AS ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO GÊNICA DE PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS INDUZIDA POR OENOTEÍNA B, UM POTENCIAL AGENTE ANTIFÚNGICO DA PLANTA DO CERRADO BRASILEIRO EUGENIA UNIFLORA.
Amanda Gregorim Fernandes1; Fernanda Garcia de Melo2;Ludimila Carvalho dos S. Marques2; Cristiane Alves da Fonseca3
1
Bolsista PBIC/UEG, graduando do Curso de Biologia, UnUCET Anápolis – UEG. 2
Voluntário PVBIC/UEG, graduandos do Curso de Farmácia, UnUCET Anápolis – UEG. 3
Orientador IES, docente dos Cursos de Biologia e Farmácia, UnUCET Anápolis – UEG.
RESUMO
A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença causada pelo fungo termodimórfico, Paracoccidioides brasiliensis, possuindo uma diferenciação celular possibilitando sua virulência e patogenicidade. Quando presente no meio ambiente e in vitro, a uma temperatura média de 26°C ele se encontra na sua fase miceliana, já nos tecidos hospedeiros e in vitro a 37°C possui a forma leveduriforme. Trata-se de uma doença prevalente da América Latina, estendendo-se do México à Argentina, sendo o Brasil responsável por 80% dos casos, e Goiás, o estado que possui um dos maiores índices da doença. O contágio se dá pela inalação de propágulos do fungo que ao atingirem o epitélio pulmonar podem se espalhar pelo organismo através do sistema linfático e sanguíneo. Assim como acontece com outras infecções fúngicas seu tratamento é feito através de uma terapêutica prolongada, o que pode causar efeitos adversos. Apesar de existirem potentes antibióticos e agentes antifúngicos, isolados resistentes ou multi-resistentes continuam surgindo, tornando-se necessário a busca constante pelo desenvolvimento de novos fármacos. A Eugenia unifora L. é uma planta encontrada no Brasil e muito conhecida na medicina popular do cerrado brasileiro no tratamento de micoses e outras doenças. Estudos já comprovaram a ação inibitória da planta no crescimento de P. brasiliensis, sugerindo que a oenoteína B pode ser um bom candidato a agente antifúngico, tornando necessária a elucidação do mecanismo de ação deste composto. Dessa forma utilizou-se o fungo cultivado em meio Fava-Netto. Em um meio quimicamente definido, o MVM, o P. brasiliensis foi tratado com a oenoteína B e realizada a extração de
RNA, amplificação dos cDNAs e subtração desses cDNAs diferencialmente expressos através da técnica de RDA, com o objetivo de avaliar a expressão gênica celular frente a essa substância. Esses cDNAs diferencialmente expressos serão seqüenciados e esses resultados confirmados através das técnicas de RT-PCR semi-quantitativo e Northen Blot.
Palavras-chave: Paracoccidioidomicose, oenoteína B, expressão gênica.
Introdução
Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico e agente causador da paracoccidioidomicose (PCM) (FRANCO, 1987). A doença é uma micose sistêmica humana de maior prevalência da América Latina (BRUMMER et al., 1993). A infecção começa com a inalação de propágulos do fungo, que atingem o epitélio dos alvéolos pulmonares, embora a maioria das formas clínicas da doença sejam assintomáticas, podem acontecer infecções severas e progressivas envolvendo os tecidos pulmonares e extrapulmonares (BRUMMER et al., 1993; RESTREPO et al., 2000).
A PCM é tratada inicialmente, com dosagens antifúngicas elevadas e agressivas; como em outras infecções fúngicas seu tratamento é um processo lento podendo se estender por meses ou anos (HANH et al., 2003). Apesar da existência de potentes antibióticos e agentes antifúngicos, isolados resistentes ou multi-resistentes continuam surgindo (HANH et al., 2003; SILVER & BOSTIAN, 1993). Desta forma, torna-se necessário a permanente busca por desenvolvimento de novos fármacos. Diversas plantas têm fornecido bases para o tratamento tradicional de diferentes tipos de doenças, oferecendo uma enorme fonte de potencial para novos agentes quimioterapêuticos (DASGUPTA & BERNARD, 2006).
A Eugenia unifora L. é uma planta pertencente á família Myrtaceae (ANGELY, 1965), conhecida popularmente como pitangueira e tem sido utilizada como antipirético e antireumático (ALICE et al., 1991), anti-hipertensivo e diurético (AMAT & YAJÍA, 1991), no tratamento de distúrbios digestivos e adstringente (BANDONI et al., 1972), antimicrobiano (ADEBAJO et al., 1989; COELHO DE SOUZA et al., 2004) e também em micoses (SOUZA et al., 2002; HOLETZ et al., 2002). Estudos fitoquímicos das folhas de E. uniflora têm mostrado a presença de três taninos hidrolisáveis macrocíclicos, nomeados de oenoteína B, eugeniflorina D1 e eugeniflorina D2 (LEE et al., 1997).
Estudos mostram que células leveduriformes de P. brasiliensis tiveram seu crescimento inibido quando expostas as frações aquosa, metanólica solúvel e insolúvel, sub fração IM-7 e oenoteína B obtidas de E. uniflora, de maneira dose-dependente (SANTOS et
al., submetido). Estes resultados sugerem que a oenoteína B pode ser um bom candidato a agente antifúngico em P. brasiliensis. Esse estudo teve como objetivo estudar o mecanismo de ação da oenoteína B em P. brasiliensis utilizando subtração dos cDNA através da técnica de RDA e utilização de ferramentas da bioinformática para identificar os genes supra ou
infra-regulados na presença e ausência de oenoteína.
Materiais e métodos
O pó das folhas de E. uniflora (coletadas na cidade de Anápolis/GO) foi homogeneizado (acetona aquosa 50%) e, filtrado para separação do extrato e das gorduras e clorofilas. A fração aquosa, foi dissolvida em metanol (MeOH) e forneceu as frações metanólicas solúveis e insolúveis. A fração metanólica insolúvel foi submetida á separação e purificação por cromatografia de coluna (CC) e obteve-se a sub fração IM-7. A partir dessa fração, a oenoteína B foi isolada como um componente puro através do sistema preparativo de cromatografia líquida de alta performance (HPLC).
O fungo P. brasiliensis, isolado Pb 01 (ATCC MYA 826), foi cultivado em meio sólido Fava Netto (FAVA-NETTO, 1955), durante sete dias, à 36oC (leveduras). Após esse período as células foram transferidas e cultivadas em meio Mc Veigh Morton (MVM) líquido adicionado de 500 µg/mL de oenoteína B. Culturas tratadas com a substância e culturas controle foram inoculadas sob agitação de 120 rpm à 36oC durante 90 e 270 minutos.
A extração de RNA total foi realizada das culturas “tester” e “driver” utilizando o método do Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) de acordo com as instruções do fornecedor. A concentração e pureza do RNA foi determinado em espectrofotômetro, e a integridade foi visualizada por eletroforese em gel de agarose 1%, livre de RNase.
A síntese da primeira fita de cDNA foi realizada com a transcriptase reversa (RT Superscrip II, Invitrogen, CA, USA), utilizando 1µg de RNA.
Resultados e discussões
Para a obtenção da primeira fita de cDNA foi realizado a extração de RNA total a partir das culturas “driver” e “tester” de células leveduriformes de P. brasiliensis. Os RNAs foram quantificados por espectrofotometria, apresentando concentrações de 302 ng/µL e 227 ng/µL para “driver” e “tester”, respectivamente. Com a finalidade de observar as integridades dos RNAs, os mesmos foram analisados em gel de agarose 0,8% em condições livres de RNAse. As integridades desses RNAs puderam ser observadas na Figura 1.
Figura 1. Perfil eletroforético do RNA extraído das culturas “driver” e “tester” de células leveduriformes de P. brasiliensis cultivado em meio MMcM na ausência e na presença de oenoteína B, respectivamente, analisado por eletroforese em gel de agarose 0,8%, corado com brometo de etídeo, em condições livres de RNAse. RNA total de P. brasiliensis cultivado em meio MMcM na ausência (Poço 1) e na presença (Poço 2) de 500 µg de oenoteína B, após 90 minutos.
Com os resultados acima pôde-se observar que o RNA extraído das duas culturas estava íntegro e apropriado para a próxima etapa que é a de síntese do cDNA.
A primeira fita sintetizada a partir dos RNAs extraídos foi utilizada como molde para a obtenção da segunda fita do “driver” e do “tester”(figura 2). A segunda fita, “driver” e “tester”, obtidas foram purificadas e quantificadas por espectrofotometria, apresentando concentrações de 27,6 ng/µL e 31,6 ng/µL, respectivamente.
Figura 2. Perfil eletroforético da segunda fita de cDNA do “driver e tester”, analisadas por eletroforese em gel de agarose 1,0%, corado com brometo de etídeo. Os poços 1 e 2 representam os cDNAs do “driver” (ausência de 500 µg de oenoteína B) e “tester” (presença de 500 µg de oenoteína B), respectivamente. Os números à esquerda correspondem ao padrão de massa molecular “500 Kb Ladder” (Amersham Biosciences).
Com a finalidade de obter-se fragmentos menores e com sítios de restrição que se ligassem aos primers adaptadores, os cDNAs, “driver” e “tester”, foram submetidos à uma clivagem utilizando a enzima de restrição Sau3AI (10 U/µL). Os cDNAs clivados foram purificados, analisados em gel de agarose 1,5% e quantificados por espectrofotometria, apresentando concentrações de 74,8 ng/µL e 26,0 ng/µL para “driver” e “tester”, respectivamente. O cDNA dupla-fita (digerido com a enzima de restrição Sau3A) e os
produtos resultantes foram purificados utilizando o kit GFX (Amershan Pharmacia Biotech, Amershan Place, UK), e ligados aos adaptadores RBam12/24. Com o objetivo de obter um material adequado para iniciar o RDA.
Conclusão
Produtos naturais ainda são os mais procurados como agentes inovadores terapêuticos para doenças infecciosas. O uso de plantas medicinais no mundo contribui, significantemente, para os cuidados de saúde primária. Estudos de Santos et al., (submetido) mostraram que as células leveduriformes de P. brasiliensis tiveram seu crescimento inibido na presença de E. uniflora. O estudo da expressão gênica do fungo nestas condições esclareceria o possível mecanismo de ação da substância e sua interferência no metabolismo celular do fungo.
Referências
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