1 ESTOCAGEM DO BIOSSURFACTANTE PRODUZIDO POR PSEUDOMONAS
AERUGINOSA PARA BIORREMEDIAÇÃO
A
Resultados Parciais do Projeto de Iniciação Científica (PIBIC-UNICAP). Financiamento: CNPq, TERMOPE, UNICAP.
Gabriel Neves da Motta Silveira1; Juliana Moura de Luna2; Raquel Diniz Rufino2; Leonie Asfora Sarubbo3
1
Graduando em Engenharia Quimica, UNICAP e Centro de Ciências e Tecnologia. [CEP: 52030-000, gabrielneves@msn.com]. Bolsista PIBIC/Voluntário. 2 Pós-Doutorandas
(PNPD), UNICAP e Centro de Ciências e Tecnologia, UNICAP. Bolsistas CAPES/FACEPE. 3Professora e Pesquisadora do Centro de Ciências e Tecnologia,
UNICAP.
Resumo
Com o desenvolvimento da zona portuária de SUAPE, em Pernambuco e com a vinda de navios petroleiros que carregarão o petróleo para a Refinaria Abreu e Lima se faz necessário desenvolver tecnologias que amenizem os possíveis impactos ambientais que podem surgir em virtude do transporte de derivados de petróleo. Pensando nisso, o biossurfactante obtido de Pseudomonas aeruginosa foi suplementado com 0,2% de sorbato para conservar suas propriedades ao longo de 45 dias visando estudar a estabilidade do biossurfactante como agente de biorremediação. Em seguida, o biossurfactante estocado foi submetido a diferentes pH’s, concentrações de sal e temperatura para avaliar a manutenção de suas propriedades em condições ambientais específicas. Os resultados revelaram que o biosurfactante manteve suas propriedades tensoativas ao longo dos dias de estocagem, apresentando resultados positivos para a dispersão do óleo de motor, além de emulsificá-lo completamente. Com isso, o biossurfactante se monstrou adequado para aplicação na biorremediação de um derramamento de derivados de petróleo.
2 INTRODUÇÃO
Desde os anos 70, diversas metodologias vêm sendo utilizadas para detectar a presença de contaminantes no solo ou nos sedimentos. Isto é particularmente importante, uma vez que o despejo indiscriminado, os métodos insuficientes de estocagem de resíduos e o tratamento e disposição desses têm contribuído para a contaminação ambiental (MULLIGAN et al, 2009).
Nesse sentido, a utilização de compostos surfactantes torna-se uma alternativa atrativa na remoção de contaminantes hidrofóbicos gerados pela indústria de petróleo (MUKHERJEE et al., 2006). Os surfactantes são compostos anfipáticos que se particionam, preferencialmente, na interface entre fases fluidas com diferentes graus de polaridade, apresentando várias aplicações industriais. Os surfactantes possuem estrutura molecular com grupos hidrofílicos e hidrofóbicos que exibem propriedades como adsorção, formação de micelas, formação de macro ou micro emulsões, ação espumante, solubilidade e detergência, todas ligadas à capacidade de redução da tensão superficial por essas moléculas (SEYDLOVÁ; SVOBODOVÁ, 2008; TORRES et al., 2011).
Nos últimos anos, os estudos voltados para a produção de biossurfactantes têm se intensificado em função das características desses compostos como biodegradabilidade, baixa toxicidade, especificidade e estabilidade sob condições ambientais extremas de temperatura, pH e salinidade (FELSE et al., 2006; MUKHERJEE et al., 2006). Nesse contexto, as indústrias de petróleo e petroquímica destacam-se como os maiores campos de aplicação dos biossurfactantes.
O Pólo Petroquímico de SUAPE tem permitido ao Estado de Pernambuco alcançar níveis de desenvolvimento elevados em virtude da instalação de inúmeros empreendimentos econômicos. A instalação da Refinaria Abreu e Lima, entretanto, tem despertado a preocupação das indústrias instaladas no seu entorno, que encontram-se sujeitas a perigo iminente de derramamento ou vazamento desses produtos. Portanto, faz-se necessário o defaz-senvolvimento de estratégias tecnológicas para prevenir problemas indesejáveis causados por possíveis acidentes ambientais. Neste caso, o desenvolvimento de uma tecnologia de aplicação de biossurfactante na contenção e degradação de resíduos de derivados de petróleo apresenta-se como solução para evitar danos ao meio ambiente marinho.
3 Assim, o objetivo desse trabalho foi testar a estabilidade de um biossurfactante visando a formulação de um aditivo que possa ser utilizado na remediação de águas marinhas contaminadas com derivados de petróleo e que garanta a preservação dos recursos marinhos.
MATERIAL E MÉTODOS
Microrganismo: Pseudomona aeruginosa (UCP0992) foi utilizada como produtora de agente surfactante. A cultura foi mantida em meio Ágar Nutriente (AN). Repiques foram mensalmente realizados para manter a viabilidade celular.
Substratos: resíduos industriais foram utilizados como substratos. Milhocina e resíduo de borra de refinaria de óleo vegetal, cedido por uma indústria alimentícia local, foram adicionados ao meio de produção do biossurfactante.
Preparação do inoculo: culturas jovens da bactéria obtidas após 24 horas de cultivo em meio AN foram transferidas para Erlenmeyer contendo 50 mL de Caldo Nutritivo (CN), o qual foi mantido sob agitação orbital de 200 rpm durante um período de 10-14 horas a 37°C para obtenção de uma D.O. (Densidade Óptica) de 0,7 (correspondente a um inóculo de 107 U.F.C./mL) a 600 nm. Esta leitura foi utilizada como inóculo na concentração de 1% (v/v).
Meio de produção: para a produção do biossurfactante foi utilizado o meio mineral contendo 2,5 % de milhocina e 2,5 % de resíduo de borra de refinaria de óleo vegetal (FARIAS et al., 2007). Após o preparo dos meios o pH foi ajustado para 7,0 com auxílio de uma solução 5M de NaOH e estes foram autoclavados a 121°C por 20 minutos.
Produção do biossurfactante: as fermentações para produção do biossurfactante foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 500 mL de capacidade, contendo 100 mL do meio de produção e incubados com 1% do pré-inóculo. Os frascos foram mantidos sob agitação orbital de 250 rpm durante 120 horas, à temperatura de 37°C. Ao fim do cultivo, amostras foram retiradas para determinação da tensão superficial.
4 Conservação do líquido metabólico com propriedade surfactante: o líquido metabólico do biossurfactante produzido foi conservado adicionando 0,2% de sorbato. Em seguida, o líquido metabólico tratado foi estocado à temperatura ambiente ao longo de 45 dias para observação da estabilidade. Testes foram realizados para determinação do tempo de estocagem (0, 15, 30, 45 dias) à temperatura ambiente de 28-30 ºC, verificando-se a tensão superficial, a capacidade de emulsificação e a estabilidade frente a condições específicas como presença de sal (1, 3, e 5%), aquecimento (40 e 50 ºC) e variações de pH (5, 7 e 9). Testes de dispersão/agregação também foram realizados. A tensão superficial foi medida em tensiômetro automático KSV Sigma 700 (Finland) utilizando-se a técnica do anel de NUOY e a determinação da atividade de emulsificação foi analisada conforme descrito por Cooper e Goldenberg (1987) em óleo de motor, óleo vegetal de milho e de soja.
Dispersãode óleo de motor em água do mar pelo líquido metabólico com propriedade surfactante: a capacidade de dispersão ou agregação de óleo de motor foi simulada em laboratório contaminando-se amostras de água do mar coletadas nas proximidades do sistema de captação do sistema gerador de energia da Termelétrica com 5% de óleo. Testes foram conduzidos pela adição do líquido metabólico livre de células após o cultivo nas proporções 1:2; 1:8 e 1:25 (Biossurfactante:Óleo, vol/vol). Os resultados foram observados visualmente e a relação entre o volume necessário de biossurfactante e as dimensões da “gota” calculados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Aplicação do biossurfactante como agente de biorremediação
A figura 1 mostra o comportamento da tensão superficial do biossurfactante produzido por Pseudomonas aeruginosa ao variar condições como pH, concentração de NaCl e temperatura.
O líquido metabólico contendo o biossurfactante produzido por Pseudomonas
aeruginosa demonstrou uma tensão superficial de 27,46 mN/m que se apresentou
estável, ao se adicionar sorbato como conservante a uma concentração de 0,2%, no primeiro dia de análise (tempo zero). Levando em consideração que a tensão superficial do pH 7 é o liquido metabólico apenas com a adição de sorbato, nota-se um decaimento
5 significativo na tensão superficial para todas as condições analisadas, o que não pôde ser observado para o pH 9 no primeiro dia do experimento (dia zero) antes da adição do sorbato e para o pH 7 que se mantem o valor da tensão original do liquido metabólico.
Figura 1- Tensões Superficiais do biossurfactante bruto produzido por P.
aeruginosa em meio formulado com água destilada contendo 2,5 % de milhocina e 2,5
% de resíduo de borra de refinaria de óleo vegetal frente a variação de pH (A), concentração de NaCl (B) e Temperatura (C)
Na figura 2 é possível observar o comportamento do biossurfactante atuando como dispersante de óleo de motor nas proporções 1:2; 1:8 e 1:25 (Biossurfactante:Óleo, vol/vol), em que observa-se que ao alterar o pH original do biossurfactante, que é 7 (Figura 2.B) para pH 5 e 9, a sua ação como dispersante começa a decair (figura 2A e 2C), tendo como o melhor resultado de dispersão no 45º dia de analise.
Figura 2- Dispersão de óleo motor em água do mar pelo biossurfactante bruto produzido por P. aeruginosa em meio formulado com água destilada contendo 2,5 % de milhocina e 2,5 % de resíduo de borra de refinaria de óleo vegetal frente a diferentes
valores de pH5 (A), pH 7 (B) e pH 9
(C)
A figura 3 mostra a dispersão do óleo motor variando as concentrações de NaCl (1%, 3% e 5%) (Figuras 3A, 3B e 3C, respectivamente), sendo observado que o biossurfactante apresentou melhor resultado na menor concentração de NaCl, obtendo no dia zero, uma dispersão 100% para as diferentes proporções de óleo utilizadas.
6 A figura 4 mostra o comportamento da dispersão levando em consideração as variações de temperatura as quais o biossurfactante produzido foi submetido a 40ºC (Figura 4A) e 50ºC (Figura 4B) o biossurfactante teve um bom resultado no seu trigésimo dia de experimento com valores próximos a 90% de dispersão do óleo motor.
Figura 3- Dispersão (%) do biossurfactante bruto produzido por P. aeruginosa em meio formulado com água destilada contendo 2,5 % de milhocina e 2,5 % de resíduo de borra de refinaria de óleo vegetal frente a concentração de 1% de NaCl(A), 3% de NaCl
(B) e 4% de NaCl (C)
Figura 4- Dispersão (%) do biossurfactante bruto produzido por P. aeruginosa em meio formulado com água destilada contendo 2,5 % de milhocina e 2,5 % de resíduo de
borra de refinaria de óleo vegetal frente a temperatura de 40ºC (A) e 50ºC (B)
Nos testes para determinação do índice de emulsificação, observou-se que em todas as condições testadas, o biossurfactante produzido conseguiu emulsificar valores de 90% a 100% do óleo de motor. A figura 5 mostra que no pH 9 (figura 5 C) o biossurfactante conseguiu emulsificar bem óleo de milho e de soja chegando a emulsificar até 88,23% dos óleos quando comparado ao pH 7 (Figura 5 B) e o pH 5 (Figura 5 A).
Figura 5- Indice de emulsificação do biossurfactante bruto produzido por P.
aeruginosa em meio formulado com água destilada contendo 2,5 % de milhocina e 2,5
% de resíduo de borra de refinaria de óleo vegetal frente a diferentes valores de pH5 (A), pH 7 (B) e pH 9 (C)
7 Para as concentrações de NaCl, a figura 6 mostra que o biossurfactante apresentou o melhor percentual de emulsificação 62,5%, para o óleo de milho, quando adicionou-se 1% de NaCl (Figura 6 A) ao líquido metabólico, no décimo quinto dia de experimento. Já na concentração de 3% de NaCl (Figura 6 B) os índices de emulsificação mantiveram-se constantes, tendo uma pequena queda no trigésimo dia. Para a condição contendo 5% de NaCl (Figura 6 C) o biossurfactante apresentou boas emulsões no décimo quinto dia.
Figura 6- Indice de emulsificação do biossurfactante bruto produzido por P.
aeruginosa em meio formulado com água destilada contendo 2,5 % de milhocina e 2,5
% de resíduo de borra de refinaria de óleo vegetal frente a concentração de 1% de NaCl(A), 3% de NaCl (B) e 4% de NaCl (C)
Quando o liquido metabólico, contendo o biossurfactante produzido, foi submetido a variações de temperatura (Figura 7), observou-se que houve uma diminuição gradativa na atividade de emulsificação, tanto para o óleo de milho quanto para o óleo de soja. Já para as temperaturas de 40ºC e 50ºC (Figura 7A e 7B) no dia zero foram observados índices de emulsificação com valores de 75% e 70% de óleo de milho e de soja, respectivamente.
Figura 7- Indice de emulsificação do biossurfactante bruto produzido por
Pseudomonas aeruginosa em meio formulado com água destilada contendo 2,5 % de
milhocina e 2,5 % de resíduo de borra de refinaria de óleo vegetal frente a temperatura de 40ºC (A) e 50ºC (B)
8 CONCLUSÃO
1. O biossurfactante demonstrou um comportamento favorável para futura aplicação em processos de descontaminação de ambientes aquáticos, com pH de 5 a 7 e 5% de salinidade.
2. O biossurfactante pode atuar principalmente como um bom agente de dispersão e emulsificação para o óleo motor, além de apresentar propriedades tenso-ativas, que são favoráveis para a sua aplicação como agente biorremediador em um possível derramamento de petróleo ou derivados.
REFERÊNCIAS
COOPER, D.G.; GOLDENBERG, B.G. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 53, p. 224-229, 1987.
FARIAS, C.B.B.; SARUBBO, L.A. Biossurfactante de Pseudomonas aeruginosa: caracterização, aplicação na remoção de poluentes oleosos e otimização da produção. In: 9ª Jornada de Iniciação Científica da UNICAP, 9 , Recife , 2007.
FELSE, P. A.; SHAH, V.; CHAN, J.; RAO, K. J.; GROSS, R. A. Sophorolipid biosynthesis by Candida bombicola from industrial fatty acid residues. Enzyme and Microbial Technology, 2006..
MUKHERJEE, S.; DAS, P.; SEN, R. Towards commercial production of microbial surfactants. Trends in Biotechnology, v. 24, p. 509-515, 2006..
MULLIGAN, C N. Recent advances in the environmental applications of biosurfactants. Current Opinion In Colloid & Interface Science, v. 14, p.372-378, 2009.
SEYDLOVÁ, G.; SVOBODOVÁ, J. Review of surfactin chemical properties and the potential biomedical applications, Central European Journal of Medicine, v. 2, p. 123-133, 2008..
TORRES, L.; MOCTEZUMA A.; AVENDAÑO, J.R.; MUÑOZ, A.; GRACIDA, J. Comparison of bio- and synthetic surfactants for EOR. Journal of Petroleum Science and Engineering, v. 76 p. 6–11, 2011.
