leveduras Área/Laboratório Microbiologia

(1)

Aplicação da Citometria de

Fluxo

(técnica citológica avançada)

ao estudo de populações de

leveduras

Área/Laboratório

Microbiologia

Trabalho realizado por:

Adriana América da Silva

Manuel António Gonçalves de Pinho

Sara Sofia dos Santos Marques

Universidade do Minho Escola de Ciências Departamento de Biologia 21 a 27 de Julho de 2010

(2)

Citometria de Fluxo = Citologia analítica/

Citologia quantitativa

“Cito” + “metria”

de Fluxo

células medição Suspensas em

meio líquido (em movimento)

‐>A técnica de Citometria de Fluxo é definida como sendo uma técnica citológica avançada utilizada para contar, analisar e classificar partículas microscópicas em suspensão.

(3)

Citometria:

Citometria de Fluxo

Citometria de Imagem

(4)

Citometria de Fluxo

Vantagens:

z Análise multiparamétrica; z Num curto espaço de tempo analisa um grande nº de células; z Análise célula a célula;

‐>

Grande importância no estudo de populações celulares não sincronizadas (as células encontram‐se em diferentes fases do ciclo celular).

‐>

Avaliação da homogeneidade ou heterogeneidade da população.

(5)

Citómetro de Fluxo

‐> Tamanho (FSC) ‐> Dispersão frontal da luz ‐ “forward scatter”

‐> Complexidade (SSC) ‐> Dispersão lateral da luz ‐ “side scatter”

(6)

Componentes de um Citómetro de

Fluxo:

‐> Suspensão de partículas

‐> Fluxo laminar ( as células fluem em fila uma a uma)

Mecânica

Óptica

Ó

ptica

Electrónic

a

Electr

ó

nic

a

‐> Conversão do sinal em valores analógico‐digitais ‐> Aquisição, processamento, análise e armazenamento de dados no computador ‐> Fonte de iluminação (feixe de luz) ‐> Captação da luz dispersa e da fluorescência emitida

(7)

‐>

Na câmara de fluxo, a suspensão de partículas que vão ser analisadas é colhida por uma agulha e é imersa num líquido que se move a uma velocidade superior. O fluido envolvente é designado de líquido de embaínhamento.

‐>

O líquido de embaínhamento cria uma pressão positiva e faz com que as partículas sejam forçadas a moverem‐se em fila, uma a uma, no centro do fluido por um processo designado por focagem hidrodinâmica.

‐>

As partículas são analisadas, uma a uma, a velocidades de 100 a 1000 partículas/s

Funcionamento do Citómetro de

Fluxo

(8)

‐> As partículas em suspensão, de uma forma alinhada, são interceptadas por um feixe de luz. ‐> A interacção das partículas com o feixe gera sinais que são captados por detectores apropriados.

‐> A informação produzida pode ser gerada: ‐Pela dispersão do feixe de luz;

‐Pela fluorescência emitida por fluorocromos após excitação pelo feixe de luz.

Funcionamento do Citómetro de

Fluxo

(9)

‐> Capta a intensidade da luz dispersa frontalmente o que nos fornece informações sobre o tamanho relativo das partículas (células);

‐> A intensidade luz dispersa frontalmente é proporcional ao tamanho e forma das partículas.

Sensor de FS Laser

(10)

Laser

Sensor de FS

Sensor SS 900

Foto-sensor de Dispersão Lateral (SS)

‐> Capta a intensidade de luz dispersa a 90o

‐> A intensidade da luz dispersa a 90o _{é proporcional à complexidade,}

(11)

‐> Capacidade de uma dada molécula emitir uma radiação electromagnética a um comprimento de onda superior ao da radiação incidente.

Luz fluorescente emitida tem menor energia e maior

comprimento de onda Fluoresceína

λ = 530 nm

Luz Incidente de

maior energía Fluorocromo

CO₂H O OH

λ = 480 nm

(12)

Dispersão da Fluorescência

‐> A fluorescência emitida é detectada por foto‐sensores que captam a luz com um comprimento de onda seleccionado.

‐> A especificidade da detecção de cada sensor é controlada pela selecção do comprimento de onda, através de uma conjugação de filtros e de espelhos dicróicos.

Laser

Sensor de FS

Detectores de Fluorescência (PMT1, PMT4 etc.)

(13)

Espelho Dicróico -Colocado a 45

o

Luz Reflectida

Luz Transmitida

Fonte de Luz

(14)

Espelhos Dicróicos

‐> Os Espelhos Dicróicos são Filtros responsáveis por separar a radiação (divisão da fluorescência em várias

cores, FL‐1, FL‐2, FL‐3 e FL‐4),

permitindo medições simultâneas de vários parâmetros numa só amostra.

(15)

Cell Sorting

‐> Os separadores físicos permitem separar partículas de interesse para compartimentos alvo; ‐> A separação é conseguida por vibração da corrente de fluido por aplicação de uma frequência muito elevada levando à formação de gotículas com 0 ou 1 partícula (idealmente); ‐> Se as partículas satisfizerem os critérios impostos é adicionada uma carga eléctrica; ‐>As gotículas ao caírem passam por duas placas metálicas, fortemente carregadas positivamente ou negativamente – as gotículas são conduzidas pelas placas de polaridade oposta para um compartimento de colheita.

(16)

Cytometric Bead Array (CBA)

Assays

‐> O CBA consiste numa mistura de esferas fluorescentes com diferentes intensidades, mas uniformes no tamanho e conjugadas com anticorpos. Desta forma, o analíto é capturado pela partícula e marcado com outro anticorpo, este com fluorescência distinta da esfera. Assim, a fluorescência obtida torna‐ se proporcional à concentração do analíto na amostra.

(17)

Aplicação da Citometria de Fluxo

(técnica citológica avançada)

ao estudo de populações de

leveduras

(18)

Objectivos:

Avaliação do efeito do etanol e do ácido acético na perda de integridade da membrana plasmática e na degradação mitocondrial na levedura

Saccharomyces cerevisiae

Princípios:

‐> O iodeto de Propídeo (IP) é uma sonda fluorescente que permite avaliar a integridade da membrana plasmática;

‐> se a célula integrar IP poderemos concluir que houve perda da integridade da membrana plasmática uma vez que em situações normais as células são

impermeáveis a IP.

‐> a degradação mitocondrial pode ser monitorizada pela expressão de uma fusão da Green Fluorescent Protein (GFP) com a citrato sintetase da matriz mitocondrial ;

‐> esta fusão permite visualizar a morfologia do compartimento mitocondrial e monitorizar a sua degradação pela detecção da perda de fluorescência

(19)

Protocolo:

Procedeu‐se à preparação e recolha das células e à sua suspensão nas seguintes condições: Tubo0‐ 10 ml de meio de cultura SCGal‐TRP. Tubo1‐ 10 ml de meio de cultura SCGal‐TRP, pH 3.0, 140mM ácido acético. Tubo2‐ 10 ml de meio de cultura SCGal‐TRP, 10% (v/v) de etanol. Tubo3‐ 10 ml de meio de cultura SCGal‐TRP, 12% (v/v) de etanol. Tubo4‐ 10 ml de meio de cultura SCGal‐TRP, 14% (v/v) de etanol. Observou‐se ao microscópio de fluorescência de uma amostra do Tubo 0.

A estirpe Saccharomyces cerevisiae W303‐ 1A transformada com o plasmídeo pYX‐ mtGFP foi cultivada overnight em meio de cultura Synthetic Complete com galactose

(20)

Resultados e discussão dos

resultados:

_{1º observação ao}

microscópio:

‐ Sem qualquer tratamento

(21)

Retiraram‐se amostras dos diferentes meios de cultura para análise no citómetro de fluxo aos seguintes tempos: ‐> T75 (75 min. ) ‐> T145 (145 min.) ‐> T230 (230 min.) ‐> T380 (380min.) para análise da fluorescência verde (degradação mitocondrial) e para análise da fluorescência vermelha (integridade da membrana plasmtica) após 5 min. de incubação à temperatura ambiente, no escuro.

Protocolo:

(22)

Resultados e discussão :

1ª parte- Citómetro de Fluxo

AF_W303_T0 (autofluorescência aos 0 min) ‐> A partir da análise do scattergram podemos avaliar a homogeneidade da população no que respeita ao tamanho relativo e complexidade relativa ‐> as células que se encontram rodeadas, no scattergram, pelo gate A são analisadas quanto à sua fluorescência vermelha no 2º gráfico (histograma monoparamétrico de FL‐4) ‐> Toda a população analisada localiza ‐se na zona D, pelo que a amostra não tratada apresenta marcação IP ‐. A D E

(23)

Resultados e discussão:

IP_W303_T0 GFP_W303_T0

(24)

(25)

(26)

Resultados e discussão:

IP_W303_T0

IP_W303_10%_T380

(27)

2ª parte- Imunofluorescência

Protocolo:

Colocou‐se 10 μl de células (previamente sujeitas a 14% de etanol, sendo submetidas a várias centrifugações, incubações e lavagens em que se utilizou sorbitol 1.2M; β‐

mercaptoetanol; zymolyase 20T 1000 mg/ml, etc ) em cada poço de uma lâmina para imunofluorescência.

Os anticorpos utilizados foram o anti‐citocromo c diluído 1:100 e o mouse‐FITC diluído 1:20 (ambos diluídos em leite).

No final, montou‐se com vectashield, selou‐se com verniz e observou‐se ao microscópio.

(28)

Resultados e discussão

(29)

Conclusão:

Tanto o ácido acético como o etanol causam danos nas leveduras uma vez que, como podemos constatar pelas experiências realizadas, a partir de determinadas concentrações estes tornam‐se citotóxicos; O ácido acético apresenta maior citotoxicidade que o etanol; Quanto maior for a concentração de etanol e maior o tempo de incubação, maior será a degradação das mitocôndrias e perda de integridade da membrana celular;

Através da citometria de fluxo conseguimos confirmar a degradação do compartimento mitocondrial e a perda de integridade da membrana plasmática;

Através da microscopia conseguimos confirmar a alteração na morfologia das mitocôndrias e a sua fragmentação.

(30)

Bibliografia:

• Kitagaki H., Arakia Y., Funatob K., e Shimoi H. (2007) Ethanol‐induced death in yeast

exhibits features of apoptosis mediated by mitochondrial fission pathway, FEBS Letters, Japan, 2935–2942

• Gregori G., Ragheb K., Robinson, J. P. (2003) Introduction to WinMDI 2.8 for the Analysis

of Flow Cytometry Listmode Data Files, Purdue University Cytometry Laboratories, July, Versão1.0