Santa Maria, RS
2018
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Fernanda Licker Cabral
AVALIAÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIOXIDANTE DO
EXTRATO DE TUCUMÃ (Astrocaryum aculeatum): ESTUDOS IN VITRO
Santa Maria, RS
2018
Fernanda Licker Cabral
AVALIAÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIOXIDANTE DO EXTRATO DE TUCUMÃ (Astrocaryum aculeatum): ESTUDOS IN VITRO E IN VIVO
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas: Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Sistema de geração automática de ficha catalográfica da UFSM. Dados fornecidos pelo autor(a). Sob supervisão da Direção da Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca Central. Bibliotecária responsável Paula Schoenfeldt Patta CRB 10/1728.
74 p.; 30 cm
Orientadora: Daniela Bitencourt Rosa Leal
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Maria, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, RS, 2018
1. Astrocaryum aculeatum 2. Tucumã 3. Carotenoides 4. Flavonoides I. Bitencourt Rosa Leal, Daniela II. Título.
AVALIAÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIOXIDANTE DO EXTRATO DE TUCUMÃ (Astrocaryum aculeatum): ESTUDOS IN VITRO E IN VIVO
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas: Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Aprovado em 19 de janeiro de 2018:
__________________________________
Daniela Bitencourt Rosa Leal, Prof.ª Dr.ª (UFSM)
(Presidente/Orientador)
__________________________________
Cleci Menezes Moreira, Prof.ª Dr.ª (UNIPAMPA)
__________________________________
Primeiro à Ele, Deus, pela vida, oportunidades e por me guiar, iluminar e proteger sempre.
À minha família por todo apoio, torcida, segurança e amor. Em especial ao meu pai Elder por me ajudar a não fraquejar e pelo companheirismo durante o desenvolvimento deste trabalho. Às minhas irmãs Bruna e Eduarda por toda a força, carinho e abraços mais intensos nesses dois anos. Ao meu namorado Vinicius pela compreensão da minha ausência e pelas palavras de incentivo. Ao meu filhote Snow que por muitas vezes tornou meus dias menos cansativos e mais felizes.
Aos meus amigos pela torcida, atenção e carinho. Em especial a Ana Cláudia, que não mede esforços para estar presente na minha vida e me auxiliar sempre que necessário.
À minha orientadora Daniela Bitencourt Rosa Leal pela oportunidade, compreensão e ensinamento nestes anos de caminhada, pela sabedoria, atenção e ajuda.
Aos meus queridos amigos e colegas do LABiBIO pela colaboração para a realização do trabalho e pela amizade durante o período de convívio. Vocês tornam meus dias mais leves e felizes! Meu reconhecimento a Viviane do Carmo, Karine Lanes, Jader Ruchel e Pedro Doleski que me receberam tão bem, passaram seus conhecimentos e são meus exemplos.
À Viviane Bernardes e sua família pela amizade, companheirismo e auxílio.
Aos meus queridos ICs Mauren Horvath e Mateus Bremm por toda ajuda e atenção dispensada.
À Juliana Sorraila e ao Guilherme Lopes pela disponibilidade e ajuda no desenvolvimento do trabalho.
Aos professores e funcionários que tornaram esse projeto possível: Ritiel da Cruz, Thiago Belarmino, Luis, Rafaela Dornelles e Melânia Palermo pela atenção e auxílio prestados.
A profª. Ivana da Cruz e ao Laboratório Biogenômica pela receptividade e ajuda. Em especial a Fernanda Barbisan, Verônica Azzolin e Cibele Teixeira.
Aos professores e funcionários do Departamento de Microbiologia e Parasitologia e do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFSM pelo auxílio e apoio prestados. Em especial a Rosalira, pessoa especial que esta sempre pronta para ajudar.
À banca examinadora, por aceitarem o convite e pelas contribuições que farão a este trabalho.
À todos que colaboraram, seja de forma profissional como pessoal, assim como a todos aqueles que de uma forma e outra, compartilham de meus ideais, a minha gratidão e respeito. O meu Muito Obrigada!!
fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes” Marthin Luther King
AVALIAÇÃO ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIOXIDANTE DO EXTRATO DE TUCUMÃ (Astrocaryum aculeatum): ESTUDOS IN VITRO E IN VIVO
AUTOR: Fernanda Licker Cabral
ORIENTADOR: Prof.ª Dr.ª Daniela Bitencourt Rosa Leal
Com a ascensão de novos conceitos como alimentos funcionais, nutracêuticos e fitomedicamentos, aliados ao uso da medicina tradicional, os produtos de origem vegetal estão em evidência. O Brasil é destaque no desenvolvimento de novos medicamentos a partir destes produtos já que apresenta a maior biodiversidade vegetal do mundo e ocupa o terceiro lugar em produção de frutos. Dentro desse contexto, encontra-se o tucumã (Astrocaryum aculeatum), um fruto amazônico amplamente utilizado no norte do país. Sabendo da ampla utilização e do uso popular como tratamento para diversas enfermidades, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios do extrato de tucumã em diferentes doses. Para isso, foram utilizadas culturas de células (RAW 264.7), ativadas com fitohemaglutinina (PHA) e tratadas com extrato de A. aculeatum nas doses de 1, 10, 30, 50, 100, 300µg/ml. Os resultados demonstraram atividade anti-inflamatória in vitro através da diminuição da viabilidade e proliferação dos macrófagos induzidos por PHA (P<0.05), modulação do ciclo celular induzindo a permanência na fase G0/G1 (P<0.001), diminuição da expressão dos genes das interleucinas pró-inflamatórias interleucina-1β (IL-1β) (P<0.001) e IL-6 (P<0.001) e aumento da expressão dos genes de IL-10 (P<0.01), anti-inflamatória, quando comparados ao grupo com PHA. Além disso, foi capaz de reduzir a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs e ERN) e se mostrou genoprotetor na dosagem de 30µg/ml (P<0.05). Posteriormente, foram realizados testes in vivo, onde utilizamos ratas Wistar saudáveis nas quais foram testados os efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios do extrato de tucumã nas doses de 250, 500, 1,000, 1,500mg/kg via oral, por gavagem, durante 30 dias. Os animais foram submetidos à toracotomia e o sangue, soro e tecidos foram coletados. Foram realizados o hemograma, as dosagens séricas de albumina, colesterol e triglicerídeos, além da determinação da atividade das enzimas aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (FAL), butirilcolinesterase (BuChE) e adenosina desaminase (ADA) no soro. Nos órgãos – fígado, rim, baço e coração – foram avaliadas a atividade da enzima catalase (CAT), a presença de tióis proteicos e não proteicos, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e proteínas carboniladas, bem como a atividade da ADA somente no coração. Os resultados sugerem que o extrato tem potencial anti-inflamatório já que foi capaz de diminuir o número de plaquetas (em torno de 85%), leucócitos (49%), neutrófilos (44%) e linfócitos (48%) em todas as doses quando comparadas ao controle. A maioria das análises bioquímicas no soro não apresentaram diferença estatística entre os grupos, sendo evidenciada somente uma redução nos níveis de triglicerídeos (66%) nas dosagens mais altas. Da mesma forma, o extrato não apresentou efeito sistêmico, considerando-se as atividades da BuChE e ADA séricas, que não apresentaram diferenças entre os grupos, exceto pela atividade da ADA que no tecido cardíaco estava diminuída (P<0.01) nas dosagens de 1,000 e 1,500mg/kg quando comparadas ao controle. Considerando os órgãos, o extrato comprovou sua atividade antioxidante e protetora através da evidente diminuição do TBARS no fígado (P<0.001) em todas as doses testadas quando comparadas ao controle. Assim, com base nos resultados do presente estudo, podemos inferir que o extrato de A. aculeatum possui propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes de ocorrência natural com possibilidade promissora de ser explorado para fins terapêuticos.
ANTI-INFLAMMATORY AND ANTIOXIDANT EVALUATION OF TUCUMÃ EXTRACT (Astrocaryum aculeatum): IN VITRO AND IN VIVO STUDIES
AUTHOR: Fernanda Licker Cabral
ADVISOR: Prof.ª Dr.ª Daniela Bitencourt Rosa Leal
With the rise of new concepts such as functional foods, nutraceuticals and phytomedicines, allied to the use of traditional medicine, products of plant origin are in evidence. Brazil is a highlight in the development of new medicines from these products since it presents the greatest vegetal biodiversity in the world and occupies the third place in fruit production. Within this context, there is the Tucumã (Astrocaryum aculeatum), an Amazonian fruit widely used in the north of the country. Knowing the wide use and popular use as a treatment for several diseases, the objective of this work was to evaluate the antioxidant and anti-inflammatory effects of the Tucumã extract in different doses. For this, cultures of cells (RAW 264.7), activated with phytohemagglutinin (PHA) and treated with extract of A. aculeatum at doses of 1, 10, 30, 50, 100, 300 μg/ml were used. The results demonstrated an in vitro anti-inflammatory activity by decreasing the viability and proliferation of PHA-induced macrophages (P<0.05), modulating the cell cycle inducing G0/G1 (P<0.001) phase stay, decreased genes expression of the proinflammatory interleukin interleukin-1β (IL-1β)
(P<0.001) and IL-6 (P<0.001) and increased genes expression of the IL-10 (P<0.01), anti-inflammatory, genes when compared to the PHA group. In addition, it was able to reduce the production of reactive oxygen and nitrogen species (ROS and NOs) and was genoprotective at the dose of 30 μg/ml (P<0.05). Later, in vivo tests were performed, where we used healthy Wistar rats in which the antioxidant and anti-inflammatory effects of the Tucumã extract were tested at doses of 250, 500, 1,000, 1,500mg/kg oral, by gavage, for 30 days. The animals were submitted to thoracotomy and blood, serum and tissues were collected. Blood count, serum albumin, cholesterol and triglycerides, as well as determination of the activity of the enzymes aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (FAL), butyrylcholinesterase (BuChE) and adenosine deaminase (ADA) in the serum. In the organs - liver, kidney, spleen and heart - the activity of the enzyme catalase (CAT), the presence of protein and non-protein thiols, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and carbonylated proteins were evaluated, as well as ADA activity in the heart. The results suggest that the extract has anti-inflammatory potential since it was able to decrease the number of platelets (around 85%), leukocytes (49%), neutrophils (44%) and lymphocytes (48%) at all doses when compared to control. Most of the biochemical analyzes in the serum did not present statistical difference between the groups, evidencing only a reduction in the levels of triglycerides (66%) in the higher dosages. Similarly, the extract had no systemic effect, considering the activities of serum BuChE and ADA, which did not show any differences between the groups, except for the ADA activity in the cardiac tissue was decreased (P<0.01) at the dosages of 1,000 and 1,500 mg/kg when compared to control. Considering the organs, the extract proved its antioxidant and protective activity through the evident decrease of TBARS in the liver (P<0.001) at all doses tested when compared to the control. Thus, based on the results of the present study, we can infer that the extract of A.
aculeatum has anti-inflammatory and antioxidant properties of natural occurrence with a
promising possibility of being exploited for therapeutic purposes.
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1 – Palmeiras de Astrocaryum aculeatum e os cachos contendo frutos. ... 18 Figura 2 – Frutos de tucumã (inteiros parcialmente descascados e seccionados) ... 19 Figura 3 – Estrutura química de alguns carotenoides. ... 23
MANUSCRITO
FIGURE 1 Representative high performance liquid chromatography profile of A. aculeatum extract, detection UV was at 325nm. Gallic acid (peak 1), catechin (peak 2), caffeic acid (peak 3), ellagic acid (peak 4), rutin (peak 5), quercetin (peak 6), β-carotene (peak 7) and kaempferol (peak 8). Chromatographic conditions are described in the Methods section... 56
FIGURE 2 Cell cycle of RAW 264.7 cells activated by PHA and treated with different concentrations of A. aculeatum extract. The analysis was performed using two-way ANOVA followed by the Bonferroni test. ***indicates a significant difference compared with control group (P <0.001)... 57
FIGURE 3 Expression of the IL-1β, IL-6, IL-10 genes in PHA activated RAW 264.7 cells and treated with different concentrations of A. aculeatum extract. The analysis was performed using one-way ANOVA followed by the Tukey’s multiple comparison test. Statistical differences are related between control and PHA and PHA and extract. **P<0.01; ***P<0.001. ... 58
LISTA DE TABELAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Tabela 1 – Composição dos principais carotenoides encontrados na polpa do tucumã (Astrocaryum aculeatum) descrita por De Rosso & Mercadante (2007).. ... 20 Tabela 2 – Composição de fenólicos e flavonoides de Astrocaryum aculeatum ... 21
MANUSCRITO
TABLE 1. Phenolics and flavonoids composition of Astrocaryum aculeatum ... 59
TABLE 2. Effects of different concentrations of A. aculeatum extract on cell viability, NOS and ROS in PHA activated RAW 264.7 cells ... 60
TABLE 3. Denaturation of DNA double-stranded DNA, TBARS and Carbonyl from RAW 264.7 cells after exposure to PHA and treated with 30 μg/ml of A. aculeatum extract ... 61 TABLE 4. Effects of administration of different doses of Tucumã extract (30 days) on biochemical and hematological parameters in healthy Wistar rats ... 62
TABLE 5. Effects of administration of different doses of Tucumã extract (30 days) on oxidative and antioxidant parameters in organs of healthy Wistar rats ... 63
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACh: Acetilcolina
AChE: Acetilcolinesterase ADA: Adenosina desaminase ADP: Adenosina difosfato ALT: Alanina aminotransferase AMP: Adenosina monofosfato AST: Aspartato aminotransferase ATP: Adenosina trifosfato
BHT: Hidroxitolueno butilado BuChE: Butirilcolinesterase CAT: Catalase
DCFH-DA: 2’,7’- diclorofluoresceína diacetato DMSO: Dimetilsulfoxido
ERN: Espécies reativas de nitrogênio EROs: Espécies reativas de oxigênio FAL: Fosfatase alcalina
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IL-10: Interleucina 10
IL-1β: Interleucina 1β IL-6: Interleucina 6 LPS: Lipopolissacarídeo MDA: Malondialdeído NPSH: Tióis não proteicos
OMS: Organização Mundial da Saúde PHA: Fitohemaglutinina
SDS: Dodecil sulfato de sódio SOD: Superóxido dismutase TBA: Ácido tiobarbitúrico TBARS: Ácido tiobarbitúrico TNF-α: Fator de necrose tumoral α
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 15
2.1 PLANTAS COM POTENCIAL TERAPÊUTICO ... 15
2.2 TUCUMÃ ... 18
2.2.1 Compostos bioativos ... 21
2.2.1.1 Carotenoides ... 22
2.2.1.2 Compostos fenólicos ... 24
2.2.2 Estudos com o tucumã ... 26
2.2.2.1 Tucumã e inflamação ... 26
2.2.2.2 Tucumã e estresse oxidativo ... 28
3 OBJETIVOS ... 30 3.1 OBJETIVO GERAL ... 30 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 30 4 MANUSCRITO ... 31 5 CONCLUSÃO ... 64 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 66 ANEXOS ... 73
APRESENTAÇÃO
Esta dissertação está subdividida nas seguintes seções: Uma introdução que apresenta de maneira sucinta o contexto e a relevância do estudo proposto seguida de uma revisão bibliográfica sobre os principais temas abordados e dos objetivos. Os itens Materiais e Métodos, Resultados, Discussão e Referências Bibliográficas, encontram-se na seção Manuscrito e representam a íntegra deste estudo. A formatação do manuscrito está organizada de acordo com as normas do periódico, Phytotherapy Reserach ao qual será submetido. A seção Conclusão disposta após o manuscrito contêm interpretações e comentários gerais referentes ao manuscrito. As Referências Bibliográficas ao final desta dissertação referem-se às citações que foram mencionadas nas seções Introdução e Revisão Bibliográfica.
1 INTRODUÇÃO
O uso das plantas há muito tempo vem sendo utilizado como meio de aliviar dores e enfermidades. As descobertas e usos pela medicina tradicional, cujas preparações foram adquiridas de forma folclórica e transmitidas através do tempo demonstram que as plantas são fontes de medicamentos e princípios ativos puros (PETROVSKA, 2012). Entretanto, muitas plantas medicinais e seus princípios ativos não tem comprovação científica de seus efeitos terapêuticos (FIRENZUOLIE e GORI, 2007).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 65 – 80% das pessoas utilizam a medicina tradicional em países em desenvolvimento e cerca de 85% destes utilizam extratos de plantas (WHO, 2011). Esta mesma organização lançou a Estratégia de Medicina Tradicional (2014-2023) com diretrizes para ajudar os países a desenvolver pesquisas, programar o uso seguro, aumentar a disponibilidade desses produtos e reduzir custos (WHO, 2014), visto que a utilização desse tipo de tratamento possibilita uma maior adesão e fácil aquisição por serem economicamente viáveis para diversas doenças.
No Brasil, encontramos uma variedade de plantas nativas que podem ser utilizadas como fitoterápicos e nutracêuticos, com potencial para inovações terapêuticas e farmacológicas. O país pode ser visto como principal candidato ao desenvolvimento de novos medicamentos a partir de espécies vegetais já que apresenta a maior biodiversidade vegetal do mundo, ocupa o terceiro lugar em produção de frutos e crescente tecnologia na área (FAO 2014; REFLORA, 2017). A bacia amazônica recebe destaque por ser rica em recursos genéticos de frutas e plantas oleaginosas e sua exploração econômica é de grande importância para a região. As frutas e plantas extraídas na Amazônia são ricas em micronutrientes, principalmente antioxidantes, como carotenoides, antocianinas e outros polifenóis (MACHADO et al., 2016; RUCHEL et al., 2015).
O tucumã, fruto da palmeira Astrocaryum aculeatum, é um destes frutos. Ele é amplamente utilizado no estado do Amazonas para fabricação de doces, sorvetes, licores ou consumo in natura. Além disso, da polpa e da semente do fruto são extraídos ainda diferentes óleos comestíveis (SHANLEY e MEDINA, 2005) e se sabe que comunidades ribeirinhas utilizam o fruto para problemas oculares e sintomas inflamatórios (COELHO-FERREIRA, 2009). Atualmente, a maioria dos estudos envolvendo este fruto tem foco na agrobiologia, destacando suas características morfofisiológicas, locais de produção, métodos de extração, utilização como biocombustível e sua caracterização fitoquímica (JUNGLES et al., 2017; MANZATO et al., 2017; RAMOS et al., 2016; UMPIERRES et al., 2017). No fruto foram
encontradas diversas substâncias como carotenoides, flavonoides, ácido ascórbico e ácidos graxos saturados ricos em ômega 3, 6 e 9 (DE ROSSO e MERCADANTE, 2007; GONÇALVES, 2008).
Considerando a utilização tradicional, a evidência dos fitoquímicos presentes em alta concentração no tucumã e a importância da descoberta de medicamentos a base de plantas fica clara a necessidade de analisar as propriedades terapêuticas deste fruto através de estudos
in vitro e in vivo para avaliar a capacidade antioxidante e anti-inflamatória.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 PLANTAS COM POTENCIAL TERAPÊUTICO
Há milhares de anos o uso das plantas nativas, como alimento ou remédio, é empregado. A história das civilizações é rica em exemplos da utilização de recursos naturais na medicina, no controle de pragas e em mecanismos de defesa (FIRENZUOLIE e GORI, 2007; PETROVSKA, 2012). No entanto, a busca dos constituintes ativos presentes em plantas medicinais, como nós conhecemos hoje, começaram apenas no século XIX (DUTRA et al., 2016). O tratado mais antigo da medicina que se tem conhecimento data 2600 a.C. e foi relatado pelos sumérios os quais utilizavam diferentes partes de lótus, oliveira e alho no tratamento de diversas enfermidades (PETROVSKA, 2012). O ópio, extraído dos bulbos de
Papaver somniferum é conhecido por suas propriedades analgésicas e soníferas, havendo
relatos na mitologia grega atribuindo à papoula do ópio o simbolismo do deus do sono Morfeu. Séculos mais tarde foi descoberto que o ópio produz outros alcaloides como a morfina (Friedrich Serturner, em 1806), codeína (Pierre-Jean Robiquet, em 1824) e a papaverina (George Merck Fraz, em 1848) (DUTRA et al., 2016).
Os egípcios tinham seus usos documentados no ―Papyrus Ebers‖ no qual mais de 700 plantas eram descritas, dentre elas o salgueiro do qual foi extraída a salicina, em 1829 por Felix Leroux, composto precursor do ácido acetilsalicílico (analgésico e antipirético) (DIAS; URBAN; ROESSER, 2012). O imperador Shen-Nung (3500 – 2600 a.C.) foi o precursor dos estudos na China e catalogou 365 espécies de plantas medicinais. A medicina tradicional chinesa desenvolveu-se tanto que talvez seja a cultura que mais estuda e busca o entendimento de suas plantas nativas, isolamento de princípios ativos e mecanismo de ação até hoje (IKRAM et al., 2015).
Na Grécia Antiga, Hipócrates, conhecido como pai da medicina (460‐377 a.C.), já percebia que através da dieta alimentar adequada poderia ser desenvolvido o tratamento para muitas doenças e que para uma prescrição mais exata deveria se conhecer os constituintes e propriedades dessa dieta. Inclusive, nesta época, extratos vegetais foram utilizados em execuções, como no caso de Sócrates, que morreu após a ingestão de uma bebida à base de cicuta, que continha a coniina (neurotoxina) (VIEGAS; BOLZANI; BARREIRO, 2006). Claudius Galeno (129‐216 d.C.), considerado o pai da farmácia, foi o primeiro grande estudioso da fisiologia experimental. Em seus mais de trezentos tratados, descreve sobre fisiologia do corpo humano, tratamentos utilizando plantas, entre outros assuntos. As preparações galênicas, como eram chamadas suas prescrições, foram estudadas e deram origem ao que hoje conhecemos como farmácia magistral (VIEGAS; BOLZANI; BARREIRO, 2006).
Observa-se que a partir das ideias introduzidas por esses estudiosos, importantes constituintes ativos foram isolados de plantas e possibilitaram o desenvolvimento de medicamentos. Entre muitos exemplos podemos citar: atropina (antagonista muscarínico) isolada de Atropa belladona por Mein em 1831; cafeína (estimulante) obtida por Runge em 1820 a partir de Coffea arabica; digoxina (digitalis) isolada por Claude-Adolphe Nativelle em 1869 da Digitalis lanata; e curare (relaxante muscular) isolado por Winstersteiner e Dutcher em 1943 de Chondrodendron tomentosum (SEN; SAMANTA, 2014).
O isolamento dos constituintes das plantas permite a produção de moléculas mais complexas, utilizando a química farmacêutica, para aumentar o efeito, diminuir a toxicidade e formular compostos sintéticos e derivados (CRAGG e NEWMAN, 2013). Essa forma de produção despertou o interesse, principalmente, das indústrias farmacêuticas em todo o mundo (DAVID; WOLFENDER; DIAS, 2015). Estima-se ainda que cerca de 30% dos medicamentos terapêuticos disponíveis são derivados de fontes naturais, principalmente de plantas e microrganismos (NEWMAN e CRAGG, 2012).
Devido à acessibilidade, uso e as propriedades farmacológicas dos produtos naturais, principalmente nos países em desenvolvimento, a OMS criou em 1970 o ―Programa de Medicina Tradicional‖. Este vem sendo atualizado regularmente e fornece incentivo e subsídio para pesquisa e integração da medicina tradicional e da medicina complementar alternativa nos sistemas nacionais de atenção à saúde, assim como promover o uso racional dessa integração (WHO, 2014).
Muitas classes de princípios ativos foram descobertas em plantas medicinais brasileiras. O Brasil é o país que abriga a maior biodiversidade do planeta. Até o momento,
são reconhecidas 46.478 espécies para a flora brasileira, sendo 4.753 de Algas, 33.083 de Angiospermas, 1.564 de Briófitas, 5.718 de Fungos, 30 de Gimnospermas e 1.330 de Samambaias e Licófitas. Esta abundante variedade de vida, eleva o Brasil ao posto de principal nação com mais de 20% do número total de espécies da Terra (REFLORA, 2017).
Dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) mostram que, em 2015, o Brasil manteve-se na terceira colocação no ranking da produção mundial de frutas, com 40,2 milhões de toneladas e responsável por 4,8% do volume colhido. Os frutos, bem como outras partes das plantas, são amplamente utilizados na medicina tradicional e para a pesquisa de fitoquímicos. Além disso, a ascensão de conceitos como alimentos funcionais e nutracêuticos têm ganhado destaque devido à busca por uma vida mais saudável e seus benefícios. Estudos mostram que a ingesta desses produtos, baseados em seus compostos bioativos, são capazes de reduzir o risco de uma grande variedade de patologias como doenças cardiovasculares, câncer, diabetes, Alzheimer entre outras (BVENURA et al., 2017; KAULMANN e BOHN, 2014; ZANG e TSAO, 2016).
Neste sentido, o Brasil criou Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, aprovada por meio do Decreto Nº 5.813, de 22 de junho de 2006. Essa política estabelece diretrizes para o desenvolvimento de pesquisas e inovação, garantia ao acesso, uso racional e utilização da biodiversidade brasileira para a saúde (BRASIL, 2006a). Estratégias foram implementadas já no mesmo ano, como a fitoterapia no Sistema Único de Saúde (SUS) e criado Programa de Pesquisas de Plantas Medicinais da Central de Medicamentos (BRASIL, 2006b).
Devido a esse incentivo, muitos estudos têm procurado caracterizar a composição química das plantas brasileiras, buscando a identificação de alguns compostos bioativos importantes (INFANTE et al., 2016; MATIAS et al., 2013; OLIVEIRA et al., 2012). Os resultados são positivos e demonstram um alto potencial farmacoterapêutico. Muitas dessas plantas estão na região amazônica, onde está nossa maior diversidade. Pouco se conhece de algumas plantas e espécies presentes na Amazônia, sendo que há indícios que há muito a se descobrir. Algumas já ganharam notoriedade como açaí, castanha do pará e guaraná que são amplamente consumidas e conhecidas até mesmo no exterior (FRUTICULTURA, 2017).
Um fruto ainda pouco explorado, mas com indícios de ações benéficas e terapêuticas é o tucumã, o qual é destaque e considerado o fruto que melhor representa a capital amazonense. Em torno dele desenvolveu-se um importante mercado na região central da Amazônia (DIDONET e FERRAZ, 2014).
2.2 TUCUMÃ
O gênero Astrocaryum, família Aracaceae possui numerosas espécies de palmeiras distribuídas ao norte da América do Sul e do Brasil. Entre as diversas espécies, encontram-se:
A. aculeatum Meyer, A. vulgare Mart, A. segregatum Dr., A. princeps Bard., A. giganteum
Bar., A. acaule Mart., A cantensis, A. chonta Mart., A. leisphota Bard., A. undata Mart (KAHN, 2008).
A palmeira Astrocaryum aculeatum ocorre geralmente sem ser plantada devido aos animais, principalmente a cutia, que se alimentam da polpa e enterram o caroço no solo. É encontrada em ambientes de terra firme, vegetação secundária, tolerante a solos pobres e degradados e é resistente ao fogo podendo regenerar-se. Os agricultores trabalham manejando o cultivo, sendo ele lento: sua germinação demora de trinta dias – se for utilizado algum processo - a dois anos, cresce 1 metro ao ano - podendo atingir 25 metros - e partir dos 7 metros começa a produzir frutos (LEITÃO, 2008; SHANLEY e MEDINA, 2005).
Possui um único tronco grosso coberto por numerosos espinhos dispostos em anéis e folhas que também apresentam espinhos em sua extensão os quais podem ser vistos na figura 1. Seu tronco é utilizado para construções rurais e as suas folhas e fibras são utilizadas em diversos tipos de artesanato (SHANLEY e MEDINA, 2005).
Figura 1 - Palmeiras de Astrocaryum aculeatum e os cachos contendo frutos.
Fonte: Adaptado do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA)
A palmeira produz de três a quatro cachos por ano contendo, em média, 240 frutos por cacho. Seu fruto é popularmente conhecido como tucumã-do-amazonas, tucumã-açu ou apenas tucumã. Floresce de julho a janeiro e frutificam de fevereiro a agosto podendo ser encontrado nas regiões norte e centro-oeste do Brasil, mas principalmente no estado do Amazonas, de onde é nativo e pode ser visto durante todos os meses do ano. Os frutos apresentam formato ovoide pesando de 20 a 100g, medindo de 4,5 a 6,0cm de comprimento e
3,5 a 4,5cm de diâmetro. A coloração da casca varia de verde a amarela e da polpa de amarela a laranja (figura 2). O caroço, que representa 80% do peso do fruto, contém em seu interior uma massa branca de onde se pode extrair manteiga e óleo (FERREIRA et al., 2008; SHANLEY e MEDINA, 2005).
Figura 2 - Frutos de tucumã (inteiros parcialmente descascados e seccionados).
Fonte: Adaptado do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA)
Seu consumo pode ser feito in natura ou como ingrediente para outras receitas como, por exemplo, sanduíche de tucumã, tapioca, licores, doces, sorvetes, sucos e óleos comestíveis. Além disso, pode ser utilizado na fabricação de produtos cosméticos e biocombustível (YUYAMA et al., 2008).
Aguiar e col. (1980) já havia demonstrado seu potencial nutricional e fonte energética. Estudos posteriores de Leitão e col. (2008) e Yuyama e col. (2008) analisaram, através 100g de fruto, que o tucumã possui, em média, 320kcal de energia, 50,25% de umidade, 1,23% de cinzas, 25,19% de lipídios, 3,39% proteína, 19,25% carboidrato e 28,71% de fibra. Entre os macrominerais, Leitão e col. (2008) encontrou concentrações consideráveis de cálcio, magnésio, potássio, sódio e fósforo e entre os microminerais estão ferro, zinco, cobre, cromo e manganês. Além disso, o óleo da polpa de tucumã apresenta 74,4% de ácidos graxos insaturados e 25,6% de ácidos graxos saturados que são ricos em ômega 3, 6 e 9 (BARBOSA et al., 2009).
Em seus estudos, De Rosso e Mercadante (2007) quantificaram 60 tipos de carotenoides em frutos amazônicos, 21 deles foram encontrados no tucumã (Tabela 1) sendo o β-caroteno-todo-trans o carotenoide em maior concentração.
Tabela 1 - Composição dos principais carotenoides encontrados na polpa do tucumã (Astrocaryum aculeatum) descrita por De Rosso e Mercadante (2007)
Composição Concentração (µg/g) Total de carotenoides 62,65 β-caroteno-todo-trans 47,36 α-caroteno-todo-trans 1,68 β-criptoxantina-todo-trans 1,64 13-cis-β-caroteno 1,60 α-criptoxantina-todo-trans 1,30 Zeinoxantina 1,02 Luteína-toda-trans 0,79 Cis-γ-caroteno 3 0,89 15-cis-β-caroteno 0,80 5,8-epoxi-β-caroteno 0,76 Cis-β-zeacaroteno 2 0,65 Cis-β-zeacaroteno 1 0,60 σ-caroteno-todo-trans 0,52 β-zeacaroteno-todo-trans 0,44 γ-caroteno-todo-trans 0,35 Neoxantina-toda-trans 0,26 Cis-violaxantina 0,24 Cis-neoxantina 0,18 Zeaxantina-toda-trans 0,16 δ-caroteno-todo-trans 0,14 Cis-luteína 0,04
Fonte: De Rosso & Mercadante, 2007
Além dos carotenoides, outros compostos bioativos foram avaliados por diversos estudos (SOUZA-FILHO et al., 2013; JOBIM et al., 2014; SAGRILLO et al., 2015) na polpa e na casca de tucumã. Alguns valores estão exemplificados na tabela 2.
Tabela 2 - Composição de fenólicos e flavonoides de Astrocaryum aculeatum
Compostos bioativos mg/100g
Sagrillo et al., 2015
Casca Polpa
Total de compostos fenólicos 790.95 426.35
Flavonoides (quercetina mg/g) 77.52 26.06 Taninos 26.37 4.03 Alcaloides 1.26 0.45 Β-caroteno 52.83 20.97 Rutina 25.64 14.51 Quercetina 10.68 4.97 Ácido Gálico 3.18 10.85 Ácido Cafeico 6.99 0.66 Ácido Clorogênico 2.55 0.91
Fonte: Sagrillo et al., 2015.
Os resultados mostram-se, em média, similares, tendo em vista que o solo, o período do ano entre outros fatores interferem na concentração dos fitoquímicos (FERRERA et al., 2016). A casca, que não é consumida pela população por ser muito consistente, apresenta concentrações superiores para a maioria dos bioativos quando comparada a polpa. Souza (2014) atentou para esse fato e para utilizar os resíduos dos frutos, como a casca, como fonte alternativa de matéria-prima em formulações de cosméticos ou nutracêuticos, bem como utilizá-los como adjuvantes pela indústria farmacêutica.
2.2.1 Compostos bioativos
O tucumã, assim como outros frutos e vegetais, não contém apenas nutrientes, mas também um número expressivo de compostos chamados fitoquímicos. Estes são compostos biologicamente ativos, de ocorrência natural nas plantas e que atuam como sistemas de defesa, protegendo-as contra infecções e invasões microbianas, além de conferir a elas cor, sabor e aroma (GRAIG, 1997).
Vários estudos epidemiológicos têm demonstrado que a alta ingesta desses fitoquímicos está relacionada a uma redução no risco de desenvolvimento de doenças crônicas (BJØRKLUND e CHIRUMBOLO, 2016; BVENURA e SIVAKUMAR, 2017; COSTA e ROSA, 2010). A manutenção de uma condição inflamatória de baixo grau crônica é caracterizada pelo aumento de marcadores inflamatórios circulantes, como por exemplo, as interleucinas, prostaglandinas, fator de necrose tumoral (TNF-α), células imunes (macrófagos, leucócitos). Observa-se também o aumento dos marcadores de estresse oxidativo como malondialdeído (MDA), a peroxidação lipídica, a carbonilação de proteínas entre outros. Esses fatores podem tanto estabelecer a doença, quanto agravá-la (KAULMANN e BOHN 2014).
Assim, busca-se avaliar os efeitos dos fitoquímicos provenientes dos tratamentos com esses compostos em parâmetros de atividade antioxidante e anti-inflamatória, já que podem atuar de várias formas para reduzir o dano celular causado. No tucumã, os compostos em maior concentração estão descritos a seguir.
2.2.1.1 Carotenoides
Os carotenoides são uma família de pigmentos que ocorrem em plantas, animais, fungos e bactérias e mais de 600 estruturas já foram isoladas e caracterizadas (figura 3). São considerados tetraterpenoides por possuírem C40 ligados através de duplas ligações conjugadas que dão origem aos diferentes tons variando do amarelo ao vermelho. Quimicamente são classificados como carotenos e xantofilas. Os carotenos são constituídos apenas de carbono e hidrogênio enquanto que as xantofilas apresentam grupamentos substituintes com oxigênio (SHIH et al., 2008; YEUM e RUSSEL, 2002).
Nas plantas, principal fonte, são precursores de hormônios, auxiliam no processo da fotossíntese e atraem polinizadores e outros agentes que contribuem para a dispersão de sementes (NAGÃO, 2014; SHETE e QUADRO, 2013). Entre os exemplos mais comuns estão: tomates, cenouras, abóbora, pimentas vermelhas, pimentão e mamão (BRASIL, 2008). Também podem ser encontrados em microrganismos, crustáceos e peixes e, aproximadamente 80 carotenoides são sintetizados por bactérias fotossintéticas e por alguns fungos filamentosos (UENOJO; MARÓSTICA; PASTORE, 2010).
Figura 3 - Estrutura química de alguns carotenoides
Figura 3. Estrutura química de alguns carotenoides
Fonte: Adaptado de Olson & Krinsky, 1995.
Fonte: Adaptado de Olson & Krinsky, 1995
Nos humanos, diversos estudos demonstraram que a ingesta de carotenoides, através da dieta, traz inúmeros benefícios para a saúde, como sua capacidade de gerar vitamina A, sua capacidade antioxidante e anti-inflamatória (SHETE e QUADRO, 2013; KAULMANN e BOHN 2014). Aproximadamente quarenta carotenoides estão presentes na dieta e foram identificados apenas vinte no sangue e tecidos humanos. Entre esses, os mais estudados em relação à saúde humana são o β-caroteno, α-caroteno, licopeno, β-criptoxantina e luteína, por serem os carotenoides mais encontrados no organismo (RAO e RAO, 2007).
Carotenoides pró-vitamina A como β-caroteno, α-caroteno e criptoxantina e os que não são precursores de vitamina A como licopeno, luteína e zeoxantina estão presentes no sangue e tecidos e apresentam uma variedade de funções que incluem a eliminação de radicais livres, melhora na comunicação intracelular e imunomodulação. Seus efeitos terapêuticos foram comprovados contra cânceres, doenças cardiovasculares, diabetes, degeneração macular, envelhecimento, além de quimioproteção à célula e ao material genético (GLORIA et al., 2014; KAULMANN e BOHN 2014).
Seus efeitos estão relacionados à cadeia estrutural comum (figura 3). As ligações simples e duplas alternadas além de oferecer estabilidade à molécula também estabilizam os elétrons não emparelhados após a extinção do radical livre. Esse sistema influencia em propriedades químicas, físicas e bioquímicas. Devido às duplas ligações podem ser considerados fortes eliminadores e/ou sequestradores de oxigênio singlet 1O2 e radicais peroxila. Entretanto, por essas mesmas ligações, são compostos facilmente oxidáveis. (KAULMANN e BOHN 2014; MILANI et al., 2017). Além de remover EROs diretamente, podem atuar por rotas indiretas como ativação de sinalização celular pelo fator nuclear κB (NF-κB), proteína quinase ativada por mitógenos (MAPK) ou ativação do fator nuclear eritroide 2 (Nrf2) (KAULMANN e BOHN 2014).
Muitos estudos in vitro, especialmente aqueles que incluem modelos celulares, ajudaram a estabelecer uma ligação entre carotenoides, estresse oxidativo e inflamação (KAULMANN e BOHN 2014). Feng e col.(2010) ativaram células RAW 264.7 com 1µg/ml de LPS e tratou com licopeno nas concentrações de 1-10 μM. O tratamento apresentou ambas atividades anti-inflamatória e antioxidante pois houve redução de NO e IL-6 (pró-inflamatória), além da inibição de NF-κB.
Glória e col. (2014) também testaram in vitro os efeitos dos carotenoides. Em seu estudo, utilizaram linhagem celular de câncer de mama humano para determinar o efeito dos carotenoides no ciclo celular e viabilidade celular. Os resultados mostraram uma diminuição significativa no número de células de câncer de mama viáveis no tratamento com carotenoides. Os carotenoides também promoveram uma interrupção do ciclo celular, como já havia sido relatado na literatura, no qual há um acúmulo de células na fase G0/G1 e consequente diminuição na G2/M.
Além disso, muitos estudos são feitos em humanos e modelos animais, demonstrando que são importantes antioxidantes dentro das membranas biológicas. Por serem moléculas lipossolúveis, são encontradas principalmente em ambientes lipofílicos e interfaces lipídicas, desempenhando suas ações tanto na membrana celular externa como também nas mitocôndrias e núcleo. Dessa forma, protegem as membranas celulares contra os radicais peroxila e contra o dano às lipoproteínas (GRUSZECKI et al., 2010).
2.2.2.1 Compostos fenólicos
Mais de 8000 estruturas fenólicas foram descritas e estão amplamente dispersas em todo o reino da plantae (OROIAN; ESCRICHE, 2015). Os compostos fenólicos ou polifenóis
são os antioxidantes dietéticos mais abundantes. Estão presentes em uma ampla gama de fru-tas, vegetais, grãos, raízes, chocolate, café, chá, vinho, entre outros (FORBES-HERNÁNDEZ et al., 2014). Nas plantas, são conhecidos como metabólitos secundários e geralmente são sintetizados como mecanismos de defesa aos estressores. Possuem um ou mais anéis aromáti-cos com grupos hidroxila como substituintes e, dependendo dos elementos estruturais são classificados em diferentes grupos. Os principais são: flavonoides, ácidos fenólicos, álcoois fenólicos, stilbenos e lignanas (D'ARCHIVIO, 2007).
Chamam a atenção por suas funções antioxidantes, anti-inflamatórias, transdutoras de sinal, antimicrobianas e antiproliferativas (ZHANG e TSAO, 2016). A presença de um anel aromático conjugado com grupos hidroxílicos torna esses compostos capazes de neutralizar os radicais livres. Podem atuar eliminando efetivamente os radicais e quelando metais para inibir a produção de espécies reativas (WANG, LI, BI, 2017).
Da mesma forma que outros constituintes, os compostos fenólicos não exercem seus efeitos apenas nas EROs diretamente, mas também ativando rotas de sinalização celular. Os principais mecanismos pelos quais os compostos fenólicos desempenham seus efeitos são através da sinalização do NF-κB, proteína ativadora-1 (AP-1– fator de transcrição sensível redox), Nrf2 e MAPK (OROIAN et al., 2015). Há evidências de que a ingesta em longo prazo pode ter efeitos favoráveis sobre a incidência de cânceres e doenças crônicas, incluindo doen-ças cardiovasculares, diabetes tipo II e funções cognitivas (DEL RIO et al., 2013).
A primeira forma de avaliação desses compostos é através de testes in vitro, utilizando métodos antioxidantes como o poder antioxidante de redução férrica (FRAP), a capacidade absortiva do radical oxigênio (ORAC), 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH) e a fotoquimilumi-nescência (PCL). Apesar dos excelentes resultados encontrados, para os mais diversos tipos de compostos fenólicos, sabe-se que eles são metabolizados rapidamente e possuem baixa solubilidade, resultando em reduzida biodisponibilidade in vivo (ZHANG e TSAO, 2016). Dessa forma, alguns estudos já procuram incluir esses compostos em formulações nanoencap-suladas como, por exemplo, o estudo de Jacques e col. (2013) que avaliou o efeito preventivo da curcumina livre e nanoencapsulada em ratos submetidos a exposição à fumaça do cigarro, obtendo a confirmação da ação protetora e antioxidante desse tipo de composto.
Os compostos fenólicos estão presentes em uma ampla gama de alimentos e são parte importante da composição do tucumã, o que pode explicar seu uso medicinal pela cultura po-pular.
2.2.2 Estudos com tucumã
A maioria dos estudos utilizando esse fruto visa elucidar questões agrobiológicas de caracterização, extração e produção, sendo que seus possíveis efeitos terapêuticos são pouco explorados na literatura (JUNGLES et al., 2017; MANZATO et al., 2017; RAMOS et al., 2016; UMPIERRES et al., 2017). O tucumã é popularmente utilizado para evitar acidentes vasculares cerebrais, dores de ouvido, problemas oculares e no combate do reumatismo (COELHO-FERREIRA, 2009). A partir da descoberta da sua composição fitoquímica, acredita-se que os compostos bioativos presentes no fruto exerçam atividades anti-inflamatórias e antioxidantes em associação.
2.2.2.1 Tucumã e inflamação
Após a verificação dos constituintes do tucumã e sua possível ação anti-inflamatória, alguns estudos procuraram comprovar esses efeitos. Bony e col. (2012) utilizaram dois modelos experimentais para verificar a capacidade anti-inflamatória. No primeiro modelo, de inflamação aguda, foi administrado lipopolissacarídeo (LPS) via intraperitoneal em ratos wistar. Essa administração induziu forte produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α e IL-6 e diminuição de citocinas anti-inflamatórias como a IL-10. No grupo com tratamento oral, via gavagem, de óleo de A. vulgare, houve diminuição de 79% nos níveis séricos de TNF-α, 35% nos de IL-6 e um aumento de 70% nos níveis de IL-10 em comparação com o grupo induzido sem tratamento. Estes resultados indicaram que o óleo de A. vulgare controla a toxicidade endógena, atenuando a resposta pró-inflamatória e aumentando a função anti-inflamatória como resposta protetora do hospedeiro. Além disso, foram analisadas as produções de citocinas nos órgãos fígado, rim, baço e pulmão. Foram encontradas respostas semelhantes ao ocorrido no soro. Após a administração de LPS, houve um significativo aumento na produção de TNF-α e IL-6 em todos os órgãos testados e um ligeiro aumento na de IL-10 no baço e pulmão. O tratamento com o óleo diminuiu a produção de TNF-α no baço (21%) e pulmão (41%), induziu uma diminuição na produção de IL-6 (29%) esplênica e pulmonar (16%) como também um forte aumento da produção de IL-10 no baço (67%), pulmão (29%) e rim (24%).
No segundo modelo, de inflamação crônica, Bony e col. (2012) sensibilizaram os ratos com ovoalbumina, a qual é utilizada para indução experimental de asma. Essa sensibilização aumentou o número de células totais no fluído de lavagem broncoalveolar (BALF) em
comparação com o controle. O tratamento com o óleo de A. vulgare diminuiu significativamente as células totais em BALF (28% pela via oral e 27% pela via intraperitoneal de óleo). A análise de subpopulações de leucócitos mostrou um forte aumento de macrófagos, eosinófilos e linfócitos induzidos pela administração de ovalbumina. O tratamento com óleo levou à diminuição em eosinófilos (45% para V.O. e 61% para administrações I.P.) e em linfócitos (46% para V.O. e 50% para administração I.P.) quando comparados com ratos sensibilizados, mas sem tratamento. O tratamento não teve efeito sobre a contagem de macrófagos e induziu um leve aumento, porém significativo no número de neutrófilos, quando a administração foi por via intraperitoneal. Este modelo demonstrou que o óleo diminuiu o afluxo de células inflamatórias no pulmão, principalmente eosinófilos e linfócitos.
Motivados pelos resultados obtidos, Bony e col. (2014) resolveram testar as frações do óleo de A. vulgare em in vitro. Os resultados foram promissores, pois demonstraram que, na dose de 250μg/ml de fração insaponificável, houve uma inibição de 97 e 80% de COX-1 e 2, respectivamente, em comparação com indometacina (utilizada como padrão) que inibiu 27% da COX-1 e 90% da COX-2. Essa inibição foi não específica, semelhante ao mecanismo dos anti-inflamatórios não esteroidais.
Após, as frações foram testadas em macrófagos de linhagem J774 ativados por LPS e IFNγ. Uma vez ativados, eles produzem grande quantidade de mediadores inflamatórios como citocinas, óxido nítrico e prostaglandinas. A análise feita foi direcionada principalmente na liberação de PGE-2, que é o produto mais importante da COX-2. Conforme o inferido, a ati-vação aumentou drasticamente a produção de PGE-2 no sobrenadante da cultura em 24h em comparação com macrófagos não ativados. A fração insaponificável induziu uma inibição dose-dependente da produção de PGE2, com 76% de inibição para 40 μg/ml, e não afetou a viabilidade celular (BONY et al., 2014).
Baldissera e col. (2017) observaram que a atividade da enzima AChE em tecido cere-bral de ratos com diabetes induzida e tratados com óleo de A. vulgare foi menor em compara-ção com os não tratados, confirmando o efeito protetor do óleo na memória. Em outro estudo no mesmo autor, avaliou o tratamento com óleo de A. vulgare e seu efeito na atividade das enzimas do sistema purinérgico em ratos com diabetes induzida. Em condições crônicas, co-mo o diabetes, as células liberam grandes quantidades de mediadores coco-mo o ATP que atuam como pró-inflamatórios. Os ratos tratados com o óleo apresentaram um aumento na atividade da enzima NTPDase que hidroliza o ATP em ADP e do ADP a AMP, diminuindo seus níveis séricos na tentativa de reduzir o processo inflamatório sistêmico. Os níveis de AMP séricos
também estavam baixos, demonstrando o aumento da atividade da 5’-nucleotidase no soro. Além disso, a atividade sérica da ADA foi maior no grupo com diabetes. A consequente di-minuição da adenosina, molécula anti-inflamatória, está associada ao desenvolvimento do processo inflamatório no diabetes. O tratamento com o óleo de tucumã foi capaz de modular as alterações, mantendo níveis séricos basais de ATP, ADP, AMP e adenosina, moléculas que exibem propriedades anti-inflamatórias.
Devido a sua composição rica em ômega 3, 6 e 9, além de outros compostos, podemos inferir que o tucumã teria um efeito na diminuição da inflamação, colesterol alto e também no controle do nível de açúcar no sangue. Maia e col. (2014) realizou um estudo no qual ratos foram submetidos a uma dieta hiperlipidêmica e tratados com a ração constituída por caseína, ração comercial e 60% de polpa de A. aculeatum. As análises de ganho de massa corporal, concentração plasmática de colesterol total, triglicerídeos, HDL-c, LDL-c, VLDL mostraram que o grupo tucumã apresentou uma tendência ao aumento de massa corporal, não mostrou diferença na concentração de colesterol total, e apresentou maiores valores absolutos para os triglicerídeos e para o VLDL. Além disso, os níveis séricos de HDL-c e LDL-c mostraram-se elevados nos grupos que consumiram tucumã. Através da pesquisa observou-se que o fruto A.
aculeatum não apresentou efeito hipolipidêmico, visto que os animais apresentaram
concen-trações elevadas dos lipídeos.
2.2.2.1 Tucumã e estresse oxidativo
Ao analisar o comportamento de ratos com diabetes e tratá-los com óleo de A. vulgare, Baldissera e col. (2017) descobriram que o tratamento reduziu o estresse oxidativo em cérebro de ratos. No homogeneizado do tecido foi observada uma redução de TBARS e carbonil em ratos com diabetes tratados, bem como o aumento na atividade das enzimas antioxidantes como a SOD e a CAT. Em outro estudo do mesmo autor, o óleo de A. vulgare também foi capaz de prevenir o estresse oxidativo no pâncreas de ratos diabéticos, através da diminuição do TBARS, e melhorar o sistema de defesa antioxidante com aumento da atividade da CAT e da SOD. Além disso, foi observado que há uma relação entre o estresse oxidativo e consequente dano no DNA (BARZILAI e YAMAMOTO, 2004).
Em células isoladas do pâncreas, através dos testes do cometa, índice de dano e viabilidade celular foi constatada essa relação. Observou-se que houve aumento da viabilidade celular, redução da cauda e consequentemente do dano nos grupos tratados com óleo de A. vulgare quando comparadas ao grupo diabético. Dessa forma, acredita-se que o
efeito protetor do óleo em células isoladas do pâncreas é uma consequência de redução do estresse oxidativo e de melhoria nas defesas antioxidantes. Esses resultados são consistentes com reduções no estresse oxidativo encontradas em outros estudos, nos quais o uso de A.
aculeatum e A. vulgare melhoraram a atividade de enzimas antioxidantes e impediram o
aumento da peroxidação lipídica (BALDISSERA et al., 2017; BONY et al., 2012; GONÇALVES et al., 2010; JOBIM et al., 2015; SAGRILLO et al., 2015).
No estudo citado anteriormente de Bony e col.(2012), onde foi simulado o modelo de asma foi demonstrado que a ovoalbumina foi capaz de aumentar o estresse oxidativo tanto em soro quanto em BALF. Através do teste de capacidade de absorção dos radicais O2 o tratamento com óleo induziu uma inibição significativa de oxidantes em BALF (28% por V.O. e 42% por via I.P.) e oxidantes séricos (11% por V.O. e I.P.) em comparação com ratos sensibilizados.
Para avaliar se os efeitos antimicrobianos do extrato de A. aculetaum eram devido ao balanço REDOX, Jobim e col. (2015) testaram o extrato de A. aculeatum em culturas de bactérias gram positivas, bactérias gram negativas e Candida albicans. Primeiramente, foi avaliado se o extrato poderia causar um efeito citotóxico agudo sobre os microrganismos através das concentrações de dsDNA. Os resultados foram negativos e semelhantes ao controle, indicando que não houve degradação significativa no DNA. Além disso, as concentrações de ROS no meio de cultura permaneceram inversamente proporcionais à quantidade de extrato de tucumã após 24h, sugerindo que uma maior quantidade de antioxidantes no meio de cultivo pode causar um desequilíbrio REDOX e contribuir para a inibição do crescimento e/ou a morte do microrganismo.
Para confirmar que as moléculas bioativas presentes nos extratos de A. aculeatum contribuem para a sua capacidade antioxidante Sagrillo e col. (2015) utilizaram linfócitos isolados de humanos expostos a H2O2 em ensaios de DDPH, TRAP e dsDNA. O ensaio DPPH no extrato de tucumã foi anteriormente descrito por Gonçalves e col. (2010). Em ambos os estudos, os extratos apresentaram atividade protetora na concentração de 20µg/mL em comparação com células não tratadas. Esses resultados estão em concordância com alguns estudos anteriores, que observaram que alguns carotenóides, como o β-caroteno, aumentam a resistência ao dano oxidativo do DNA em concentrações relativamente baixas (RAO e RAO, 2007).
Diante do exposto, podemos perceber que o tucumã possui efeitos terapêuticos, entretanto, faltam dados sobre a melhor dose a ser utilizada e quais os mecanismos de ação ou vias pelas quais as atividades antioxidante e anti-inflamatória são desencadeadas.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar os efeitos do tratamento com extrato de tucumã sobre o processo inflamatório e o metabolismo oxidativo, a partir de estudos in vitro e in vivo.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Analisar os compostos bioativos presentes no extrato de tucumã;
Em cultura de células, tratadas com diferentes doses do extrato de tucumã, avaliar: o Viabilidade celular
o Ciclo celular o Citotoxicidade
o Expressão gênica das interleucinas IL-1β, IL-6, IL-10 o Quantificar os níveis de EROs e ERN
Em ratos tratados com diferentes doses do extrato de tucumã, avaliar: o Parâmetros hematológicos
o Concentrações de albumina, colesterol e triglicerídeos
o Atividade das enzimas marcadoras de dano hepático: ALT, AST e FAL o Atividade da enzima BuChE em soro
o Atividade da enzima ADA em soro e coração
o Investigar os marcadores de estresse oxidativo (TBARS, carbonil, CAT, T-SH e NPT-SH) em homogeneizados de fígado, rim, baço e coração
4 MANUSCRITO
Astrocaryum aculeatum (TUCUMÃ): ANTI-INFLAMMATORY AND ANTIOXIDANT EFFECTS IN VITRO AND IN VIVO
Fernanda Licker Cabrala, Viviane Martins Bernardesb, Juliana Sorraila de Oliveirab, Pedro Henrique Doleskib, Karine Lanes Silveiraa, Mauren Cattani Hovarta, João Mateus Bremmb, Fernanda Barbisanc, Verônica Farina Azzolinc, Cibele Ferreira Teixeirac, Guilherme Lopes Dornellesd, Cínthia Melazzo de Andradebd, Ivana Beatrice Mânica da Cruzbc, Euler Esteves Ribeiroe, Daniela Bitencourt Rosa Lealab.
a Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria-RS, Brazil;
b Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria-RS, Brazil;
c
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria-RS, Brazil;
d Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Centro de Ciências Rurais, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria-RS, Brazil;
e Programa de Pós-graduação em Gerontologia e Saúde do Idoso, Escola Superior de Ciências da Saúde, Uni-versidade do Estado do Amazonas;
* Corresponding author: Daniela Bitencourt Rosa Leal Tel.: +55-553220-9581 Fax: + 55-553220-8242
Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Centro de Ciências da Saúde (CCS),
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Av. Roraima, 1000, 97105-900, Prédio 20, Sala 4102. Santa Maria, RS, Brazil
Studies have sought new sources of antioxidants and anti-inflammatory compounds in plants because of their numerous phytochemicals. Thus, this study investigated the anti-inflammatory properties of A. aculeatum extract at different concentrations in RAW 264.7 cells through the cell viability, cytotoxicity, in the gene expression of interleukins IL-1β, IL-6, IL-10 in addition to quantifying the levels of ROS and NO in cell culture. Subsequently, the antioxidant capacity in vivo was evaluated in healthy Wistar rats was evaluated through he-matological, biochemical and oxidative stress tests. The extract could reduce the proliferation of RAW 264.7 cells (P<0.05), retain the cell cycle in the G0/G1 phase (P<0.001) and modu-late genes remodu-lated to the inflammatory response via NF-κB (P<0.001). In ex vivo analysis it was verified decrease inflammatory cells, reduce triglyceride levels by 66% and have a pro-tective role in the liver (P<0.001) after treatment with the extract.
HIGHLIGHTS
Plants have a high concentration of phytochemicals and these are to health benefits
A. aculeatum is a fruit used in traditional medicine due to phytochemicals
The dose that showed the best effect in vitro was the dose of 30μg/ml
In the ex-vivo tests the dose 250mg/kg has already presented beneficial actions
1. INTRODUCTION
The genus Astrocaryum, family Aracaceae has numerous species of palm trees distributed to the north of South America and Brazil (Kahn, 2008). The species Astrocaryum
aculeatum is found mainly in the state of Amazonas, from where it is native, being able to be
found regions north and center-west of Brazil. Its fruit is popularly known as
tucumã-do-amazonas, tucumã-açu or only tucumã and although its seasonality is from February to
August, can be found all year at the fairs of Manaus, Brazil (Ferreira, Lucien, Amaral, & Silveira, 2008; Shanley, Cymerys, Serra, Medina, 2011).
Leitão et al. (2008) and Yuyama et al. (2008) demonstrated their nutritional potential and as an energy source. Further studies have identified the presence of antioxidant and anti-inflammatory compounds such as carotenoids, flavonoids and fatty acids (De Rosso & Mercadante, 2007; de Souza Filho et al., 2013; Jobim et al., 2014; Sagrillo et al., 2015).
The effects of the Astrocaryum genus have already been observed in some studies, such as the antioxidant effect in bronchoalveolar lavage cells (Emilie Bony et al., 2012), antibacterial and antifungal in cultures of gram positive bacteria and Candida albicans (Jobim et al., 2014), as anti-inflammatory in LPS and INF-γ activated macrophages J774 cells (E. Bony et al., 2014), protective effect on lymphocytes submitted to high concentrations of H2O2 (Sagrillo et al., 2015), hypoglycemic effect in an experimental model of diabetes in mice (Baldissera, Souza, Grando, Cossetin, et al., 2017), among others.
Inflammation, under normal conditions, is a defense mechanism against exogenous and endogenous damage. Acute inflammation is usually beneficial to the host because it persists for a short period. However, if it is persistent over an extended period, it progresses to a state of chronic inflammation. This condition is harmful because it can result in responses that increase the risk of cell and tissue damage (Mittal, Siddiqui, Tran, Reddy, & Malik, 2014).
Under these conditions, inflammatory cells liberate a number of reactive species at the site of inflammation leading to exaggerated oxidative stress. There is an overproduction of reactive oxygen species (ROS) and nitrogen (NOs) that determine changes in the structure and modulation of nucleic acid, lipid and protein function (Pisoschi & Pop, 2015). At low concentrations or physiological concentrations, ROS acts as signaling molecules that regulate cell growth, cell adhesion, differentiation, and apoptosis (Mittal et al., 2014), as a way to minimize such damages, antioxidant and anti-inflammatory compounds are studied.
In addition, they are nutritionally rich playing a positive role in a balanced diet (Aguiar, Marinho, Rebêlo, & Shrimpton, 1980). In this way, they can decrease the incidence of various chronic diseases, such as type 2 diabetes, cardiovascular diseases, such as atherosclerosis and various types of cancer (Kaulmann & Bohn, 2014; Pisoschi & Pop, 2015; Rani, Deep, Singh, Palle, & Yadav, 2016). Although some studies with the genus Astrocaryum are reported, the species A. aculeatum is little explored and the majority uses the oil extracted from the fruits. Little is described in the literature on the use of the whole fruit, being that it has greater use in use and in phytochemical constituents.
Thus, the aim of this study was to investigate the potential anti-inflammatory effects and antioxidant effects in vitro and in vivo at different doses of the lyophilized hydroalcoholic extract of A. aculeatum.
2. EXPERIMENTAL
2.1. Chemicals
All chemicals used in this study were purchased from Gibco® Life Technologies Inc., Grand Island, NY, USA, Merck®, Darmstadt, Germany, Invitrogen (Eugene, OR, USA) and Sigma® St. Louis, MO, USA.
2.2. Collection of Plant Material and Preparation of Extract
In a native forest near Manaus (Amazonas, Brazil), located in the Amazon region (3,08 °S, 60,01 °W), mature fruits of Astrocaryum aculeatum were collected in March 2016. The fresh fruits of A. aculeatum (5kg) were used for the preparation of the hydroalcoholic extract as described in Souza Filho et al. (2013) resulting in 134,7g of liofilized extract.
2.3. Quantification of compounds by HPLC-DAD
Tucumã (Astrocaryum aculeatum) at a concentration of 12 mg/mL was injected by means of a model SIL-20A Shimadzu Auto sampler. Separations were carried out using Phe-nomenex C18 column (4.6mm x 250mm x 5m particle size). The mobile phase was water with 1% phosphoric acid (v/v) (solvent A) and HPLC grade methanol (solvent B) at a flow rate of 0.6 mL/min and injection volume 40 μL. The composition gradient was: 5% solvent B reaching 15% at 10 min; 30% solvent B at 25 min, 65% solvent B at 40 min and 98% solvent B at 45 min, followed by 50 min at isocratic elution until 55 min. At 60 min the gradient
reached the initial conditions again, following the method described by Brum et al. (2016) with slight modifications.
The sample and mobile phase were filtered through 0.45 μm membrane filter (Milli-pore) and then degassed by ultrasonic bath prior to use. Stock solutions of standards refer-ences were prepared in the methanol at a concentration range of 0.030 – 0.500 mg/mL. Quan-tifications were carried out by integration of the peaks using the external standard method, at 254 nm for gallic acid; 280 nm for catechin; 325 nm for caffeic acid and ellagic acid; 366 for quercetin, rutin and kaempferol; and 450 nm for β-carotene. The chromatography peaks were confirmed by comparing its retention time with those of reference standards and by DAD spectra (200 to 600 nm). All chromatography operations were carried out at ambient tempera-ture and in triplicate.
2.4. In vitro experiments 2.4.1. Cell Culture
Macrophages are important effector cells of the immune system, increase numbers and produce greater amounts of NO and ROS to potentiate their activity. Because of this, we used RAW 264.7 cells were derived from murine macrophages and obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Cells were grown in DMEM (Dul-becco's Modified Eagle's Medium) supplemented with 10% heat inactivated fetal calf serum (Gibco, Grand Island, NY, USA), 1% of the antibiotics penicillin and streptomycin and 1% of the antifungal amphotericin B at 37ºC in a humidified 5% CO2 atmosphere for 24h for the assays.
Then the cells were activated by incubation with phytohemagglutinin (PHA, 4µg/ml) for 24 hours. Phytohemagglutinin is a protein isolated from beans that has the power to acti-vate macrophages and induce mitosis.
Concurrently with the induction were tested six concentrations of A. aculeatum extract (1, 10, 30, 50, 100, 300µg/ml) dissolved in the culture medium itself, were tested. These con-centrations were based on other studies that used A. aculeatum (de Souza Filho et al., 2013; Sagrillo et al., 2015). A cultured medium containing cells without treatment was used as a negative control.
2.4.2. Cell Viability
Cell viability was evaluated after extract (1, 10, 30, 50, 100, 300µg/ml) exposure and PHA 4µg/ml for 3, 6, 24 and 72 h. The effect on cell viability and proliferation was
deter-mined by MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] spectropho-tometric assay as described by Fukui et al., 2010. For this assay, the cells were incubated for 1h at 37ºC with MTT reagent. After formazan salt was dissolved with dimethylsulfoxide (DMSO) and absorbance was measured at 560 nm. All assays were performed in triplicate, and the results were presented as a percentage of untreated control group.
2.4.3. Intracellular oxidative stress assay
To evaluate the antioxidant capacity of the A. aculeatum extract 2',7'-dichlorofluorescine diacetate (DCFH-DA), a reagent capable of detecting intracellular reac-tive species, was used (Halliwell & Whiteman, 2004). After the cells were exposed to PHA 4µg/ml and extract concentrations extract (1, 10, 30, 50, 100, 300µg/ml) for 3, 6, 24 and 72h was added 10 mM Tris HCl, pH 7.4 and 0.1 mM DCFH-DA. The samples were incubated for 1h in the dark and at room temperature. The reading was made using spectrofluorimeter and wavelengths of emission 525nm and 488nm of excitation and the results were presented as a percentage of untreated control group.
2.4.4. Measurement of NO
The marker used to indicate the activation of macrophages is NO. Their levels were measured after exposing the cells to PHA 4µg/ml and concentrations of the extract (1, 10, 30, 50, 100, 300µg/ml) for 3, 6, 24 and 72h using the Griess Reagent System (Gibco, Grand Is-land, NY, USA). Samples (100μl) and standard media were combined with 50μl of sulfanila-mide. Then, 50μl N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dichlorhydrate solution was added to all wells and incubated for 15 minutes. Absorbance was measured at 540nm (Lee et al., 2005). Nitrite levels were determined using the standard curve generated for plate and the results were presented as a percentage of untreated control group.
2.4.5. Cell cycle analysis by flow cytometry
For a cell cycle analysis, RAW 264.7 cells were seeded in 6-well plates at 1x105 cells per well and incubated for 72h after induction with PHA 4µg/ml at different concentrations of Tucumã extract (1, 10, 30, 50, 100, 300µg/ml). After incubation, the cells were trypsinized, washed with PBS and resuspended in 70% ethanol for 15 minutes of ice. Cells were then cen-trifuged, resuspended and stained with a solution containing PBS, 0.05% Triton, propidium iodide and RNase and incubated for 40 min at 37 ºC. Finally, as the cells were centrifuged and resuspended in 500μl of PBS for cytometer analysis (William-Faltaos et al., 2006).
