1. Farmacêutica Especialista em Cosmetologia – Pesquisa e Desenvolvimento de Produtos Cosméticos, Instituto Racine – São Paulo – SP e Doutoranda em Neurociências pela Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP);
2. Farmacêutica Especialista em Cosmetologia – Pesquisa e Desenvolvimento de Produtos Cosméticos, Instituto Racine – São Paulo - SP; 3. Química Especialista em Administração Industrial,
docente do Instituto Racine – São Paulo - SP; 4. Doutora e farmacêutica em Ciências na área de
Produção e Controle Farmacêuticos – USP – São Paulo, docente da Fatec de Diadema – Luigi Papaiz, Diadema, SP e SENAC – São Paulo - SP. Autor para Correspondência: Carla Aparecida Pedriali Moraes. E-mail: capedriali@hotmail.com Data Recebimento: 30/03/2014 Aceito para p Publicação: 18/05/2015
AnáLiSE dA utiLizAção dE tEStES ALtERnAtivoS PARA
AvALiAção dE SEguRAnçA dE PRodutoS CoSmétiCoS
Daisylea de Souza Paiva1, Juliana Riguetti Vitalli2, Maria Aparecida Lima Moreira3 e Carla Aparecida Pedriali Moraes4
Atualmente observa-se uma crescente movimentação por parte de algumas agências regulatórias, organizações não governamentais (ONGs) e até mesmo indústrias de cosméticos no sentido de tentar diminuir o uso de animais de laboratório em ensaios biológicos. Este trabalho teve como objetivo a realização de uma breve revisão bi-bliográfica da descrição dos métodos de avaliação da segurança in vivo e a possível substituição por métodos alternativos in vitro e in silico pela indústria cosmética no âmbito nacional. Isto foi feito correlacionando a posição de diversos órgãos reguladores referente ao uso de técnicas alternativas. Constatou-se que ainda não é possível subs-tituir totalmente o uso de animais para determinação de novos ativos ou formulações cosméticas, mas os testes alternativos estão contribuindo para reduzir o número de animais utilizados na pesquisa científica.
Palavras-chave: Testes alternativos, segurança, produtos cosméticos.
1. intRodução
O Brasil é o terceiro maior mercado no mundo em consumo de cosméticos e, como consequência, houve um aumento na variedade de matérias--primas de diferentes origens e pureza disponí-veis para este fim. Com isso, os fabricantes têm a obrigação de garantir a segurança e a eficácia dos cosméticos aos consumidores, fazendo com que os riscos de aparecimento das reações adversas (irritação, sensibilização e efeitos sistêmicos) a algum produto seja cada vez menor.
Por outro lado, nos últimos anos várias meto-dologias que não utilizam animais como modelo experimental vêm sendo validadas e recebendo aprovação regulatória na União Europeia, e há incentivo em sua substituição por métodos
alter-nativos in vitro1, conforme a introdução da Sétima
Alteração às Diretrizes de Cosméticos (do inglês,
Seventh Amendment to the Cosmetics Directive)2,3.
Uma vez havendo a utilização de animais, o uso de técnicas bioestatísticas é crucial para deter-minação do cálculo da amostra a ser utilizada, no planejamento do desenho experimental apropriado, na deteminação da hipótese estatística a ser testada
e na escolha do método para análise de dados4.
O Comitê Coordenador Interagência na Validação de Métodos Alternativos (ICCVAM) (do inglês, Interagency Coordinating Commit-tee on the Validation of Alternative Methods) é responsável pela validação dos testes in vitro desenvolvidos, que são posteriormente aprovados pelo Laboratório de Referência da União Europeia para Alternativas aos Testes em Animais (EURL ECVAM, do inglês, European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing). Nos Estados Unidos, o Programa Nacional de
RES
Toxicologia (NTP, do inglês National Toxicology Program) do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, por meio do Centro Interagências para Avaliação de Métodos Toxicológicos Alternativos (NICEATM, do inglês NTP Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Metho-ds) trabalha em conjunto com o ICCVAM e aceita as validações feitas pelo mesmo. Dessa forma, as metodologias criadas pela comunidade científica são validadas pelo ICCVAM e publicadas como de guia ou TG (do inglês, Test Guidelines) pela OECD (do inglês Organisation for Economic Co--operation and Development, Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico).
A partir desse contexto, realizamos neste artigo uma breve exposição sobre os métodos conven-cionais utilizados para determinar segurança de produtos cosméticos, bem como revisamos os principais e recentes métodos alternativos publi-cados em revistas científicas, e se estes podem vir a substituir o uso de animais estritamente na área cosmética, tendo como base os aspectos éticos, eficiência e harmonização de resultados.
2. métodoS in SiLiCo dE AnáLiSE dE novAS
moLéCuLAS
O termo in silico refere-se aos métodos de análise baseados em modelos computacionais. São capazes de predizer as características de moléculas e a interação destas com proteínas co-nhecidas, além de dados toxicológicos. O uso de ferramentas computacionais para prever respostas biológicas vem sendo usado desde meados de
19605. Incluídos nos métodos in silico, temos o
SAR6 (do inglês, Structure-activity Relationship,
Correlação estrutura-atividade e identifica gru-pos reativos), QSAR 2D (do inglês, Quantitative Structure-activity Relationship, Correlação quan-titativa estrutura-atividade), QSAR 3D (considera a tipologia tridimensional) e QSAR 4D (considera as dinâmicas de interações).
Os métodos QSAR são os mais utilizados atu-almente, principalmente no ramo da “toxicologia
in silico”, chamados QSTR (do inglês, Quantita-tive Structure-toxicity Relationship, Correlação quantitativa estrutura-toxicidade). Esses modelos podem predizer endpoints contínuos (doses letais)
ou categóricos (genotóxico ou não genotóxico)6,7.
Uma nova abordagem in silico denominada CADD (do inglês Computer-Aided Drug Design, Desenho de Drogas Feito por Computador) leva em conta a ligação da molécula ao receptor, pode prever ou melhorar o metabolismo,
farmacociné-tica e toxicidade5,8.
O sucesso de um método in silico vai depender da infraestrutura químico-informática que com-bine diversas fontes de dados para compreender melhor a atividade biológica dos compostos. Esses sistemas preditivos estão em constante mudança, o que implica que novos dados devem ser conti-nuamente incorporados ao sistema na medida em que novos conhecimentos estejam disponíveis. Assim, a validação desses métodos apresenta difi-culdades, uma vez que o sistema está em constante
mudança9.
3. utiLizAção dE téCniCAS in vitRo E
in vivo PARA AnáLiSE dE ingREdiEntES E
foRmuLAçõES CoSmétiCAS
irritação ocular
O teste proposto por Draize10 ainda é padrão
quando se trata de irritação ocular, pois vários estudos de validação concluíram que nenhum teste in vitro sozinho é capaz de substituí-lo, uma vez que ainda seria incapaz de modelar toda a resposta imunológica, bioquímica e celular à ir-ritação ocular. No entanto, quando utilizados em conjunto fornecem valiosas informações sobre
irritação ocular11.
No teste ICE (do inglês, Isolated Chicken Eye test ou Teste de olho de galinha isolado)
desen-volvido por Prinsen e Koeter12 os efeitos tóxicos
causados por uma substância são medidos pela análise qualitativa da opacidade, pela retenção de fluoresceína e danos macroscópicos na morfologia
da superfície do olho, além da determinação
quan-titativa do aumento da espessura da córnea12,13.
A proposta do teste BCOP (do inglês, Bovine Corneal Opacity and Permeation test ou Teste de
Permeabilidade e opacidade de córnea bovina)14
é avaliar o potencial de risco para o olho de uma substância teste medida pela habilidade em indu-zir a opacidade e aumentar a permeabilidade em córnea bovina, sendo que a medição é feita pela
diminuição na transmissão da luz15.
O Teste do Ovo de Hen - Membrana Co-rioalantoide (HET-CAM, do inglês, Hen’s Egg Test - Chorioallantoic Membrane) é um modelo organotípico utilizado para avaliar os efeitos das substâncias (visualização de reações irritantes como hemorragia, lise e coagulação) nos tecidos conjuntivais do olho, uma vez que a membrana corioalantóide do ovo embrionado (Leghorn com 10 dias de fecundação) de galinha possui tecidos de mucosa vascularizados semelhantes aos
encon-trados nos olhos humanos e de coelhos16,17.
Os métodos in vitro ICE e o BCOP são valida-dos pela União Europeia (ICCVAM e aprovavalida-dos pelo ECVAM) e preconizados pelo Programa Nacional de Toxicologia, nos Estados Unidos,
para predição de irritação ocular severa13,15, e
também para distinguir substâncias irritantes de categoria 1 e 2.
Os ensaios de citoxicidade têm como objetivo determinar a porcentagem de morte celular por meio de corantes vitais como o MTT (ou 3-(4,5 dimethyl thiazole-2yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) ou vermelho neutro, que são incorpo-rados pelas células vivas. A adição de solvente solubiliza os cristais e a mudança na coloração para púrpura é quantificada por meio de medição
da absorbância17,18. No Brasil, a ANVISA aceita
este teste18.
Existe ainda vários novos protocolos, como o EpiOcular™ e o SkinEthic™, que estão em fase de validação e utilizam tecidos humanos reconsti-tuídos para avaliação de toxicidade ocular. Dentre eles, o sistema EpiOcular™ utiliza epitélio corneal humano e consiste na exposição do epitélio à subs-tância a ser testada, verificando-se a diminuição
na viabilidade celular por meio do método MTT3.
Corrosividade Cutânea
A corrosividade cutânea refere-se à produção de dano irreversível (necrose visível) à pele, causa-do pela aplicação de uma determinada substância num período de 4 horas. O teste in vivo consiste em colocar um patch semi-oclusivo em contato com a pele de coelhos albinos e verificar as
re-ações manifestadas19. Apesar da corrosividade
não ser um fator de risco para cosméticos, pode acontecer após algum erro na fabricação ou mal uso de consumidores.
Nos últimos anos algumas metodologias in vitro já foram validadas pelo ICCVAM e são aceitas como substitutas para o teste de Draize. Dentre elas, podemos citar o TER, EpiSkin™, EpiDerm™, Skin Ethic™, Corrositex™ e EST-1000.
O Teste de Resistência Elétrica Transcutânea (do inglês Transcutaneous Electrical Resistance Test Method, conhecido como TER) é validado pela OECD e diferencia substâncias e misturas
corrosivas e não corrosivas à pele20. O método
utiliza discos de pele acoplados a um sistema de dois compartimentos, onde o disco é a separação entre compartimentos. O potencial corrosivo é testado aplicando-se uma substância por 24 horas para verificar a perda da integridade do estrato córneo, que é medida como uma redução na TER
para abaixo de 5Ω20.
Outros métodos para avaliação da corrosivi-dade de substâncias são baseados em Epiderme Humana Reconstituída (RhE), sendo denominados comercialmente como SkinEthic™, EpiSkin™ e
EpiDerm™21,22. Tais modelos se baseiam na
pre-missa de que substâncias corrosivas penetram no estrato córneo por difusão e que são tóxicas para as células. Dessa forma, a viabilidade celular é medida por adição de corante MTT e identificadas pela capacidade de reduzir em 50% a viabilidade
celular2,21,22.
Um outro modelo que utiliza epiderme recons-tituída é o Teste de Epiderme 1000 (do inglês Epidermal Skin Test 1000, EST-1000). A camada submersa de queratinócitos humanos encontra-se em uma interface ar-líquido, que estimula a
dife-renciação das células. O protocolo é baseado na
TG 43121, que é o mesmo utilizado para os testes
EpiDerm™, EpiSkin™ e SkinEthic™23.
Para avaliação do potencial de corrosividade de ácidos, bases e derivados ácidos utiliza-se o en-saio Corrositex®. Tal enen-saio consiste em colocar a substância teste em um tubo contendo solução indicadora de pH separada por uma membrana semipermeável composta de queratina, de forma que, se a substância atravessar a membrana,
ocor-rerá a alteração no pH da solução24,25,26.
irritação dérmica
Irritação dérmica é caracterizada pelo apareci-mento de dano reversível à pele em decorrência da aplicação de uma determinada substância por mais de 4 horas. Para determinação de irritação dérmica, os testes de epiderme humana
reconsti-tuída (RHE) validados pela ECVAM (TG 439)27
são: EpiDerm™ SIT (EPI-200), SkinEthic™ RHE e EpiSkin™. O EpiSkin™ foi validado como um método que pode ser utilizado sozinho para distinguir substâncias não irritantes de irritantes,
substituindo o tradicional teste in vivo de Draize10
para irritação dérmica. Além destes últimos, os testes EpiDerm™ e SkinEthic™ também pode ser utilizados para identificação de substâncias irritantes. O teste de Epiderme Humana recons-tituída (RHE) é feito com base na formação de edema e eritema, como resultado de uma cascata de eventos de irritação da pele, começando pela
penetração pelo estrato córneo27.
Sensibilização cutânea
Para determinação da sensibilização dérmica não existe nenhum teste in vitro validado pela ECVAM como alternativa para os testes em ani-mais, devido à complexidade e diversidade dos mecanismos biológicos de sensibilização e a
gran-de quantidagran-de gran-de substâncias disponíveis28. No
teste de Maximização em Guinea pig (conhecido
como porquinho-da-índia)28, a sustância-teste é
injetada intradermicamente na região dorsal com um adjuvante em cobaias, e a duração do teste
é de aproximadamente 35 dias. Para o teste de oclusão de Buehler não é necessária a utilização de adjuvantes e, nesse caso, o processo de sen-sibilização ocorre quando a pele fica em contato com um patch oclusivo que contém a substância
teste18,29.
No intuito de diminuir o número de animais utilizados, foi desenvolvido o teste LLNA
descri-to na TG 42930. Tal método é baseado no
princí-pio de que os agentes sensibilizadores induzem proliferação de linfócitos no local de aplicação e é proporcional à concentração da substância
analisada30.
O Ensaio de Reatividade Direta de Peptídeo (DPRA, do inglês Direct Peptide Reactivity Assay) foi desenvolvido pela Procter & Gamble. Verifi-ca o processo de haptenação, que é a ligação de substâncias de baixo peso molecular (haptenos) à proteínas da pele consideradas iniciadoras dos
processos de sensibilização dérmica31. Já o teste
KeratinoSens™ avalia a ativação da via dependen-te do elemento de resposta antioxidandependen-te (ARE) em queratinócitos, um mecanismo-chave conhecido na sensibilização dérmica. KeratinoSens™ é uma linhagem celular que contém a sequência ARE do gene envolvido com a ativação dessa via, e o resultado do teste é dado pela determinação da
ativação da enzima luciferase32.
Adicionalmente, o teste RBC (Sistema de célu-las vermelhas, do inglês Red Blood Cell System) é aceito pela Anvisa e permite quantificar e ava-liar os efeitos de substâncias sobre a membrana plasmática de hemácias, bem como a consequente liberação da hemoglobina (hemólise) e ainda, o índice de desnaturação da hemoglobina que são
quantificados por espectrofotometria33.
fototoxicidade
A fototoxicidade ou fotoirritação é defini-da como uma resposta tóxica induzidefini-da após a primeira exposição da pele ou administração sis-têmica de uma substância química e subsequente
exposição à luz18. No teste de fototoxicidade, o
produto é aplicado na pele do animal, seguido por exposição à radiação UVA e UVB. Após
48 horas, são feitas observações macroscópicas comparando-se com a área controle onde não
houve exposição18.
O 3T3 – NRU – PT (Teste de Fototoxicidade pela captação de Vermelho Neutro pela linhagem de células 3T3, do inglês Neutral Red Uptake Phototoxicity Test) é o teste de fototoxicidade in
vitro validado e publicado na TG 43234. 3T3 é uma
linhagem de células obtidas a partir do tecido de embrião de camundongo. Esse teste é realizado após a exposição a uma dose de radiação UVA em comparação com a ausência de exposição. A citotoxicidade é expressa com uma redução da con-centração da captação do corante vermelho
neu-tro35. Apesar de utilizar uma linhagem de células
de camundongos, o uso de animais foi diminuído drasticamente após a adoção desse teste.
Vermelho neutro (NR, do inglês Neutral Red) é um corante catiônico que se difunde rapidamente através das membranas celulares e acumula-se nos lisossomas celulares. Uma vez no meio ácido do lisossoma, o NR é oxidado, tornando-se carregado positivamente e preso dentro do lisossoma. A me-nos que a célula ou o lisossoma seja danificado, o
corante vermelho permanece preso35.
toxicocinética
A Anvisa define toxicocinética como os proces-sos de resposta do nosso organismo frente a uma substância química, em função da dose e do tempo, em termos de ADME (Absorção, Distribuição,
Metabolismo e Excreção)36. De todos os
mecanis-mos ADME, apenas a absorção dérmica pode ser
avaliada in vitro, conforme a TG 42834. O método
consiste em um aparato de difusão constituído por uma câmara doadora e um compartimento recep-tor, entre os quais a pele é posicionada. Aplica-se a substância na pele por um período de até 24 horas. Durante esse período, a pele é lavada e o líquido dos dois compartimentos é recolhido para determinar o quanto de substância penetrou na
pele34. Este teste é muito difícil de ser mensurado
in vitro. Encontra-se em fase de desenvolvimento um teste que tenta mimetizar a metabolização in vitro. No entanto, como os sistemas de
metabo-lização em humanos e animais são diferentes, desenvolver métodos alternativos torna-se um desafio. Nos Estados Unidos, o FDA recomenda a avaliação metabólica em humanos. Devido a essas limitações, tem crescido o uso de ferramentas in silico para predição da toxicocinética. Um dos modelos in silico utilizados é o “Toxicocinética Fisiologicamente Fundamentada” (PBTK, do inglês Physiologically-Based ToxicoKinetics), que avalia os parâmetros físico-químicos das substâncias e prediz como será o comportamento nos processos ADME.
o posiciomento das agências regulatórias quanto
aos métodos alternativos in vitro
A ANVISA determina que sejam utilizados métodos alternativos sempre que for possível, mas não impõe restrição quanto ao uso de animais. Nos Estados Unidos, o FDA exige, para produtos que contenham substâncias em escala nano, que sejam feitos testes em animais. Já na União Europeia, os testes em animais para avaliar a segurança cosmética são proibidos. Porém, na China, o uso de animais em testes de segurança e eficácia em cosméticos é obrigatório. Dessa forma, um outro aspecto que deve ser levado em conta é se existe no briefing do produto a intenção de venda em algum país onde é obrigatório o uso de animais para determinação de segurança, como na China. Essa decisão deve ser tomada antes mesmo de escolher uma substância nova como ingrediente de um produto cosmético.
4. ConSidERAçõES finAiS
A comunidade científica, no Brasil e no exte-rior, na maioria de seus membros, vem declarando que, devido à complexidade em representar em culturas de células o funcionamento de um sis-tema, e até mesmo em obter de forma alternativa um organismo completo, não é possível substituir totalmente o uso de animais para determinação de alguns atributos (Toxicocinética, por exemplo).
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Por outro lado, a partir dos dados apresentados, podemos inferir que para a pesquisa de desen-volvimento em cosméticos, foco deste artigo, existem várias alternativas validadas e aceitas pela ANVISA, FDA e COLIPA para diminuir ou até mesmo eliminar o uso de animais, dependendo da complexidade da nova molécula apresentada.
Embora ainda existam vários desafios a serem cumpridos, a capacidade de predizer o risco de determinada substância sem a utilização de novos testes em animais provavelmente será possível nos próximos anos, principalmente se houver um grande esforço das empresas e da comunidade científica mundial.
AnALySiS of thE uSE of ALtERnAtivE tEStS foR CoSmEtiC
PRoduCtS SAfEty EvALuAtion
Currently there has been a growing movement by regulatory agencies, non--governmental agencies and even cosmetics industries in order to reduce the use of laboratory animals in biological tests. This study aimed to hold a brief literature review of methods for the assessment of in vivo safety and the possible use of in vitro and in silico alternative methods by the national cosmetic industry. This was done to correlate the position adopted by the various regulatory agencies concerning the use of alternative methods. It was found that still can not completely replace the use of animals for determination of new actives or cosmetic formulations, but the alternative tests contributed to reduce the number of animals used in scientific research.
Keywords: Alternative tests, safety, cosmetics products.
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