DETERMINAÇÃO DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁTICAS
AUTÓCTONES EM QUEIJOS COLONIAIS E
SEU POTENCIAL BACTERIOCINOGÊNICO
K. Pegoraro
1, M.J. Sereno
2, M.S. Fortes
3, T. H. Bellé
4, V. C. Barcellos
5, L.S. Bersot
61 – Departamento de Ciências Veterinárias – Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: 85950-000 – Palotina – PR – Brasil, Telefone: 55 (44) 3211-8513 – e-mail: (kadigiapegoraro@gmail.com)
2 – Departamento de Ciências Veterinárias – Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: 85950-000 – Palotina – PR – Brasil, Telefone: 55 (44) 3211-8513 – e-mail: (mallusereno@gmail.com)
3 – Departamento de Ciências Veterinárias – Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: 85950-000 – Palotina – PR – Brasil, Telefone: 55 (44) 3211-8514 – e-mail: (maira_salomao@yahoo.com.br)
4 – Departamento de Ciências Veterinárias – Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: 85950-000 – Palotina – PR – Brasil, Telefone: 55 (44) 3211-8513 – e-mail: (thiago-belle@hotmail.com)
5 – Departamento de Ciências Veterinárias – Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: 85950-000 – Palotina – PR – Brasil, Telefone: 55 (44) 3211-8514 – e-mail: (vcbarcellos@gmail.com)
6 – Departamento de Ciências Veterinárias – Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: 85950-000 – Palotina – PR – Brasil, Telefone: 55 (44) 3211-8516 – e-mail: (lucianobersot@gmail.com)
RESUMO – Bactérias ácido láticas (BAL) compõem a microbiota autóctone de queijos coloniais sendo capazes de sintetizar diversas substâncias antimicrobianas, como as bacteriocinas, antagônicas ao desenvolvimento de patógenos. Este trabalho objetivou determinar contagens de BAL e a presença de Listeria sp. em queijos colônias na região oeste paranaense e identificar as BAL bacteriocinogênicas capazes de inibir L. monocytogenes. A contagem e determinação de BAL e BAL produtoras de bacteriocinas foram realizadas conforme método triple-ágar layer e inoculação em ágar spot. Os resultados mostraram ausência de Listeria sp. e elevadas contagens de BAL, indicando uma possível atividade antagônica das BAL frente à Listeria sp., seja pelo potencial bacteriocinogênico ou pela produção de outros compostos antimicrobianos. Dessa forma, conclui-se que altas concentrações de BAL podem contribuir para a inocuidade dos queijos coloniais.
ABSTRACT – Lactic acid bacteria (LAB) are in the natural microbiota of colonial cheese and they can produce several antimicrobial substances, such as bacteriocins. They are antagonistics to development of microrganisms pathogenic. The aim of this study were detect LAB and Listeria sp. in colonial cheese at west Parana and recognize LAB able to produce bacteriocins with antimicrobial activity against L. monocytogenes. Counting and determination of LAB and LAB bacteriocinogenic was made according to triple-ágar layer method and inoculation in spot agar. The results showed non-presence of Listeria sp. and high counts of BAL, indicating possible antagonistic activity of BAL front Listeria sp. either by its bacteriocinogenic potential or its capacity to produce others substances antimicrobial. Therefore, it can be concluded that high concentration of LAB can contribute to the safety of colonial cheese.
PALAVRAS-CHAVE: bacteriocinas; patógenos; antimicrobianas; inocuidade; biopreservação. KEYWORDS: bacteriocins; pathogens; antimicrobials; harmlessness; biopreservation.
O queijo colonial é um produto de grande aceitação, comercialização e consumo na região sul do Brasil. A tecnologia adotada para sua confecção na grande maioria das vezes é empregada de maneira empírica e dotada de características culturais marcantes. O leite utilizado como matéria-prima não recebe tratamento térmico (pasteurização) e o produto pronto não passa por processo padronizado de maturação, conferindo a estes produtos geralmente alto teor de umidade. A associação de todos estes fatores cria um ambiente favorável à multiplicação de diversos micro-organismos patogênicos e deteriorantes que podem oferecer riscos aos consumidores (Schimitt et al., 2011).
Segundo Germano e Germano (2011), dentre os micro-organismos patogênicos presentes no leite cru que podem ser veiculados pelo consumo de queijo destacam-se Staphylococcus aureus,
Escheriachia coli, Listeria monocytogenes e Salmonella sp. As contagens de coliformes e os aeróbios
mesófilos são utilizadas como indicadores higiênico-sanitários em produtos lácteos, e podem ser reflexo das condições higiênico-sanitárias empregadas na obtenção da matéria-prima e fabricação dos queijos. Elevadas contagens dos micro-organismos indicadores, associadas a altas concentrações de microbiota endógena do leite, costumam reduzir o isolamento de patógenos, uma vez que estes últimos são considerados maus competidores (Nero et al., 2008).
Além de micro-organismos deteriorantes e patogênicos, há grupos de micro-organismos que constituem a microbiota autóctone dos produtos lácteos, dentre eles, o grupo das bactérias ácido láticas (BAL) merece destaque, pois seu metabolismo pode contribuir para o desenvolvimento das características sensoriais dos queijos artesanais, além da produção de diversas substâncias com atividade antimicrobiana, tais como ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio, diacetil e bacteriocinas (Nero, et al., 2008; Ortolani, 2009).
A maioria das BAL são seguras ao consumo humano e não são capazes de causar enfermidades aos consumidores de forma que, além de serem utilizadas como culturas starters e probióticos, várias espécies podem ser empregadas na conservação de alimentos, pela sua atividade antagonista frente a micro-organismos deteriorantes e patogênicos como L. monocytogenes e S. aureus (Oliveira, 2014; Sobrino-López e Martin-Belloso, 2008).
Tendo em vista o potencial antagonista das BAL frente a micro-organismos patogênicos, este trabalho teve como objetivo determinar a presença de Listeria sp. e as contagens de BAL em queijos coloniais produzidos e comercializados na região oeste do estado do Paraná e, a partir das BAL isoladas, determinar as potenciais produtoras de bacteriocinas com capacidade de inibir cepas de L.
monocytogenes.
2. MATERIAL E MÉTODOS
As amostras foram coletadas em três municípios localizados na região oeste do estado do Paraná. Ao todo foram amostrados vinte e um queijos coloniais: cinco no município de Umuarama, oito no município de Terra Roxa e oito no município de Assis Chateaubriand. As amostras foram adquiridas no varejo e transportadas em caixas isotérmicas até o Laboratório de Inspeção e Controle de Qualidade de Alimento e Água da Universidade Federal do Paraná, localizado em Palotina-PR. Ao dar entrada no laboratório, as amostras foram mantidas sob refrigeração (3 a 8°C) por no máximo 24 horas até o seu processamento.
A pesquisa de Listeria sp. foi realizada diluindo-se 25gramas da amostra em 225ml de caldo para Enriquecimento de Listeria (LEB) incubado a 30°C/18-24h, seguido de inoculação em Caldo Fraser (35°C/24-48h) e plaqueamento seletivo diferencial em Ágar Oxford (35°C/24h). A confirmação bioquímica foi realizada a partir da purificação das colônias suspeitas em Ágar Triptona de Soja suplementado com extrato de levedura (TSA-YE) incubadas a 35°C/24-48h. Das placas de TSA-YE 3
a 5 colônias foram selecionadas e semeadas em Ágar Sangue de equino 5%(35°C/24h) para avaliação da hemólise. Foi verificada ainda a utilização dos açúcares manitol, ramnose, dextrose e xilose (35°C/24-48h) e a motilidade em ágar SIM (25°C/7 dias).
A contagem de BAL e determinação de BAL produtoras de bacteriocinas foram realizadas de acordo com o método triple-ágar layer proposto por Todorov e Dicks (2004). Para tal, 25g de cada amostra foram homogeneizadas com 225 mL de solução salina 0,85%. Após diluições seriadas das amostras, 0,1ml de cada diluição foi semeado, em duplicata, em placas de Ágar Man Rogosa e Sharpe (MRS). As placas foram cobertas com uma camada de ágar bacteriológico e incubadas a 30°C/48h.
Foi realizada contagem de todas as placas nas quais houve crescimento após incubação e as que continham menos de 50 UFC foram selecionadas e cobertas com uma terceira camada de ágar, neste caso, Ágar Infusão Cérebro Coração (BHI) 1,5% contendo Listeria monocytogenes ATCC 7644 e sua duplicata foi coberta com ágar BHI 1,5% contendo uma cepa de campo de Listeria
monocytogenes, ambas na concentração de 106 UFC/mL. As placas foram incubadas por mais 24h a
35°C e após este período as colônias de BAL rodeadas por uma zona de inibição do crescimento de L.
monocytogenes foram selecionadas e submetidas aos testes de catalase e coloração de Gram.
As colônias gram-positivas e catalase negativas foram confirmadas como BAL e submetidas à confirmação da produção de bacteriocinas. Para tal, as culturas de BAL isoladas foram ressuspendidas em caldo MRS (30oC/24h), do qual 1ml foi centrifugado em eppendorf (14000g por
15min). O sobrenadante obtido foi submetido ao ajuste de pH com hidróxido de sódio para próximo a 7,0, com o objetivo de inativar o ácido lático, seguido do tratamento térmico em banho-maria (80°C/10 minutos) para inativação de peróxido de hidrogênio. Cada sobrenadante foi plaqueado (10µl) em placas de ágar BHI 1,5% contendo L. monocytogenes ATCC 7644 e placas de ágar BHI 1,5% contendo uma cepa de campo de L. monocytogenes, ambas na concentração de 106 UFC/ml, utilizando
a metodologia de plaqueamento em ágar-spot proposta por Todorov (2008).
As cepas que permaneceram com capacidade de inibir L.monocytogenes após incubação das placas a 35ºC/24h foram submetidas ao teste da ação da proteinase K, uma enzima com capacidade de agir frente a bacteriocina, desativando-a. Para este teste, após os sobrenadantes serem submetidas ao ajuste de pH e tratamento térmico, como descrito anteriormente, foi adicionado ao eppendorf 0,1ml de proteinase K (20mg/ml). Para a ativação e ação desta enzima, incubou-se o eppendorf a 30oC por 2
horas, sendo necessário a sua desativação após este período, através do aumento de temperatura para 98oC durante 2 minutos, para possibilitar o plaqueamento sem que houvesse interferência nas
interpretações dos resultados. Cada sobrenadante foi plaqueado (10µl) em placas de ágar BHI 1,5% contendo L. monocytogenes ATCC 7644 e placas de ágar BHI 1,5% contendo uma cepa de campo de
L. monocytogenes, ambas na concentração de 106 UFC/ml, utilizando a metodologia de plaqueamento
em ágar-spot proposta por Todorov (2008), as placas foram incubadas a 35oC/24h.
A partir dos sobrenadantes das BAL, obtidos da centrifugação do caldo MRS, que mantiveram a habilidade de inibir o desenvolvimento de Listeria monocytogenes após inativação do ácido lático e do peróxido de hidrogênio, e que perderam esta habilidade de inibição após o tratamento com a proteinase K, pode-se confirmar que a produção da zona de inibição pela BAL isolada ocorreu devido à presença de substancias de origem proteica, como as bacteriocinas.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Todas as amostras de queijo colonial avaliadas apresentaram ausência de Listeria sp. em 25g. Quanto às BAL, todas as amostras apresentaram contagens elevadas para este grupo de micro-organismos, com valores entre 2,0x105 e 1,2x109UFC/g, como mostra a Tabela 1.
Tabela 1 – Contagem de BAL e de BAL bacteriocinogênicas (UFC/g) em amostras de queijo colonial.
1 5x4x107 - 2 1,6x108 - 3 9,5x106 8,0x104 4 1,1x108 - 5 3,4x107 - 6 1,5x108 - 7 8,7x108 - 8 2,3x107 - 9 2,7x107 - 10 1,5x108 - 11 1,8x108 - 12 7,0x107 - 13 2,0x105 - 14 4,9x107 1,3x106 15 4,6x108 3,2x107 16 5,0x108 4,5x106 17 4,1x108 4,3x106 18 2,9x107 5,8x105 19 1,2x109 - 20 4,0x108 - 21 4,3x108 -
A presença de BAL em leite cru e seus derivados é desejada, uma vez que são elas as responsáveis pela produção de metabólitos antagonistas de patógenos e pela formação de flavour característico do queijo artesanal (Oliveira, 2014). As espécies de BAL mais frequentes em pesquisas com queijo artesanal são Lactococcuslactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus e
Streptococcus agalactiae, além de bactérias do gênero Enterococcus sp. (Resende et al., 2011).
Corroborando com os resultados obtidos nesta pesquisa, Rezende et al. (2011) ao avaliarem a presença de BAL em queijo minas artesanal da Serra da Canastra obtiveram contagens semelhantes às obtidas neste estudo, com valores entre 1,2x107 e 3,5x108UFC/g. Em pesquisa com queijo Fresco
mexicano, as contagens de BAL em ágar MRS foram de 1,9x108 UFC/g no primeiro dia de produção e
mantiveram valores semelhantes após o período de maturação, atingindo contagens de até 2,6x108
UFC/g (Torrez-Llanezet al., 2006). Em queijo Pecorino, os valores de BAL também permaneceram altos, com contagens iniciais de 3,3x107 UFC/g e após 60 dias de maturação, com valores de 4,2x109
UFC/g (Randazzo et al., 2008). González et al.(2003), observaram que as contagens de BAL durante a maturação de queijo Ibore, apresentaram valores entre 107a 109 UFC/g, semelhante aos resultados
encontrados por Oliveira (2014), ao avaliar as características microbiológicas do queijo minas artesanal durante seu período de maturação. Ortolani (2009) avaliando a microbiota autóctone de queijo minas artesanal obteve contagens de BAL entre 105 e 108 UFC/g em aproximadamente 85% das
amostras avaliadas.
Ao se relacionar as altas contagens de BAL com a ausência de Listeria sp. obtidas nesta pesquisa, pode-se inferir que os altos níveis da microbiota autóctone possam ter exercido efeito antagônico frente ao desenvolvimento deste patógeno. De acordo com Nero et al. (2009), os agentes patogênicos necessitam de condições altamente específicas para se desenvolverem e quando estão presentes em baixas concentrações nos alimentos, associados a altos níveis de microbiota endógena, podem ter seu desenvolvimento restringido devido à habilidade das BAL em produzir substâncias com atividade antimicrobiana, como os ácidos orgânicos (lático, acético e propiônico), diacetil, dióxido de carbono, peroxido de hidrogênio, sustâncias antimicrobianas de baixo pelo molecular (reuterina, reutericiclina e ácido piroglutâmico) e bacteriocinas (Ortolani, 2009).
Com relação às BAL produtoras de bacteriocinas, foram obtidas contagens elevadas, com valores entre 8,0x104e 3,2x107UFC/g, em seis amostras avaliadas (28,6%), como pode ser verificado
na Tabela 1. Segundo Alves et al. (2009), a concentração de bacteriocinas em alimentos é um fator que determina seu potencial antimicrobiano e sua produção pode ser influenciada por diversas condições que interferem no desenvolvimento das culturas bacteriocinogênicas, como ambiente desfavorável com reação à temperatura, concentração de nutrientes e pH.
Ortolani (2009), ao avaliar 18 amostras de queijo minas Artesanal observou a presença de BAL com efeito antagônico frente a L. monocytgenes em 61,1% das amostras. Furtado (2010) ao avaliar 60 culturas de BAL com efeito antagonista isoladas de queijo Minas artesanal observou que todas as culturas eram produtoras de bacteriocinas com potencial de inibição para L. monocytogenes. Jeronymo (2013) ao avaliar o potencial probiótico de BAL isoladas de muçarela de búfala, observou que das 32 cepas de BAL avaliadas, 06 apresentaram capacidade de inibir o desenvolvimento de L.
monocytogenese e destas, apenas duas tiveram a capacidade de inibição devido à produção de
bacteriocinas. Hermanns (2013) ao avaliar o potencial bacteriocinogênico de BAL isoladas de leite e queijo artesanal no Rio Grande do Sul, observou que das 112 cepas de BAL isoladas, 21 apresentaram capacidade para inibir L. monocytogenes.
Como a presença de BAL em alimentos é, na maioria das vezes, considerada segura para o
consumo, há um estímulo ao desenvolvimento de estudos que visem o isolamento e identificação de BAL com potencial antimicrobiano, como fonte alternativa para biopreservação dos alimentos, pela sua capacidade de controlar a deterioração e a proliferação de micro-organismos patogênicos e com o intuito também de atuar como culturas starter e probióticos (Cavicchioli et al., 2015).
4. CONCLUSÕES
As altas contagens de BAL autóctones detectadas em queijos coloniais fabricados na região oeste do PR, podem ter exercido atividade antagônica frente ao desenvolvimento de Listeria sp., seja pelo potencial bacteriocinogênico ou pela produção de outros compostos antimicrobianos. Assim, as altas concentrações de BAL podem ter contribuído com a inocuidade dos queijos coloniais.
A identificação de cepas de BAL com potencial antimicrobiano para o uso na biopreservação de alimentos é de grande relevância, uma vez que sua aplicação na indústria de alimentos pode contribuir para o controle da deterioração e do desenvolvimento de micro-organismos patogênicos indesejáveis em diversos produtos artesanais.
5. AGRADECIMENTOS
L.S. Bersot recebe apoio do CNPq; M. J. Sereno recebe apoio da CAPES; K. Pegoraro, T. H. Bellé recebem apoio do MEC.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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