RENATA LEBORATO GUERRA
AVALIAÇÃO DE CUSTO-EFETIVIDADE DE DIFERENTES ESTRATÉGIAS LABORATORIAIS PARA A REALIZAÇÃO DE UM TESTE DE AMPLIFICAÇÃO DE
ÁCIDO NUCLÉICO NO DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE PULMONAR
RIO DE JANEIRO 2009
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Renata Leborato Guerra
AVALIAÇÃO DE CUSTO-EFETIVIDADE DE DIFERENTES ESTRATÉGIAS LABORATORIAIS PARA A REALIZAÇÃO DE UM TESTE DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO NO DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE PULMONAR
Um volume
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Pneumológicas
Orientadores: Marcus Barreto Conde Susan Elizabeth Dorman
Rio de Janeiro 2009
Guerra, Renata Leborato
Avaliação de custo-efetividade de diferentes estratégias laboratoriais para a realização de um teste de amplificação de ácido nucléico no diagnóstico da tuberculose pulmonar / Renata Leborato Guerra . -- Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2009.
64 f. : il. ; 31 cm.
Orientadores: Marcus Barreto Conde e Susan Elizabeth Dorman Dissertação (mestrado) – UFRJ / Faculdade de Medicina / Pós-graduação em Clínica Médica, 2009.
Referências bibliográficas: f. 52-56
1. Tuberculose pulmonar - diagnóstico. 2. Técnicas e procedimentos de laboratório. 3. Técnicas de amplificação de ácido nucléico - utilização 4. Avaliação de custo –efetividade. 5. Ciências Pneumológicas - Tese. I. Conde, Marcus Barreto. II. Dorman, Susan Elizabeth. III.Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Clínica Médica. IV. Título.
Renata Leborato Guerra
AVALIAÇÃO DE CUSTO-EFETIVIDADE DE DIFERENTES ESTRATÉGIAS LABORATORIAIS PARA A REALIZAÇÃO DE UM TESTE DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO NO DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE PULMONAR
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Pneumológicas
Aprovada em ______ de _________________ de __________.
_________________________
José Roberto Lapa e Silva, Médico, PhD, Professor Titular da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro
________________________________
Sônia Catarina de Abreu Figueiredo, Médica, PhD, Professor Adjunto da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro
__________________
Rafael Silva Duarte, Bacharel em Microbiologia e Imunologia, PhD, Professor Adjunto do Departamento de Microbiologia Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro
Agradecimentos
Este estudo foi realizado em colaboração com a Universidade Johns Hopkins em Baltimore, Maryland, Estados Unidos da América (EUA), sendo financiado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA (National Institutes of Health - NIH) e pelo Programa ICOHRTA (International Clinical, Operational and Health Services Research Training Award) do NIH dos EUA.
Meus agradecimentos são dirigidos a todos que, de alguma forma, contribuiram para a realização do estudo e conclusão desta dissertação.
Aos meus orientadores, Marcus Barreto Conde e Susan Elizabeth Dorman, com quem aprendi, desde os primeiros passos, a produzir ciência de forma ética e com qualidade.
À equipe do Centro de Pesquisa em Tuberculose da Universidade Johns Hopkins, coordenado por Richard E. Chaisson e à equipe do laboratório de Tuberculose do estado de Maryland, coordenado por Nancy Hooper, pelo apoio e contribuição à realização deste estudo.
À equipe do Laboratório de Pesquisa Clínica em Tuberculose do Instituto de Doenças do Tórax pelo excelente ambiente de trabalho proporcionado.
À minha família, exemplo e inspiração de vida, sempre me incentivando a continuar perseguindo meus objetivos.
Resumo
GUERRA, Renata Leborato. Avaliação de custo-efetividade de diferentes estratégias laboratoriais para a realização de um teste de amplificação de ácido nucléico no diagnóstico da tuberculose pulmonar. Rio de Janeiro, 2009. Dissertação (Mestrado em Ciências Pneumológicas) - Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009.
A diluição de amostras respiratórias tem sido proposta como uma estratégia para minimizar a inibição da amplificação de ácidos nucléicos obtida no teste EMTD (Enhanced Amplified
Mycobacterium tuberculosis Direct). O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto da diluição de
amostras respiratórias no rendimento do teste EMTD para o diagnóstico da tuberculose (TB) pulmonar em um laboratório de referência para os programas de controle da TB no estado de Maryland, Estados Unidos. Um total de 491 amostras respiratórias, submetidas à pesquisa direta de bacilo álcool-ácido resistente (BAAR), teste EMTD pelo método convencional e pelo método de diluição e cultura para micobactéria, foi analisado. A diferença entre as sensibilidades do teste EMTD pelos métodos de diluição e convencional foi de 15,9% (99.1% versus 83.2% respectivamente; p=0,001) para amostras com pesquisa de BAAR positiva e -3,6% (46.4% versus 50% respectivamente; p=0,38) para amostras com pesquisa de BAAR negativa. Além disso, um modelo de análise de decisão foi realizado para avaliar e comparar a relação de custo-efetividade de estratégias laboratoriais atuais para a realização do teste EMTD, incluindo a estratégia recomendada pelo Centro de Controle de Doenças dos Estados Unidos da América (Centers for
Disease Control and Prevention), e novas estratégias que incluam o método de diluição do teste
EMTD para o diagnóstico da TB pulmonar. A estratégia com melhor custo-efetividade (USD$53.40 por diagnóstico correto fornecido pelo teste) foi aquela em que apenas amostras com pesquisa de BAAR positiva foram diluídas antes da realização do teste EMTD.
Abstract
GUERRA, Renata Leborato. Cost-efectiveness of different laboratory strategies for nucleic acid amplification testing for pulmonary tuberculosis diagnosis. Rio de Janeiro, 2009. Dissertação (Mestrado em Ciências Pneumológicas) - Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009.
Respiratory specimen dilution has been proposed as a strategy to minimize the acid nucleic amplification inhibition of the EMTD (Enhanced Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct) test. The study objective was to evaluate the impact of respiratory specimen dilution on EMTD test accuracy for pulmonary tuberculosis (TB) diagnosis in a reference laboratory for the TB control programs in Maryland State, USA. A total of 491 specimens, submitted to smear, dilution and conventional EMTD testing methods, and mycobacteria culture, were analyzed. The difference in EMTD sensitivity between the dilution and conventional methods was 15.9% (99.1% versus 83.2% respectively; p=0.001) for smear-positive, and -3.6% (46.4% versus 50% respectively; p=0.38) for smear-negative specimens. In addition, a decision analysis model was constructed to assess and compare the cost-effectiveness of current strategies for EMTD testing, including the recommended strategy of United States’ Centers for Disease Control and Prevention, and new strategies including specimen dilution for pulmonary TB diagnosis. The most cost-effective strategy (USD$53.40 per correct diagnosis by the test) was one in which only smear-positive respiratory specimens were diluted prior to EMTD testing.
Lista de abreviaturas
AAN amplificação de ácido nucleico
ATS American Thoracic Society
BAAR bacilo álcool-ácido resistente
CDC Centers for Diseases Control and Prevention
DHMH Department of Health and Mental Hygiene
DNA deoxyribonucleic acid
DOTS Directly Observed Treatment Short Course
MTD Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test
EMTD Enhanced Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test
EUA Estados Unidos da América
FDA Food and Drug Administration
HIV Human Immunodeficiency Virus
MNT micobactéria não-tuberculose OMS Organização Mundial de Saúde
PCR Polimerase Chain Reaction
RLU relative light units
RNA ribonucleic acid
TB tuberculose
UFC unidades formadoras de colônia VPN valor preditivo negativo
Lista de tabelas
Tabela 1. Resultados de pesquisa direta de BAAR e cultura para micobactéria de 491 amostras respiratórias ... ... 44 Tabela 2. Rendimento do teste EMTD para os dois métodos utilizados, convencional e com uma diluição de 1:10, em amostras respiratórias com pesquisa de BAAR positiva ...45 Tabela 3. Rendimento do teste EMTD para os dois métodos utilizados, convencional e com uma diluição de 1:10, em amostras respiratórias com pesquisa de BAAR negativa...46 Tabela 4. Análise de custo-efetividade das diferentes estratégias laboratoriais para realização do teste EMTD...48
Lista de figuras
Figura 1. Custo-efetividade do teste EMTD por prevalência de TB entre amostras com pesquisa direta de BAAR positiva (eixo X) e número de amostras com pesquisa direta de BAAR positiva processadas por ano (eixo Y) ...33 Figura 2. Árvore de decisão para análise de custo-efetividade de diferentes estratégias para a realização do teste EMTD. Definição das variáveis: custo_T1-4 (custo total da respectiva estratégia), p_dc1-4 (probabilidade de diagnóstico correto pelo teste EMTD para a respectiva estratégia)...47 Figura 3. Custo-efetividade da “estratégia CDC” e da “estratégia de diluição seletiva” após a análise de sensibilidade para alterações na sensibilidade do teste EMTD pelos métodos convencional e de diluição para amostras com pesquisa de BAAR positiva...50
Página de assinaturas...i Agradecimentos ... ...ii Resumo ... iii Abstract ... iv Lista de abreviaturas ... v Lista de tabelas ... vi
Lista de figuras ... vii
1 INTRODUÇÃO ... ...1 2 REVISÃO DA LITERATURA ... 11 3 JUSTIFICATIVA ... 28 4 OBJETIVOS ... 30 5 METODOLOGIA ... 31 5.1 Modelo do estudo ... 31 5.2 População de referência ... 31 5.3 População do estudo ... 31 5.4 Seleção da amostra ... 31 5.4.1 Critérios de inclusão ... 31 5.4.2 Critérios de exclusão ... 31 5.5 Período do estudo ... 31 5.6 Operacionalização do estudo. ... 32 5.7 Aspectos estatísticos. ... 33 5.8 Aspectos éticos ... 35
6. RESULTADOS ... 36 7. DISCUSSÃO ... 43 8. CONCLUSÕES ... 51 Referências bibliográficas ... 52 Anexo A ... 57 Anexo B ... 58 Apêndice A ... 59 Apêndice B ... 60 Apêndice C ... 63
1. INTRODUÇÃO
Apesar das estimativas anuais consecutivas da Organização Mundial de Saúde (OMS) sobre a tuberculose (TB) sugerirem que os três principais indicadores de doença – taxas de incidência, prevalência e mortalidade – vêm reduzindo globalmente, a TB continua sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade em vários países e um importante problema de saúde pública em todo o mundo (WHO, 2008).
Em 2006, a OMS estimou 9.2 milhões de casos novos de TB no mundo (taxa de incidência 139/100.000 habitantes), incluindo os 4.1 milhões (44%) de casos novos com baciloscopia direta de escarro positiva. Além disso, foram estimados 14.4 milhões de casos prevalentes e 1.7 milhões de óbitos, incluindo os 0.2 milhões de casos com coinfecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV – Human Immunodeficiency Virus) (WHO, 2008).
O combate à TB tem sido sugerido pela OMS como parte integrante de programas nacionais de desenvolvimento e alguns objetivos internacionais foram adotados com a finalidade de ampliar o compromisso global para o controle da TB. Esses objetivos, aprovados pela OMS em 1991, correspondem a uma detecção de 70% dos casos novos de TB com baciloscopia direta de escarro positiva e o tratamento com sucesso de 85% dos casos detectados (BLANC, 2007). Como forma de alcançar tais objetivos, a OMS sugeriu um conjunto de ações conhecido como estratégia DOTS (Directly Observed Treatment Short Course) ou Tratamento Diretamente Observado de Curta Duração. A estratégia DOTS é composta por cinco elementos:
1- Comprometimento dos governos no suporte financeiro das atividades de controle da TB; 2- Detecção dos casos através da baciloscopia direta do escarro em indivíduos sintomáticos
3- Esquema de tratamento padronizado e diretamente observado (DOT) pelo menos nos 2 primeiros meses;
4- Suprimento regular dos medicamentos anti-TB;
5- Sistema padronizado de registro e notificação que permita conclusões seguras sobre o resultado do tratamento para cada paciente e sobre o programa de controle de forma geral.
A estratégia DOTS foi implementada no Brasil em 1998, apresentando uma cobertura de 86% das regiões em 2006 (WHO, 2008). Considerando o segundo elemento da estratégia DOTS, a baciloscopia direta para pesquisa de bacilo álcool-ácido resistente (BAAR) no escarro pode ser descrita como um método laboratorial simples, rápido e de relativo baixo custo (ATS, 2000). Além de ser a primeira evidência bacteriológica da presença do bacilo da TB na amostra clínica, a pesquisa de BAAR fornece uma estimativa do número de bacilos presentes na amostra, sendo capaz de identificar os pacientes com maior carga de M. tuberculosis no escarro, isto é, aqueles com maior capacidade de infectar outros indivíduos (ATS, 2000). Entretanto, para que um resultado positivo seja obtido através da pesquisa de BAAR pelo método de Zielh-Neelsen em amostra clínica de paciente com TB pulmonar, a presença de 5.000 a 10.000 bacilos por mililitro de amostra clínica é necessária (ATS, 2000).
Assim, a limitação da pesquisa de BAAR no escarro em detectar os casos de TB pulmonar tem sido uma importante barreira para o controle da TB globalmente (PERKINS, 2000). Por exemplo, considerando todas as áreas no mundo em que o programa DOTS foi implementado, apenas 55% do total de casos novos de TB estimados pela OMS foram detectados em 2005 (WHO, 2008). Um aumento na detecção de casos de TB pode ser alcançado não apenas através da expansão geográfica da cobertura do programa DOTS, mas através do aumento no
número total de casos de TB diagnosticados dentro das áreas de DOTS já estabelecidas (WHO, 2008).
Além de um aperfeiçoamento dos métodos diagnósticos atualmente existentes, um interesse aumentado tem surgido em relação ao desenvolvimento de novas tecnologias que promovam uma rápida identificação do bacilo da TB (STEINGART, 2006, PERKINS, 2000, SHINNICK, 1995). Como esperado, os países desenvolvidos têm demonstrado vantagens em relação ao desenvolvimento e uso de novos testes diagnósticos (TENOVER, 1993; SALFINGER, 1994). Um dos mais importantes avanços tecnológicos para os laboratórios de TB nestes países foi o desenvolvimento de testes de amplificação de ácidos nucléicos (AAN), ácido ribonucléico (RNA - ribonucleic acid) ou ácido desoxirribonucléico (DNA - deoxyribonucleic acid). Estes testes promovem, em poucas horas, a amplificação e detecção de seqüências de ácidos nucléicos específicas do complexo M. tuberculosis, sendo progressivamente utilizados para o diagnóstico da TB pulmonar como uma ferramenta adicional aos testes convencionais, isto é, pesquisa de BAAR e cultura para micobactéria (SALFINGER, 1994; RICHELDI, 1995; PERKINS, 2000; ATS, 2000).
Apesar dos testes de AAN serem capazes de detectar o complexo M. tuberculosis em amostras contendo apenas 10 bacilos em laboratórios de pesquisa, ensaios clínicos realizados posteriormente demonstraram que os melhores resultados, especialmente no que diz respeito à sensibilidade do teste para a detecção da TB pulmonar, foram alcançados em amostras respiratórias com pesquisa de BAAR positiva (95-96% de sensibilidade, 100% de especificidade); em amostras com pesquisa de BAAR negativa, a sensibilidade dos testes de AAN encontrada foi inferior (48-53% de sensibilidade, 96-99% de especificidade) (ATS, 1997). Em função disto, a Administração de Alimentos e Medicamentos (FDA – Food and Drug
Adminstration) dos Estados Unidos da América (EUA) limitou o uso comercial de apenas dois
testes de AAN em pacientes com pesquisa direta de BAAR positiva nas amostras respiratórias, o Cobas Amplicor (Cobas Amplicor Mycobacterium tuberculosis System - Roche Diagnostic Systems, Branchburg, NJ), método baseado na amplificação do DNA micobacteriano mediada pela DNA polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) e o MTD (Amplified Mycobacterium
Tuberculosis Direct Test – Gen-Probe, San Diego, CA), método baseado na amplificação de
RNA ribossomal micobacteriano mediada pela transcriptase (CDC, 1996).
Entretanto, em 1999, a FDA aprovou uma nova versão do teste MTD para a investigação da TB pulmonar tanto em amostras respiratórias com pesquisa de BAAR positiva quanto em amostras com pesquisa de BAAR negativa (CDC, 2000). A aprovação pela FDA foi baseada nos resultados de um ensaio clínico para a avaliação desta nova versão do teste, o EMTD (Enhanced
Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test), em que o rendimento do EMTD ainda foi
superior nas amostras respiratórias com pesquisa de BAAR positiva (96.9% de sensibilidade, 100% de especificidade) do que nas amostras com pesquisa de BAAR negativa (72% de sensibilidade, 99.3% de especificidade), porém em menor proporção do que na versão anterior (GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). É importante destacar que a nova versão deste teste foi capaz de diagnosticar 72% dos casos com pesquisa de BAAR negativa, ou seja, o EMTD fez um rápido diagnóstico em mais de dois terços dos casos de TB pulmonar que seriam apenas detectados tardiamente pela cultura. Apesar de ainda existirem limitações para o seu uso em amostras paucibacilares, o teste EMTD apresenta importante utilidade quando comparado ao uso isolado dos testes diagnósticos atuais.
Estudos clínicos posteriores confirmaram estes achados (GAMBOA, 1998; BERGMAN, 1999; SCARPARO, 2000; O’SULLIVAN, 2002; PIERSIMONI, 2002; GUERRA, 2007). De
uma forma geral, a especificidade do teste tem sido elevada (97.8%-100%) independentemente do resultado da pesquisa direta de BAAR, porém os valores de sensibilidade têm sido melhores em amostras com pesquisa de BAAR positiva (88%-100%) do que em amostras com pesquisa de BAAR negativa (63%-85.3%). Por conseguinte, com base na alta especificidade do teste, pode ser inferido que o resultado positivo do EMTD confirma o diagnóstico de TB pulmonar tanto em amostras com pesquisa de BAAR positiva quanto em amostras com pesquisa de BAAR negativa. Por outro lado, a utilidade de um resultado negativo de EMTD em amostras com pesquisa de BAAR negativa apresenta certa restrição devido à limitada sensibilidade do teste, embora seja de grande importância em amostras com pesquisa de BAAR positiva por permitir a diferenciação entre TB e doença pulmonar por micobactérias não-tuberculose (MNT), que também podem levar a um resultado positivo pela pesquisa de BAAR.
É importante destacar, que a interpretação do resultado do teste EMTD, além de depender dos seus valores laboratoriais de sensibilidade e especificidade, deve ser baseada tanto na apresentação clínica do paciente quanto na prevalência local de TB e de MNT. Em um estudo realizado por Catanzaro (2000), o valor preditivo positivo (VPP) do EMTD para o diagnóstico da TB pulmonar foi 59% para pacientes com baixo risco de TB e 100% para pacientes com alto risco de TB. Similarmente, o valor preditivo negativo (VPN) do teste foi 91% nos casos com elevada suspeita clínica de TB e 99% nos casos com baixa suspeita clínica de TB (CATANZARO, 2000). Assim, a confidência tanto na confirmação quanto na exclusão do diagnóstico de TB pelo EMTD torna-se maior dependendo do grau de suspeita clínica de TB (CATANZARO, 2000; WOODS, 1999). Nos EUA, onde a prevalência de infecção pulmonar por MNT vem apresentando um aumento progressivo coincidente com a diminuição das taxas de TB, o EMTD tem demonstrado um grande potencial especialmente na diferenciação entre TB e MNT
em pacientes com amostras respiratórias com pesquisa de BAAR positiva (WOODS, 1999; MARRAS, 2002; GUERRA, 2007). Por exemplo, para amostras com pesquisa de BAAR positiva de pacientes com baixo risco para TB e/ou provenientes de uma área onde MNT é comum, um resultado negativo do EMTD pode evitar a decisão de iniciar o tratamento anti-TB até que os resultados da cultura sejam conhecidos, assim como evitar a hospitalização desses pacientes em locais com isolamento respiratório e o início da investigação de seus contatos (WOODS, 1999).
Em países em desenvolvimento, onde estão localizados 95% dos casos de TB e onde 98% dos óbitos pela doença ocorrem, o EMTD poderia ter um importante papel como teste complementar para o diagnóstico rápido da TB pulmonar (WHO, 2008). Embora tenha sido demonstrado que em um local com alta prevalência de TB (94%) o VPP da pesquisa direta de BAAR no escarro seja alto (>96%), a sua sensibilidade é variável (CONDE, 1999). Assim, o teste EMTD poderia, como descrito anteriormente, contribuir para a detecção rápida de uma grande parte dos pacientes com TB pulmonar e pesquisa de BAAR no escarro negativa. Por exemplo, de acordo com dados do Ministério da Saúde, no período de 2001 a 2006 foram notificados 582.342 casos de TB no Brasil, dos quais 466.760 tinham idade superior a 14 anos e apresentavam a forma pulmonar da doença (SINAN, 2008). Dentre estes pacientes, 93.194 (20%) tinham pesquisa direta de BAAR no escarro negativa, ou seja, considerando a sensibilidade do EMTD já demonstrada, até aproximadamente 80 mil pacientes poderiam ter se beneficiado do uso deste teste para a rápida identificação do M. tuberculosis no escarro.
Um estudo realizado em Zambia na África demonstrou sensibilidade do EMTD de 92% em amostras respiratórias com pesquisa de BAAR positiva e 60% em amostras com pesquisa de BAAR negativa. Além disso, considerando-se dados microbiológicos e clínicos como o padrão-ouro, o EMTD apresentou maior sensibilidade (88%) para o diagnóstico da TB pulmonar do que
a baciloscopia direta pelo método de auramina (29%) e, até mesmo, do que a cultura para micobactéria pelo método de Löwenstein-Jensen (71%) (KAMBASHI, 2001).
Uma grande limitação à aplicação dos testes de AAN para o diagnóstico da TB pulmonar nos setores de saúde pública dos países em desenvolvimento é o alto custo do método. Entretanto, estratégias capazes de aumentar a efetividade destes testes, especialmente no que diz respeito a sua sensibilidade quando realizados em amostras com pesquisa de BAAR negativa, poderiam ter um significativo impacto na relação de custo-efetividade para o diagnóstico da TB.
A causa mais freqüente e melhor documentada de resultados falso-negativos dos testes de AAN com conseqüente limitação na sua sensibilidade é a presença de substâncias capazes de inibir a amplificação dos ácidos nucléicos (VALENTINE-THON, 2002; DELLA-LATTA, 1999; SMITH, 1999; SCARPARO, 2000; PIERSIMONI, 2002; SLOUTSKI, 2004). Tais substâncias, ainda pouco conhecidas, podem estar presentes tanto nas amostras clínicas quanto em reagentes utilizados para descontaminação e concentração das mesmas (DELLA-LATTA, 1999; VALENTINE-THON, 2002). Por exemplo, já foi demonstrado que a utilização do tampão de fosfato Alpha-Tec XPR-plus (Alpha-Tec Systems, Inc.) no processamento de amostras clínicas pode prejudicar o rendimento do teste EMTD ao inibir a amplificação dos ácidos nucléicos, sendo tal inibição atribuída à concentração aumentada de fosfato neste tipo de tampão (DELLA-LATTA, 1999). De uma forma geral, uma taxa de inibição de 3,4% a 4,3% tem sido descrita em amostras respiratórias com resultados negativos ou inconclusivos do EMTD, porém com cultura positiva para M. tuberculosis (GAMBOA, 1998; BEGMAN, 1999; SCARPARO, 2000; GEN-PROBE INCORPORATED, 2001; PIERSIMONI, 2002).
Para investigar a presença de substâncias inibitórias em amostras clínicas com pesquisa de BAAR positiva e EMTD negativo, o protocolo do fabricante do teste EMTD assim como o do
Centro para Controle e Prevenção de Doenças (CDC – Centers for Disease Control and
Prevention) dos EUA recomendam que o teste seja repetido em uma alíquota adicional (450 µL)
da amostra após incluir o controle interno positivo de amplificação, que contém M. tuberculosis R37Ra ou H37Rv (CDC, 2000; GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). A obtenção de um resultado positivo do teste repetido demonstra que a amplificação não foi prejudicada, validando conseqüentemente o resultado negativo do primeiro teste. Por outro lado, caso a presença de substâncias inibitórias seja confirmada, o resultado negativo da amostra testada inicialmente não pode ser interpretado corretamente e uma nova amostra clínica do paciente deve ser coletada e analisada (CDC, 2000; GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). Entretanto, a confirmação da presença de substâncias inibitórias em amostra clínica pela técnica recomendada tanto pelo fabricante do teste quanto pelo CDC, além de não fornecer informação diagnóstica e não promover um aumento na sensibilidade do teste, uma vez que um resultado falso-negativo não é modificado, ainda pode acrescentar maior custo ao laboratório pela realização repetida do teste. Além disso, esta técnica recomendada requer um volume adicional de amostra (450 µL) que pode não se encontrar disponível no laboratório após a realização dos outros testes como pesquisa direta de BAAR, EMTD inicial e cultura para micobactéria.
Visando melhorar a sensibilidade dos testes de AAN alguns laboratórios passaram a realizar a diluição apenas de amostras clínicas armazenadas que apresentassem resultados discordantes entre o EMTD inicial (negativo) e a cultura para micobactéria (positiva para M.
tuberculosis) seguida da realização de um novo teste EMTD, independentemente do resultado da
pesquisa de BAAR (SCARPARO, 2000; PIERSIMONI, 2002; SLOUTSKY, 2004). O objetivo da diluição destas amostras clínicas seria atingir uma redução na concentração das substâncias inibitórias presentes de modo que não mais interferissem na amplificação dos ácidos nucléicos do
complexo M. tuberculosis promovida pelo teste. Nestes estudos, esta estratégia produziu um aumento de 7% a 9% na sensibilidade do EMTD, uma vez que mais da metade das amostras respiratórias provenientes de pacientes com diagnóstico de TB que inicialmente renderam um resultado falso-negativo do EMTD passou a apresentar um resultado positivo após a diluição das mesmas (SCARPARO, 2000; PIERSIMONI, 2002; SLOUTSKY, 2004). Entretanto, do ponto de vista da prática clínica, um resultado de EMTD mais acurado alcançado com a diluição realizada apenas em amostras clínicas armazenadas que renderam resultados discrepantes entre EMTD e cultura não apresentaria grande impacto no diagnóstico do paciente, visto que o resultado da cultura para micobactéria já estaria disponível.
O estado de Maryland nos EUA, em 2005, ocupava a 11˚ posicão em prevalência de TB no país, com 283 casos notificados e uma prevalência de 5.1/100.000 habitantes. De acordo com o Sistema Nacional de Vigilância em TB dos Estados Unidos, aproximadamente 60% dos casos de TB no estado de Maryland ocorreram em estrangeiros, sendo estes principalmente provenientes da África e da América Latina (CDC, 2007). O laboratório de TB do Departamento de Saúde e Higiene Mental do estado de Maryland (DHMH - Department of Health and Mental
Hygiene) é o laboratório de referência para todos os Programas de Controle da TB no estado,
realizando anualmente cerca de 9.000 exames de cultura para micobactéria em amostras clínicas, sendo, aproximadamente 75% destas, amostras respiratórias. Desde dezembro de 2003, este laboratório passou a incluir na sua rotina a realização do teste EMTD na primeira amostra respiratória de pacientes cuja pesquisa de BAAR tenha sido positiva, assim como em amostras respiratórias com pesquisa de BAAR negativa conforme requisição do médico assistente. Com o objetivo de reduzir o impacto da presença de substâncias inibitórias no rendimento do teste EMTD, a partir de abril de 2004 o laboratório passou a adotar uma estratégia em que dois testes
EMTD são realizados simultaneamente para cada amostra respiratória, isto é, um teste é realizado em uma alíquota da amostra processada de forma habitual (método convencional) e outro teste é realizado em uma alíquota da mesma amostra após uma diluição de 1:10 (método de diluição).
No entanto, ainda não havia sido realizada nenhuma avaliação do impacto desta estratégia no rendimento do teste de AAN pelo EMTD para o diagnóstico da TB pulmonar. Além disso, apesar de uma melhor sensibilidade do teste EMTD pelo método de diluição ter sido demonstrada em estudos prévios, questões como o impacto do resultado da pesquisa de BAAR nos resultados do EMTD realizado pelo método convencional e pelo método de diluição, assim como a avaliação da relação de custo-efetividade da implementação desta nova técnica de diluição na rotina laboratorial não são conhecidos. Desta forma, uma avaliação retrospectiva do rendimento do teste EMTD e da relação de custo-efetividade de estratégias que incluam o método de diluição na rotina de um laboratório com elevado fluxo de processamento de amostras clínicas permitirá inferir, a partir de um estudo preliminar retrospectivo, a utilidade deste método para melhorar a sensibilidade do teste de AAN para o diagnóstico da TB pulmonar, subsidiando a decisão de conduzir ou não estudo similar prospectivo em laboratórios de rotina localizados em regiões com elevada prevalência de TB.
4. REVISÃO DA LITERATURA
A TB é causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis, principal micobactéria pertencente ao complexo M. tuberculosis responsável por doenças em seres humanos (VAN SOOLINGER, 1997; ATS, 2000). A transmissão do M. tuberculosis entre os indivíduos ocorre por via aérea. Após a sua chegada aos alvéolos pulmonares, a primoinfecção é estabelecida quando o bacilo passa a multiplicar-se no interior do macrófago alveolar, podendo evoluir de duas formas: rápido encarceramento dos bacilos ou, após uma broncopneumonia inespecífica, o encapsulamento dos bacilos e a formação de um granuloma, chamado foco de Ghon. A partir deste foco pulmonar, ocorre uma disseminação linfática até o linfonodo satélite (foco ganglionar) e, então, uma disseminação hematogênica. Este complexo composto pelo foco pulmonar, linfangite e foco ganglionar é denominado complexo primário ou de Ranke. (ATS, 2000; HOPEWELL, 2005). Em 95% dos casos, a imunidade adquirida é capaz de impedir o estabelecimento da TB doença (TB primária) a partir da primoinfecção, ainda que alguns bacilos viáveis possam permanecer latentes no interior do granuloma (ATS, 2000; HOPEWELL, 2005).
A TB secundária ocorre em conseqüência da reativação de focos antigos de infecção latente. Estima-se que, em indivíduos imunocompetentes, a TB infecção latente progrida para doença ativa em aproximadamente 10% dos casos não submetidos à terapia preventiva, metade destes ocorrendo nos dois primeiros anos após a primoinfecção (ATS, 2000; HOPEWELL, 2005).
Estratégias para o controle global da TB incluem identificação e tratamento de indivíduos com TB doença, identificação e tratamento dos contatos de casos de TB doença que desenvolvem TB infecção latente e, ainda, investigação e tratamento de TB infecção latente em populações
com alto risco para o desenvolvimento de doença ativa como indivíduos HIV soropositivos (BRODIE, 2005). De uma forma geral, as principais prioridades no controle da TB têm sido a identificação e o tratamento da doença ativa (BRODIE, 2005). Isto se deve ao fato de que tanto um atraso na detecção dos casos de TB doença quanto a ausência ou falência de tratamento anti-TB são responsáveis pelo prolongamento do período de transmissibilidade destes indivíduos, contribuindo para a disseminação da TB (ENARSON, 2000). O atraso na identificação dos casos de TB doença pode ocorrer devido a uma procura tardia do paciente ou por atraso no diagnóstico do paciente, entretanto, a deficiência de novas ferramentas diagnósticas também impede o progresso no controle global da TB (PERKINS, 2000; RIDDERHOF, 2007).
Apesar da suspeita de TB pulmonar ser baseada tanto na avaliação clínica e de aspectos da teleradiografia de tórax do paciente quanto na resposta ao tratamento quando este é iniciado, o isolamento e a identificação do M. tuberculosis são essenciais para a sua confirmação (ATS, 2000). Para isso, testes laboratoriais como microscopia para a detecção de BAAR, cultura para micobactéria e, mais recentemente, testes de AAN são indicados (ATS, 2000; BRODIE, 2005).
A pesquisa de BAAR pela microscopia do escarro, isto é, baciloscopia direta, fornece a primeira evidência bacteriológica sugestiva de TB (ATS, 2000). Além disso, a pesquisa de BAAR permite uma estimativa quantitativa do número de bacilos sendo eliminados pelo paciente, sendo de grande importância para identificar aqueles pacientes com maior capacidade de transmissão da doença, ainda que aproximadamente 17% dos casos com pesquisa de BAAR negativa no escarro também sejam capazes de transmitir a doença (BEHR, 1999). Esta técnica é baseada na capacidade da micobactéria de reter a coloração aplicada à amostra clínica mesmo após a ação de uma solução de álcool e ácidos utilizada para a descoloração. Os dois tipos de procedimentos de coloração mais comumente utilizados são: fucsina básica, incluindo
Ziehl-Neelsen e Kinyoun, e fluorescência com auramina (ATS, 2000; HOPEWELL, 2005). A pesquisa de BAAR permanece como o principal método para a investigação da TB pulmonar por ser um procedimento de baixo custo, rápido e fácil de ser realizado (ATS, 2000). Entretanto, para que a pesquisa de BAAR seja positiva através do método de Ziehl-Neelsen em um paciente com TB, é necessária a presença de 5.000 a 10.000 bacilos por mL de amostra clínica (ATS, 2000; HOPEWELL, 2005). Além disso, outras espécies de micobactérias, como as MNT, também podem produzir um resultado positivo pela pesquisa de BAAR (ATS, 2000). Assim, apesar de ser um teste diagnóstico rápido, a pesquisa de BAAR em amostra respiratória apresenta tanto uma sensibilidade quanto uma especificidade limitada para o diagnóstico da TB pulmonar (ATS, 2000).
Atualmente, o diagnóstico laboratorial definitivo da TB somente pode ser obtido pela cultura para micobactéria de amostra clínica processada, em meios sólido ou líquido, acompanhado de testes adicionais que permitam a identificação do complexo M. tuberculosis. Entre os meios sólidos de cultura, o crescimento da micobactéria pode fornecer resultados positivos a partir de três semanas (ATS, 2000; HOPEWELL, 2005). Entretanto, os meios de cultura sólidos requerem um período de incubação de 6 a 8 semanas antes de serem classificados como negativos (BRODIE, 2005). O crescimento do bacilo em meios líquidos é mais rápido do que em meios sólidos, fornecendo resultados positivos em aproximadamente duas semanas (ATS, 2000). Alguns métodos utilizam os meios líquidos de cultura e são capazes de detectar o crescimento do M. tuberculosis através da mensuração de reações metabólicas, como por exemplo, taxas de consumo de oxigênio e de produção de gás carbônico (HOPEWELL, 2005; BRODIE, 2005). A identificação da espécie da micobactéria isolada é realizada, além da avaliação morfológica das colônias cultivadas em meio sólido, através do uso de testes
bioquímicos ou testes de biologia molecular (ATS, 2000; HOPEWELL, 2005). Assim, apesar do longo tempo para fornecer os resultados, a cultura para micobactéria permanece como o padrão ouro para o diagnóstico da TB pulmonar, uma vez que promove a identificação precisa das espécies presentes na amostra clínica. A cultura é capaz de detectar M. tuberculosis a partir de 10 unidades formadoras de colônia (UFC) por mL de amostra, apresentando uma sensibilidade de aproximadamente 85% e uma especificidade que pode chegar a 98% (ATS, 2000).
Uma vez que os dois principais métodos laboratoriais utilizados para a investigação de pacientes com suspeita de TB pulmonar apresentam importantes limitações, ou seja, reduzida sensibilidade e especificidade da pesquisa de BAAR e tempo prolongado de fornecimento dos resultados da cultura para micobactéria, um interesse aumentado tem surgido tanto em relação ao desenvolvimento de novas tecnologias que promovam uma rápida identificação do bacilo da TB (PERKINS, 2000; STEINGART, 2006).
Um importante progresso na detecção direta e identificação do M. tuberculosis tem resultado do uso de técnicas de AAN (RICHELDI, 1995; PERKINS, 2000). Estes métodos permitem a amplificação e a posterior detecção de seqüências específicas de ácidos nucléicos do complexo M. tuberculosis, sendo aplicados diretamente às amostras clínicas com tempo de processamento de aproximadamente três horas (ATS, 2000). Atualmente, existem sistemas de amplificação tanto de DNA quanto de RNA, como os dois testes comercialmente aprovados pela FDA dos EUA, o Cobas Amplicor (Cobas Amplicor Mycobacterium tuberculosis System - Roche Diagnostic Systems, Branchburg, NJ), método baseado na amplificação do DNA micobacteriano mediada pela DNA polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) e o MTD (Amplified
Mycobacterium Tuberculosis Direct Test – Gen-Probe, San Diego, CA), método baseado na
1996). Em laboratórios de pesquisa, estes métodos foram capazes de fornecer resultados positivos em amostras contendo somente 10 bacilos (SHINNICK, 1995). Entretanto, quando tais testes são utilizados na prática clínica, a sua sensibilidade tem sido variável (GRECO, 2006).
Em 1996, a FDA aprovou o uso do teste MTD em amostras respiratórias com pesquisa de BAAR positiva de pacientes com suspeita de TB pulmonar que não tenham recebido tratamento para TB durante ≥ 7 dias ou durante os 12 meses prévios à coleta da amostra (CDC, 1996). Esta decisão foi baseada nas recomendações da Sociedade Torácica Americana (American Thoracic
Society – ATS) que revisou os dados dos ensaios clínicos conduzidos para a avaliação deste teste
(ATS, 1997). Estes estudos iniciais foram realizados sob uma perspectiva laboratorial em que todas as amostras respiratórias submetidas à cultura para micobactéria, independentemente do grau de suspeita clínica de TB, foram também submetidas ao teste MTD (ATS, 1997). Em amostras respiratórias com pesquisa de BAAR positiva, o teste demonstrou um excelente rendimento, com sensibilidade em torno de 95% e especificidade de 100%. Por outro lado, em amostras com pesquisa de BAAR negativa, a sensibilidade variou de 48% a 53% e a especificidade de 96% a 99% (ATS, 1997).
Após avaliação dos resultados obtidos nos ensaios clínicos, uma versão modificada do teste MTD, o EMTD (Enhanced Mycobacterium tuberculosis Direct Test), foi desenvolvida com o objetivo de aumentar o seu rendimento e reduzir o tempo de procedimento do teste (GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). Nesta nova versão, as duas etapas do procedimento, amplificação e detecção de ácidos nucléicos, são realizadas em um tubo único. Na primeira etapa, os ácidos nucléicos são extraídos das células micobacterianas, através da técnica de sonicação, sendo elevada a temperatura com a finalidade de promover a desnaturação dos ácidos nucléicos e romper a estrutura secundária do rRNA. A amplificação é mediada pela transcrição de sequências
específicas do rRNA do complexo M. tuberculosis, resultando em múltiplos amplicons de RNA micobacteriano. Na segunda etapa, as sequências específicas do complexo M. tuberculosis são detectadas nos amplicons de RNA pelo método de hibridização, que contém uma sonda de DNA com marcador de luminescência química. O DNA desta sonda é complementar às sequências específicas de rRNA do complexo de M. tuberculosis e, quando híbridos estáveis de RNA:DNA são formados, a sonda hibridizada é selecionada e mensurada em um luminômetro (GEN-PROBE INCORPORATED, 2001).
Desta forma, o resultado do teste, reportado como unidades relativas de luz (relative light
units - RLU), é considerado negativo quando <30.000 RLU e positivo quando ≥500.000 RLU.
Valores entre 30.000 e 499.999 RLU são interpretados como inconclusivos. Quando um teste inicial fornece um resultado inconclusivo, o EMTD deve ser repetido na mesma amostra previamente reservada e o novo resultado é considerado negativo quando < 30.000 RLU e positivo quando ≥30.000 RLU (GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). Para um controle de qualidade interno, amostras contendo uma espécie de micobactéria não-tuberculosa, como M.
gordonae ou M. terrae, devem ser utilizadas como controle negativo e amostras contendo um
membro do complexo M. tuberculosis, como H37Ra ou H37Rv, devem ser utilizadas como controle positivo do teste. Assim, resultados do EMTD realizados em amostras clínicas de pacientes devem ser divulgados apenas quando o controle negativo fornecer um resultado < 20.000 RLU e o controle positivo ≥ 1.000.000 RLU (GEN-PROBE INCORPORATED, 2001).
O EMTD foi aprovado pela FDA, em 1999, para o uso em amostras respiratórias independentemente do resultado da pesquisa direta de BAAR (CDC, 2000). Diferentemente dos estudos anteriores, o ensaio clínico para a avaliação desta nova versão do teste MTD envolveu pacientes com suspeita de TB pulmonar cuja probabilidade de apresentar a doença foi estimada
por um médico especialista (GEN-PROBE INCORPORATED, 2001; WOODS, 1999). Assim, o padrão-ouro de diagnóstico final considerado para avaliar o rendimento do teste foi a combinação entre resultados da cultura para micobactéria e grau de suspeita clínica de TB. Neste estudo, 206 pacientes foram incluídos, sendo 57 deles (27.7%) diagnosticados com TB pulmonar, incluindo quatro pacientes com cultura negativa para TB e quatro pacientes com crescimento tanto de M.
tuberculosis quanto de NTM na cultura. De uma forma geral, a sensibilidade, a especificidade e
os valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN) do EMTD foram 86%, 99.3%, 98% e 94.9%, respectivamente (GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). Esses mesmos valores foram 96.9%, 100%, 100% e 87.5% em pacientes com pesquisa de BAAR de positiva e 72%, 99.3%, 94.7% e 95.3% em pacientes com pesquisa de BAAR negativa, respectivamente (GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). Em comparação, o método de baciloscopia direta em amostra respiratória forneceu uma sensibilidade de 64.9% e uma especificidade de 89.3% (GEN-PROBE INCORPORATED, 2001).
Em avaliações clínicas subsequentes, o EMTD apresentou rendimento ainda melhor do que no ensaio clínico. Uma metanálise comparando a acurácia dos dois testes para o diagnóstico da TB pulmonar demonstrou que, em amostras com pesquisa de BAAR positiva, o EMTD apresentou sensibilidade semelhante (97% versus 96%) e melhor especificidade do que o Cobas Amplicor (96% versus 74%) enquanto que, em amostras com pesquisa de BAAR negativa, o EMTD apresentou melhor sensibilidade do que o Cobas Amplicor (76% versus 64%), porém este demonstrou melhor especificidade ainda que com pouca diferença (99% versus 97%) (GRECO, 2006).
Gamboa (1998) comparou o rendimento das duas versões do teste MTD em 410 amostras respiratórias. A nova versão do teste (EMTD) demonstrou melhor rendimento, com sensibilidade
de 94.7% e especificidade de 100% (GAMBOA, 1998). Bergmann (1999) analisou o teste EMTD realizado em amostras respiratórias submetidas à cultura para micobactéria provenientes de 489 prisioneiros, apresentando sensibilidade de 90.0% e especificidade de 99.1%. Em indivíduos com pesquisa de BAAR positiva, esses valores foram 100% e, em indivíduos com pesquisa de BAAR negativa, a sensibilidade foi 83.3% e a especificidade foi 99.1% (BERGMAN, 1999). Ambos os estudos utilizaram a cultura para micobactéria como critério para diagnóstico final de doença, realizando posteriormente nova análise em amostras com EMTD negativo e cultura positiva para TB. Assim, através da repetição do teste EMTD apenas nas amostras respiratórias que inicialmente forneceram resultados discrepantes entre EMTD e cultura, os resultados do EMTD foram atualizados. No estudo de Bergmann, o rendimento do teste EMTD antes da resolução de discrepâncias demonstrou sensibilidade e especificidade menores, sendo 80% e 98.7% em geral, 100% e 83.3% em amostras com pesquisa de BAAR positiva, e 66.7% e 98.9% em amostras com pesquisa de BAAR negativa, respectivamente (BERGMAN, 1999).
Catanzaro (2000) avaliou o rendimento do teste EMTD realizado sob condições de rotina em pacientes agrupados de acordo com o grau de suspeita de TB pulmonar conforme avaliação do médico assistente. O diagnóstico final utilizado foi baseado na combinação dos resultados da cultura em amostras respiratórias com diagnóstico clínico de TB pulmonar por especialistas. Os valores de sensibilidade e especificidade não diferiram significativamente entre os grupos de baixa, intermediária e alta suspeita de TB pulmonar (sensibilidade: 83%, 75%, 87% e especificidade 97%, 100%, 100%, respectivamente). Entretanto, para o grupo de pacientes com baixo grau de suspeita de TB, não foi demonstrada uma forte evidência de que o EMTD seja capaz de confirmar o diagnóstico de TB, já que o VPP neste grupo foi de 59%. Em contraste, nos grupos com suspeita intermediária ou alta de TB pulmonar, o EMTD apresentou VPP de 100%.
Similarmente, porém em menor intensidade, a contribuição do teste EMTD em excluir o diagnóstico de TB foi mais evidente no grupo com baixa suspeita do que nos grupos de intermediário e alto grau de suspeita de TB (VPNs de 99%, 91% e 91%, respectivamente). Este estudo demonstrou a importância da avaliação clínica do paciente com suspeita de TB pulmonar na interpretação do teste EMTD. A prevalência de TB pulmonar neste estudo foi de 21% (CATANZARO, 2000).
A capacidade do EMTD, com elevados valores de VPN, em contribuir para a exclusão de TB pulmonar durante uma investigação diagnóstica inicial é especialmente importante em locais com uma substancial prevalência de MNT, onde a taxa de resultados positivos pela pesquisa de BAAR pode ser similar tanto para M. tuberculosis quanto para MNT (WRIGHT, 1998). Desta forma, para amostras com pesquisa de BAAR positiva de pacientes com baixo risco para TB e/ou provenientes de uma área onde doença pulmonar por MNT é comum, um resultado negativo do EMTD poderia evitar a decisão de iniciar o tratamento anti-TB até que os resultados da cultura fossem conhecidos, assim como evitar a hospitalização desses pacientes em isolamento respiratório e o início da investigação de seus contatos (WOODS, 2001). Entretanto, em um estudo avaliando o impacto do teste EMTD nas decisões clínicas relacionadas aos pacientes com suspeita de TB pulmonar, o diagnóstico inicial de TB foi adotado e o tratamento anti-TB foi iniciado para metade dos pacientes que, apesar de demonstrarem pesquisa de BAAR em amostra respiratória positiva, apresentavam EMTD negativo. Nenhum destes pacientes teve o diagnóstico final de TB pulmonar confirmado pela cultura, considerada como método-ouro para o diagnóstico de TB neste estudo. Assim, apesar do teste EMTD ter apresentado uma excelente concordância com o diagnóstico final destes pacientes, por uma falta de confidência dos médicos assistentes no
resultado negativo do EMTD, o teste demonstrou apenas um impacto parcial na diferenciação precoce entre TB e NTM nestes pacientes com pesquisa de BAAR positiva (GUERRA, 2007).
Em contraste com a pesquisa direta de BAAR, cujo rendimento em amostras respiratórias para o diagnóstico de TB pulmonar foi menor em pacientes com co-infecção pelo HIV quando comparados com pacientes imunocompetentes (sensibilidade 36% vs 66% e especificidade 84% vs 96%, respectivamente), o EMTD não demonstrou diferença estatisticamente significativa no rendimento entre estes dois grupos de pacientes (sensibilidade 71% vs 86% e especificidade 97% vs 98%, respectivamente) (PERRY, 2000). É importante destacar que, até o momento, a maioria dos estudos avaliando o teste EMTD para o diagnóstico da TB pulmonar não estratificaram os pacientes de acordo com o status de HIV. No entanto, em um estudo realizado em Zambia na África, país com alta incidência de TB e HIV, demonstrou um rendimento do EMTD para o diagnóstico da TB pulmonar comparável aos estudos prévios, com uma sensibilidade de 92% em amostras com pesquisa de BAAR positiva e 60% em amostras com pesquisa de BAAR negativa (KAMBASHI, 2001). Além disso, considerando os dados microbiológicos e clínicos como o padrão-ouro, o EMTD apresentou maior sensibilidade (88%) para o diagnóstico da TB pulmonar do que a baciloscopia direta pelo método de auramina (29%) e, até mesmo, do que a cultura para micobactéria pelo método de Löwenstein-Jensen (71%). Este estudo demonstra que o EMTD poderia ter um importante papel como teste complementar para o diagnóstico rápido da TB pulmonar também em países em desenvolvimento, onde estão localizados 95% dos casos de TB e onde 98% dos óbitos por TB ocorrem (WHO, 2008). Entretanto, o custo desta tecnologia de AAN pode limitar a sua aplicação nos setores de saúde pública destes países.
Uma vez que o teste EMTD é capaz de amplificar e detectar os ácidos nucléicos do complexo M. tuberculosis viável ou morto, o seu uso para avaliação da resposta ao tratamento anti-TB não é indicado (ATS, 2000; GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). Outra limitação do teste EMTD é a produção de resultados falso-positivos devido à reação cruzada com organismos como M. celatum e M. terrae, quando estes encontram-se presentes nas amostras clínicas em uma concentração maior do que 30 UFC (SOMOSKOVI, 2000; GEN-PROBE INCORPORATED, 2001; GUERRA, 2007). Além disso, o teste EMTD é incapaz de diferenciar os membros do complexo M. tuberculosis que, como descrito anteriormente, além do próprio M. tuberculosis ainda incluem M. bovis, M. africanum, M. microti e M. canetti (GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). Apesar destes organismos somente infectarem animais ou raramente produzirem doença em humanos, a identificação precisa da espécie M. tuberculosis através da cultura para micobactéria ainda é necessária para a confirmação do diagnóstico de TB pulmonar (ATS, 2000).
Os resultados do teste EMTD podem ser afetados por fatores que vão desde a coleta e o transporte das amostras clínicas de forma inadequada até erros durante os procedimentos laboratoriais ou durante o método de transcrição (GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). Assim, a acurácia dos resultados do EMTD também é dependente da proficiência operacional e da adesão às instruções do fabricante para a realização dos procedimentos laboratoriais. Entretanto, mesmo em condições ideais, resultados falso-negativos do teste EMTD, isto é, resultados negativos do EMTD em amostras clínicas contendo M. tuberculosis, ainda podem ser encontrados em amostras pauci-bacilares (RICHELDI, 1995; GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). Entretanto, a causa mais freqüente e melhor documentada de resultados falso-negativos do EMTD, assim como de outros testes de AAN, é a presença de substâncias capazes de inibir a
amplificação dos ácidos nucléicos (VALENTINE-THON, 2002; DELLA-LATTA, 1999; SMITH, 1999; SCARPARO, 2000; PIERSIMONI, 2002; SLOUTSKI, 2004). Tais substâncias, ainda pouco conhecidas, podem estar presentes tanto nas próprias amostras quanto em reagentes utilizados para os procedimentos de descontaminação e concentração das mesmas (DELLA-LATTA, 1999; VALENTINE-THON, 2002). Por exemplo, já foi demonstrado que a utilização do tampão de fosfato Alpha-Tec XPR-plus (Alpha-Tec Systems, Inc.) no processamento de amostras clínicas pode prejudicar o rendimento do teste EMTD ao inibir a amplificação dos ácidos nucléicos, sendo tal inibição atribuída à concentração aumentada de fosfato neste tipo de tampão (DELLA-LATTA, 1999). Resultados falso-negativos conseqüentes à inibição da amplificação de AAN contribuem para a limitação da sensibilidade desses testes. De uma forma geral, uma taxa de inibição de 3,4% a 4,3% tem sido descrita em amostras respiratórias com resultados negativos ou inconclusivos do EMTD, porém com cultura positiva para TB (GAMBOA, 1998; BERGMAN, 1999; SCARPARO, 2000; GEN-PROBE INCORPORATED, 2001; PIERSIMONI, 2002).
O Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC - Centers for Diseases Control and
Prevention) dos Estados Unidos recomenda a investigação da presença de substâncias inibitórias
em amostras clínicas com resultado positivo na pesquisa de BAAR, porém negativo pelo EMTD (CDC 2000). Para detectar a presença de substâncias inibitórias, o protocolo do fabricante do teste EMTD sugere o uso de uma quantidade adicional da mesma amostra clínica (450 µL) para repetir o teste após a adição do controle interno positivo que contém M. tuberculosis R37Ra ou H37Rv (GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). A obtenção de um resultado positivo do teste repetido demonstra que a amplificação não foi prejudicada, validando conseqüentemente o resultado negativo do primeiro teste. Por outro lado, caso o resultado deste novo teste também
seja negativo, a presença destas substâncias é confirmada. Assim, o resultado negativo do teste realizado previamente não pode ser interpretado corretamente e uma nova amostra clínica deve ser coletada e analisada (CDC, 2000; GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). Tal abordagem requer uma grande quantidade de amostra clínica adicional que, muitas vezes, não está disponível no laboratório após a realização dos outros testes como baciloscopia direta, EMTD inicial e cultura para micobactéria. Além disso, quando substâncias inibitórias são detectadas através da repetição do teste EMTD na mesma amostra, o resultado negativo prévio não fornece informação útil em relação à exclusão da doença e, ainda, pode produzir um elevado custo para o laboratório caso um grande número de amostras contendo substâncias inibitórias estiverem presentes.
Visando o aumento da sensibilidade dos testes de AAN, incluindo o EMTD, alguns laboratórios passaram a realizar, retrospectivamente, a diluição apenas de amostras clínicas armazenadas que apresentassem resultados discordantes entre o EMTD inicial (negativo) e a cultura para micobactéria (positiva para M. tuberculosis) seguida da realização de um novo teste EMTD, independentemente do resultado da pesquisa de BAAR (SCARPARO, 2000; PIERSIMONI, 2002; SLOUTSKI, 2004). O objetivo da diluição destas amostras clínicas seria atingir uma redução na concentração das substâncias inibitórias presentes de modo que não mais interferissem na amplificação dos ácidos nucléicos do complexo M. tuberculosis promovida pelo teste.
Em um primeiro estudo realizado no laboratório estadual de Massachussetts com o objetivo de minimizar o impacto de substâncias inibitórias no rendimento do teste EMTD, nove amostras respiratórias que apresentaram cultura positiva para TB, porém EMTD negativo, foram submetidas a um segundo teste EMTD retrospectivamente, desta vez com uma diluição de 1:10 das mesmas amostras (SLOUTSKI, 2004). A diluição de 1:10 das amostras respiratórias foi
realizada acrescentando 450µL da solução padrão de reação do EMTD a 50µL do sedimento processado da amostra. Os resultados subsequentes de EMTD de todas as amostras submetidas a novo teste EMTD foram positivos. Assim, esta estratégia resultou em uma diminuição do número de resultados falso-negativos do EMTD, com um aumento de aproximadamente 7% na sensibilidade do teste (61% versus 68.3%). Após a exclusão de 18 amostras respiratórias provenientes de pacientes em tratamento para TB durante a coleta das mesmas, a sensibilidade do teste aumentou para 91% (SLOUTSKI, 2004). Em um segundo estudo do mesmo laboratório, todas as amostras respiratórias foram submetidas simultaneamente a dois testes EMTD, convencional e com diluição 1:10, independentemente do resultado da pesquisa de BAAR (POLLOCK, 2006). Dentre 17 amostras com resultado de EMTD negativo pelo método convencional, todas demonstraram um resultado positivo pelo método de diluição, sendo negativa a pesquisa de BAAR em apenas uma das amostras. Dentre três amostras com resultado de EMTD inconclusivo pelo método convencional, uma demonstrou um resultado positivo pelo método de diluição, porém o resultado da pesquisa de BAAR destas amostras não é descrito. Assim, baseando-se na capacidade do método de diluição em reduzir o número de resultados falso-negativos ou inconclusivos de EMTD e nos valores de sensibilidade e especificidade de 100% produzidos pelos dois métodos em conjunto, os autores concluem que a combinação dos resultados de EMTD pelos dois métodos, convencional e de diluição, fornece o melhor rendimento do teste para o diagnóstico de TB pulmonar (POLLOCK, 2006).
A avaliação de custo-efetividade de testes de AAN para o diagnóstico da TB pulmonar em países em desenvolvimento e com alta prevalência de TB tem sido bastante limitada, uma vez que estes testes não são utilizados na rotina. Como para qualquer intervenção, o custo elevado dos testes de AAN é muitas vezes utilizado como argumento para que estes testes não sejam
implementados nestes países. Entretanto, um estudo comparando a relação de custo-efetividade entre o teste Cobas Amplicor-PCR para a detecção do M. tuberculosis e a pesquisa direta de BAAR realizados em amostras respiratórias demonstrou que, quando os custos relacionados ao tratamento para TB de pacientes com pesquisa direta de BAAR negativa que tardiamente demonstram resultado negativo pela cultura para micobactéria, ou seja, custos de um tratamento incorreto são incluídos na análise, a utilização do teste Cobas Amplicor-PCR passa a ser mais custo-efetivo do que a pesquisa direta de BAAR para o diagnóstico da TB pulmonar (VAN CLEEFF, 2005).
Em Baltimore, Maryland nos EUA, um estudo foi realizado no Hospital Johns Hopkins para avaliar o custo-efetividade da implantação do teste EMTD na rotina com o objetivo de excluir precocemente a TB como causa de doença pulmonar em pacientes com pesquisa direta de BAAR no escarro positiva (DOWDY, 2003). Este estudo demonstrou um custo de $494 por exclusão precoce de TB baseada em um resultado negativo do teste EMTD enquanto que uma economia de $201 por paciente com pesquisa direta de BAAR positiva em termos de isolamento respiratório e tratamento anti-TB evitados. Entretanto, como pode ser visto na figura a seguir, foi demonstrado que fatores como: redução na quantidade de resultados positivos para TB na cultura entre amostras com pesquisa direta de BAAR positiva, aumento no número de amostras com pesquisa direta de BAAR positiva processadas por ano e/ou aumento no custo diário do isolamento respiratório poderiam tornar a implantação do teste EMTD custo-efetiva. Neste estudo, a prevalência de TB entre amostras respiratórias com pesquisa direta de BAAR positiva foi de 31%, uma média de 14 amostras com pesquisa direta de BAAR positiva foi processada por ano e cada caso de isolamento respiratório teve um custo de $28 por dia (DOWDY, 2003).
Figura 1. Custo-efetividade do teste EMTD por prevalência de TB entre amostras com pesquisa direta de BAAR positiva (eixo X) e número de amostras com pesquisa direta de BAAR positiva processadas por ano (eixo Y).
O quadro em destaque no canto superior esquerdo demonstra a relação de custo-efetividade em laboratórios que processam pequeno número de amostras por ano. Modificado de Dowdy (2003).
O teste EMTD tornou-se um componente diagnóstico na rotina de investigação e avaliação de pacientes com suspeita de TB pulmonar em alguns países desenvolvidos, especialmente nos Estados Unidos. Desta forma, muito empenho tem sido sobreposto com a finalidade de melhorar o rendimento do teste EMTD. O aperfeiçoamento do teste e o conhecimento de novas estratégias para a realização do mesmo podem ajudar no desenvolvimento de estratégias laboratoriais mais eficientes. Apesar dos dois estudos citados anteriormente terem sido de grande importância neste sentido, questões essenciais como o impacto do resultado da pesquisa de BAAR das amostras nos resultados de EMTD pelos métodos
convencional e de diluição, e a relação de custo-efetividade para a implementação uma nova estratégia laboratorial que inclua a diluição das amostras antes da realização do teste MTD não foram abordados especificamente. Além disso, do ponto de vista da prática clínica, um resultado de EMTD mais acurado alcançado apenas após a diluição retrospectiva destas amostras clínicas armazenadas, como realizado nos estudos anteriores, não apresentaria grande impacto no diagnóstico do paciente, visto que o resultado da cultura para micobactéria já estaria disponível.
Em conclusão, o EMTD tem sido demonstrado como um potencial teste complementar para o rápido diagnóstico da TB pulmonar, especialmente em pacientes cujo tratamento imediato é imperativo, uma vez que este teste é capaz de aumentar a confiança de um diagnóstico clínico inicial enquanto os resultados confirmativos da cultura são aguardados. Entretanto, o teste EMTD não substitui a necessidade da realização da baciloscopia direta e da cultura em amostras clínicas de pacientes com suspeita de TB pulmonar, já que estes métodos convencionais são essenciais para acessar a capacidade de transmissão da doença pelo paciente, para a confirmação do diagnóstico e realização de testes de sensibilidade aos medicamentos anti-TB. Os resultados do teste EMTD devem ser interpretados de acordo com o contexto clínico e resultado dos exames convencionais e, ainda, com a prevalência de TB pulmonar dentro da comunidade onde o mesmo é utilizado.
3. JUSTIFICATIVA
Em 2005, 25% e 30% dos pacientes notificados como casos de TB pulmonar no Brasil e no município do Rio de Janeiro, respectivamente, apresentaram pesquisa de BAAR no escarro negativa (SVS, 2005). Embora a AAN seja uma técnica coadjuvante promissora para a investigação inicial de pacientes com suspeita de TB pulmonar, a sua utilização tem valor limitado na prática clínica diária em países em desenvolvimento em função do elevado custo e da baixa sensibilidade em pacientes com pesquisa de BAAR no escarro negativa.
Por outro lado, em países com mais recursos financeiros, novas gerações de testes de AAN, como o teste EMTD, têm sido utilizadas na rotina da investigação de pacientes com suspeita de TB pulmonar, sendo consideradas importantes ferramentas para a confirmação ou exclusão precoce de TB pulmonar durante a investigação inicial. Ainda que melhores valores de sensibilidade tenham sido alcançados com as novas gerações dos testes, inclusive em indivíduos com pesquisa direta de BAAR negativa, sua sensibilidade ainda não é ideal.
A principal causa demonstrada de uma sensibilidade reduzida (resultados falso-negativos) dos testes de AAN é a presença de substâncias inibitórias nas próprias amostras respiratórias ou nos reagentes utilizados para descontaminação e concentração das mesmas. Estudos têm demonstrado que a técnica de diluição em 1:10 das amostras respiratórias antes da realização do teste de AAN aumenta de forma significativa a sensibilidade do teste.
O Laboratório de TB do DHMH do estado de Maryland nos EUA é o principal laboratório de referência para todos os Programas de Controle da TB no estado e realiza de rotina o teste EMTD em amostras respiratórias. Desde abril de 2004, o laboratório passou a adotar a estratégia de realizar dois testes EMTD simultaneamente em cada amostra respiratória: um pelo método
convencional (amostras não-diluídas) e outro pelo método de diluição (amostras com uma diluição de 1:10).
A análise dos resultados desta estratégia permite inferir o seu impacto na sensibilidade do teste EMTD para o diagnóstico da TB pulmonar, especialmente em amostras com pesquisa de BAAR negativa, bem como avaliar a relação de custo-efetividade desta e de diferentes estratégias para realização do teste. Estes dados podem ser úteis na decisão de conduzir ou não estudos sobre o impacto da implementação das técnicas de AAN na rotina de avaliação diagnóstica de casos suspeitos de TB pulmonar em regiões com alta prevalência de TB.
4. OBJETIVOS
Os objetivos deste estudo foram:
9 Estimar e comparar o rendimento do teste EMTD em amostras respiratórias com pesquisa direta de BAAR positiva e pesquisa direta de BAAR direta negativa para o diagnóstico da TB pulmonar, utilizando dois métodos laboratoriais diferentes, o método convencional e o método de diluição 1:10.
9 Estimar a relação de custo-efetividade de diferentes estratégias laboratoriais para a realização do teste EMTD para o diagnóstico da TB pulmonar.
5. METODOLOGIA
5.1 Modelo do estudo
Estudo observacional analítico transversal.
5.2 População de referência
Pacientes com suspeita de TB pulmonar.
5.3 População do estudo
Pacientes com suspeita de TB pulmonar cujas amostras respiratórias tenham sido encaminhadas ao laboratório de TB do DHMH de Maryland, Estados Unidos.
5.4 Seleção da amostra
5.4.1 Critérios de inclusão
• Pacientes cuja primeira amostra respiratória tenha sido submetida à pesquisa direta de BAAR, cultura para micobactéria e aos dois métodos do teste EMTD, convencional e de diluição.
5.4.2 Critérios de exclusão
• Tratamento para TB durante 7 dias ou mais antes da coleta da amostra. • Resultado não disponível no laboratório
Os dados laboratoriais foram coletados para amostras respiratórias submetidas a BAAR, teste EMTD e cultura para micobactérias no laboratório de TB do DHMH no período de 01 abril de 2004 a 31 março de 2006.
5.6 Operacionalização do estudo
O presente estudo fez parte de um estudo prévio realizado também no laboratório de TB do DHMH de Maryland nos EUA com o objetivo de estimar o rendimento do teste EMTD utilizado na rotina para o diagnóstico da TB pulmonar e avaliar o papel deste teste na prática clínica (Guerra e cols. 2007). No estudo prévio, realizado como parte dos requisitos necessários para completar o programa de pós-graduação - Post-Doctoral Research Fellowship - da Universidade Johns Hopkins (Baltimore, Maryland, Estados Unidos da América), os dados laboratoriais de pacientes com suspeita de TB pulmonar cujas amostras respiratórias tinham sido submetidas à pesquisa direta de BAAR, teste EMTD (métodos convencional e de diluição) e cultura para micobactéria no laboratório de TB, no período de 01 de abril de 2004 a 31 de março de 2006, foram coletados em um instrumento de coleta de dados (apêndice A) e introduzidos em um banco de dados Excel.
No laboratório de TB do DHMH após descontaminação e concentração das amostras respiratórias, a pesquisa direta de BAAR é feita pelo método de auramina seguida do método Ziehl-Neelsen para as amostras com BAAR negativo. A cultura para micobactéria é realizada em meio líquido Bactec 12B e em meio sólido Lowenstein Jensen. O teste EMTD é realizado de acordo com o protocolo do fabricante (GEN-PROBE INCORPORATED, 2001). Entretanto, para cada amostra respiratória, dois testes EMTD são realizados simultaneamente, um pelo método
convencional (amostras não-diluídas) e outro pelo método de diluição (amostras com uma diluição de 1:10, através da adição de 450µl de água destilada a cada 50µl de amostra processada). Os resultados do teste EMTD são interpretados de acordo com o protocolo do fabricante do teste: EMTD negativo: < 30,000 unidades relativas de luz (relative light units - RLU); EMTD inconclusivo: 30,000 - 499,999 RLU; EMTD positivo: > 500,000 RLU.
Para o presente estudo, os dados laboratoriais obtidos previamente foram utilizados com o objetivo de comparar o rendimento do EMTD entre o método convencional e o método de diluição 1:10 em amostras respiratórias estratificadas por resultados da pesquisa direta de BAAR. Dados clínicos dos pacientes que forneceram as amostras respiratórias para a avaliação de rotina pelo laboratório de TB do DHMH não foram obtidos para este estudo. Para a análise de custo-efetividade, o custo total de cada estratégia de realização do teste EMTD avaliada foi calculado. Os custos para a realização do teste EMTD (reagentes específicos e utensílios, como pipetas e tubos) e relacionados aos equipamentos de proteção pessoal (luvas, máscaras e jalecos) foram obtidos diretamente do laboratório de TB do DHMH. A proporção total de diagnóstico correto pelo teste EMTD foi estimada para o período do estudo, também com base nos dados do laboratório de TB de DHMH.
5.7 Aspectos estatísticos
Rendimento do teste EMTD para o diagnóstico da TB pulmonar
A sensibilidade, a especificidade, o VPN e o VPP do teste EMTD foram estimados para as primeiras amostras respiratórias submetidas simultaneamente aos métodos convencional e de diluição, usando os resultados finais da cultura para micobactéria de cada paciente como o
