PROPOSTA DE UM ROTEIRO PRÁTICO PARA A VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Pinto, T.J.A., Ferrarini, M., Gatti, R.M.
Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos, Cosméticos e Domisanitário, Produtos Afins e as Respectivas Matérias-Primas – CONFAR Departamento de Farmácia – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – São Paulo –
Brasil INTRODUÇÃO
Até algum tempo atrás, dava-se uma grande importância ao desenvolvimento dos métodos analíticos, sendo que a real comprovação de sua aplicabilidade era deixada de lado, ou testada apenas superficialmente. Os resultados provenientes destes métodos eram difíceis de serem reproduzidos fora dos laboratórios de origem e muito tempo era gasto na adequação de métodos que se provariam ser inaplicáveis em amostras reais. (Causon, 1997)
Hoje reconhece-se que a validação dos métodos analíticos consiste em uma etapa importante na obtenção de resultados analíticos confiáveis. Entretanto, o desconhecimento da razão desta importância, do momento da validação e, ainda, exatamente do que deve ser feito, parece ainda persistir entre muitos químicos analíticos. (Eurachem, 1998)
Uma grande quantidade de material referente à validação de métodos analíticos já se encontra disponível porém, de maneira geral, ou referem-se à um método específico, ou apresentam apenas conceitos gerais, sendo de utilidade limitada no desenvolvimento de uma rotina de validação.
A proposta deste trabalho é a de sugerir alguns parâmetros básicos, a serem seguidos durante a validação de métodos analíticos, o mecanismo para obte-los e valores para a aceitação dos métodos.
A NECESSIDADE DA VALIDAÇÃO:
Validação de um método analítico é o processo pelo qual se estabelece, através de estudos laboratoriais, que as características de performance de um método atende aos requisitos das aplicações analíticas para as quais aquele método se destina. (USP24 - <1225>)
O método analítico deve ser validado sempre que seja necessário verificar a adequação de sua performance, objetivando soluções para circunstâncias como: (Eurachem, 1998)
• No desenvolvimento de um novo método analítico para uma situação específica;
• Quando da revisão de um método analítico específico, para incorporar melhorias ou estende-lo a novas aplicações;
• Quando aspectos do controle de qualidade indicarem que um método anteriormente estabelecido tornou-se obsoleto, apresentando eficácia questionável;
• Quando um método previamente estabelecido passa a ter escopo de abrangência mais amplo, envolvendo diferentes laboratórios, além de analistas e instrumentos distintos;
• Para demonstrar a equivalência entre duas metodologias analíticas.
É importante ressaltar que a validade dos resultados obtidos no processo de validação irá depender das condições do ambiente laboratorial, do envolvimento de pessoal qualificado, treinado e motivado, do uso de equipamentos calibrados ou qualificados e da utilização de materiais, soluções e reagentes analíticos de procedência confiável, devidamente preparados, padrões e substâncias químicas de referência compatíveis e rastreáveis. Deste modo que a validação do método analítico se inicia pela qualificação dos equipamentos e dos operadores, pela calibração de vidrarias e outros equipamentos de medição e pelos cuidados na aquisição anteriormente à execução da técnica sob consideração.
A calibração deverá sempre ser realizada por pessoal ou empresas especializadas. Embora instrumentos de medição mais simples (pipetas, termômetros, potenciômetros) sejam passíveis de serem calibrados o mesmo não ocorre para sistemas analíticos maiores (cromatógrafos, dissolutores, analisadores automáticos), devido à sua complexidade e número de componentes, neste caso, recomenda-se a verificação do funcionamento dos seus componentes individuais, seguida pela verificação da performance de funcionamento do sistema como um todo, esta pode ser realizada com o uso de padrões apropriados para essa finalidade.1
VALIDAÇÃO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO
No curso de uma análise, raras são as ocasiões em que temos o analito livre de uma matriz, da qual ele deva ser extraído. Seja em uma formulação farmacêutica, em um extrato vegetal ou em um fluído biológico, sempre haverá uma matriz, mais ou menos complexa, que poderá interferir, em graus distintos, nas etapas subsequentes da análise.
A validação do processo extrativo é intrínseco à determinação de precisão e exatidão do método, entretanto aceitável mas nada impede que a extração seja validada independentemente, de forma complementar, como seria o caso da utilização de um método já validado em outro tipo de amostra.
PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
Os seguintes parâmetros podem fazer parte da validação do processo analítico: (USP 24) • Exatidão • Precisão • Especificidade 1
É interessante ressaltar a importância da adoção de Boas Prática Laboratoriais (Garfield), assim como do ISO TEC 170025 como mecanismo de orientação das condições gerais a serem adotadas no laboratório
• Limite de Detecção • Limite de Quantificação • Linearidade e Faixa • Robustez
Antes de se iniciar a validação, deve-se determinar quais destes parâmetros serão estudados e quais serão os critérios de aceitação do método para cada um deles. Adicionalmente, não contemplado na USP XXIV, há que mencionar-se a escolha de quais parâmetros deverão fazer parte da validação e até onde eles deverão ser testados irá dependendo da aplicação do método. Exemplificando, não faz-se necessária a inclusão da linearidade do aparelho em toda sua faixa de aplicação, em um método para a análise qualitativa de traços.(Labcompliance, 2001)
SEQUÊNCIA DO PROCESSO DE VALIDAÇÃO
Não existe uma sequência oficial para a execução da validação porém, existe uma sequência que pode ser considerada lógica, em vista da complexidade crescente inerente às etapas. A primeira etapa é a elaboração de um Plano Mestre de Validação (“Validation Master Plan”), que irá guiar o trabalho durante as etapas seguintes, as quais incluem:
1) SELETIVIDADE/ESPECIFICIDADE
Especificidade é a habilidade do método em avaliar, inequivocamente, o analito, na presença de componentes que poderão estar presentes durante a análise, como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz. (USP 24)
Nesta etapa se estará verificando se o método não é afetado por outras substâncias que poderão estar presentes durante o curso da análise, sejam advindas de excipientes ativos contaminados ou degradados, residual de produtos de limpeza ou aqueles detectáveis no estudo de estabilidade, natural ou sob estresse. Algum exemplos de interferentes estão listados na tabela 1. O grau de especificidade, ou melhor seletividade, irá depender da finalidade do ensaio. Em um ensaio qualitativo, um resultado positivo na presença do item sob análise, associado à resultados negativos em sua ausência, em uma amostra que contenha interferentes comuns seria suficientes para aprovar este método.
No entanto, em um método quantitativo deverá ser comprovado que o item sob análise é quantificado independente dos eventuais interferentes presentes. O método mais comum para a execução deste ensaio é adicionar estes interferentes a uma amostra (matriz) que contenha o item sob análise e verificar o efeito. Uma pesquisa sobre sua rota sintética poderá permitir a visualização das impurezas a ele relacionadas. Neste caso o maior problema poderá ser a obtenção destes compostos, talvez por síntese laboratorial ou cedidas pelo produtor da matéria-prima.
De forma semelhante, os produtos de degradação e metabólitos devem ser pesquisados na literatura, na falta de informações a esse respeito, pode-se
promover artificialmente a degradação da substância analisada, expondo-o a condições de estresse. Estas condições podem incluir:
• Fotodegradação e termodegradação: a exposição de uma solução do analito à temperatura, na presença de luz pode acelerar a formação de produtos de degradação. Uma primeira abordagem seria a exposição por uma hora a 100°C na presença de luz.
• Hidrólise ácida: ácido clorídrico 1N por 2 horas • Hidrólise alcalina: hidróxido de sódio 1N por 2 horas • Oxidação: peróxido de hidrogênio 30% por 2 horas • Termólise: fusão do analito
Deve sempre ser contemplada a etapa de neutralização do agente de degradação antes das etapas subsequentes. Isso é de especial importância no caso da metodologia de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ou HPLC em inglês), uma vez que a maior parte das colunas é sensível à valores extremos de pH ou à agentes oxidantes.
2) LINEARIDADE
O teste da linearidade visa, principalmente, estabelecer a faixa (“range”) em que o método poderá ser utilizado. Embora regressões não lineares possam ser utilizadas para o cálculo do resultado final do ensaio, é recomendável permanecer na sua parte linear.
Brittain (1998) sugere trabalhar com concentrações de 50, 75, 100, 125 e 150 % em relação ao valor teórico. A Farmacopéia Americana, em seu capítulo geral <1225>, estabelece diferentes faixas, conforme a finalidade para qual o método será utilizado:
• Doseamento: 80 a 120% do valor teórico
• Determinação de Impurezas: 50 a 120% da especificação • Uniformidade de conteúdo: 70 a 130% do valor teórico
• Ensaio de Dissolução: +/- 20% sobre a faixa de dissolução especificada. Por exemplo, em um comprimido de liberação controlada, que deva liberar 20 % na primeira hora e 90% após 24 horas, deveria se validar o método para uma faixa de 0 a 110% do valor teórico.
Exceto neste último caso, relativamente raro, a validação do método em um intervalo de 50 a 130% do valor teórico permitiria que o ensaio fosse utilizado para todos os testes, evitando-se assim, a necessidade de se executar diversas validações para um mesmo produto. É importante ressaltar que, neste caso, todas as condições deverão ser mantidas, uma vez que uma mudança no solvente, por exemplo, poderá alterar a resposta do teste. Caso isso não seja possível, deve-se validar a etapa que difere das condições de validação, para substanciar que essa diferença não irá alterar o resultado analítico.
Existem diversos métodos para a verificação da linearidade, desde a simples aproximação visual até métodos estatísticos complexos. O mais empregado é, sem dúvida, a regressão linear pelo método dos mínimas quadrados e o cálculo do coeficiente de correlação.
No entanto, apenas o coeficiente de correlação pode não ser um indicador preciso da linearidade, deve-se verificar visualmente o ajuste da reta e a correlação dos resíduos. (Castillo, M.A.)
Pode-se considerar satisfatório curvas com R2 ≥ 0,998, desde que se verifique, visualmente, uma adequação satisfatória e a correlação de resíduos não demonstre desvio significativo. Pode-se verificar na figura 1 a importância da análise visual do ajuste, nesta simulação, pode-se verificar que abaixo do ponto 6, a resposta deixa de ser linear, no entanto, se traçarmos a retas dos mínimos quadrados (A), o coeficiente de correlação é 0,9982. A reta correta seria a reta (B), que considera apenas o intervalo linear.
Castillo, M.A.(2001) considera que a porção inferior da faixa linear coincide com o limite de quantificação e a superior é imposta por fatores instrumentais. 3) EFEITO DA MATRIZ
Uma vez determinado que o método apresenta linearidade na faixa de trabalho escolhida, é necessário determinar se a matriz onde o analito se encontra irá influir na linearidade.
A matriz pode não influir sobre a linearidade, porém pode produzir um efeito somatório ou multiplicativo (fig. 2) ou ainda uma associação destes efeitos. Idealmente a matriz não deveria influenciar a linearidade, porém nem sempre isso acontece, caso haja influência da matriz, pode-se optar pelo desenvolvimento de uma nova metodologia ou por adaptar o método para o uso de um branco que contenha a matriz sem substância analisada, o que nem sempre é aplicável.
4) LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO
Estes limites referem-se, respectivamente, à menor quantidade do item a ser analisado capaz de ser detectada com satisfatório grau de certeza e à menor quantidade deste item capaz de ser quantitativamente determinada com graus de precisão e exatidão aceitáveis.
Uma vez que o método passou pela etapa de linearidade, pode ser considerado suficientemente sensível para detectar o analito na menor concentração na faixa linear. Desta forma, determinar o limite de detecção e quantificação consiste em um refino justificável apenas em casos mais específicos.
5) PRECISÃO/EXATIDÃO
A adequada recuperação da substância analisada, em uma amostra simulada, irá definir qual é a exatidão do método. Para a realização desta fase da validação há que se dispor de uma matriz que represente, da forma mais fiel possível, as amostras que conterão a substancia analisada.
Em na área farmacêutica isso é totalmente factível, tendo em vista a disponibilidade de um placebo do produto. Em outros métodos, a obtenção desta matriz pode ser inviável, neste caso, deve-se pelo menos, buscar uma matriz que se aproxime ao máximo do que encontrará na prática.
A definição da exatidão deve, pelo menos, incluir um ponto de baixa concentração, um na concentração média esperada e um ponto de alta concentração. O ICH, por exemplo, recomenda que este teste seja realizado
com, no mínimo, nove determinações (USP 24), desta forma cada um destes pontos, alta, média e baixa concentração, devem ser estudados em triplicata. Todas as amostras devem ser tratadas independentemente e serem submetidas ao conjunto das etapas analíticas, do início ao final do ensaio.
Com o resultado deste ensaio estar-se-á apto a calcular a precisão do método, através do calculo de um parâmetro que nos forneça o grau de dispersão entre os resultados de uma mesma amostra. O cálculo do desvio padrão relativo (DPR) é um bom indicador do grau de dispersão dos resultados e oferece valores absolutos, que permitem análise independentemente das médias. A dispersão dos resultados irá depender, em grande parte, da concentração da substância analisada na amostra, da sensibilidade do método e do número de etapas preparatórias necessárias antes da análise. Pode-se aceitar valores de RSD entre 1 e 2 % para métodos que envolvam apenas pesagem e dissolução da amostra. Métodos mais complexos, que exijam operações de extração complexas, derivação, ou na análise de traços, estes valores podem chegar a 5 ou 10% (Castillo, M.A.,2001). Este fator reforça a importância de trabalhar com placebo incorporado, de forma a simular todo o processo farmacotécnico, em detrimento da inoculação do ativo no momento final.
6) ROBUSTEZ
Até esta etapa, o método analítico não foi testado quanto à sua “estabilidade” ou consistência de resultados. Pode-se optar por testar o efeito que pequenas alterações, propositais, na metodologia irão causar no resultado analítico. Esta é uma fase bastante trabalhosa e, em optando-se por não realizá-la, o método pode ser considerado validado apenas para aquelas, determinadas condições em que o ensaio foi realizado, ou seja, mesmo equipamento, mesmas condições, mesmos reagentes, etc.
7) PRECISÃO INTERMEDIÁRIA
Com objetivos semelhantes, a precisão intermediária visa testar a estabilidade do teste, porém investigando o efeito que modificações mais severas irão causar nos resultados. Para isso pode-se repetir o método utilizando-se diferentes analistas, equipamentos ou, até mesmo, laboratórios.
Os resultados obtidos pela robustez e pela precisão intermediária devem ser comparados entre sí e com os resultados iniciais, procurando por eventuais desvios. Para essa finalidade, é interessante o uso de um teste de hipótese, por exemplo, o teste de student (T).
PROPOSTA DE UM ROTEIRO DE VALIDAÇÃO DE MÉTODO CLAE (HPLC) Um dos métodos atualmente em destaque é a cromatografia líquida de alta eficiência, (CLAE ou HPLC). Sua principal vantagem reside na capacidade do método separar e quantificar os componentes presentes em uma amostra relativamente complexa. A roteiro a seguir consiste em uma proposta para a validação de métodos desta natureza. Para a elaboração deste roteiro, utilizou-se partes de uma série de validações, de maior ou menor complexidade, realizadas no CONFAR – FCF - USP.
Roteiro para a Validação do método de Doseamento, Uniformidade de Conteúdo e Dissolução de Cápsulas
1) Pesquisa dos principais interferentes:
O primeiro passo, deve consistir na consulta à literatura e ao fabricante da matéria-prima, objetivando conhecer quais seriam os eventuais interferentes na amostra. Conhecimentos sobre a síntese química permitem ainda inferir se existe um intermediário sintético que possa interferir na análise, seja por semelhanças com a substância a ser analisada, ou por mascará-la perante o método escolhido.
2) Obtenção dos interferentes
Primeiramente a obtenção de substâncias interferentes pode ser conseguida entrando em contato com o fabricante da substância.
Durante a validação da metodologia de doseamento do sulfato de indinavir – cápsulas, esta etapa permitiu verificar que os principais interferentes neste produto seriam lactona, penultimate, bis-alquil-piperazina e cis-aminoindanol (Fig. 2a) os quais foram sintetizados e fornecidos pelo fabricante da matéria-prima. Neste caso, foi possível o desenvolvimento da metodologia, de modo a obter uma cromatograma com os picos dos principais interferentes razoavelmente resolvidos e identificados.(Fig. 2b)
Nem sempre isto é possível, no caso da validação de uma metodologia para ranitidina, não houve acesso a padrões de intermediários de síntese ou de produtos de degradação. Houve a necessidade de se buscar eventuais produtos de degradação, submetendo a ranitidina à hidrólise e oxidação. A figura 2c mostra os cromatogramas da ranitidina e dos eventuais produtos de degradação, mostrando que a metodologia utilizada propicia uma seletividade adequada. A pureza cromatográfica para o pico da ranitidina foi testada pela análise dos espectros obtidos por um detector de arranjo de fotodiodos, conforme mostra a fig 2d.
3) Verificação da Seletividade do Método
Novamente, a literatura pode fornecer algumas condições cromatográficas que foram testadas para a substância, cabendo ao responsável chegar à uma condição que possa aliar rapidez de análise e economia com um bom perfil analítico. Muitas vezes o melhor perfil cromatográfico não é viável na prática, como é o caso apresentado na fig3, onde, para se obter a eluição de todos os interferentes, houve a necessidade do uso de um tempo de corrida de 22 minutos
Assim, combinando a análise das condições cromatográficas e dos possíveis interferentes deve-se obter uma metodologia que permita separa-los do analito de maneira eficiente.
4) Determinação da Linearidade
Tendo assegurado que o método possui um seletividade adequada, segue-se o próximo passo, verificar se o método é linear em toda a faixa a que o método se propõe a atender.
Para os testes de doseamento, uniformidade de conteúdo e dissolução do ativo os parâmetros adotados foram os da USP 24, sendo:
• Doseamento: 80 a 120 % do valor teórico
• Uniformidade de Conteúdo: 70 a 130 % do valor teórico
• Dissolução: sendo Q = 80 %, teria-se que verificar a linearideade entre Q +/- 20 %, ou seja, 60 a 100 % do valor teórico.
Desta forma optou-se por validar a linearidade na faixa de 60 a 130 % do valor teórico. Ajusta-se a solução de modo que, injetando-se 20μl, um pico adequado, com altura de 0,1 AU seja obtido, neste caso, a concentração se foi de 100 μg/ml, considera-se esse valor como 100%. Desta forma, ter-se-ia:
• 60%: 0,6 x 100 μg/ml = 60 μg/ml • 80%: 0,8 x 100 μg/ml = 80 μg/ml • 100%: = 100 μg/ml
• 115%: 1,15 x 100 μg/ml = 115 μg/ml • 130%: 1,3 x 100 μg/ml = 130 μg/ml
Cada uma destas soluções deve ser preparadas em triplicata e, cada amostra, injetada de três vezes no cromatógrafo. Os valores obtidos para a determinação de linearidade em um experimento estão representados na tabela II:
Podemos concluir, pelo RSD (<2%) que o método é exato. A curva obtida no gráfico Concentração x Área está representada na fig.4
Observa-se um bom coeficiente de correlação e uma boa adaptação da curva aos pontos, sem tendências. O mesmo não é verdade para a validação de uma pomada de betametazona, representada na fig. 4a, onde observa-se um claro desvio da linearidade. Neste caso, a validação foi menos abrangente, e utilizou apenas a faixa de concentração de 90 a 110% do valor teórico, onde a curva apresenta-se razoavelmente linear.
5) Determinação do Efeito da Matriz Linearidade
Para a verificação do efeito da matriz, é necessária a preparação de uma amostra simulada, contendo quantidades conhecidas da substância em na matriz. Em seguida, com essa amostra simulada, repete-se o que foi feito no item 4.A tabela III sumariza os dados obtidos:
Plotando-se ambas as retas em um único gráfico (fig 5) tem-se, praticamente, a superposição das retas indicando que a matriz não interfere na metodologia. A diferença entre os coeficientes angulares foi menor que 0,02%, o que demonstra o paralelismo entre as retas.
Portanto podemos dizer que neste caso não ocorre uma interferência da matriz na linearidade da resposta da metodologia em relação a esta substância.
6) Determinação da precisão e exatidão do método
Nesta etapa é necessário determinar se a metodologia tem uma boa recuperação. Para tanto, realiza-se determinações das concentrações da substância adicionada a uma matriz, no caso de fármacos, o placebo é a escolha ideal.
Deve-se fazer três experimentos independentes, e em triplicata, para validação estatística. Toma-se três valores de concentração, 70%, 100% e 130% do valor esperado para a substância, adiciona-se ao placebo. A determinação da concentração é feita de acordo com o método já descrito obtendo-se , portanto, nove valores de concentração. A precisão é definida pelo desvio padrão relativo (RSD):
RSD(%) = desvio padrão*100 concentração média
Considera-se que o método é preciso, no caso de metodologias para determinação de teor, quando o valor de RSD for menor que 2,0%
A exatidão da metodologia, por sua vez, é definida como
Exatidão(%)= teor médio experimental*100 teor teórico
Considera-se, para essa aplicação, uma exatidão aceitável entre 98 e 102%
7) Determinação da precisão intermediária
Uma vez determinados os parâmetros acima descritos, estes devem ser repetidos em dias diferentes por analistas diferentes e aparelhos diferentes afim de certificar-se da confiabilidade da metodologia.
A comparação entre os dados do teste e da repetição pode ser efetuado através de uma análise simples, como é o caso do teste T, porém, antes de se executar o teste T, é necessária a execução de um teste F, para se assegurar de que as variâncias, em ambos os estudos são iguais.
A tabela IV reúne os resultados dos testes T e F para os dados das tabelas II e III, onde podemos verificar que as variâncias e as médias das recuperações são estatisticamente iguais.
Conclusão
Este roteiro baseia-se tanto pela metodologia oficial farmacopéia americana (USP24) como também pela aplicação deste no laboratório do CONFAR. A seqüência de etapas, bem como a rigidez dos procedimentos visam assegurar que os resultados obtidos sejam confiáveis. Assim com esta proposta de roteiro objetivamos fornecer uma referência em metodologia análitica, e garantir a qualidade dos resultados obtidos através desta metodologia
DEFINIÇÕES
Abaixo estão listados uma série de termos utilizados durante este trabalho e em outros artigos sobre o assunto. Para facilitar a compreensão, em alguns casos, damos a definição para o termo sugerida por mais que uma fonte, porém, deve-se preferir a definição para pelo Vocabulário Internacional em Metrologia – VIM, adotada no Brasil pelo INMETRO e outros termos internacionalmente aceitos.
Acurácia: o grau de concordância entre o resultado de um teste e o valor de referência aceito (Isso)
Uma quantidade referente às diferenças entre a média de um conjunto de resultados, ou um resultado individual, e o valor considerado como verdadeiro ou correto para a quantidade medida(IUPAC)
Acurácia (de um instrumento de medição): habilidade de um instrumento de produzir respostas próximas ao valor verdadeiro (IUPAC)
Analito: vide mensurando
Bias: a diferença entre os valores esperados para o teste e o valor de referência aceito (ISO)
Calibração: conjunto de procedimentos
Curva de Calibração: a representação gráfica da resposta do instrumento de medição em função da quantidade do mensurando(EURACHEM)
Especificidade: a habilidade do método em medir apenas aquilo que ele se propõe a medir (EURACHEM)
Exatidão: a medida da proximidade entre o valor médio de um grande número de resultados de um teste e seu valor de referência (ISO)
Incerteza de Medição: parâmetro associado com a o resultado de uma medida, que caracteriza a dispersão dos resultados que podem ser razoavelmente atribuídos ao mensurando(EURACHEM)
Limite de detecção: a menor quantidade do analito que, estando presente, pode ser detectada e identificada (AOAC)
Limite de Quantificação: a menor quantidade do analito que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob determinadas condições de teste (EURACHEM)
Mensurando: quantidade particular sujeita a medida (VIM)
Precisão: medida da proximidade entre os resultados de testes independentes sob condições estipuladas (EURACHEM)
Repetibilidade: grau de concordância entre os resultados de medições sucessivas de um mesmo mensurando, efetuadas sob as mesmas condições de medição (VIM)
Reprodutibilidade: Grau de concordância entre os resultados das medições de um mesmo mensurando, efetuadas sob condições variadas de medição (VIM).
Validação: confirmação, pela examinação e obtenção de evidências objetivas, que os requisitos particulares para um determinado uso estão sendo preenchidos.
TABELA I Exemplos de interferentes que podem estar presentes durante as análises e suas respectivas origens
Origem Interferentes
Medicamentos Intermediários de síntese, produtos de degradação, excipientes, reagentes utilizados na preparação da amostra Drogas Vegetais Outros compostos presentes na
planta de origem, produtos de degradação, reagentes utilizados na extração e na preparação da amostra
Fluídos Biológicos Componentes biológicos (proteínas, lipídeos, etc.), metabólitos e produtos de degradação, reagentes utilizados na preparação da amostra
Figura 1
Figura 1: Correlação entre um fator qualquer e sua resposta. A) utilizando todos os pontos e B) Computando-se apenas a parte linear
y = 1,0507x - 0,5657 R2 = 0,9982 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 5 10 15 A B Fator Resposta 1 0,1 2 1,2 3 2,6 4 3,8 5 4,9 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15
Figura 2
Figura2: Efeito da matriz na linearidade do método analítico Efeitos da Matriz Nenhum Efeito Efeito Somativo Efeito Multiplicativo
Figura 2a
Figura 2a: Estrutura do Indinavir e um dos seus interferentes, o cis-aminoindanol N N N O NH OH O NHC(CH3)3 OH OH H2N
Figura 2d
Fig. 2: Cromatogramas de diclofenaco resinato submetido à vários tratamentos para obtenção dos produtos de degradação
Padrão
Temperatura
Hidrólise Alcalina
Hidrólise Ácida
TABELA II Determinação da Linearidade para o Doseamento Áreas (média de 3 injeções) (AU)
Amostra 1 2 3 Média RSD(%) 60 % 141158 140988 139990 140712 0,45 80% 187548 187053 188023 187541 0,26 100 % 234435 235640 236508 235528 0,44 115 % 270000 269589 271596 270395 0,39 130% 304700 305070 304026 304599 0,17
Figura 4 Linearidade 60 a 130 % y = 2355,5x - 459,59 R2 = 0,9996 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 0 20 40 60 80 100 120 140 Concentração (ug/ml) Resposta (AU)
Figura 5 Efeito da Matriz 130000 150000 170000 190000 210000 230000 250000 270000 290000 310000 55 65 75 85 95 105 115 125 135 Concentração (ug/ml) Resposta
TABELA III Efeito da matriz na linearidade da metodologia
Áreas (média de 3 injeções) (AU)
Amostra 1 2 3 Média RSD(%) 60 % 140138 140568 141090 140599 0,34 80% 186957 186945 187986 187296 0,32 100 % 235023 234980 236012 235338 0,25 115 % 269358 269991 271023 270124 0,31 130% 305102 305899 303680 304894 0,37
Figura 6 Efeito da Matriz 60 a 130 % y = 2335x + 1463,3 R2 = 0,9997 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 0 20 40 60 80 100 120 140 Concentração (ug/ml) R esposta (A U )
