 1908, Darling observou mais dois casos fatais da doença (DANIEL, BAUL,2002).
O agente etiológico, inicialmente designado como protozoário, foi considerado fungo pelo patologista brasileiro Henrique da Rocha Lima, ao examinar o material de Darling no ano de 1912. A comprovação definitiva desse fato ocorreu em 1934, quando o patologista Willian De Monbreau obteve cultura, em sua fase saprofítica, de material de paciente do primeiro caso diagnosticado em vida. Além de caracterizar o agente definitivamente como fungo, ainda determinou seu caráter dimórfico (WANKE, LAZÉRA, 2004).
Até 1945, a histoplasmose era considerada doença rara, fatal e de transmissão desconhecida. Esse conceito foi modificado depois dos trabalhos de Palmer (1945) e Christie e Peterson (1945), que demonstraram, mediante testes com histoplasmina, que a histoplasmose era uma doença benigna, cosmopolita e de transmissão respiratória (WANKE, LAZÉRA, 2004; TORRES-RODRÍGUEZ et al., 1993)
O primeiro isolamento de H. capsulatum do solo foi realizado por Emmons em 1949. Em 1951, Ajello e Zeidberg associaram o fungo a solos enriquecidos com fezes de morcegos e aves (AINSWORTH, 1986).
Em 1939, Almeida e Lacaz diagnosticaram a histoplasmose no Brasil pela primeira vez. O fungo foi isolado com base em fragmento de biopsia de uma lesão de cromoblastomicose. Dois anos depois, os mesmos autores isolaram pela segunda vez H.
capsulatum, sendo este isolado do escarro de um paciente de um sanatório para tuberculose
(WANKE, LAZÉRA, 2004).
2.3.2 Aspectos Epidemiológicos
A histoplasmose é uma micose sistêmica cosmopolita ocasionada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum var. capsulatum (FERREIRA, BORGES, 2009). A doença é endêmica em varias regiões de clima tropical e temperado, sobretudo no Continente
26 Americano (SAHEKI et al., 2008). Nos Estados Unidos, é considerada endêmica nas regiões de Ohio e Mississipi (QUIST et al., 2011). Na América do Sul, é prevalente na Venezuela, Equador, Paraguai, Uruguai, Argentina (GUIMARÃES et al., 2006), Peru (FERREIRA, BORGES, 2009) e Colômbia (MUÑOZ et a., 2010). Microfocos de infecções em humanos e animais são relatados em países com pouca ou nenhuma casuística anteriormente descrita, como Canadá, Espanha, Itália e Japão (NAVASQUÉS et al., 2011; MAVRAPOLOU et al., 2010, KOBAYASHI et al., 2009; TYRE et al., 2007).
Apesar de a doença ser predominante no Continente Americano, numerosos casos esporádicos são relatados em outras partes do mundo, provavelmente em razão do trânsito internacional entre áreas endêmicas e não endêmicas (QUIST et al., 2011).
No Brasil, antes do surgimento da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), a histoplasmose era raramente diagnosticada. Do final da década de 1980 em diante, com o advento da AIDS, foram diagnosticados centenas de casos, principalmente na forma disseminada da doença, fazendo com que essa micose passasse a ter lugar de destaque nas doenças fúngicas em humanos (FERREIRA, BORGES, 2009). Já foram relatados surtos e/ou microepidemias nos Estados de São Paulo, Rio de Janeiro, Espírito Santo, Minas Gerais, Mato Grosso (FERREIRA, BORGES, 2009), Rio Grande do Sul (SEVERO et al., 2001), Santa Catarina, Distrito Federal, Paraíba, Amazonas, Bahia (OLIVEIRA et al., 2006) e Ceará (PONTES et al., 2010; DAHER et al., 2007) (Figura 5). A taxa de prevalência, em humanos, foi avaliada, em diversas regiões do País, por intermédio do teste de reação dérmica com histoplasmina e revelou variações entre 2,6 a 93,2% (LEIMANN et al., 2005), sendo o Estado do Rio de Janeiro o responsável pelo maior número de microepidemias relatadas (AIDÉ, 2009). No Ceará, Daher et al.(2007) realizaram um estudo com 378 pacientes HIV positivos, no qual 164 dos pacientes (43%) apresentava histoplasmose disseminada associada a AIDS.
A histoplasmose pode afetar humanos de qualquer idade, sexo e raça. Pacientes com extremos de idade, no entanto, portam maior risco de desenvolver a forma aguda da doença (OLIVEIRA et al., 2011; KNOX, HAGE, 2010). Nas últimas décadas, apareceu como um patógeno oportunista em pacientes com distúrbios de imunidade celular, tais como transplantados, doentes imunodeprimidos, pacientes em corticoterapia prolongada e, principalmente, pacientes acometidos com a síndrome da imunodeficiência adquirida (CURY et al., 2001)
Além do homem, vários animais, domésticos e silvestres, podem ser acometidos pela histoplasmose. Já foram relatados casos em cães (CORDEIRO et al., 2011a; TYRE et al., 2007; FERNANDES et al., 2003), gatos (BRILHANTE et al., 2012; MAVRAPOLOU et al.,
27 2010; CARNEIRO et al., 2005), roedores e marsupiais (NAIFF et al., 1996; SILVA-VERGARA et al., 2001), equídeos (NUNES et al., 2006; RICHTER et al., 2003; JOHNSTON et al., 1995; REZABEK et al., 1993), gazelas (FARIÑAS et al., 2009), bovinos, suínos (OLIVEIRA et al., 2011) e aves (QUIST et al., 2011). Os quirópteros, além de contribuírem para criar um ambiente favorável à proliferação do fungo, também são suscetíveis à infecção (OLIVEIRA et al., 2011; WANKE & LAZÉRA, 2004). Dias et al. (2010) isolaram o fungo em morcegos da área urbana de São Paulo. As aves, normalmente, não se infectam em razão da sua alta temperatura corporal (WANKE & LAZÉRA, 2004).
Mesmo com o aparecimento de novos casos em animais no Brasil, dados epidemiológicos são escassos e sua prevalência é desconhecida. Já foram isolados, entretanto,
H. capsulatum de espécies diversas, como em animais silvestres na Amazônia (NAIFF et al.,
1996), roedores e marsupiais no Rio de Janeiro (ZANCOPÉ-OLIVEIRA, WANKE, 1986), marsupiais em Minas Gerais (SILVA-VERGARA et al., 2001), gatos em Minas Gerais (CARNEIRO et al., 2005) e no Ceará (BRILHANTE et al., 2012). (Figura 3).
Figura 3: Distribuição geográfica do Histoplasma capsulatum no Brasil. Estados marcados em vermelho demonstraram isolamento do fungo em animais e os Estados realçados em preto relatam casos clínicos em humanos. Fonte: Bittencourt 2012.
A identificação da doença em animais domésticos e silvestres, naturalmente infectados, é uma ferramenta importante para monitorar a ocorrência do H. capsulatum em um determinado ambiente, já que os animais podem atuar como marcadores epidemiológicos (animais sentinelas) para a presença do microrganismo naquela região e indicar a existência
28 de fontes comuns de infecção aos homens e animais (CANTEROS et al., 2010; ZANCOPÉ-OLIVEIRA, WANKE, 1986).
2.3.3 Biologia do fungo Histoplasma capsulatum
Histoplasma capsulatum é a forma anamórfica do Ajellomyces capsulatum que
pertence ao reino Fungi, filo Ascomycota, classe Eurotiomycetes, ordem Onygenales e família Ajellomycetaceae (NCBI, Taxonomy, 2011).
O H. capsulatum é um fungo dimórfico, pois apresenta duas formas morfológicas que, para sua modificação, dependem de fatores nutricionais e da temperatura (OLIVEIRA et al., 2011). No ambiente, o fungo cresce na sua forma filamentosa e, uma vez no hospedeiro, ocorre a conversão para a forma de levedura (MUÑOZ et al., 2010).
A forma filamentosa cresce em temperaturas abaixo de 35ºC, em meios de cultura adequados, ou no solo (GUIMARÃES et al., 2006). Macroscopicamente se caracterizam por colônias de coloração branco-algodonosa, e microscopicamente são observadas hifas hialinas septadas com 1-2 µm de diâmetro, além das suas estruturas de reprodução assexuada, os microconídios e macroconídios tuberculados. Estes são largos com parede espessa, cobertos por projeções espiculadas, com 7 a 15 µm de diâmetro. Os microconídios são ovais e pequenos, com 2 a 5 µm de diâmetro, e se caracterizam por ser a forma infectante do fungo (OLIVEIRA et al., 2011; FERREIRA, BORGES, 2009) (Figura 6). No hospedeiro ou em meios de cultura adequados a 37 ºC, o H. capsulatum exibe-se como pequenas leveduras ovaladas com 3 a 5 µm de diâmetro e podem ser visualizadas no interior dos macrófagos (FERREIRA, BORGES, 2009).
O H. capsulatum é um saprófito de solos com alto teor de nitrogênio, encontrado em áreas contaminadas com fezes de morcegos e aves (KNOX, HAGE, 2010; CURY et al., 2001), onde é encontrado na forma de micélio. Geralmente, o microrganismo pode ser isolado em amostras de solos de ambiente abrigados, como cavernas, construções abandonadas, galinheiros e árvores (KAUFFMAN, 2009; WANKE, LAZÉRA, 2004). Andreu & Machin (1992) conseguiram, entretanto, isolar o microorganismo do solo em Cuba, em áreas abertas com incidência direta do sol, sítio considerado improvável por vários autores. Tais dados suscitam importantes questionamentos epidemiológicos sobre a procedência de casos ligados a origens desconhecidas, como os provenientes de grandes cidades. A profundidade em que o
29 superficial, até 30 cm, favorece o crescimento do fungo, possivelmente devido à maior aeração (KAUFFMAN, 2009).
Fonte: CEMM 2011
Figura 4: a) Macromorfologia de Histoplasma capsulatum em sua forma micelial – cultivo em ágar batata dextrose a 28ºC (20 dias), mostrando colônias brancas e algodonosas. b) Micromorfologia de H. capsulatum em sua forma micelial a 28ºC, apresentando hifas hialinas, finas e septadas com macroconídios tuberculados, característicos do fungo (seta). Exame direto da colônia com lactofenol azul algodão.
2.3.4 Patogenia e Aspectos clínicos
A infecção ocorre por meio da inalação de microconídios presentes no solo contaminado. Estes, ao atingirem os alvéolos pulmonares, são fagocitados pelos macrófagos alveolares e em seu interior convertem para a forma parasitária leveduriforme, ocasionando pneumonite focal. Mediante a circulação linfática, chegam aos linfonodos mediastinais formando o complexo pulmonar ganglionário semelhante ao complexo de Ghon na tuberculose. Desde esse estágio, o fungo pode se disseminar por via hematógena para diversos órgãos (KNOX, HAGE, 2010; AIDÉ, 2009; GUIMARÃES et al., 2006; WANKE, LAZÉRA, 2004). Essa fase acontece antes da imunidade específica se desenvolver. Após duas a três semanas, ocorre resposta celular mediada por células T que, por meio de várias citocinas, irão ativar os macrófagos, os quais adquirem capacidade de lisar as leveduras. Se o indivíduo for imunocompetente, esse tipo de resposta imune ocasiona a cura da infecção primária; entretanto, se a imunidade celular do individuo for deficiente, os microrganismos continuam viáveis no interior dos macrófagos e causam infecção progressiva (KNOX, HAGE, 2010; FERREIRA, BORGES, 2009; KAUFFMAN, 2009).
a b
30 Apesar de a transmissão por via respiratória ser a mais frequente, existem relatos que sugerem infecção oral em animais. Kerl (2003) fez essa observação em virtude de muitos cães portarem somente sintomatologia gastrointestinal, sem nenhum envolvimento no trato respiratório. Nunes et al. (2006) examinaram uma égua com quadro clínico de desconforto abdominal com perda de peso progressiva durante duas semanas. Após diversos exames e tratamento, o animal veio a óbito. Com base nos achados de necropsia e nos exames realizados no material coletado, diagnosticaram histoplasmose. A égua não revelou nenhum sinal de comprometimento de outros órgãos como pulmões ou rins. Baseados em relatos de outros autores, Johnston et al. (1995) e Rezabek et al. (1993), e nos seus achados clínicos e laboratoriais, os autores sugeriram que a infecção ocorreu pela via oral.
Em humanos o quadro clínico pode variar desde infecções assintomáticas até quadros graves disseminados (FERREIRA, BORGES 2009). A intensidade dessas manifestações clínicas está relacionada com a quantidade de microconídeos inalados, virulência da cepa e a imunidade prévia do indivíduo (MUÑOS et al., 2010; KAUFFMAN, 2009; AIDÉ, 2009; CURY et al., 2001).
A sintomatologia clínica em animais é variável de acordo com a espécie acometida. Em cães e gatos, espécies mais comumente infectadas, os sinais clínicos variam de inaparentes à doença, aguda ou crônica, com resposta granulomatosa no trato respiratório e a forma disseminada (CORDEIRO et al., 2011a; BRÖMEL, SYKES, 2005), como também lesões granulomatosas cutâneas (CARNEIRO et al., 2005). A forma disseminada afeta fígado, baço, trato gastrointestinal, ossos e medula óssea, olhos e pele (BRÖMEL, SYKES, 2005). Os sintomas incluem inapetência, perda de peso, diarreia, tosse, dispneia, febre e claudicação (QUIST et al., 2011).
Os relatos de casos em equinos são escassos na literatura, entretanto, os sinais descritos incluem dispneia, perda de peso, diarreia, colite granulomatosa, placentite, aborto e ceratite. O fungo foi identificado em diversos órgãos e tecidos como pulmão, fígado, baço, rim, nódulos linfáticos, intestino delgado, ceco, cólon, medula óssea, cérebro, olhos, placenta e tecidos fetais (NUNES et al., 2006; RICHTER et al., 2003; JOHNSTON et al., 1995; REZABEK et al., 1993). Johnston et al. (1995) relataram o único caso de histoplasmose disseminada em equino até o momento.
31 2.3.5 Diagnóstico
O diagnóstico clínico da histoplasmose é baseado na sintomatologia clínica, exames radiológicos e aspectos epidemiológicos. O diagnóstico micológico se baseia na identificação do agente em materiais biológicos, cultura do fungo em meios específicos e exame histopatológico (AIDÉ, 2009; LEIMANN et al., 2005).
Para o exame direto em lâmina, pode-se utilizar diversas amostras clínicas como esfregaço de medula óssea, sangue periférico, exsudato de lesões cutâneas ou mucosas, escarro, fluido de lavado broncoalveolar e líquor, as quais são tratadas a fresco com hidróxido de potássio (KOH) a 10% para melhor visualização (MUÑOZ et al., 2010; FERREIRA, BORGES, 2009). Essa técnica, entretanto, tem baixo valor diagnóstico em decorrência da localização intracelular do microrganismo e seu tamanho pequeno, o que dificulta sua visualização (MUÑOZ et al., 2010; AIDÉ, 2009).
A utilização de corantes nas amostras propicia um aumento na qualidade da visualização. Para tanto, podem ser empregados corantes especiais, como prata metenamina Grocott (GMS), ácido periódico de Schiff (PAS), além do corante hematológico Giemsa (OLIVEIRA et al., 2011; GUIMARÃES et al., 2006). A coloração permite a visualização das leveduras localizadas ao redor e no interior dos macrófagos (AIDÉ, 2009). Utilizando o GMS, o H. capsulatum é visualizado como pequenas leveduras de coloração marrom-escura em virtude da precipitação dos íons de prata (MUÑOZ et al., 2010); com PAS, apresentam-se com a coloração vermelha; e com Giemsa, aparecem como massa cromática polar azul em forma de meia lua (FERREIRA, BORGES, 2009) (Figura 7). Leimann et al. (2005) consideram a coloração com GMS a melhor técnica, pois permite um melhor contraste, além de corar células fúngicas refratárias ao PAS.
Os métodos baseados em colorações contêm sensibilidade inferior a 50% e ampla variabilidade, o que depende da forma clínica da doença, bem como da experiência do patologista. Portanto, para visualização do fungo na fase de levedura com base em material biológico, é necessária atenção na identificação em virtude da similaridade da levedura de H.
capsulatum com outros patógenos, como Candida glabrata, Penicillium marneffei, Pneumocystis (carinii) jiroveci, Toxoplasma gondii, Leishmania sp. e Cryptococcus neoformans (GUIMARÃES et al., 2006), Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis (LEIMANN et al., 2005).
Exames histopatológicos são usados frequentemente para o diagnóstico de histoplasmose. Amostras de sangue periférico podem demonstrar microrganismos intracelulares em macrófagos e monócitos. Biopsias de medula óssea, contudo, podem ser o
32 método mais rápido de definir um diagnóstico (OLIVEIRA et al., 2011). Aidé (2009) relata diferenças histológicas encontradas entre pacientes imunocompetentes e imunodeprimidos. O estudo histopatológico de várias espécies de tecidos, como pulmão, gânglios, fígado e medula óssea, mostra a presença de granulomas, em organismos imunologicamente competentes ao passo que, nos imunodeprimidos, é frequente a presença de granuloma frouxo, agregados linfo-histiocitários ou apenas infiltrado mononuclear.
Fonte: Kauffman, 2009. Fonte: Marques, 2009.
Figura 5: a) Biopsia de tecido pulmonar corado com prata metenamina Grocott, demonstrando leveduras ovais típicas do Histoplasma capsulatum. b) Aspecto microscópico de H.
capsulatum corado pelo Giemsa com base em creme leucocitário: visualização de células
leveduriformes intracelulares (seta).
A cultura é considerada padrão ouro no diagnóstico da histoplasmose (OLIVEIRA et al., 2011). Para tanto, é necessário que o laboratório esteja equipado com cabine de biossegurança de nível 3, além de equipe especializada, visto que a manipulação do fungo pode liberar os microconídios no ambiente (MUÑOZ et al., 2010).
Podem ser utilizados vários meio de cultura para o cultivo do H. capsulatum como ágar Sabouraud e ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol e cicloeximida (Mycosel®) (AIDÉ, 2009). A identificação do fungo baseia-se nas características macro e microscópicas das colônias. Após um período de incubação de seis a 12 semanas, a 25ºC, as colônias fúngicas se mostram, inicialmente, glabras de coloração branca a bege e, com o tempo, tornam-se filamentosas, algodoadas e amarronzadas. Microscopicamente, caracterizam-se por hifas hialinas delgadas e septadas com micro e macroconídios em diferentes fases de desenvolvimento (OLIVEIRA et al., 2011; GUIMARÃES et al., 2006). Os macroconídios são
33 estruturas características do H. capsulatum, sendo a base da identificação de gênero e espécie (MUÑOZ et al., 2010).
Para a confirmação do diagnóstico da cultura, é necessária a conversão do H.
capsulatum para sua forma leveduriforme (LEIMANN et al., 2005). Podem ser utilizados
vários meios, como ágar sangue, ágar infusão-cérebro-coração (BHI), acrescido de cisteína (OLIVEIRA et al., 2011; GUIMARÃES et al., 2006), e também ágar batata acrescido de cloranfenicol (BURTELOW et al., 2009). A cultura deve ser incubada a temperatura entre 35-37ºC. Após a conversão, observam-se colônias glabras de coloração branco-amareladas que microscopicamente se mostam como leveduras ovais de paredes espessas (OLIVEIRA et al., 2011). O H. capsulatum, porém, não se converte facilmente e depende de condições nutricionais especiais, temperatura adequada, além das características fisiológicas da própria cepa (GUIMARÃES et al., 2006).
A cultura traz limitações relacionadas à forma clínica da doença, especificamente em casos subagudos, agudos e de sintomatologia clínica leve; e também relacionada ao tempo necessário para identificação do agente etiológico, fato que pode ocasionar atraso na introdução da medida terapêutica específica e piorar o quadro clínico (OLIVEIRA et al., 2011; MUÑOZ et al., 2010; GUIMARÃES et al., 2006).
Trabalhos de revisão recentes relatam muitos casos de histoplasmose em diferentes regiões no Brasil, verificando-se o aumento do número de casos humanos da doença. Isso decorre do maior conhecimento dos médicos em relação aos aspectos clínicos e epidemiológicos da micose e também dos últimos avanços no diagnóstico laboratorial (WANKE, LAZÉRA, 2004). Apesar disso, o esforço em elucidar aspectos epidemiológicos desta doença tem sua importância no aumento do número de pacientes imunodeprimidos que contraem a enfermidade a cada dia no Brasil.
2.4 Coccidioidomicose
2.4.1 Aspectos históricos
O primeiro caso de coccidioidomicose foi descrito na Argentina, em 1892, por Alejandro Posadas, residente de Medicina, ao examinar Domingo Escurra, de 36 anos, o qual portava lesões cutâneas crônicas. Ao examinar biopsias das lesões, observou estruturas semelhantes a protozoários (NEGRONI 2008). Em 1894, Thome e Rixford relataram os dois primeiros casos nos Estados Unidos em emigrantes dos Açores que trabalhavam no Vale de
34 São Joaquim. Em 1896, Rixford e Gilchrist, após exame das biopsias desses pacientes, detectaram semelhança com o agente encontrado por Posadas e o identificaram como um protozoário da ordem Coccidia, Classe Sporozoa denominado Coccidioides immitis (HIRSHMANN, 2007).
Em 1900, Ophüls e Moffitt descobriram a natureza fúngica do agente, quando examinaram biopsias das lesões e pus, procedente do terceiro paciente norte-americano. Após observarem a regularidade do aparecimento do “mofo branco” nos cultivos, realizaram inoculação experimental desses cultivos em cobaias e, assim, demonstraram que o agente era um fungo, e ainda descreveram seu caráter dimórfico. Cinco anos depois, Ophüls definiu a via de infecção da doença como sendo a via respiratória (DEUS FILHO, 2009; NEGRONI 2008).
Até 1929, a doença era conhecida somente na forma disseminada, com caráter raro e fatal (COX, MAGEE, 2004). Este fato mudou quando o estudante de Medicina Harold Chope, em experimentos no laboratório de Ernest Dickson, contaminou-se acidentalmente com o fungo, desenvolvendo um quadro de pneumonia com eritema nodoso, do qual de recuperou plenamente mudando o status da doença para benigna e autolimitada (AMPEL, 2009; HIRSHMANN, 2007).
Em 1932, Steward e Meyer, isolaram o Coccidioides immitis de amostras de solo coletadas próximo a uma fazenda em que haviam morrido quatro filipinos acometidos de coccidioidomicose grave caracterizando sua natureza geofílica (NEGRONI, 2008).
Em 1937, Dickson revelou outros casos da forma benigna da doença, caracterizada por sintomas pulmonares agudos e eritema nodoso, semelhantes ao quadro de Chope, denominado Febre do Vale. O termo coccidioidomicose foi então proposto por Dickson para todas as formas infecciosas causadas por Coccidioides immitis (AMPEL, 2009; COX, MAGEE, 2004). Por volta de 1940, Smith et al. realizaram estudo sistemático sobre a epidemiologia da coccidioidomicose no Vale do São Joaquim, mediante testes intradérmicos com coccidioidina e observação dos pacientes, no qual estabeleceram o período de incubação da infecção, sua incidência estacional e comprovaram a técnica de prova cutânea. Continuaram seus estudos durante a Segunda Guerra Mundial, demonstrando o valor prognóstico da intradermorreação, como também características clínicas da enfermidade e a predisposição racial dos descendentes de africanos e filipinos a apresentarem formas mais graves da doença (NEGRONI, 2008).
Em meados da década de 1940, foram relatados casos da doença também em animais domésticos e silvestres, principalmente em cães (SMITH et al., 1948). Na década de 1950, foi observado o primeiro caso de coccidioidomicose cutânea em um embalsamador. Estudos
35 sobre a evolução clínica e os aspectos sobre a aquisição da doença permitiram que pesquisadores afirmassem que a forma cutânea da doença seria rara (ESPINEL-INGROFF, 1996).
Até o final da década de 1970, o Brasil era considerado área indene para a coccidioidomicose. O primeiro caso da doença no País foi descrito por Gomes et al. (1978) em paciente natural de Pirapiranga, região do semiárido do Estado da Bahia. Um ano depois, Vianna et al. (1979) descreveram o segundo caso autóctone da doença em paciente originário da cidade de Floriano, no Estado do Piauí (NEGRONI, 2008).
O primeiro surto epidêmico de coccidioidomicose ocorreu em 1991, no Município de Oeiras, Estado do Piauí, onde três indivíduos e oito cães demonstraram quadro respiratório agudo após participarem de uma caçada a tatus (WANKE et al., 1999). Os autores descreveram o primeiro relato do acometimento de cães por essa enfermidade no País, além da primeira investigação sorológica em animais, bem como o primeiro isolamento de C.
immitis de amostras de solo no Brasil. Em 1995, foi relatado o segundo surto de
coccidioidomicose, ocorrido no Município de Aiuaba, região sudoeste do Estado do Ceará, e acometeu quatro homens e dois cães após caça a tatus (SILVA et al., 1997; SIDRIM et al., 1997). Apenas em 1998, após descrição destes surtos, o Brasil foi incluído no mapa de distribuição geográfica da coccidioidomicose (PAPPAGIANIS, 1998).
No Estado do Ceará, o primeiro caso da doença foi descrito em 1995, em um paciente natural de Jaguaribara (KUHL et al., 1995). Cordeiro et al. (2010) afirmaram que, até o ano de 2010, foram diagnosticados 19 casos da doença no Estado, além do caso descrito por Kuhl et al. (1995).
Em 2000, foi publicado estudo em tatus, realizado no Estado do Piauí, identificando-se a contaminação dos mesmos por C. immitis, hoje denominado C. posadasii nesta região (EULÁLIO et al., 2000). Em 2012, Cordeiro et al. relataram infecção natural em morcegos por C. posadasii, no Estado do Ceará.
2.4.2 Aspectos epidemiológicos
A coccidioidomicose é uma infecção sistêmica exclusiva do Continente Americano, entre as latitudes 40ºN e 40ºS, ocasionada por dois fungos dimórficos do gênero Coccidioides:
C. immitis e C. posadasii (AMPEL, 2009). O C. immitis é isolado no Vale do São Joaquim na
Califórnia, Estados Unidos enquanto o C. posadasii prevalece nas outras áreas endêmicas do Continente Americano, desde o sul dos Estados Unidos até a Argentina (DEUS FILHO, 2009,
36 PARISH & BLAIR, 2008), incluindo Honduras, Guatemala, Colômbia, Venezuela, Bolívia, Paraguai e Brasil (CORDEIRO et al., 2011b; NEGRONI, 2008).
Embora os primeiros casos brasileiros tenham sido descobertos no final da década de 1970, o Brasil só foi incluído no mapa da distribuição geográfica da doença em 1998, após relato dos primeiros surtos da forma pulmonar aguda nos Estados do Piauí e Ceará (PAPPAGIANIS, 1998). Atualmente, a coccidioidomicose é considerada endêmica nos Estados da Bahia, Piauí, Maranhão e Ceará (TOGASHI et al., 2009). No Estado do Ceará já foram relatados casos em diversas cidades, como Aiuaba, Arneiroz, Parambu, Jaguaribe, Solonópole, Independência, Boa Viagem, Catunda, Santa Quitéria e Sobral (CORDEIRO et al., 2010). (Figura 8).
Legenda:
Jaguaribe Independência Sonolópole Boa viagem Aiuaba Catunda Arneiroz Santa Quitéria Parambu Sobral
Figura 6: Distribuição geográfica do Coccidioides posadasii no Nordeste do Brasil. Estados marcados em vermelho são endêmicos para coccidioidomicose. Áreas coloridas correspondem a municípios do Estado do Ceará com casos confirmados da doença. Fonte: Bittencourt 2012.
No Nordeste do Brasil, a caça a tatus (Dasypus novemcinctus) é uma importante atividade de risco associada à doença, já que nessa região essa é uma atividade recreativa. Em razão da perseguição dos caçadores, o tatu penetra na sua toca levando a escavação do solo até a sua captura. Com isso, os humanos e os cães ficam suscetíveis a inalação maciça dos artroconídeos (COSTA et al., 2001). Eulálio et al. (2000) relataram a infecção natural de tatus
37 no Piauí, sendo esse o único relato cientifico do gênero. Os estudos, contudo, não revelam claramente a importância do tatu na história natural da doença, definindo se ele realmente serve de reservatório ou é apenas mais um dos animais suscetíveis à infecção (CORDEIRO et al., 2011b).
A coccidioidomicose acomete o homem e uma grande variedade de animais, como bovinos, ovinos, equinos, caninos, felinos, roedores, suínos, antas, lhamas, primatas, golfinho, leão-marinho (AJITHDOSS et al., 2011; GAIDICI, SAUBOLLE, 2009; SHUBITZ, 2007), tatu (EULÁLIO et al., 2000) e morcegos (CORDEIRO et al., 2012). Embora seja largo o espectro de animais que podem ser infectados, o cão parece ser o hospedeiro preferencial após os humanos (GRAUPMANN-KUZMA et al., 2008). Apesar da faltas de dados epidemiológicos precisos sobre a incidência da doença em cães, estima-se, que em áreas endêmicas, esta incidência seja similar à dos humanos (CORDEIRO et al., 2011b).
Por não ser uma doença de notificação obrigatória suas reais prevalência e incidência não podem ser estabelecidas com precisão. É muito provável que seja subdiagnosticada e que a sua distribuição geográfica no Brasil se estenda a outros estados nordestinos (DEUS FILHO, 2009).
As duas espécies são consideradas agentes de bioterrorismo, assim agentes de biossegurança nível 3, sendo o único grupo fúngico pertencente a Select Agent List of the
Departament of Health and Human Service (DICAUDO, 2006).
2.4.2 Biologia do fungo Coccidioides sp.
Taxonomicamente, as espécies do gênero Coccidioides pertencem ao reino Fungi, filo Ascomycota, classe Eurotiomycetes, ordem Onygenales, família Onygenaceae, sendo representado por duas espécies, Coccidioides immitis e C. posadasii. As espécies guardam características morfológicas muito semelhantes, contudo exibem polimorfismos moleculares e preferências ecológicas distintas (FISHER et al., 2002). Apesar das diferenças genéticas entre as espécies, ambas causam infecção, em humanos e animais, e não revelam diferença quanto às manifestações clínicas e resposta imune do hospedeiro (AMPEL, 2009).
O gênero Coccidioides pode apresentar-se em duas fases - saprofítica e parasitária. Em condição saprofítica, encontra-se sob a forma filamentosa no solo à temperatura de 25-30°C ou cultivado em meio de cultura em baixa temperatura, sendo esta a forma infectante do ciclo biológico dos fungos (SABOULLE et al., 2007; COX, MAGEE, 2004). Na macromorfologia, as espécies são caracterizadas por um micélio vegetativo com colônias esbranquiçadas de
