CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE ENFERMAGEM
FLÁVIA DOCKHORN RODRIGUES
EFEITO DO ÓLEO DE JATOBÁ (Hymenaea courbaril L.) SOBRE
A MEMÓRIA E PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS EM
CAMUNDONGOS
Sinop – MT 2015
EFEITO DO ÓLEO DE JATOBÁ (Hymenaea courbaril L.) SOBRE
A MEMÓRIA E PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS EM
CAMUNDONGOS
Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado á Banca Examinadora da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do grau de Bacharel em Enfermagem, sob a orientação da Prof. Dra. Pacífica Pinheiro Cavalcanti.
Sinop – MT 2015
Dedico aos meus queridos e amados pais Laura e Reni, que foram os meus companheiros nessa longa e dura jornada, com muita dedicação, apoio, incentivo, amor, carinho, paciência, experiência e acima de tudo respeito. Obrigada por cobrarem dedicação e responsabilidade em tudo o que eu fazia, isso me tornou uma pessoa melhor.
As minhas irmãs Franciele e Fernanda que às vezes distantes, mas sempre me ajudando e incentivando a continuar e nunca desistir dos meus sonhos.
Obrigada
À Deus em primeiro lugar.
À minha orientadora Prof. Dr. Pacifica Pinheiro Cavalcanti, pelo apoio, pela confiança e paciência durante esse processo de orientação e finalização deste trabalho.
À Prof. Dr. Valéria Dornelles Gindri Sinhorin, que durante esses anos de convivência, muito me ensinou, para meu crescimento intelectual e cientifico.
Ao meu querido amigo Valfran da Silva Lima, que me ajudou muito na realização deste projeto, com paciência, conhecimento e dedicação.
Ao Biotério Central da Universidade Federal de Mato Grosso – Campus de Cuiabá pelo fornecimento dos animais.
As minhas queridas amigas Ana Paula Pinatti, Brenda Marli Klann Pinheiro, Caroline Tomazelli e Marilía Resende Pepinelli, que estiveram comigo durante esses 4 anos e meio nos momentos felizes e de desespero, sempre me apoiando.
À minha querida Prof. Me. Patricia Reis pelos ensinamentos durante as aulas e agora como peça fundamental nessa reta final.
Aos demais professores que foram companheiros, pacientes e fundamentais nesse processo de formação acadêmica. Muito obrigada.
Aos animais que contribuíram com este trabalho meu sincero respeito.
Aos demais colegas que foram companheiros durante essa dura jornada.
Ao professor Adilson Paulo Sinhorin e a sua aluna Hocelayne Fernandes que disponibilizaram o óleo fixo da semente de jatobá para a realização desta pesquisa.
SOBRE A MEMÓRIA E PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS EM CAMUNDONGOS. Trabalho de Curso (Graduação em Enfermagem)-Universidade Federal de Mato Grosso – UFMT-Sinop, Brasil, 2015.
INTRODUÇÃO: As plantas medicinais são importantes fontes de compostos bioativos, e são escolhidas para pesquisas a partir do seu uso popular. O jatobá (Hymenaea courbaril) é uma árvore de grande porte a qual ocorre principalmente em floresta primária de terra firme e várzea alta, apresenta fácil adaptação a ambientes pouco favoráveis, o extrato da casca é indicada para tratar gripe, cistite, bronquite, infecções da bexiga e como vermífugo. OBJETIVO: O objetivo do presente trabalho foi verificar o efeito biológico do óleo fixo da semente de Hymenaea courbaril L. var courbaril como possível fármaco no tratamento da depressão, ansiedade, compulsão e memória. MATERIAL E MÉTODOS: Foram testados camundongos da linhagem Swiss machos (n=8 e n=10), com aproximadamente 45 dias de idade. Após o período de aclimatação, os animais foram divididos em 9 grupos (controle negativo, diazepam, imipramina, cafeína e óleo fixo da semente de jatobá (100 e 250 mg/kg). Essas substâncias foram inoculadas por via oral, utilizando a técnica de gavagem, no período de 30 dias, este tratamento foi realizado uma vez ao dia no mesmo horário. Realizamos os testes de atividade locomotora espontânea, de nado forçado, labirinto em cruz elevado, teste de esconder esferas, esquiva inibitória tipo ―step-down”. Após os testes comportamentais os animais foram eutanasiados para dosagem da enzima acetilcolinesterase no tecido cerebral dos animais que participaram do teste de esquiva inibitória do tipo “step-down”. Número da aprovação do presente projeto (23108.706870/2014-05) no Comitê de Ética em Experimentação Animal. RESULTADOS: O tratamento crônico com óleo fixo da semente de jatobá não provocou alterações na mobilidade dos animais, bem como também não apresentou atividade antidepressiva, ansiolítica e anti-compulsiva. Já no teste de Esquiva Inibitória tipo ―step-down‖ os grupos tratados com o óleo de jatobá, no tratamento agudo, apresentaram uma diferença significativa com o aumento do tempo de latência, melhora da memória espacial de curta duração, no grupo tratado com o óleo 100 mg/kg, comparado com o grupo tratado com cafeína 10 mg/kg. O grupo tratado com óleo da semente 250 mg/kg, apresentou uma melhora na memória espacial de curta e longa duração. O tratamento crônico com óleo fixo da semente de jatobá aumentou significativamente a latência dos animais na memória de longa duração, apenas no grupo que recebeu a maior concentração do óleo (250 mg/kg). Na dosagem da acetilcolinesterase os grupos tratados com óleo da semente apresentaram uma redução significativa da enzima comparados com o grupo controle negativo e o tratado com cafeína. CONCLUSÃO: Dessa forma, considera-se que óleo fixo da semente de jatobá pode beneficiar os processos cognitivos, entretanto sugerem-se novos estudos para uma avaliação mais precisa do mecanismo de ação dessa planta.
MEMORY AND BEHAVIORAL PARAMETERS IN MICE. Work course (Diploma in Nursing) Federal -University of Mato Grosso - UFMT-Sinop, Brazil, in 2015.
INTRODUCTION: Medicinal plants are important sources of bioactive compounds, and are chosen for research from its popular use. The Jatoba (Hymenaea courbaril) is a large tree which occurs mainly in primary forest land and high floodplain features easy adaptation to unfavorable circumstances, the bark extract is indicated to treat flu, cystitis, bronchitis, infections bladder and as anthelmintic. OBJECTIVE: The aim of this study was to investigate the biological effect of the fixed oil seed Hymenaea courbaril L. var courbaril as a possible drug for treating depression, anxiety, compulsion and memory. METHODS: lineage of mice were tested Swiss males (n = 8 and n = 10), with approximately 45 days of age. After the acclimation period, the animals were divided into 9 groups (negative control, diazepam, imipramine, Fixed caffeine and oil seed Jatoba (100 and 250 mg / kg). These substances were inoculated orally gavage using the technique, a 30-day period, that treatment was performed once daily at the same time. We conduct spontaneous locomotor activity tests of forced swimming, elevated plus-maze test to hide balls, inhibitory avoidance type "step-down". After behavioral testing the animals were sacrificed for measurement of the enzyme acetylcholinesterase in the brain tissue of animals participating in the inhibitory avoidance test of the "step-down". Of this project approval number (23108.706870 / 2014-05) on the Ethics Committee in Animal Experimentation. RESULTS: Chronic treatment with fixed oil jatobá seed did not cause changes in animal mobility, and did not show antidepressant activity, anxiolytic and anti-compulsive. Since the inhibitory avoidance task type "step down" the groups treated with the oil jatobá the acute treatment, showed a significant difference in the increase in the latency time, improves spatial memory of short duration, in the group treated with oil 100 mg / kg, compared with the group treated with caffeine 10 mg / kg. The group treated with seed oil 250 mg / kg, showed an improvement in spatial memory short and long term. Chronic treatment with fixed oil jatobá seed significantly increased latency of animals in long-term memory, only the group receiving the highest concentration of oil (250 mg / kg). The dosage of the acetylcholinesterase seed oil treated groups showed a significant reduction of the enzyme compared with the negative control group and the treated caffeine. CONCLUSION: Thus, it is considered that fixed oil jatobá seed can benefit cognitive processes, however they suggest new studies for a more accurate assessment of this plant mechanism of action.
Figura 1 - 1A Semente do Jatobá (DoDesign-s) /1B Árvore do Jatobá
(Foto: Bento
Viana/ISPN)... ...16 Figura 2 - Aparato usado para o teste de Atividade Locomotora Espontânea...29
Figura 3 - Aparato usado para o teste
LCE...30
Figura 4 - Aparato usado para o teste de Nado
Forçado...32
Figura 5 - Aparato usado para o teste de Esconder
Esferas...33
Figura 6 - Aparato usado para o teste de Esquiva Inibitória tipo ―step-down‖...34
Gráfico 1 - Efeito do tratamento crônico com o H. Courbaril L. (100 e 250 mg/kg, v.o.), Imipramina (30 mg/kg v.o.), Diazepam (1 mg/kg v.o), como controle positivo e SF 0,9% + Tween a 2% como controle negativo em camundongos avaliados no teste
campo aberto. # p<0,05
(N=8)... ...39
Gráfico 2 - Efeito do tratamento crônico com o H. Courbaril L. (100 e 250 mg/kg, v.o.), DZP (1 mg/kg v.o.), como controle positivo e SF 0,9% + Tween a 2% como controle negativo em camundongos avaliados no teste LCE, na percentagem de entradas nos braços abertos (%EBA) (A), percentagem do tempo nos braços abertos (%TBA) (B) e no número de entradas nos braços fechados (EBF) (C), durante 5 min. #
p<0,05 (N=8)...40
Gráfico 3 - Efeito do tratamento crônico com o H. Courbaril L. (100 e 250 mg/kg, v.o.), Imipramina (30 mg/kg v.o.), como controle positivo e SF 0,9% + Tween a 2% como controle negativo em camundongos avaliados no teste nado froçado. #
p<0,05(N=8)...43
Gráfico 4 - Efeito do tratamento crônico com o H. Courbaril L. (100 e 250 mg/kg, v.o.), Imipramina (30 mg/kg v.o.), como controle positivo e SF 0,9% + Tween a 2% como controle negativo em camundongos avaliados no teste de esconder esferas. #
p<0,05 ≠ IMP
(N=8)... ...44
Gráfico 5 - Efeito do tratamento agudo com o H. Courbaril L. (100 e 250 mg/kg, v.o.), CAF (10 mg/kg v.o.), como controle positivo e SF 0,9% + Tween a 2% como controle negativo em camundongos avaliados no teste a esquiva inibitória do tipo ―step-down‖. # p<0,05 ≠ CAF
(N=10)... ...45
Gráfico 6 - Efeito do tratamento crônico com o H. Courbaril L. (100 e 250 mg/kg, v.o.), CAF (10 mg/kg v.o.), como controle positivo e SF 0,9% + Tween a 2% como controle negativo em camundongos avaliados no teste a esquiva inibitória do tipo ―step-down‖. # p<0,05 ≠ CAF
(N=10)... ...46
Gráfico 7 - Efeito do tratamento crônico com o H. Courbaril L. (100 e 250 mg/kg, v.o.), CAF (10 mg/kg v.o.), como controle positivo e SF 0,9% + Tween a 2% como controle negativo no cérebro dos camundongos avaliados na dosagem da atividade da enzima acetilcolinesterase. # ***p<0,05 ≠ CAF e CN (N=10)...47
ANOVA Análise de Variância AA Ácido Araquidônico ACh Acetilcolina
AChE Acetilcolinesterase
APA American Psychiatric Association BA Braço Aberto
ºC Graus Celsius
CAF Cafeína
CEUA Comitê de Ética no Uso Animais CN Controle Negativo CP Controle Positivo DA Doença de Alzheimer DHA Docosahexaenoico DTNB 5,5'-Ditiobis-(2-ácido nitrobenzóico) DZP Diazepam
EBA Entrada em Braço Aberto EBF Entrada em Braço Fechado GABA Ácido Gama aminobutírico
IPEF Instituto de Pesquisas e Estudos Florestais LCE Labirinto em Cruz Elevado
LCR Liquido Cefalorraquidiano
LIPEQ Laboratórios Integrados de Pesquisas em Ciências Químicas MCD Memória de Curta Duração
MLD Memória de Longa Duração NE Noradrenalina
NaCl Cloreto de Sódio SF Soro Fisiológico
TBA Tempo em Braço Aberto
TBF Tempo em Braço Fechado
TFK Tampão Fosfato de Potássio TFNa+ Tampão Fosfato de Sódio
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO...132.
REVISÃO BLIBIOGRÁFICA...15 2.1 Hymenaea courbaril L...15 2.2 Patologias...17 2.2.1 Ansiedade...17 2.2.2 Depressão...19 2.2.3 Memória e envelhecimento...21 2.3 Testes Comportamentais...22 2.4 Fármacos...22 2.4.1 Cafeína...22 2.4.2 Imipramina...23 2.4.3 Diazepam...23 2.5 Acetilcolinesterase...243.
JUSTIFICATIVA...254.
OBJETIVOS...27 4.1 Objetivo Geral...27 4.2 Objetivos Específicos...275.
MATERIAL E MÉTODOS...28 5.1 Sistema Teste...28 5.2 Delineamento do Estudo...29 5.3 Ensaios Comportamentais...305.3.1 Teste de atividade locomotora espontânea...30
5.3.2 Teste do labirinto em cruz elevado (LCE)...30
5.3.3 Teste de nado forçado...32
5.3.4 Teste de esconder esferas ...34
5.3.5 Teste de esquiva inibitória do tipo “step-down”...35
5.4 Eutanásia...36
5.5 Ensaio in vitro da acetilcolinesterase...37
5.6 Análise Estatística...37
6.2 Teste do labirinto em cruz elevado (LCE)...41
6.3 Teste de nado forçado...44
6.4 Teste de esconder esferas...45
6.5 Teste de esquiva inibitória do tipo ―step-down‖...46
6.5.1 Atividade da enzima acetilcolinesterase...47
7.
CONSIDERAÇÕES FINAIS...51REFERÊNCIAS...52
1.
INTRODUÇÃO
As plantas medicinais são importantes fontes de compostos bioativos, utilizadas pelos seres humanos, desde a antiguidade, no tratamento de doenças (MORGAN, 1994) e durante muito tempo, por razões econômicas ou culturais, elas foram a principal alternativa de cura da população mundial. A fitoterapia, prática de medicina tradicional ou popular, evoluiu consideravelmente nos últimos anos entre todos os grupos socioeconômicos da população, sendo atualmente um importante setor econômico (SACHETTI, 2010).
Contudo, apesar da expansão dos medicamentos fitoterápicos, as pesquisas realizadas para avaliação da sua eficácia e uso seguro são raras, e muitas plantas ainda são utilizadas apenas pelo conhecimento popular, sem a avaliação dos verdadeiros efeitos que os mesmos possam exercer no organismo. Os efeitos adversos dos fitoterápicos são menores, quando comparados as demais drogas sintéticas, contudo ensaios clínicos revelaram que efeitos indesejáveis também ocorrem com a utilização de plantas medicinais, sendo relevante a realização de estudos toxicológicos bem controlados para comprovar sua segurança e eficácia (CALIXTO, 2000).
O jatobá (Hymenea courbaril) é uma árvore de grande porte a qual é encontrada principalmente em floresta primária de terra firme e várzea alta, com freqüência em solos argilosos e solos pobres. O produto mais comercializado do jatobá é a madeira, utilizada para móveis e construções externas. A casca é utilizada na medicina popular para tratar gripe, cistite, bronquite, infecções da bexiga e vermífugo (EMBRAPA, 2004).
O óleo da semente de jatobá, apresenta seis ésteres metílicos derivados de ácidos graxos: palmítico (11,9%), oleico (30,49%), linoleico (30,57%), araquídico (3,73%), bénico (9,24%) e o ácido lignocérico (5,78%). E desses 61,06% dos ésteres metílicos são derivados de ácidos graxos insaturados (FERNANDES, 2014).
Os ácidos graxos que apresentam duas ou mais ligações duplas em sua cadeia de carbonos são chamados de polinsaturados, sua nomenclatura leva
em consideração o número de carbonos e de insaturações das moléculas e a posição da primeira ligação dupla em relação ao grupo metil. Os ácidos graxos com ligações duplas nos carbonos 6 e 3 (ômega 6 e 3), ácidos linoléico e linolênico respectivamente, são essenciais para o funcionamento do organismo dos mamíferos (CALDER; YAGOOB, 2009).
Pessoas que ingerem esses ácidos em quantidade insuficiente ou que não mantêm um equilíbrio entre os ácidos ômega-3 e ômega-6 na alimentação, apresentam risco elevado em desenvolver depressão. Esses lipídios são componentes importantes da membrana celular nervosa e ajudam na comunicação entre essas células, por isso são importantes na manutenção da saúde mental. Uma ingesta adequada dos ácidos graxos essenciais, bem como o equilíbrio entre o ômega-3 e ômega-6 demonstrou uma redução, prevenção e tratamento (TIEMEIER et al., 2003) nos sintomas da depressão (LOGAN, 2004; HIBBELN et al., 1995; TIEMEIER et al., 2003), o que se deve ao fato desses influenciarem nas propriedades biofísicas das membranas neuronais (TIEMEIER et al., 2003).
Dessa forma fica clara a importância dos testes com o óleo de jatobá, já que estudos com os compostos bioativos dessa planta são escassos, e mesmo assim são utilizadas popularmente para tratamento ou profilaxia de algumas enfermidades. Sendo, portanto, a realização do presente trabalho relevante, para verificar a eficácia do óleo da semente de jatobá no tratamento de demências e transtornos mentais como ansiedade, depressão e compulsão.
2.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Hymenaea courbaril L.
Dados da planta (IPEF, 2008):
Nome científico: Hymenaea courbaril Linneaus. Sinônimo botânico: Hymenaea stilbocarpa Hayne. Familia: Fabaceae/Caesalpiniaceae (Leguminosae). Gênero: Hymenaea.
Nomes populares: Algarrobo, Jatobá-do-Cerrado, Jatobá-Capão, Casca-Fina, Jatobeiro, Jatobá-do-Campo, Jataí-de-Piauí, Copal, Jatobá-da-Serra, Jatobá-da-Caatinga, Jutaé, Jutaí, Jutaicica, Jatobá-de-Vaqueiro e Jatobai (LORENZI, 2002; CARVALHO, 2006; NETO et al., 2008).
O Hymenaea, surgiu na África há aproximadamente 25 milhões de anos atrás (MOLLE, et al., 2009), sua distribuição ocorre amplamente pela América Central, América do Sul, oeste das Índias e uma espécie no leste da África (FERNANDES, 2006; BRANDÃO et al., 2009). Este gênero possui 14 espécies e 13 se adaptaram bem as variações ambientais das regiões brasileiras, desde a Floresta Amazônica até a floresta semidecídua do Paraná e centro oeste (FERNANDES, 2006). A espécie Hymenaea courbaril L. é considerada de fácil adapatação devido a sua capacidade de sobrevivência a diferentes condições de luz, água e temperatura, não exigindo solo muito fértil (BRANDÃO et al., 2009; LIMA, 2010).
O jatobá morfologicamente é uma árvore de grande porte e se apresenta como uma semicaducifólia, mede cerca de 20 metros de altura e em média 80 cm de diâmetro, tronco longevo e cilíndrico, copa grande e arredondada, casca externa lisa, dura e acinzentada e casca interna rosada exsudativa de resina tom de vinho, folhas compostas alternas, bifoliadas e pecioladas, folíolos brilhantes e bases desiguais, flores que variam de branca a bege, dispostas em uma média de 14 flores em inflorescência (EMBRAPA, 2008).
Os frutos apresentam características de vagem lenhosa indeiscente, meio arredondada, rugosa, comprimento de aproximadamente 15 cm, largura
de 4 cm e espessura de 6 cm, de coloração marrom-escura. Cada fruto contêm de duas a quatro sementes ovaladas de coloração vermelho-escuro (ALMEIDA et al., 2011), como mostra a figura 1, ricas em polissacarídeos de reserva (xiloglucano) que é mobilizado após a germinação da planta (MOLLE et al., 2009), recobertas por polpa amarelo-lívido, comestível do tipo farinácea, sabor adocicado e aroma característico. A colheita dos frutos pode ser feita manualmente ou coletados depois que caírem das árvores (ALMEIDA et al., 2011), os quais são vendidos em supermercados de grandes cidades segundo Mendonça et al., (2007)
Figura 1: 1A Semente do Jatobá (DoDesign-s) /1B Árvore do Jatobá (Foto: Bento Viana/ISPN)
Fonte:(http://www.cerratinga.org.br/jatoba/)
A árvore do jatobá é uma fruteira de cultivo pouco frequente, o período de florescência vai de setembro a novembro e seu processo reprodutivo se inicia após 10 anos (EMBRAPA, 2008). O fruto é resultado do desenvolvimento ovariano e polinização, contudo pode se desenvolver sem a polinização (frutos partenocárpicos). Os frutos são fontes de alimento de grande valor nutritivo para os seres humanos e animais, e podem ser consumidos de forma in natura ou na produção de bolos, mingaus, biscoitos e pães (ALMEIDA et al., 2011).
Segundo Lima et al., (2007) o aproveitamento e as utilizações do jatobá são diversas dadas as suas propriedades. Algumas das utilidades dessa planta são: paisagismo, arborização de praças, parques e estradas (EMBRAPA, 2008); reflorestamentos heterogêneos devido sua agilidade na multiplicação para reparação da mata ciliar de áreas degradadas (BARBIERI et al., 2007; EMBRAPA, 2008); a madeira é utilizada na construção civil, na carpintaria, como postes dormentes, na confecção de artigos esportivos e cabos de ferramentas (MENDONÇA et al., 2007, EMBRAPA 2008); a resina de coloração avermelhada é empregada na confecção de vernizes, extraída do tronco, raízes ou ramos (EMBRAPA, 2008);.
A planta também apresenta ações fitoterápicas, no tratamento de infecções do trato respiratório de um modo geral, cólicas e dores estomacais (BARBIERI et al., 2007; LIMA et al., 2007), antioxidante, antimicrobiano, antiinflamatório, antimalárico (ALECHANDRE et al., 2011) e atua na redução dos níveis de triacilglicerol e colesterol (ABED-EL-KADER et al., 2009). Deste modo o jatobá se caracteriza como uma espécie arbórea que amolda ao conceito de floresta com diversos potenciais de mercado (MENDONÇA et al., 2007).
Segundo Fernandes, (2014) em suas pesquisas, o óleo de jatobá não apresenta atividade antifúngica e antibacteriana, já na avaliação citotóxico, óleo apresenta toxicidade para as células esplênicas (baço), porém não foi observado o mesmo resultado para as células tumorais (tumor de Ehrlich), não havendo efeito tóxico direto sobre essas células.
2.2 Patologias
2.2.1 Ansiedade
Ansiedade é um sentimento vago e desagradável de medo, apreensão, caracterizado por tensão ou desconforto derivado de antecipação de perigo, de algo desconhecido ou estranho, as manifestações patológicas da ansiedade podem ser classificadas como: transtorno de pânico, transtornos fóbicos,
transtorno obsessivo-compulsivo, transtorno de estresse pós-traumático, transtorno de estresse agudo, transtorno de ansiedade generalizada, transtorno de ansiedade induzido por substâncias, devido a uma condição médica geral (ABRATA, 2014).
A ansiedade e o medo passam a ser reconhecidos como patológicos quando são exacerbados, desproporcionais ao estímulo, ou qualitativamente diversos do que se observa como normal naquela faixa etária e interferem a qualidade de vida, o conforto emocional ou o desempenho diário do indivíduo. Tais reações exageradas ao estímulo ansiogênico se desenvolvem, mais comumente, em indivíduos com uma predisposição neurobiológica herdada (KUMMER et al., 2010).
Padrões animais de ansiedade validos devem: (1) reproduzir características comportamentais e patológicas da síndrome de ansiedade; (2) permitir investigação de mecanismos neurobiológicos que não são facilmente estudados no homem; e (3) permitir avaliação confiável de agentes ansiolíticos, assim como identificar efeitos ansiogênicos de drogas e toxinas (ANDREATINIA et al., 2001). Uma grande variedade de modelos animais de ansiedade tem sido validada farmacologicamente usando os ansiolíticos clássicos benzodiazepínicos, que apresentam início de efeito rápido. Além disso, esses agentes tem sido usados como padrão de comparação com agentes novos propostos como efetivos para controle da ansiedade (SILVA et al., 2012).
O Transtorno Obsessivo Compulsivo (TOC), uma das manifestações patológicas da ansiedade, caracteriza-se pela presença primária de obsessões ou compulsões persistentes e recorrentes, que consomem tempo, causam sofrimento e interferem de forma significativa nas relações sociais e nas atividades do indivíduo (APA, 2002).
As obsessões são ideias, pensamentos, impulsos ou imagens persistentes, experimentadas como intrusivas, inadequadas e desagradáveis, reconhecidas como produtos da própria mente que o paciente tenta ignorar, suprimir ou neutralizar com algum outro pensamento ou ação. As compulsões são comportamentos ou atos mentais repetitivos que o indivíduo é levado a
executar com o objetivo de prevenir ou reduzir a ansiedade ou o sofrimento, geralmente em resposta a uma obsessão ou de acordo com regras que devem ser seguidas rigidamente (CORDIOLI, 2014).
O TOC pode manifestar-se sob várias formas clínicas, sendo mais freqüente a ocorrência simultânea de obsessões e compulsões, embora existam pacientes só obsessivos e, mais raramente só compulsivos (CORDIOLI, 2014).
O tratamento utiliza basicamente duas estratégias terapêuticas, a farmacoterapia com inibidores da recaptação da serotonina e a terapia cognitivo-comportamental, empregadas associadas ou isoladamente (ABREU; ROSO, 2012).
2.2.2 Depressão
A depressão é uma psicopatologia caracterizada por humor deprimido ou falta de motivação, perda de interesse ou prazer (anedonia) e cansaço ou fadiga. Além disso, alteração no peso corporal (ganho ou perda de peso significativo – 5 %) prejuízo no sono (insônia ou hipersonia), agitação ou retardo psicomotor, sentimento de inutilidade ou culpa, baixa capacidade de concentração ou tomada de decisão e/ou ideação suicida são outros sintomas relevantes (FLECK et al., 2009).
Segundo Potter e Manji (1993) os sistemas monoaminérgicos se originam em pequenos núcleos no tronco cerebral e mesencéfalo e projetam-se difusamente pela córtex e sistema límbico. Esses sistemas são compostos por neurônios que contêm norepinefrina (NE), serotonina (5-HT) e dopamina (DA). Junto com a acetilcolina (ACh), eles exercem efeitos de modulação e integração sobre outras atividades corticais e subcorticais e estão envolvidos na regulação da atividade psicomotora, apetite, sono e, provavelmente, do humor. Estudos básicos e clínicos procuraram confirmar a hipótese monoaminérgica na fisiopatologia da depressão e descreveram anormalidades nos níveis desses metabólitos no sangue, urina e líquido céfalo-raquidiano (LCR).
O diagnóstico diferencial deve ter o cuidado de excluir todas as possibilidades de outra situação clínica ou psicológica estar envolvida, somente depois de descartar todas as hipóteses é que o diagnóstico de depressão é concluído. Situações como: hipotiroidismo, a mononucleose infecciosa, a anemia, as neoplasias e as doenças autoimunes devem ser investigadas. Também alguns medicamentos, como os estimulantes, os corticóides e os contraceptivos, podem desencadear sintomas idênticos aos depressivos. A história clínica do paciente também é decisiva para obter uma avaliação mais específica (BRITO, 2011).
Alterações da função dos sistemas neurotransmissores podem ocorrer através da mudança na sensibilidade de receptores pré e pós-sinápticos, sem alteração da quantidade do próprio neurotransmissor. Essa observação permitiu que a hipótese de deficiência de neurotransmissores fosse modificada e, em seu lugar, proposta a hipótese de dessensibilização dos receptores (HYMAN; NESTLER, 1993). Tal hipótese propunha que o atraso no aparecimento do efeito terapêutico dos antidepressivos estava relacionado a alterações no número e sensibilidade dos receptores monoaminérgicos. Como esse efeito demora dias ou semanas para ocorrer, os investigadores propunham que a depressão podia ser explicada por uma supersensitividade de receptores beta-adrenérgico. As alterações presentes na sensibilidade e no número de receptores podem ser vistas meramente como marcadores de adaptações crônicas dos neurônios monoaminérgicos ao invés de representarem o mecanismo terapêutico (HYMAN; NESTLER, 1993).
O desenvolvimento de experimentos clínicos com animais em estudos antidepressivos é possível. A utilização de alguns procedimentos em pesquisas geram resultados semelhantes aos dos seres humanos, como submeter o animal a estímulos dolorosos sem que haja escapatória, levando-o a um estado de desamparo e desesperança, e quando administrado um antidepressivo no animal, ocorre a reversão do comportamento anterior. Desse modo, ocorre a mimetização da doença depressiva do homem. (RANG et al., 2012).
2.2.3 Memória e o envelhecimento
Segundo Bear et al.,2002; Kandel et al., 2000 memória é capacidade dos animais e do homem em armazenar, recuperar e evocar informações disponíveis no SNC. Existem diversas estruturas responsáveis por esse fenômeno tais como: hipocampo, amígdala, córtex entorrinal, giro parahipocampal, fórnix, corpos mamilares, giro do cíngulo, entre outros.
A memória é também a capacidade de um organismo alterar seu comportamento em decorrência de experiências prévias. Do ponto de vista fisiológico, essa capacidade é resultado de modificações na circuitaria neural em função da interação do indivíduo com o ambiente (PAVÃO, 2008).
As memórias podem ser classificadas, conforme o seu tempo de duração, memória imediata (operacional ou trabalho, dura segundos ou poucos minutos), memória de curta duração (se desenvolve em segundos ou minutos e dura várias horas) e memória de longa duração (consolidada lentamente e é relativamente estável) de acordo com Izquierdo et al., 1999. Esses tipos de memórias podem ser avaliados em pesquisas animais, por meio de testes comportamentais.
A amnésia é uma doença que pode causar perda total ou parcial da memória. Aparece após algum trauma físico ou mental que atinge os lobos temporais do individuo. Outra doença relacionada à neurodegeneração é o ―Mal de Alzheimer‖, que acarreta na perda de neurônios colinérgicos, e na perda progressiva da memória (NEVES et al., 2008; MACHADO et al., 2009; RANG et al., 2012; SILVA et al., 2012 - B).
A opção de tratamento atual é a utilização de medicamentos que inibem a acetilcolinesterase, pois assim acarreta o acúmulo de acetilcolina nas terminações nervosas, e induz maior ativação do impulso nervoso, podendo auxiliar no tratamento de Alzheimer. A acetilcolina é o principal neurotransmissor envolvido na memória (ZANELLA et al., 2012; TORRES et al., 2012).
2.3 Testes Comportamentais
Os testes comportamentais são usados em animais, pois são os mecanismos possíveis para comprovar o efeito do tratamento, porque a única forma de expressão é a mudança de comportamento. Modelos experimentais perfeitos para uso animal devem ser isomórficos às condições humanas e torna-se útil quando pode ser mostrado que tem uma analogia relevante, ou seja, quando ele revela alguns aspectos de um processo complexo, por meio de hipóteses testadas em humanos (McBRIDE; LI, 1998).
A utilização de animais é uma ferramenta importante para o estudo e compreensão dos transtornos psiquiátricos e déficits de memória, principalmente na busca de novos e melhores tratamentos.
2.4 Fármacos
2.4.1 Cafeína
A cafeína (1, 3, 7-trimetilxantina) é uma metilxantina que apresenta efeitos estimulantes sobre o coração, a respiração e no comportamento. É a droga psicoestimulante mais consumida no mundo, está presente em alguns produtos como o café, chá, refrigerante a base de cola e o chocolate (SOUZA et al., 2005; SIMONS et al., 2012).
O mecanismo de ação da cafeína envolve a antagonização dos receptores de adenosina de forma competitiva, também potencializa a liberação de cálcio do reticulo endoplasmático, consequentemente, facilitando a transmissão da sinapse no sistema nervoso central (GUERRA et al., 2000).
De acordo com Simons et al., (2012), doses de cafeína in vivo produzem uma potencialização da transmissão sináptica de longa duração. Porém a ação estimulante somente acontece em doses moderadas, pois doses muito altas podem suprimir essa atividade e até performances de aprendizado e memória (ANGELUCCI et al., 2002).
2.4.2 Imipramina
A imipramina (nome comercial Tofranil) pertence ao grupo de medicamentos conhecidos como antidepressivos tricíclicos, que são usados para tratar depressão e distúrbios do humor (RANG et al., 2012).
Este fármaco atua aumentando a quantidade de mensageiros químicos (noradrenalina e serotonina) no cérebro, ou fazendo seus efeitos durarem mais tempo. A imipramina tem várias propriedades farmacológicas, incluindo-se as propriedades alfadrenolítica, anti-histamínica, anticolinérgica e bloqueadora do receptor serotoninérgico (5-HT). Contudo, acredita-se que a principal atividade terapêutica da imipramina seja a inibição da recaptação neuronal de noradrenalina (NA) e serotonina (5-HT). A imipramina é chamada de bloqueador "misto" da recaptação, isto é, ela inibe a recaptação da noradrenalina e da serotonina, aproximadamente na mesma proporção (RANG et al., 2012).
2.4.3 Diazepam
É um ansiolítico da classe dos benzodiazepínicos, o local exato e o modo de ação não estão totalmente elucidados, mas o efeito da droga parece estar mediado pela inibição do neurotransmissor GABA. A droga parece agir nos níveis límbico, talâmico, produzindo efeitos ansiolíticos, sedativos, hipnóticos e de relaxante muscular e anticonvulsivante. Os benzodiazepínicos podem produzir todos os níveis de depressão do sistema nervoso central, de sedação moderada, hipnose e coma (RANG et al., 2012).
O medicamento pode produzir tolerância, o individuo tem que aumentar a dose progressivamente para surtir o efeito desejado, e também induz à dependência do usuário ao fármaco. Os efeitos adversos que pode causar são náuseas, tremores, sonolência, amnésia, confusão e mudanças no libido (PAGE et al., 2004; RANG et al., 2012).
2.5 Acetilcolinesterase
A acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima pertencente a família das colinesterases, sendo responsável pela finalização da transmissão dos impulsos nervosos nas sinapses colinérgicas pela hidrólise do neurotransmissor acetilcolina (ACh). A AChE está presente no sistema nervoso central e periférico (RANG et al., 2012).
A deficiência de neurotransmissores, principalmente a acetilcolina que está envolvida diretamente nos processos motores, cognitivos e de memória leva ao aparecimento da doença de Alzheimer (DA) que é um dos maiores problemas de demência. A DA gera degradação de neurônios, o que diminui a atuação da ACh. Descoberta em 1907, pelo neuropatologista Alois Alzheimer, esta doença afeta cerca de 35,6 milhões de pessoas atualmente, na sua maioria, idosos, dados do jornal Folha de São Paulo, 2010. É uma afecção neurodegenerativa progressiva e irreversível, que acarreta vários distúrbios cognitivos como perda da memória, linguagem, razão e habilidade de cuidar de si próprio (DEMARIN et al., 2011).
Apesar da DA não ter cura, existem tratamentos para diminuir os sintomas da doença, o uso de fármacos inibidores da AChE, é o mais utilizado, evitando a degradação da ACh, possibilitando a permanência desse neurotransmissor por mais tempo na fenda sináptica (PETRONILHO et al., 2011).
3.
JUSTIFICATIVA
Os distúrbios comportamentais, principalmente as demências, apresentam um número crescente de casos na população, mostrando a necessidade de prevenção e tratamento adequado para melhorar a qualidade de vida dos indivíduos afetados. Uma das causas elucidadas é a deterioração dos neurônios, onde há uma diminuição da ação do neurotransmissor acetilcolina, que pode ser decorrente de fatores genéticos ou exposição a fatores externos como estresse oxidativo provocados por espécies reativas de oxigênio e/ou aminoácidos neurotóxicos.
O estudo tem como interesse farmacológico a planta H. courbaril L., devido ao potencial poder antioxidante da família Fabacea, sua fácil adaptação a ambientes pouco favoráveis e sua grande disponibilidade na nossa flora. Estudos apontam que os radicais livres, produzidos a partir do estresse oxidativo, são os principais responsáveis pelas doenças neurodegenerativas.
Pesquisas prévias apontam a presença de ácidos graxos de cadeia longa no óleo fixo da semente do jatobá, essas substâncias são responsáveis pela formação das membranas celulares, através da conversão por processo enzimático desses ácidos (linoleico) em ácido araquidônico (fundamental na estrutura celular) e assim a funcionalidade adequada das células.
O equilíbrio entre os ácidos graxos essenciais podem prevenir alterações de comportamento, como a depressão, dessa forma a ingesta adequada dessas substâncias pode ser uma alternativa para a profilaxia e tratamento de déficits de memória e transtornos comportamentais (ansiedade, depressão e compulsão).
Com o envelhecimento do indivíduo, há um aumento do estresse oxidativo, que atua reduzindo os níveis do ômega 3 e do ácido araquidônico (AA), no cérebro. Esse processo resulta em um aumento na proporção de colesterol no cérebro e ocorre em maior intensidade nas doenças de Alzheimer, Parkinson e na esclerose lateral amiotrófica (SIMONIAN, 1996).
Pesquisas no Laboratório de Fitoquímica da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT-MT), com a planta Hymenaeacourbaril L. var courbaril
(jatobá), demonstraram que o óleo fixo da semente apresenta ácidos graxos essenciais como oléico e linoléico. Assim a pesquisa com animais para testar memória e parâmetros comportamentais, surgiu com o intuito de promover a descoberta de tratamentos alternativos para depressão, ansiedade, compulsão e déficit de memória.
Considerando os resultados evidenciados em outros estudos, se faz relevante o desenvolvimento de novas pesquisas para confirmação dos efeitos do jatobá, porque apesar do potencial terapêutico apresentado pelos extratos da planta, na profilaxia, no tratamento ou na cura de doenças, não existe estudos científicos realizados com o óleo fixo da semente do jatobá para a profilaxia e tratamento dos transtornos comportamentais e alterações da memória.
4.
OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral:
Verificar o efeito biológico do óleo fixo da semente de Hymenaeacourbaril L. var courbaril (jatobá) como possível fármaco no tratamento da depressão, ansiedade, compulsão e memória em camundongos Swiss.
4.2 Objetivos específicos:
Verificar os benefícios do óleo de jatobá sobre a memória através da avaliação da atividade da enzima acetilcolinesterase e do teste de Esquiva Inibitória do tipo ―step-down‖.
Avaliar os efeitos ansiolíticos e antidepressivos do óleo fixo de jatobá por meio dos testes de Atividade Locomotora Espontânea, Labirinto em Cruz Elevado e o Nado Forçado.
Estimar a potencialidade do óleo fixo do jatobá sobre o tratamento de compulsões através do teste de esconder esferas.
5.
MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Sistema teste
Foram utilizados camundongos Swiss machos (n=80), com aproximadamente 45 dias de idade e peso médio de 35 g, provenientes do Biotério da Universidade Federal do Mato Grosso (UFMT), Campus Universitário de Cuiabá. Foram alojados em grupos de 20 animais por caixa, mantidos em ciclo de claro/escuro de 12 horas, recebendo ração em forma de
pellets e água filtrada ad libitum, com período de aclimatação de 15 dias. Todos os critérios estavam de acordo com as normas estabelecidas por Guias de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (SILVANIA et al., 2013).
Os experimentos foram realizados em parceria com a Prof. Drª. Valéria Dornelles Gindri Sinhorin, do Instituto de Ciências Naturais Humanas e Sociais e o óleo usado neste trabalho foi disponibilizado pelo Prof. Dr. Adilson Paulo Sinhorin ambos dos Laboratórios Integrados de Pesquisas em Ciências Químicas - (LIPEQ) da Universidade Federal do Mato Grosso.
As drogas sintéticas foram diluídas em SF 0,9% (NaCl), nas seguintes proporções, imipramina 30 mg/kg, diazepam 1 mg/kg e cafeína 10 mg/kg, por meio do peso médio dos animais, essas concentrações foram determinadas de acordo com Lucena (2010). Esses fármacos foram adquiridos em uma farmácia da cidade de Sinop, mediante apresentação da receita disponibilizada por um médico. Já a cafeína, conseguimos compra-la em uma farmácia de manipulação. Segue abaixo os lotes e a validade das medicações: Lote. Za059, Val. 01/16; Lote 567604, Val. 08/15; Req: 111494, Val. 24/08/15, respectivamente.
O óleo fixo da semente de jatobá, foi preparado em duas concentrações (100 e 250 mg/kg), a diluição foi calculada pelo peso médio dos animais, foi utilizado SF 0,9% + Tween 80® a 2% para emulsificação do óleo.
5.2 Delineamento do Estudo
Para os primeiros testes, tais como: atividade locomotora espontânea, labirinto em cruz elevado, nado forçado e o teste de esconder esferas, os 40 animais, foram divididos em 5 grupos contendo 8 camundongos cada, conforme a distribuição abaixo:
Grupo I: controle negativo (NaCl 0,9% + Tween 80®
a 2%,); Grupo II: óleo fixo da semente do jatobá (100 mg/kg); Grupo III: óleo fixo da semente do jatobá (250 mg/kg); Grupo IV: controle positivo - Imipramina (30 mg/Kg); Grupo V: controle positivo - Diazepam (1mg/Kg).
Para a realização do teste de esquiva inibitória tipo “step-down” os 40 camundongos, foram divididos em 4 grupos contendo 10 animais cada:
Grupo VI: controle negativo (NaCl 0,9% + Tween 80®
a 2%,); Grupo VII: óleo fixo da semente do jatobá (100 mg/kg); Grupo VIII: óleo fixo da semente do jatobá (250 mg/kg); Grupo IX: controle positivo - Cafeína (10 mg/Kg);
Todas as substâncias foram administradas por gavagem (200 µl, vo.) pelo mesmo pesquisador, uma vez ao dia no mesmo horário, ás 6:30 da manhã, e trinta dias após o tratamento, os testes foram realizados. Os grupos I, II, III, IV e V, foram submetidos aos testes, nesta sequência: atividade locomotora espontânea, teste do Labirinto em Cruz Elevado, nado forçado e Teste de Esconder Esferas, respectivamente. O intervalo entre um teste e outro foi de aproximadamente 1 hora. Já os animais dos grupos VI, VII, VIII e IX, realizaram o teste de esquiva inibitória do tipo ―step-down‖ (LUCENA, 2010) e nestes 4 últimos grupos, foi dosada a atividade da enzima acetilcolinesterase no tecido cerebral. Os camundongos foram levados no local do teste uma hora antes do inicio dos experimentos, para aclimatação e habituação ao ambiente do teste. O ciclo claro/escuro foi invertido para a realização dos experimentos durante o dia, para que o ciclo circadiano não interferisse nos resultados. Os testes foram filmados para a presença do observador não interferir nos resultados.
5.3 Ensaios Comportamentais
5.3.1 Teste de atividade locomotora espontânea
APARATO: Para este ensaio foi necessário, a construção de uma base circular de madeira com 60 cm de diâmetro e 50 cm de altura, onde a superfície foi dividida em doze quadrantes (Figura 2).
Figura 2: Aparato usado para o teste de Atividade Locomotora Espontânea Fonte própria
FUNDAMENTO: A avaliação de roedores em um campo aberto tem como objetivo a observação da atividade locomotora do animal. Assim como o homem, o camundongo também pode reagir de forma aversiva ao andar em um ambiente novo, uma característica de congelamento (do inglês ―freezing‖), para tentar diminuir sua localização visual e auditiva e evitar possíveis predadores, porém, rapidamente muda sua atitude anterior e tende a explorar o ambiente onde se encontra (LUCENA, 2010; LUCIA et al., 2005).
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS: A atividade locomotora foi considerada quando o animal atravessava com as quatro patas em um dos quadrantes da caixa, cada animal foi testado por 5 minutos. Os testes foram filmados e posteriormente foi contada a frequência de entradas feitas nos quadrantes
próximos a parede, e a frequência de entradas nos quadrantes internos do aparato. Os ensaios foram realizados durante o dia, para acompanhar o ciclo circadiano, e evitar alterações que pudessem interferir nos resultados. (LUCENA, 2010).
5.3.2 Teste do labirinto em cruz elevado (LCE)
APARATO: É um equipamento em madeira, na forma de cruz, elevado 50 cm do chão, que contem dois braços abertos (50 x 10 cm) e dois fechados (50 x 10 x 40 cm). Os braços abertos tem uma proteção de acrílico de 1 cm, para evitar a queda dos camundongos (Figura 3).
Figura 3: Aparato usado para o teste LCE. (http://www.ccb.ufsc.br/~andre/fotos02.htm)
FUNDAMENTO: O LCE é baseado, principalmente na aversão natural que animais apresentam pelos braços abertos do labirinto (MONTGOMERY, 1955). Porque quando forçados a permanecerem nos braços abertos apresentam manifestações comportamentais e fisiológicas de medo (congelamento, defecação e aumento dos níveis de corticosteroides plasmáticos), segundo Pellow et al., 1985. Assim permanecem mais tempo nos braços fechados. Vários estudos demostram que a ―reação de medo‖ está relacionada a falta de paredes altas nos lados abertos, que impede a tigmotaxia (tendência dos roedores de permanecerem perto de superfícies verticais (TREIT, et al., 1993). Portanto o aumento da exploração, a permanência e o número de entradas
nos braços abertos indicam uma ação ansiolítica de drogas ( HANDLEY; MITHANI, 1984; PELLOW et al., 1985).
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS: O roedor foi posicionado no centro do labirinto, com a cabeça voltada para um dos braços fechados, podendo andar livremente durante 5 minutos, após esse tempo o equipamento foi limpo com álcool 10%, para evitar qualquer alteração nos resultados devido ao cheiro dos outros animais. Cada animal foi filmado e em outro momento foi avaliado as imagens e contado o número de entradas nos braços abertos (EBA), o tempo de permanência nos braços abertos (TBA), o número de entradas nos braços fechados (EBF), e o tempo de permanência nos braços fechados (TBF), para obter os índices de ansiedade. A porcentagem de EBA (%EBA) foi calculada com relação ao número total de entradas nos braços [(EBA/EBA+EBF)x100], e a porcentagem de TBA (%TBA) foi calculada em relação ao tempo total do experimento [(TBA/TBA+TBF)x100]. O índice ansiolítico foi determinado pelo aumento ou diminuição das porcentagens de EBA e TBA, sabendo que o animal tem aversão natural aos braços abertos, e que se for obrigado a permanecer neles, possivelmente demonstrará sinais de medo, caso contrário, certamente ficará mais tempo nos braços fechados (LUCENA, 2010; CARVALHO et al., 2012; RODRIGUES et al., 2011).
5.3.3 Teste de nado forçado
APARATO: Neste teste foi usado um cilindro Plexiglass, com 30 cm de diâmetro e 50 cm de altura, contendo 40 cm de volume de água, a uma temperatura de 23 ± 1 ºC por 5 min (Figura 4).
Figura 4: Aparato utilizado no teste de Nado Forçado
(http://loucoengano.blogspot.com.br/p/teste-do-nado-forcado.html).
FUNDAMENTO: Observar o desenvolvimento de ansiedade e depressão. Nos primeiros minutos espera-se o comportamento de fuga, com nado em volta da circunferência do cilindro ou a tentativa de subida ao longo dos lados internos do cilindro, caracterizando um momento de ansiedade. Nos últimos minutos o camundongo espera-se o estado de imobilidade, mantendo apenas os movimentos necessários para sobrevivência, demonstrando sinais de depressão. Foi avaliado de acordo com o aumento ou diminuição do tempo de nado (LUCENA, 2010; MENEZES et al., 2008 ).
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS: O camundongo foi colocado no cilindro Plexiglass, obrigados a nadar sem possibilidade de fuga, durante 5 minutos. Eles exibiram 4 tipos de comportamentos: fuga, observado nos primeiros 2 minutos, nos três últimos minutos foram observados: a imobilidade contínua (flutuação, movimentos mínimos necessários para manter a cabeça fora da água), nado (circundando todo o cilindro) e o climbing (subida, movimentos ascendentes). Os dois primeiros minutos foram considerados para habituação ao teste. Os testes foram filmados e avaliados posteriormente. Foi contabilizado o tempo de imobilidade de cada animal (LUCENA, 2010).
5.3.4 Teste de Esconder Esferas
APARATO: Para este experimento foi necessário caixas de policarbonato de 27 x 16 x 13 cm as quais foram forradas com uma camada de 5 cm de maravalha sobre a qual serão distribuídas ao acaso 25 esferas de vidro com 1,5 cm de diâmetro (Fig. 05). Essas caixas foram cobertas com uma placa de acrílico transparente com pequenos furos para ventilação.
Figura 5: Aparato utilizado no Teste de Esconder Esferas
FUNDAMENTO: Este procedimento foi descrito para ratos por Poling et al., (1981) e posteriormente validado para camundongos (BROEKKAMP et al., 1986) visto que os roedores exibem o comportamento de esconder (enterrar) objetos aversivos como uma fonte de choque, alimentos nocivos ou objetos inanimados como as esferas de vidro. As esferas são contabilizadas no final do teste, quanto menor número de esferas escondidas indica um efeito anti-compulsivo do tratamento realizado.
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS: Após 30 dias do tratamento (gavagem) com as substâncias citadas, cada animal foi colocado em uma caixa individual e ao término de 30 minutos ele foi retirado e o número de esferas de vidro escondidas pelos animais foi registrado. Foram consideradas escondidas as esferas que estiverem completamente cobertas pela maravalha (PULTRINI et al., 2006).Considerando a grande variabilidade no número de esferas escondidas entre um animal e outro, foram submetidos ao procedimento
experimental apenas aqueles que esconderam durante os três dias consecutivos de treino anteriores ao dia do teste, pelo menos 13 das 25 esferas (BROEKKAMP et al., 1986; NJUNG´E; HANDLEY, 1991).
5.3.5 Teste de esquiva inibitória do tipo “step-down”
APARATO: O equipamento usado consiste de uma caixa de vidro e plástico (50 x 25 x 25 cm), cujo chão apresenta barras de alumínio de 1 mm de diâmetro com espaçamentos de 1 cm de distância, conectado a um estimulador elétrico (Figura 6), e do lado esquerdo da caixa tem uma plataforma que não possui estímulo elétrico (25 x 8 x 5 cm).
Figura 6: Aparato usado para o teste de Esquiva Inibitória do tipo ―stepdown‖.
(http://insightltda.com.br/insight-equipamento-cientifico-1520-Caixa-de-Esquiva-Passiva)
FUNDAMENTO: O teste de esquiva inibitória tipo “step-down”, avalia a latência, ou seja, o tempo para descida dos camundongos da plataforma, é muito utilizado em laboratórios para avaliação da aprendizagem e memória (IZQUIERDO et al., 1998; MAIA et al., 2009; VAKILI, et al., 2004). Para tal, as medidas de avaliação envolvem uma fase de treino e pós-treino e um choque de baixa intensidade, o qual é um estímulo aversivo para que o animal não execute uma determinada tarefa que foi apresentada a ele.
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS: No primeiro dia do teste, os camundongos foram colocados no aparato durante 3 minutos para se familiarizar com o ambiente novo. No segundo dia, o animal foi posicionado na plataforma com o rosto virado para o lado oposto do pesquisador, e no momento em que o camundongo colocou as quatro patas no assoalho de grade, recebeu um choque nas patas de 0,3 mA/s. Depois do estímulo o camundongo foi retirado imediatamente da caixa, e após 1 hora foi reposicionado na plataforma, para avaliação da memória de curta duração (MCD). O tempo que os animais levaram para descer com as quatro patas da plataforma foi usado para indicar a retenção de memória. Conforme estabelecido o intervalo de 180 segundos ficou determinado como tempo máximo de espera (latência) para a descida do animal durante os testes.
No terceiro dia, o animal foi colocado novamente na plataforma, para a avaliação da memória de longa duração (MLD) após 24 horas do treino. No padrão, o camundongo também levará no máximo 180 segundos, para se aventurar na grade do assoalho. Esse intervalo de tempo, em que o animal se sentiu seguro para descer, foi usado como indicativo de retenção de memória de longa duração (LUCENA, 2010; RODRIGUES et al, 2011).
Este teste foi realizado no primeiro dia de gavagem (tratamento), para avaliação da memória de curta e longa duração no tratamento agudo e depois de 30 dias de gavagem, para avaliação da memória de curta a longa duração no tratamento crônico.
5.4 Eutanásia
Após os testes comportamentais, os camundongos foram eutanasiados, através de inconsciência por aprofundamento de plano anestésico em câmara de vaporização com isoflurano em concentrações acima de 5 V % durante 5 minutos seguido de decaptação (MASSONE, 2008).O cérebro foi cuidadosamente removido do crânio e em seguida pesado e mantido em solução salina (0,9%) fria, para análise da atividade da enzima acetilcolinesterase.
5.5 Ensaio in vitro da acetilcolinesterase
A atividade da acetilcolinesterase cerebral foi dosada de acordo com o método de Ellman, (1961), com algumas modificações. O cérebro do camundongo foi homogeneizado na proporção de 1/30 em TFNa+ 50 mM (pH 7,2) e Triton X-100. Logo após separado em um eppendorf 200 µL do homogeneizado e acrescentado 200 µL de TFNa+ 50 mM (pH 7,2) sem Triton para dosar a proteína, segundo Bradford. Em outro eppendorf, foi adicionado 800 µL de homogeneizado, mais 800 µL de TFNa+ 50 mM (pH 7,2) com Triton para o ensaio da AChE. E então agitados em vortéx e centrifugados a 8.500 rpm por 10 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi usado para determinação da atividade da enzima. Um volume de 500 µL do sistema (40 ml TFK 100mM pH 7,5 + 10 ml DTNB 10 mM) foi adicionado ao tubo de ensaio com mais 500 µL de água ultra pura, depois permaneceu no banho-maria por dois minutos a 30 ºC e transferido para o espectrofotômetro (absorbância de 412 nm) para zerar o aparelho e dar início a leitura da atividade da AChE. Para o ensaio da enzima foi adicionado no tubo de ensaio 500 µL do sistema + 375 µL de água ultra pura 25 µL da amostra centrifugada. Foi pré-incubada a 30 ºC por 2 minutos, logo após adicionado 100 µL do substrato acetilcolina 1mM, agitado e colocado na cubeta para leitura, por 2 minutos de 20 em 20 segundos a 412 nm, no espectrofotômetro. A atividade da enzima foi expressa como mmol segundo a fórmula (µmol substrato hidrolisado/min/mg de proteína).
5.6 Análise Estatística
Os dados estatísticos foram computados no software GraphPadPrism 5®, sendo expressos pela média e o desvio padrão da média por grupo (D.P.M.), a diferença foi considerada estatisticamente significativa para valores de p<0,05. As análises dos testes de Atividade de Locomoção Espontânea, Nado Forçado, Esconder Esferas e LCE foram realizadas por análise de variância de uma via (ANOVA), seguido pelo teste de post-hoc de Newman-Keuls, para comparação entre os grupos, e para o teste de esquiva inibitória
foram realizados os cálculos para evidenciar as medianas, com seus intervalos interquartis das latências de descida da plataforma para serem analisadas através do teste de Kruskal-Wallis seguido do teste post-hoc de Dunn.
5.7 Aspectos éticos
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA), do Campus Universitário de Cuiabá, da UFMT (ANEXO A).
6.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados apresentados neste trabalho demonstram, pela primeira vez, estudos farmacológicos realizados com o óleo fixo da semente de Hymenae courbaril L., administrados de forma aguda e crônica (30 dias), em
modelos comportamentais para ansiedade, depressão, compulsão e memória. Mesmo com o avanço da medicina moderna, os produtos obtidos a partir
de plantas tem contribuído de forma importante como novas alternativas terapêuticas (CALIXTO, 2000). Nos últimos anos aumentou a inserção de produtos naturais com potencial psicoterapêutico como: Ginseng, Ginko Biloba, St. John’s Wort e Kava-Kava (ZHANG, 2004), já que apresentam menores efeitos adversos e baixo custo.
A investigação de substâncias ativas em plantas e seus efeitos no tratamento de algumas doenças, parte do principio da utilização da mesma para fins terapêuticos pela população (ELISABETSKY; SOUZA, 2004). O uso excessivo ou errôneo pode causar danos ao organismo assim como qualquer outro fármaco, por isso é importante a realização de pesquisas prévias com essas plantas, afim de oferecer um tratamento seguro e eficaz.
O óleo fixo da semente de jatobá, por exemplo, apresenta ácidos graxos insaturados essenciais (FERNANDES, 2014), que são fundamentais na síntese de membrana celular nervosa, na regulação do colesterol, de neurotransmissores e na atividade enzimática (SANGIOVANNI, 2005).
6.1 Teste de atividade locomotora espontânea
Neste teste os animais foram tratados com duas doses do óleo fixo da semente de jatobá (100 e 250 mg/kg), controle negativo (NaCl 0,9% + Tween 80® a 2%), IMP (30 mg/kg, controle positivo para os testes do nado forçado e de esconder esferas), DZP (1 mg/kg, controle positivo para o teste do LCE). A análise estatística (ANOVA de uma via) do número de cruzamentos mostrou que não houve alteração na mobilidade dos animais após o tratamento crônico de 30 dias conforme mostra o Gráfico 1.
Gráfico 1 - Efeito do tratamento crônico com o H. Courbaril L. (100 e 250 mg/kg, v.o.), Imipramina (30 mg/kg v.o.), Diazepam (1 mg/kg v.o), como controle positivo e SF 0,9% + Tween a 2% como controle negativo em camundongos avaliados no teste campo aberto. # p<0,05 (N=8).
O teste do campo aberto foi realizado para avaliar qualquer efeito inespecífico, que poderia interferir nos resultados do óleo de jatobá, o qual avalia a locomoção espontânea dos animais. Os resultados evidenciam que não houve alterações significativas na mobilidade dos animais expostos ao óleo de jatobá e demais medicações testada, o mesmo foi observado por Lucena (2010) em ratos tratados com fluoxetina (10 mg/kg), diazepam (1 mg/kg), cafeína (10 mg/kg) e C. paludosa (alho-do-mato, estudos revelam presença de flavonoides) (0,5; 1; 10 e 100 mg/kg) e por Taiwo (2007) em ratos que receberam extrato etanólico de Melissa officinalis (erva-cidreira, utilizada como calmante) (30, 100 e 300 mg/kg), diazepam (1 mg/kg) e fluoxetina (10 mg/kg).
Porém Dickel et al (2010) demonstrou em ratos Wistar tratados cronicamente com o extrato aquoso bruto de Brugmansia suaveolens (cartucheira, planta alucinógena, utilizada para analgesia) (300 mg/kg) uma redução significativa no número de cruzamentos quando comparado ao grupo controle e ao grupo tratado com 100 mg /kg do mesmo extrato.
6.2 Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE)
O Gráfico 2 revela os resultados dos efeitos da administração crônica do óleo da semente de jatobá (100 e 250mg/kg), controle negativo e DZP (1 mg/kg controle positivo). O teste de ANOVA, seguida do teste de post-hoc de Newman-Keuls, não mostrou qualquer diferença entre os grupos tratados com óleo de jatobá, quando comparados com os grupos controles positivo e negativo.
A
B
C
Gráfico 2 - Efeito do tratamento crônico com o H. Courbaril L. (100 e 250 mg/kg, v.o.), DZP (1 mg/kg v.o.), como controle positivo e SF 0,9% + Tween a 2% como controle negativo em camundongos avaliados no teste LCE, na percentagem de entradas nos braços abertos (%EBA) (A), percentagem do tempo nos braços abertos (%TBA) (B) e no número de entradas nos braços fechados (EBF) (C), durante 5 min. #
p<0,05 (N=8).
O teste LCE avalia diferentes parâmetros que estão relacionados à atividades ansiolítica, motora e exploratória, tornando possível várias interpretações de comportamentos (RODGERS et al., 1997; ESPEJO, 1997). Neste teste é analisado o percentual de entradas nos braços abertos e o tempo que ele permanece nesse local, porque roedores evitam lugares elevados e desprotegidos (lugares perigosos) (GRAEFF; GUIMARÃES, 2000).
Medicamentos usados no tratamento de transtornos de ansiedade generalizada, os benzodiazepínicos, aumenta a interação do animal com o ambiente aversivo, porém quando tratados com drogas ansiogênicas (cafeína) ocorre o oposto (LISTER, 1987).
Os resultados deste trabalho não mostraram diferenças significativas na %TBA e na %EBA entre os grupos tratados com óleo fixo (100 e 250 mg/kg) em relação ao grupo CN e o grupo CP (DZP 1 mg/kg), isso sugere ausência de atividade ansiolítica do óleo e do DZP. O que difere de outros trabalhos, Lima (2010) observou em camundongos um aumento no %TBA e uma diminuição
TBF no grupo tratado com DZP, além do aumento do número de entradas no BA em relação aos grupos tratados com o óleo essencial de Rosmarinus officinalis (alecrim, antibiótico, anti-inflamatório) (125, 250 e 500 mg/kg) e o CN. Segundo Lucena (2010) os ratos após o tratamento com DZP (1 mg/kg) e extrato etanólico da C. paludosa (1, 10 e 100 mg/kg), apresentaram um aumento do %TBA e na %EBA, sem alterar o número de EBF, no grupo tratado com DZP em relação ao CN.
No que concerne ao número de EBF, os grupos tratados com o óleo também não apresentaram diferenças significativas em relação aos grupos CN e CP, confirmando a ausência de atividade sobre o sistema motor já observado anteriormente no teste de atividade locomotora espontânea (Gráfico 1). Segundo Rodgers et al., (1997) o número de entradas nos braços fechados é definido como um parâmetro de atividade locomotora.
Entretanto, Dickel et al., (2010), observou uma redução no número de entradas e percentagem de tempo despendido nos braços abertos nos animais tratados de forma crônica, o que indica um efeito ansiogênico do extrato da Brugmansia suaveolens (100 e 300 mg/kg) em relação ao grupo controle, além disso o grupo tratado com 300 mg/kg apresentou uma redução no número de entradas total, o que pode significar uma alteração na atividade locomotora, diferente do que foi observado neste trabalho.
Como neste trabalho não houve alteração do número de entradas totais podemos sugerir que óleo não altera a atividade locomotora dos animais, porém quando analisamos o grupo controle positivo não observamos o aumento do %TBA e %EBA o que foi observado nos demais estudos, podemos sugerir que a dose de diazepam não está sendo efetiva para alterar o comportamento do animal, o que era esperado. Em outras pesquisas que estão sendo realizadas em nosso laboratório, em animais tratados com a mesma dose, porém 3 vezes ao dia o diazepam apresentou resultados positivos.
6.3 Teste nado forçado
O efeito do tratamento crônico da administração oral do óleo fixo do jatobá (100 e 250mg/kg), controle negativo ou IMP (30mg/kg como controle positivo), em camundongos adultos, avaliados no teste do nado forçado, estão demonstrados no Gráfico 3. ANOVA de uma via não revelou efeitos significantes para o fator tempo de imobilidade.
Gráfico 3 - Efeito do tratamento crônico com o H. Courbaril L. (100 e 250 mg/kg, v.o.), Imipramina (30 mg/kg v.o.), como controle positivo e SF 0,9% + Tween a 2% como controle negativo em camundongos avaliados no teste nado froçado. # p<0,05 (N=8).
O teste nado forçado foi realizado com o objetivo de identificar uma possível atividade antidepressiva do óleo de jatobá, para isso o parâmetro avaliado foi o tempo de imobilidade que serve como indicador de desespero comportamental (GUTIÉRREZ-GARCIA; CONTRERAS, 2009). A imobilidade neste teste sugere uma incapacidade ou relutância em manter o esforço necessário, em vez de uma diminuição da atividade generalizada (CRYAN; HOLMES, 2005).
A imipramina, fármaco utilizado como controle positivo neste teste, é um inibidor não seletivo de receptação de noradrenalina e serotonina, o esperado era que ele interferisse no comportamento dos animais, aumentando os comportamentos ativos (nadar e subir), diminuindo consequentemente o tempo de imobilidade, conforme proposto por Cryan et al., (2002) em ratos.
