PROSPECÇÃO DE VARIANTES DE TOXINAS CRY COM ALTA ESPECIFICIDADE E TOXICIDADE CONTRA O BICUDO DO ALGODOEIRO (Anthonomus grandis) E A LAGARTA DO CARTUCHO
DO MILHO (Spodoptera frugiperda)
Patrícia Sanglard Felipe Brunetta (Embrapa Cenargen – UCB / brunetta@cenargen.embrapa.br), G .R. Oliveira, (Embrapa Cenargen), E. L. Z. Figueira (Embrapa Cenargen), H. B. Ramos (Embrapa Cenargen - UnB), M. C. M. Silva (Embrapa Cenargen), K. L. Cavalcanti (Embrapa Cenargen), M. F. Grossi de Sá (Embrapa Cenargen - UCB).
RESUMO - Nos últimos dez anos a cotonicultura aumentou significativamente a sua participação na economia agrícola, atingindo principalmente a região Centro-Oeste e implementando uma nova realidade nos sistemas de cultivo utilizando tecnologias avançadas de produção, o que contribuiu para o restabelecimento do fornecimento de fibra no mercado interno e a participação nas exportações agrícolas nacional. No entanto, o cultivo intensivo em grandes extensões por vários anos consecutivos tem gerado altos índices de infestação por pragas, como o bicudo e a lagarta do cartucho do milho, demandando grandes volumes de inseticidas que, além de dispendiosos, apresentam eficiência variável. O presente trabalho tem por objetivo a prospecção de genes que apresentem toxicidade e especificidade contra estas pragas, através do uso da técnica de evolução molecular in vitro (DNA
Shuffling) e da construção de uma biblioteca combinatória tipo Phage Display contendo 105
transformantes. A metodologia consistiu na amplificação dos genes originais, fragmentação destes genes com DNaseI, recombinação dos fragmentos em reação de PCR sem a utilização de oligonucleotídeos e amplificação dos mutantes, que foram selecionados através de ligantes presentes no intestino do bicudo e da lagarta do cartucho. Os genes mutantes selecionados (21 para o bicudo e 16 para a lagarta do cartucho) foram expressos na superfície de fagos, seqüenciados e avaliados em bioensaios, cujos primeiros resultados apresentam variabilidade na taxa de mortalidade das larvas dos insetos.
Palavras-chave: algodão, bicudo do algodoeiro, lagarta do cartucho do milho.
SCREENING OF MUTANTS CRY TOXINS WITH TOXICITY AGAINST COTTON BOLL WEEVIL (Anthonomus grandis) AND FALL WARM (Spodoptera frugiperda)
ABSTRACT - During the last ten years the Brazilian cotton production increased its participation in the agricultural economy in Brazil, establishing a strong empathy especially with the Central-West-Region, implementing a new reality in the production system of this crop as new production technologies, which contributed to the re-establishment of fiber sells in the nacional market and the participation in the Brazilian agricultural exportations. However, the intensive grow in big areas for many years have generated high levels of pests infestations, as well as the boll weevil (Anthonomus grandis) the fall warm (Spodoptera frugiperda), which are insects that boasts an enormous devasting power and causes great concern in the cerrado region. In this context aimined the cry genes screening, which be toxic and specific against that pest by using of molecular evolution in vitro strategy (DNA Shuffling) and the combinatory library construction applying Phage Display thodologiesme, with 105 mutants. The two originals genes were amplified, then they were cleaveged with DNaseI, and the fragments were recombinited by a polimerase chain reaction, without the presence of primers. The mutants were selected by some proteins from the insects midgust. There were selected 21 mutants against the boll
weevil, and 16 against fall warm. These mutants were expressed on phage membrane, sequenced and the toxicity against theses insect pest were evaluated in bioassays where the results indicates a variability among protein toxicity.
Key words: cotton, cotton boll weevil and fall warm. INTRODUÇÃO
A cotonicultura é uma das atividades de grande importância sócio-econômica para o Brasil na atualidade, ocupando 1.151,8 mil hectares de área cultivada no ano agrícola 2004/2005, dentre os quais 631 mil na região Centro-Oeste (CONAB, 2005). Consta que no ano em que o Brasil plantou área recorde de algodão herbáceo, (2.200.000 de hectares) registrou pela primeira vez a ocorrência do bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis) e desde então, observou-se uma decadência progressiva na área do cultivo, fortemente provocada pela dificuldade de controle da nova praga que apresenta hábito de crescimento endofítico e altos índices de danos econômicos, levando o Brasil a registrar sua pior marca em área de cultivo, na safra 1996/1997, tendo plantado naquele ano apenas 600 mil hectares (CONAB, 2005). A retomada da expressividade da cotonicultura no cenário nacional e internacional se deu gradativamente com a migração da cultura para a região Centro-Oeste, com a reorganização e mecanização do setor ocorrido no final dos anos 90 e pela qualidade da fibra produzida.
Porém, o cultivo do algodão sofre grandes prejuízos com o ataque de insetos-pragas, tais como: o bicudo do algodoeiro (A. grandis), o curuquerê (Alabama argilacea), a lagarta do cartucho do milho (S. frugiperda), a lagarta da maçã (Heliothis virescens) a lagarta rosada (Pectinophora
gossypiella). O bicudo do algodoeiro é considerado uma das pragas mais relevantes na cotonicultura
mundial, devido aos danos causados e dificuldades de controle pelos métodos convencionais, apresenta ampla distribuição geográfica e nos últimos anos vêm exercendo fortes pressões em Goiás, Minas Gerais, Bahia e Mato Grosso. Além do bicudo, destacam-se também os problemas relacionados à lagarta do cartucho do milho, que se alimenta das folhas no seu estágio larval e penetra nas maçãs e nos botões florais, dificultando o seu controle e comprometendo a qualidade e quantidade de fibra produzida. O controle destas pragas pela aplicação de inseticidas demanda grandes volumes e apresenta eficiência relativa, devido, principalmente, à dificuldade de acesso aos insetos que apresentam hábito endofítico.
Tendo em vista os prejuízos causados pelos insetos-pragas e a necessidade de preservação da saúde humana e do meio ambiente, a adoção de plantas geneticamente modificadas (GM) vem se consolidando no mundo como uma promissora ferramenta nos programas de sanidade vegetal. Prova disto é que no ano de 2004, a área total cultivada com culturas GM atingiu a marca dos 81 milhões de hectares, crescimento significativo (47 vezes) se comparado com os 1,7 milhões de hectares plantados em 1996. Do total da área mundial cultivada com culturas GM, 34% foi cultivado em países em desenvolvimento. Plantas GM que expressam proteínas de Bacillus thuringiensis (Bt) (comumente chamadas de culturas-Bt) consistem em um método seguro e eficiente de controle de pragas. No ano de 2004, foram cultivados 4,5 milhões de hectares de algodão Bt no mundo (JAMES, 2004).
A crescente adoção desta tecnologia é reflexo dos benefícios diretos propiciados sendo eles: melhoria substancial da produtividade, do meio ambiente, da economia, redução dos riscos para a saúde dos pequenos e grandes agricultores, consumidores e para a sociedade em geral.
B. thuringiensis é uma bactéria de grande interesse agronômico e científico. As subespécies de Bt colonizam e matam uma grande variedade de insetos e nematóides, porém cada cêpa o faz com
alto nível de especificidade (MAAGD et al., 2001). Esta característica é atribuída ao grupo de proteínas cristais (proteínas Cry) que esta bactéria produz durante a fase de esporulação. Proteínas Cry individualmente possuem um espectro definido de atividade inseticida, normalmente restrito a uma ordem de insetos (díptera, coleóptera, lepidóptera, etc). Dentre as vantagens do uso de genes que codificam proteínas Cry na construção de plantas transgênicas destacam-se: i-) a baixa toxicidade das proteínas Cry sobre humanos e mamíferos de um modo geral; ii-) o alto nível de especificidade de uma dada proteína a um inseto alvo, minimizando a possibilidade de efeitos indesejáveis sobre insetos não alvo, como por exemplo os polinizadores e inimigos naturais; iii-) rápida degradação no meio ambiente (BETZ et al., 2000).
Os índices mundiais de adoção da nova tecnologia, somado as perspectivas de implantação destas no Brasil (liberação do algodão Bt – evento Cry1Ac em abril de 2005) e os danos econômicos causados pelo ataque das pragas, bem como aos bons resultados anteriormente obtidos com plantas transformadas, motivaram o presente trabalho, que tem como objetivo a prospecção de genes de resistência ao bicudo do algodoeiro e a lagarta do cartucho do milho a partir de uma biblioteca de moléculas melhoradas, geradas pela técnica do DNA Shuffling e selecionadas por Phage Display, considerando-se a possibilidade de aplicação dos genes selecionados no programa de melhoramento de algodão, através do uso de técnicas de transformação de plantas.
MATERIAL E MÉTODOS
Genes cry: Foram utilizados para construção da biblioteca os genes cry3Aa, doado pelo Bacillus Genetic Stock Center-EUA e o gene cry8Ga isolado previamente pelo grupo a partir de uma cepa de Bt da coleção do Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologia da Embrapa.
Criação do bicudo do algodoeiro: Os ovos do bicudo do algodoeiro foram espalhados em dieta artificial à base de extrato de algodão e as larvas ao eclodirem se desenvolveram no interior desta dieta e os adultos ao emergirem foram acondicionados em um recipiente onde copularam e ovopositaram. Estes adultos foram alimentados com a mesma dieta das larvas. Os ovos foram coletados, esterilizados e espalhados novamente na dieta, para a manutenção da colônia (MONNERAT
et al., 1999).
Criação da lagarta do cartucho do milho: Os ovos foram depositados em papel de filtro, esterilizados e colocados em dieta artificial, onde as lagartas se desenvolveram. Após a eclosão, as larvas se alimentaram da dieta e posteriormente completaram o ciclo larval, as pupas foram coletadas e colocadas em recipientes onde copularam e ovopositaram em papel.
Obtenção de receptores de toxinas Cry do intestino do bicudo do algodoeiro e da lagarta do cartucho do milho: As proteínas periféricas do epitélio intestinal “Brush Border Membranes Vesicles” (BBMV) do bicudo do algodoeiro e da lagarta do cartucho do milho foram extraídas segundo Biber et al. (1981) e utilizadas no processo de seleção das moléculas de toxina Cry mutantes.
Construção de biblioteca combinatória de toxinas Bt e seleção de mutantes contra as pragas alvo: Na construção da biblioteca combinatória de genes codificadores para toxinas Bt, foram utilizados os genes cry3Aa e cry8Ga, sendo que moléculas mutantes geradas a partir da aplicação da tecnologia de DNA shuffling (STEMMER, 1994), cuja seleção foi realizada por Phage Display (Smith, 1985). O método compreende as seguintes etapas: (i) amplificação dos genes originais em reação de
PCR com oligonucleotídeos específicos contendo o sítio de restrição para a enzima SfiI, (ii) fragmentação de 5 µg de cada um dos genes amplificados com a enzima DNaseI, cujos fragmentos obtidos apresentaram entre 30-50 pb, (iii) recombinação aleatória dos fragmentos em reação de PCR sem a adição de oligonucleotídeos e (iv) amplificação dos novos genes recombinados (Figura 1 A). Os novos genes foram digeridos com SfiI, introduzidos no fagomídeo pCOMB3X, clonados em Escherichia
coli XL1 Blue e submetidos a seleção por Phage Display utilizando como ligantes receptores do
intestino do bicudo do algodoeiro e da lagarta do cartucho do milho. Os genes mutantes selecionados foram seqüenciados expressos na superfície de fagos para a caracterização e realização de bioensaios.
Bioensaio utilizando as proteínas melhoradas: As toxinas Bt melhoradas foram expressas no capsídieo de fagos (helper M13) e incorporadas na dieta artificial do bicudo do algodoeiro e da lagarta do cartucho do milho.
Sequenciamento dos genes selecionados: Os genes selecionados foram seqüenciados em seqüenciador automático.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os genes cyr3Aa e cry8Ga foram inicialmente amplificados (Figura 1B) e após fragmentação com DNaseI obteve-se fragmentos com 30 a 50 pb (Fig. 1C). Estes fragmentos foram recombinados em reação de PCR sem a utilização de oligonucleotídeos e, posteriormente, utilizados como molde para a recuperação dos novos genes recombinados em outra reação de PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos (Fig. 1D).
Figura 1. Obtenção de genes cry mutantes. A. Esquema geral da metodologia de DNA shuffling na obtenção de genes mutantes. B. Amplificação dos genes originais. C. Fragmentação dos genes originais com DNaseI. D. Amplificação dos genes mutantes.
Os genes mutantes foram introduzidos no fagomídeo pCOMB3X, clonados em E. coli XL1 Blue, obtendo uma biblioteca combinatória de genes cry mutantes com 105 transformantes. Estes genes
foram submetidos à seleção por Phage display utilizando como ligantes as BBMV do intestino do bicudo do algodoeiro e/ou as BBMV do intestino de S. frugiperda. Até o momento foram selecionados aleatoriamente 21 genes cry mutantes para A. grandis e 16 para S. frugiperda após o terceiro e quarto ciclo de seleção, respectivamente. Os genes mutantes foram expressos para avaliação em bioensaios (Fig. 2 A e B e Fig. 3), e apresentaram variabilidade na taxa de mortalidade, como esperado.
A tecnologia do DNA shuffling vem sendo disseminada com sucesso no meio científico, e trata-se de uma ferramenta poderosa para a construção de bibliotecas combinatórias de genes mutantes, cujo produto resulta na produção de grande variedade de novos genes e permite a seleção das proteínas com características desejadas, segundo critérios previamente estabelecidos. Na agricultura, a tecnologia do DNA shuffling permite o melhoramento de genes que poderão solucionar problemas específicos, tais como o desenvolvimento de resistência a estresse biótico e/ou abiótico. Exemplos clássicos do emprego desta metodologia, na seleção de genes com características importantes como atividade inseticida, já foram relatados no melhoramento de genes cry, onde Lassner e Bedbrook (2001) obtiveram uma biblioteca de genes cry que codificam toxinas Bt com incremento na atividade de até 3,8 vezes, quando comparados com os genes parenterais precursores da biblioteca combinatória.
Figura 2: A. Diferentes níveis de toxicidade de proteínas melhoradas sobre larvas de A. grandis. B. Diferentes níveis de toxicidade de proteínas melhoradas sobre larvas de S. frugiperda.
0 10 20 30 40 50 60
pCOMB CRY3 CRY8 S28 S53
M o rtal id ad e (% ) 0 10 20 30 40 50 60 70 pC O M B Cr y3 Cr y8 B2 B5 B16 B19 B31 B34 B35 B42 B46 B60 B89 B94 B100 B114 B116 B124 B141 B144 B145 % Mor ta lida d e A B A B C D E
Figura 3: Aspectos dos bioensaios com larvas de A. grandis. A e B. Larvas de bicudo do algodoeiro desenvolvidas em dieta artificial contendo toxinas Cry melhoradas. C, D e E. Diferentes fases do bioensaio com larvas de bicudo do algodoeiro.
CONCLUSÃO
Os resultados preliminares apresentaram variabilidade na taxa de mortalidade das larvas dos insetos testados.Espera-se, ao final, do trabalho ter selecionado genes cry melhorados que
codificam para toxinas Bt com maior atividade e especificidade contra as pragas do algodoeiro, com enfoque ao bicudo do algodoeiro e a lagarta do cartucho do milho, a fim de aplicá-los no Programa de Melhoramento do Algodão.
(*) Trabalho financiado por: Facual, Fialgo, CNPq e Embrapa.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BETZ, F. S.; HAMMOND, B. G.; FUCHS, R. L. Safety and Advantages of Bacillus thuringiensis-Protected Plants to Control Insect Pests. Regulatory Toxicology and Pharmacology, v. 32, p. 156-173, 2000.
BIBER, J.; STIEGER, B.; HAASE, W.; MURER, H. A high yield preparation for rat kidney brush border membranes different behaviour of lysosomal markers. Biochimica et Biophysica Acta, v. 647, p.169-176, 1981.
JAMES, C. Situação global da comercialização de lavouras geneticamente modificadas (GM): 2004. (www.isaaa.org – acessado em 29/05/2005).
LASSNER, M.; BEDBROOK, J. Directed molecular evolution in plant improvement. Current Opinion in Plant Biology, v.4, p.152-156, 2001.
MAAGD, R. A.; BRAVO, A.; CRICKMORE, N. How Bacillus thuringiensis has envoved specific toxins to colonize the insect world. TRENDS in Genetics. 17,193-199, 2001.
MONNERAT, R.G.; DIAS, S.C.; OLIVEIRA NETO, O.B.; NOBRE, S.D.; SILVA-WERNECK, J.O.; GROSSI DE SÁ, M.F. Criação massal do bicudo do algodoeiro Anthonomus grandis em laboratório. Comunicado Técnico/Embrapa, v.46, p.1-4, 2000.
PERLAK, F. J., STONE, T. B., MUSKOPF, Y. N., PETERSEN, L. J., PARKER,G. B., MCPHERSON, S. A., WYMAN, J., LOVE, S., REED, G., BIEVER, D., FISCHHOFF, D. A. Genetically improved potatoes: protection from damage by Colorado potato beetles. Plant Molecular Biology, v. 22, 313-321,1993. SMITH, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, v. 228, p.1315-1317, 1985.
STEMMER, W. P. C. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proceeding of the National and Academy Science of the United States of America, v. 91, p.10747-10751, 1994.
