GRUPO DE DESENVOLVIMENTO DE RECURSOS HUMANOS-GDRH CENTRO DE FORMAÇÃO DE RECURSOS HUMANOS PARA O SUS
“Dr. Antonio Guilherme de Souza”
SECRETARIA DE ESTADO DA GESTÃO PÚBLICA
PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL - PAP
Gabriela Gomes Rivera
Vírus da Diarreia Viral Bovina -2 (BVDV-2): ocorrência em bovinos e suínos criados na mesma propriedade.
Monografia apresentada ao Programa de Aprimoramento Profissional - SES-SP, elaborada no Hospital Veterinário da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP - Jaboticabal. Medicina Veterinária e Saúde Pública
Jaboticabal - SP 2016
Agradeço...
Primeiramente, à Deus e Nossa Senhora da Aparecida por estarem comigo nesta jornada me amparando em todos os momentos.
Aos meus pais (Margarete e Antonio), por todo amor, carinho, dedicação e confiança. Amo vocês.
Aos familiares por cada oração e pensamento positivo.
Aos avós (Ida, Luiz, Mafalda e Antônio). Todos lá do Céu me cuidando.
Aos meus Mestres, que foram essenciais na minha formação profissional e pessoal.
Pelos muitos ensinamentos, conselhos, estímulos, oportunidades e amizade meus agradecimentos especiais ao meu orientador Prof. Dr. Luis Guilherme, ao Prof. Dr. Paulo Aléscio Canola e Profa. Dra. Annelise Carla Camplesi
Aos meus irmãos de residência, que foram sensacionais. Minha segunda família. À Vanessa irmã–amiga. Amizade pra vida toda.
À Dabinha, meu anjo da guarda.
À República Chumbo Grosso (Vanessa, Jyan, Bruna e Dabinha) .
Aos amigos que para cada conquista vibraram comigo. Tenho sim os melhores amigos
Alunos, estagiários, pós-graduandos e ferradores, pelo respeito e ajuda.
Aos pós-graduandos Henrique, Igor, Jyan, Nathan, Daniele, Karla, aluno Jeferson, proprietário e funcionários das fazendas pela imensa colaboração no desenvolvimento desse trabalho.
Aos proprietários pela confiança; funcionários do Hospital Veterinário por toda paciência e amizade.
À FCAV Câmpus de Jaboticabal pelo acolhimento nesses bons anos.
Ao Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel” por ter me recebido e permitido praticar a Medicina Veterinária e aos departamentos da FCAV pelo apoio.
Aos animais, por toda forma de carinho e de ensinamento..
À minha égua Karina que me motivou a nunca desistir das “Cólicas Equinas”. E para todo e qualquer animal, meus sinceros agradecimentos.
Simplesmente único. Levo esses dois anos com muito carinho
RESUMO ... ABSTRACT ...
1. INTRODUÇÃO ... 9
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 14
2.1 BVD no rebanho bovino ... 14
2.2 A infecção pelo BVDV no rebanho suíno ... 17
3. HIPÓTESES ... 19
4. OBJETIVOS ... 19
4.1 Objetivo geral ... 19
4.2 Objetivos específicos ... 19
5. MATERIAIS E METODOS ... 20
5.1 Formas de colheita para os bovinos e suínos ... 21
5.2 Análise laboratorial das amostras ... 22
5.2.1 Técnica de Virusneutralização ... 23
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 25
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 29
8. CONCLUSÃO ... 29
Figura 1. A) Colheita de sangue na veia jugular de bovino leiteiro na fazenda A. B) Colheita de sangue de bovino de corte na veia coccígea na fazenda B. . 22
Tabela 1. Ocorrência do BVDV-2 em bovinos leiteiros, nas diferentes faixas etárias da fazenda A. ... 25 Tabela 2. Ocorrência do BVDV-2 dos suínos, nas diferentes fases, da fazenda A. ... 26 Tabela 3. Ocorrência do BVDV-2 nos bovinos de corte, nas diferentes faixas etárias da fazenda B. ... 26 Tabela 4. Ocorrência do BVDV-2 dos suínos, nas diferentes fases, da fazenda B. ... 26
% ºC CO2 Border disease BVD BVDV BVDV – 1 BVDV – 1b BVDV – 2 CP DM ECP ELISA FCAV G Kb µg µL MAPA MEM MDBK mL mm NCP nm OIE PCR PI PIBIC PSC RNA SFB SP UI UNESP VN VPSC Porcentagem Graus Celsius Dióxido de carbono Doença das fronteiras Diarreia Viral Bovina
Vírus da diarreia viral bovina
Vírus da diarreia viral bovina, do tipo 1
Vírus da diarreia viral bovina, do tipo 1, subtipo b Vírus da diarreia viral bovina, do tipo 2
Citopático
Doença das Mucosas Efeito Citopático
Ensaio imunoenzimático
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Gauge
Quilobyte Micrograma Microlitro
Ministério da Agricultura e Pecuária e Abastecimento Meio Mínimo Essencial
Madin Darby Bovine Kidney Mililitro
Milímetro Não citopático Namomêtro
Organização Mundial da Saúde Reação de polimerase em cadeia Persistente Infectado
Programa Institucional de Bolsa de Iniciação Peste Suína Clássica
Ácido Rinonucléico Soro Fetal Bovina São Paulo
Unidades Internacionais
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Virusneutralização
RESUMO
A Diarreia Viral Bovina (BVD) é considerada uma doença de grande impacto na pecuária mundial devido às perdas produtivas associadas à esta infecção. O vírus é capaz de infectar uma grande variedade de ruminantes e os suínos, porém os ruminantes são considerados reservatórios. O presente estudo teve como objetivo averiguar a ocorrência de anticorpos contra o Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV), biotipo 2, em suínos e bovinos criados na mesma propriedade. Foram selecionadas duas fazendas com criação de suínos e bovinos, onde foram retiradas amostras de sangue de suínos e bovinos em diferentes faixas etárias. Foi utilizado a técnica de virusneutralização (VN) como um teste diagnóstico. Os resultados indicaram uma ocorrência de anticorpos neutralizantes de BVBV-2 na fazenda de aptidão leiteira de 69,09% nos bovinos e de 2,44% nos suínos. Já na fazenda de aptidão de corte obteve-se uma ocorrência de 1,75% nos bovinos e nula nos suínos. Os resultados indicaram que o sistema de criação utilizado em cada fazenda pode influenciar a disseminação do vírus entre os animais da mesma espécie, no caso dos bovinos, e entre as espécies, nos caso dos bovinos para os suínos. A fazenda de aptidão leiteira possuía um manejo do tipo semi-intensivo e a fazenda de aptidão de corte possuía um manejo do tipo extensivo. Os animais mais velhos nas propriedades apresentaram uma alta ocorrência de BVDV-2. Esse fato pode ser explicado devido ao tempo de exposição ao patógenos quando comparado com os animais mais novos. Entretanto observou-se que os bezerros, principalmente da fazenda de aptidão leiteira, apresentaram uma alta ocorrência de anticorpos, visto que o leite é considerado um dos meios de infecção na espécie bovina. Como os animais adultos apresentavam uma alta ocorrência esperava-se que os animais mais jovens dessa mesma espécie apresentasse uma ocorrência significativa, o que foi confirmado. Também nesse estudo foi possível afirmar que a infecção dos suínos está intimamente ligada a ocorrência presente nos ruminantes. Medidas preventivas ser instituídas nessas propriedades, assim como a identificação e eliminação dos animais persistentes infectados (PI), a realização de quarentena, uso de vacinações e a adoção de medidas de biossegurança. Além do mais o uso de matérias estéreis, utilizados várias vezes em diferentes animais, como o uso de agulhas, pode facilitar a disseminação do BVDV assim como outras doenças infecciosas. Os dados obtidos auxiliaram na obtenção de dados epidemiológicos da doença, visto que a mesma possui uma prevalência significativa no rebanho bovino brasileiro, assim como em outras espécie. Além do mais esse estudo auxiliará na elaboração de programas de prevenção, principalmente em propriedades que possuem uma diversificação de espécies criadas no mesmo espaço, como exemplo do trabalho realizado.
Palavras-chaves: Diarreia Viral Bovina, epidemiologia, Pestivirus, sorologia, virusneutralização,
ABSTRACT
Bovine Viral Diarrhea (BVD) is considered a disease of great impact on the brasilian livestock. The loss of production was associated with this infection. The virus has a competence of infecting a wide variety of ruminants, and pigs, but cattle are considered their reservoirs. This study aimed to investigate the occurrence of antibodies to BVDV, biotype 2, pigs and cattle raised on the same farm. Two farms were selected with the pig and cattle creations, so blood samples of pigs and cattle were obtained from different age groups. Virus neutralization (VN) was used as a diagnostic test in order to detect neutralizing antibodies to the Bovine Viral Diarrhea Virus type 2 (BVDV-2). The results showed the occurrence of BVBV-2 neutralizing antibody in the dairy farm 69.09% in cattle and 2.44% in swine. In the beef cattle farm obtained an incidence of 1.75% in cattle and pigs was zero. The results indicated that the build system used in each farm can influence the spread of the virus among animals of the same species, in the case of cattle, and among species, in the case of cattle for pigs. The dairy farm had a management of semi-intensive and the beef cattle farm had a management of the extensive. Older animals on the properties showed a high incidence of BVDV-2. This effect can be explained by the duration of exposure to pathogens when compared with younger animals. However it has been observed that cattle, especially of the dairy farm, showed a high incidence of antibodies, since the milk is considered a means of infection in bovine species. As adult animals had a high occurrence was expected that the younger animals of the same species present a significant occurrence, which was confirmed. Also in this study, we could say that the infection of swine is relatively connected to the occurrence in ruminants. The preventive measures should be imposed on those properties, as well as the identification and removal of persistent infected (PI) animals, conducting quarantine, use of vaccinations and adoption of biosecurity measures. Furthermore the use of sterile materials used several times in different animals, such as use of needles can facilitate the spread of BVDV as well as other infectious diseases. The data assisted in obtaining epidemiological data on the disease since it has a significant prevalence among Brazilian cattle, as well as other species. Moreover this study will help in the development of prevention programs, especially in properties that have a diversity of species created in the same space as an example this study.
Keywords: Bovine Viral Diarrhea, epidemiology, Pestivirus, serology, virus neutralizatization
1. INTRODUÇÃO
A Diarreia Viral Bovina (BVD) é considerada uma doenças de grande impacto financeiro na pecuária mundial, visto que é um dos principais patógenos em termos de doença aguda e perdas fatais que atinge milhares de propriedades (BRODERSEN 2014, LANYON; REICHEL 2014), sendo assim, atualmente, estão em vigor vários programas nacionais e regionais ao redor do mundo voltado para o controle da BVD (LANYON; REICHEL 2014).
A infecção e as enfermidades associadas ao Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV) têm sido descritas no Brasil desde os anos 60. Diversos relatos sorológicos, clínico-patológicos e de isolamento do agente demonstram a ampla disseminação da infecção no rebanho bovino brasileiro (FLORES et al. 2005). Somente em 1974, Vidor (1974) e colaboradores conseguiram isolar o agente etiológico da Diarreia Viral Bovina (BVD) a partir do sangue de feto bovino coletado em matadouro no Rio Grande do Sul.
O BVDV pertence ao gênero Pestivirus da família Flaviviridae (VIRUS TAXONOMY 2012). Existem outras espécies de Pestivirus reconhecidas como: o vírus causador da doença da fronteira (border disease) e o vírus da peste suína clássica (VPSC) relacionado à peste suína clássica (PSC). Os Pestivirus que infectam os ruminantes, ocasionalmente podem infectar os suínos e, se o faz é de forma subclínica, podendo resultar em reação cruzada com o diagnóstico sorológico da PSC (MOENNING 2015). O conhecimento da diversidade dos Pestivirus é imprenscindível para os programas de controle e desenvolvimento de vacinas além de determinar as prováveis fontes de infecção (WEBER et al. 2014).
O BVDV é capaz de infectar uma grande variedade de ruminantes domésticos e silvestres, além de suínos. Os bovinos são considerados seus reservatórios. Alguns estudos confirmaram a soropositividade para o BVDV em suínos (ROEHE et al. 1998; FLORES et al. 2005), caprinos, ovinos, bubalinos e javalis (FLORES et al. 2005).
Os pestivírus são vírus pequenos (40 e 60nm), envelopados e contêm uma molécula de ácido rinonucléico (RNA) linear, fita simples, não segmentado, polaridade positiva de aproximadamente 12,5kb como genoma (HORZINEK 1991), sendo assim traduzida em uma única poliproteína que sofre clivagem, originando entre 10 a 12 polipeptídios estruturais e não estruturais (BAKER 1995).
Dentre as diversas características dos Pestivirus, a mais marcante é o seu elevado grau de variabilidade antigênica, principalmente, entre as amostras do BVDV (ROEHE et al. 1998), sobretudo na região da glicoproteína E2, região que reflete maior variabilidade na partícula viral, cujos epítopos possuem uma região de hipervariabilidade responsáveis pela alta freqüência de mutações e recombinações genéticas observada no referido virus (BAKER 1995) além disso são regiões responsáveis pela indução de anticorpos neutralizantes contra o virus da BVDV-1 e 2 (BOTTON et al. 1998), os quais são os dois grupos antigênicos que foram identificados. Conforme diferenças genéticas e antigênicas, foi proposta uma subdivisão do genótipo 1 em 11 subgrupos, sendo o 1a predominante em quadros de infecção respiratória e BVDV-1b mais comum em infecções fetais de estágios gestacionais tardios. O genótipo BVDV-2 também foi classificado em, pelo menos dois subgrupos diferentes (FLORES et al. 2005).
No Brasil, amostras de BVDV-2 já foram isoladas em muitos casos clínicos assim como em fetos bovinos saudáveis e, além disso, foram feitos estudos sorológicos que indicam que a infecção está disseminada no rebanho bovino do país (FLORES et al. 2000b). Aparentemente, a prevalência de BVDV-2 na América do Sul é mais elevada do que a relatada na América do Norte (RIDPATH et al. 2000), na Europa (STRONG et al. 2013), Ásia (DENG et al. 2012) e na Austrália (RIDPATH et al. 2010). Segundo Weber et al. (2014), em estudos de animais infectados com idade entre seis meses a um ano no sul do Brasil, observaram uma elevada prevalência de BVDV-2 em comparação com outros países. O genótipo BVDV-2 não é sinônimo de alta virulência, pois uma parcela significativa desses vírus tem sido isolada de infecções subclínicas, de animais persistentemente infectados (PI), e como contaminantes de soro fetal bovino e vacinas (RIDPATH et al. 2000).
Em termos gerais, as taxas de prevalência da BVD variam entre países e entre diferentes regiões geográficas de um mesmo país. Essa variação depende de alguns fatores, tais como densidade animal, aptidão do rebanho (leiteiro ou corte), sistema de criação (intensivo, semi-intensivo ou extensivo), programa de vacinação, práticas de manejo e medidas de biossegurança adotadas por cada propriedade (PACHECO 2010). Segundo estudos de Weber et al. (2014), sugerem que um programa de controle do BVDV baseado apenas em investigações de bovinos não será bem sucedida em regiões onde as explorações abrigar vários espécies de animais.
Considerando o efeito de replicação em cultivos celulares, o BVDV é constituído de dois biótipos; um não citopático (NCP) e outro citopático (CP). Sendo que o efeito citopático ocasiona alterações morfológicas durante a sua
replicação que levam a lise celular, ocasionando o óbito do animal entre 24 e 36 horas depois do inicio do processo de replicação viral. Já a versão citopática não causa nenhuma alteração celular durante a replicação, permitindo sua viabilidade. A maioria dos isolados caracterizados pertence ao genótipo do biótipo NCP, embora vários isolados do biótipo CP já tenham sido identificados (FLORES et al. 2005).
A grande diversidade antigênica observada entre estirpes isoladas do BVDV possui significado especial para epidemiologia, diagnóstico, estratégias de imunização e controle da enfermidade (RIBEIRO 2009).
A patogenia depende vários fatores, sendo que alguns fatores hospedeiro influenciam na consequência da infecção da BVD: hospedeiro imunocompetente ou imunotolerante ao vírus, idade do animal, infecção transplacentária e idade gestacional do feto, indução de tolerância imune no feto e o surgimento de competência imunofetal, e fatores estressantes (RADOSTITS et al. 2002).
Os animais portadores, eliminam o vírus na descarga nasal, no leite, na urina e na saliva. O vírus penetra no organismo pelas vias nasais e oral; multiplica-se nas células epiteliais das tonsilas e no tecido linfóide de boca e laringe. Logo em seguida atinge a corrente sanguínea pelos vasos linfáticos. Muitas concentrações do vírus aparecem nas vias respiratórias, no baço, nos linfonodos, nas glândulas salivares e em outros (MARQUES 2009).
A infecção de animais susceptíveis pelo BVDV pode resultar em uma grande variabilidade de manifestações clínicas, que incluem desde infecções subclínicas, respiratórias, gastrointestinais, reprodutivas, doenças das mucosas
(DM), síndromes hemorrágicas e imunodepressão (SAMARA; DIAS 2003; FLORES et al. 2005, PASSLER; WALZ 2010).
O diagnóstico da BVD é realizado por meio da detecção de antígenos e da detecção de anticorpos específicos. O isolamento do vírus em cultivo celular seria a melhor maneira de identificar os animais infectados, entretanto, o diagnóstico pode ser feito também pelas técnicas de soroneutralização, imunoflorescência, imunoperoxidase, reação de polimerase em cadeia (PCR) e ensaio imunoenzimático (ELISA) (SAMARA; DIAS 2003, PILZ 2005).
Infecções por BVDV causam significativas perdas econômicas para produção. Dessa forma, torna-se imprescindível o estabelecimento de um programa de controle e monitoramento de propriedades pecuárias baseado na combinação entre medidas de biossegurança e biocontenção da doença. Segundo Radostits et al. (2007), adoção de uma série de medidas profiláticas é essencial para o sucesso de programas de controle e prevenção para a BVD. A identificação e eliminação de animais PI nos bovinos, realização de quarentena para animais recém-adquiridos, independente da espécie e o uso de vacinação na espécie bovina, em casos específicos, podem ser medidas imprescindíveis para reduzir os casos de BVD nos bovinos e em outras espécies (LANYON; REICHEL 2014). Segundo estudos de Weber et al. (2014) estes sugerem que um programa de controle do BVDV baseado apenas em investigações de bovinos, não será bem sucedido em regiões onde as explorações abrigam várias espécies de animais.
Embora a especialização das criações esteja cada vez mais presente no país, ainda existem diferentes tipos de criações em uma única propriedade, o que eleva assim a ocorrência de determinadas doenças entres as diferentes
espécies, como a BVD, visto que é uma doença capaz de infectar tanto os bovinos e consequentemente suínos, causando sérios prejuízos econômicos. Este trabalho contribuirá com informações sobre a epidemiologia desta enfermidade entre os bovinos de diferentes tipos de criações, de leite e de corte, e suínos, criados em uma mesma propriedade, com destaque para o BVDV-2, por ter uma prevalência maior no território brasileiro.
2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 BVD no rebanho bovino
A infecção pelo BVDV está amplamente difundida no rebanho bovino brasileiro (FLORES et al. 2000a, SAMARA; DIAS; MOREIRA 2003). É uma doença infecciosa que possui uma patogenia complexa (CANÁRIO et al. 2009), pois causa uma grande variedade de manifestações clínicas, que vão desde formas subclínicas até a forma fatal, conhecida como doença das mucosas (DM) (BAKER 1995, LARSON 2015).
Enfermidades gastroentéricas ou respiratórias, doença hemorrágica, perdas reprodutivas devido à infertilidade temporária, mortalidade embrionária, abortos ou mumificações fetais, malformações, natimortos ou o nascimento de bezerros fracos e inviáveis podem ser decorrente da infecção pelo BVDV, ocasionando sérios prejuízos econômicos (BAKER 1995).
O BVDV está associado a um complexo de doenças respiratórias dos bovinos. Embora seja ocasionalmente um agente patogênico primário, existe um impacto na imunidade dos animais. Além do mais, existe um sinergismo presente com outros agentes patogênicos (LARSON 2015).
infecção dependente do estado imunológico do animal. De acordo com a fase de infecção da gestação é perceptível sequelas como: falha de concepção, aborto e uma variedade de malformações congênitas (NEWCOMER et al. 2015).
A transmissão vertical ocorre devido à capacidade do vírus de atravessar a placenta e infectar o feto ainda não imunocompetente. Infecções fetais ocorridas durante o primeiro trimestre de gestação resultam em morte embrionária ou fetal seguida de absorção, mumificação ou abortamento. Já entre o 45 e 125 dias de gestação, de forma que seu sistema imunológico não é capaz de responder a infecção, então o vírus continua a multiplicar-se, gerando assim os animais persistentemente infectados (PI). Estes são bezerros que mostram crescimento retardado e excretam quantidades variáveis de vírus por toda a vida, ocasionando a propagação da infecção no rebanho. Bezerros PI geralmente morrem durante os dois primeiros anos de vida da doença das mucosas (DM) ou devido a outras doenças, mais provavelmente como uma consequência da depressão imune induzida por vírus (FLORES et al. 2005, CANÁRIO et al. 2009, MACLACHLAN; DUBOVI 2011, FINO et al. 2012). Infecções ocorridas após 150 dias de gestação resultam em animais imunocompetentes, capazes de desenvolver uma resposta efetiva contra o vírus e eliminá-lo do organismo. Logo, esses bezerros nascem com anticorpos contra BVDV, mas livres do vírus. Os efeitos da infecção em estágios gestacionais tardios ainda não foram bem documentados, entretanto, abortamentos e nascimentos de animais fracos ou inviáveis já foram relatados (Radostits et al. 2007).
altíssima letalidade (quase 100%). Atinge bovinos entre 6 meses e 2 anos de idade e geralmente tem curso agudo. Na forma aguda, observase febre (40 -41 ºC), salivação, descarga nasal e ocular, diarreia profusa hemorrágica e úlceras nas narinas, boca, olhos, espaço interdigital. As lesões ulcerativas são encontradas na mucosa do trato digestivo. Laminite e coronite podem ser observadas. É necessário realizar o diagnóstico diferencial da forma trombocitopênica de outras enfermidades hemorrágicas como a intoxicação aguda por Pteridium aquilinum (MAPA 2009). Importante salientar que é um tipo de doença que deve ser averiguada como diagnóstico diferencial de Febre Aftosa, conforme o plano de Ação para Febre Aftosa do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (2009).
A transmissão horizontal pode ocorrer pelo contato direto entre animais, principalmente pelas mucosas, o que inclui o coito. Já no contato indireto inclui o contato com secreções (aerossóis nasais, oculares, saliva, leite e sêmen), excreções e fômites contaminados (FLORES et al. 2005, FINO et al. 2012).
Em regiões onde a infecção pelo BVDV é endêmica, é recomendada a vacinação de rebanhos para minimizar os surtos. De modo geral, a vacinação é indicada em rebanhos com sorologia positiva ou histórico de doença clínica ou compatível. A vacinação também é indicada em locais de alta rotatividade, visto que vários animais são reunidos em um mesmo local de diferentes procedências (FLORES 2003). No Brasil, somente vacinas inativadas com adjuvantes oleosos ou hidróxido de alumínio estão disponíveis para a imunização contra BVDV (LANYON; REICHEL 2014).
Entretanto no exterior é utilizado também as vacinas vivas atenuadas ou modificadas, as quais são capazes de induzir uma resposta imune satisfatória e
duradoura, que persiste, por mais de um ano após a vacinação. Algumas desvantagens como falhas vacinas por estocagem e acondicionamento equivo-cado do produto biológico, a possibilidade de reversão de virulência e surtos de DM pós-vacinais, transmissão viral via transplacentária e infecção fetal produzindo abortamentos ou teratogenia limitam o uso desse tipo de vacina, principalmente em fêmeas gestantes (FINO et al. 2012).
2.2 A infecção pelo BVDV no rebanho suíno
A incidência da infecção por BVDV em rebanhos suínos tem crescido substancialmente nos últimos anos, causando perdas econômicas na indústria mundial da suinocultura (TAO et al. 2013). As maiores fontes de BVDV na infecção de suínos são os bovinos, sendo relatadas altas taxas de soroconversão em suínos localizados perto de fazendas de gado (PASSLER; WALZ 2010). Outra fonte de BVDV pode ser a alimentação dos suínos com leite e soro de leite ou restos de carne bovina (STEWART; CARBREY; JENNEY 1971).
Os suínos são suscetíveis a infecções por diversas espécies de Pestivirus que podem causar perdas na produtividade, confundir o diagnóstico e causar sinais clínicos. Infecção por BVDV em suínos geralmente desenvolve de forma subclínica, permitindo ao vírus se disseminar no rebanho sem detecção. Porém, em alguns casos os sinais clínicos são semelhantes à PSC (TAO et al. 2013), com anemia, pelagem áspera, crescimento retardado, tremores, conjuntivite, diarreia, poliartrite, petéquias na pele e cianose de orelha (TERPSTRA; WENSVOORT 1988). A infecção de fêmeas por outros Pestivirus também está associada a problemas reprodutivos, baixa taxa de concepção, abortos e morte de neonatos (LIESS; MOENNIG 1990).
O vírus da PSC é um agente de notificação obrigatória para a Organização Mundial de Saúde Animal (OIE); contudo, a infecção pelo BVDV em suínos pode cursar com quadro semelhante em algumas situações e causar confusão no diagnóstico dependendo do método empregado (MÓSENA 2014).
Vários trabalhos relatam a ocorrência da infecção pelo BVDV na população suína (LIESS; MOENNIG 1990, LEFORBAN et al. 1992, PASSLER; WALZ 2010, TAO et al. 2013), logo, é imprescindível o diagnóstico diferencial para PSC. A especificidade e sensibilidade associada à rapidez dos resultados laboratoriais são necessárias para confirmar uma suspeita de PSC (WIERINGA- JELSMA; QUAK; LOEFFEN 2006).
Sabe-se que a transmissão entre espécies do BVDV aos suínos comumente requer contato direto com ruminantes, entretanto alguns autores alegam que a transmissão do BVDV entre suínos não ocorre (BECHENHAUER et al. 1961, LEFORBAN et al. 1992). O fato é que a relação de transmissão entre suínos ainda permanece desconhecida (TAO et al. 2013). A contaminação de soro fetal bovino utilizado em culturas celulares também pode contaminar as vacinas provenientes delas, sendo uma fonte importante e relatada em vários casos de inoculação em rebanhos suínos. (MÓSENA 2014).
A transmissão do BVDV entre suínos é limitada e o vírus pode desaparecer de um rebanho caso não haja nova introdução (WIERINGA-JELSMA; QUAK; LOEFFEN 2006). Logo a maneira mais efetiva de manter rebanhos comerciais livres ou controlados em relação a agentes de enfermidades de impacto econômico e evitar efeitos negativos à produtividade e/ou saúde pública (zoonoses) é através da utilização de programas de biossegurança, que deverão contemplar todos os aspectos gerais da medicina veterinária
preventiva, bem como conter aspectos exclusivos direcionados a cada sistema de produção em particular. A introdução de uma doença em um país, uma região, um sistema ou rebanho é um dos grandes riscos operacionais a que a suinocultura está exposta, como no caso a BVD, podendo resultar em problemas com impactos técnicos, econômicos (BARCELLOS et al. 2008)
3. HIPÓTESES
Nesse estudo espera-se obter como resultados:
- alta prevalência de BVDV-2 em gados leiteiros quando comparado com o gado de corte;
- animais mais velhos com uma maior ocorrência de anticorpos neutralizantes do BVDV – 2;
- bezerros com uma maior ocorrência de anticorpos neutralizantes do BVDV – 2;
- correlação da ocorrência de suínos infectados nas diferentes idades relacionada à alta prevalência em ruminantes na mesma propriedade
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
Estudar a ocorrência do BVDV-2 em rebanhos bovinos leiteiros e de corte e suínos criados na mesma propriedade.
4.2 Objetivos específicos
• Estudar a ocorrência de anticorpos contra o BVDV-2 presente nas diferentes idades na criação de bovinos e suínos;
suínos e bovinos leiteiros e de corte
5. MATERIAIS E METODOS
Cinco granjas de suínos foram selecionadas aletoriamente para aquisição das amostras suínos. As granjas selecionadas possuem caráter comercial com o tamanho mínimo de 200 matrizes em reprodução, as quais possuem um sistema intensivo de produção, ciclo completo, independente e possuem manejo all-in/all-out ou fluxo contínuo.
Para a obtenção das amostras dos bovinos foram selecionadas duas granjas, as quais possuíam a criação de bovinos na mesma propriedade. A fazenda A possui aproximadamente 140 bovinos aptidão leiteira com caráter comercial, a qual possuí um sistema de criação semi-intensivo diário com grande parte dos animais do rebanho, como alimentação, ordenha e manipulação dos bezerros diariamente. A fazenda B possui aproximadamente 50 bovinos de aptidão de corte com um sistema de criação extensiva. Os animais eram manejados poucas vezes ao ano, o que englobava vacinação, vermifugação, manejo com os bezerros e separação para venda de determinados animais.
Nas fazendas selecionadas foram coletadas as amostras de sangue das diferentes fases de criação, tanto dos suínos como dos bovinos. Para cada categoria de suínos foi determinado um número fixo de 30 amostras por grupo, sendo fêmeas reprodutoras, leitões da maternidade, leitões da creche e suínos no crescimento/terminação. No caso dos bovinos foi instituído aproximadamente 50 amostras no total para as diferentes idades dos bovinos, sendo de 0 – 365 dias, 365 – 730 dias e 730 – 1095 dias. O número de
amostras estipulado nos bovinos foi decorrente disponibilidade da obtenção das amostras de apenas as vacas em tratamento e no período seco de lactação e os animais mais jovem. As vacas em lactação não foram disponibilizadas devido ao estresse que poderia ser ocasionado e assim influenciar na produção leiteira. Já na Fazenda B era a quantidade de bovinos que eram criados na mesma propriedade dos suínos.
5.1 Formas de colheita para os bovinos e suínos
As amostras foram coletadas na propriedade, durante as visitas realizadas nas fazendas selecionadas. Foram coletadas amostras individuais de sangue dos bovinos e suínos e armazenadas separadamente em tubos coletores livres de anti-coagulante. Cada tubo foi identificado com o nome da fazenda e a identificação do animal. O sangue foi coletado por punção na veia jugular, nos bovinos de produção leiteira (figura 1-A) e nos suínos. Na fazenda B, de gado de corte, o sangue foi coletado por punção da veia coccígea (figura 1-B).
Para os bovinos foram utilizados agulhas para coleta múltipla de sangue a vácuo, medindo 25x7 (22G) acopladas em adaptador para coleta de sangue a vácuo e nos tubos coletores de sangue livre de anti- coagulante. Para as matrizes foram utilizadas agulhas descartáveis, específicas para coleta de sangue e de espessura 40 x 12 mm. Já para o leitões foram utilizadas agulhas de espessura 25 x 8 mm O sangue foi coletado em seringas plásticas com volume de 10 mL. Terminada a coleta a agulha foi desacoplada e o sangue foi transferido para tubos livres de anti-coagulante. Em todas as coletas, todos os tubos de ensaio com sangue foram transportados resfriados dentro de caixas térmicas com gelo reciclável até o laboratório.
No laboratório de Patologia Clínca do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária - FCAV – UNESP – Jaboticabal/SP, após a separação do soro por centrifugação, uma quantidade de 1,5 mL de soro foi retirada com uma pipeta automática e armazenada em microtubos plásticos do tipo Eppendorf®, em duplicata. Os microtubos com as amostras foram identificados e armazenados em freezer a -20ºC até sua utilização
Figura 1. A) Colheita de sangue na veia jugular de bovino leiteiro na fazenda A.
B) Colheita de sangue de bovino de corte na veia coccígea na fazenda B.
5.2 Análise laboratorial das amostras
O teste sorológico utilizado foi a virusneutralização (VN) para detecção de anticorpos neutralizantes para BVDV-2 citopático. Todas as amostras de soro sanguíneo, tanto nos suínos como nos bovinos, foram testadas em duplicata, com diluições sucessivas de 1:10 até 1:5.120 conforme preconizado pelo “Manual of Diagnostic Tests and Vaccines of Terrestrial Animals” (OIE 2009). Para tal, foram utilizadas células epiteliais de rim bovino da linhagem permanente “Madin Darby Bovine Kidney” (MDBK) e empregadas às estirpes
CP do BVDV-2 (VS-253). A execução do teste ocorreu no Laboratório de Viroses da Reprodução do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal - FCAV – UNESP – Jaboticabal/SP.
5.2.1 Técnica de Virusneutralização
O soro foi descongelado à temperatura ambiente e colocado no banho-maria à 56ºC durante 30 minutos, para inativação do complemento. As reações foram realizadas em placas de micro titulações descartáveis de poliestireno cristal com 96 cavidades, e o meio de manutenção Eagle-MEM, acrescido de 1% de uma solução de penicilina (10.000 UI/mL) e estreptomicina (10.000 µg/mL). Solução GibcoR foi utilizado para as diluições das amostras de soro.
Adotaram-se os seguintes procedimentos: nas cavidades da primeira coluna da placa, destinadas ao controle de suspensão celular, foram adicionados 100 µL de meio de manutenção Eagle-Meio Mínimo Essencial (MEM) ; nas cavidades da segunda coluna, destinadas ao controle de toxicidade das amostras de soro testadas, foram adicionados 90 µL de meio de manutenção Eagle-MEM e 10 µL de cada soro teste, de tal forma que a diluição final do controle de toxicidade do soro seja a mesma da primeira diluição testada (1:10). Nas cavidades da terceira coluna foram adicionados 80 µL de meio de manutenção Eagle-MEM e 20 µL da amostra teste, obtendo-se a diluição inicial 1:5 do soro.
Nas cavidades da quarta até a décima segunda coluna, correspondente as demais diluições do soro, foram adicionados 50 µL de meio de manutenção Eagle-MEM em todas as cavidades das respectivas colunas. Da coluna 3 que apresentava um volume de 100 µL em cada cavidade com diluição inicial 1:5, após a homogeneização, foram retirados 50 µL por cavidade e adicionados nas
cavidades da quarta coluna, procedimento que foi sucessivamente realizado até a décima segunda coluna, para a realização das diluições. Das cavidades da última coluna foram retirados 50 µL da diluição, e todas as cavidades correspondentes às diluições da amostra teste apresentavam o mesmo volume (50 µL).
Nas cavidades da terceira até a décima segunda coluna, que contém as diluições do soro, foram adicionados 50 µL da suspensão viral com 100 TCID50 do BVDV-2. Nas cavidades das duas primeiras colunas, que são destinadas ao controle da suspensão celular e ao controle de toxicidade do soro, não foi adicionada a suspensão viral. Após esta adição, as diluições finais das amostras de soro sanguíneo testadas passam a corresponder as diluições 1:10 até 1:5.120, respectivamente da terceira até a décima segunda coluna. A placa foi então incubada por 60 minutos em estufa a 37°C com atmosfera controlada contendo 5% de CO2.
Terminado o tempo de incubação, foram adicionados em todas as cavidades da placa 50 µL de uma suspensão de células MDBK contendo 300.000 células/mL em meio de manutenção Eagle-MEM com 10% de SFB. Em seguida, a placa foi novamente incubada em estufa a 37ºC com atmosfera controlada contendo 5% de CO2. Transcorridas 96 horas, foi feita a leitura da
placa em microscópio ótico invertido, primeiramente verificando as cavidades do controle da suspensão celular e do controle de toxicidade do soro teste, para em seguida verificar a presença ou não de efeito citopático (ECP) nas outras cavidades referentes às diluições das referidas amostras. Foram consideradas reagentes as amostras de soro sanguíneo que promovam neutralização total de 100 TCID50 do BVDV a partir da diluição 1:10. Os títulos
de anticorpos foram expressos como a recíproca da maior diluição em que foi verificada a neutralização viral, e o título final foi resultante da média geométrica dos títulos encontrados nas duplicatas.
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na fazenda A foram obtidos 70,69% animais positivos no rebanho bovino (Tabela 1) e 2,44% animais positivos no rebanho suíno (Tabela 2) para BVDV-2. Nos bovinos da fazenda A houve uma elevada ocorrência em todas as faixas etárias, destacando-se a fase adulta (730 – 1095 dias) que teve 100% de ocorrência (Tabela 1). Ainda na fazenda A obtiveram apenas animais positivos em fase de terminação (3,33%) e porcas (6,06%) positivas (Tabela 2). Na fazenda B foi obtido apenas 1,75% de animais positivo no rebanho bovino, sendo presente apenas na fase adulta (Tabela 3) e nenhum suíno positivo para BVDV-2 (Tabela 4).
Taela 1. Ocorrência do BVDV-2 em bovinos leiteiros, nas diferentes faixas etárias da fazenda A.
Classes (dias) Total de amostras Número de Positivos Ocorrência na classe (%) 0 – 365 365 – 730 730 – 1095 18 28 12 15 14 12 83,33 50 100 Total 58 41 70,69
Tabela 2. Ocorrência do BVDV-2 dos suínos, nas diferentes fases, da fazenda A.
Classe (dias) Total de amostras Número de Positivos Ocorrência na classe (%) 0 – 21 21 – 63 63 – 120 120 – 1825 30 30 30 33 0 0 1 2 0 0 3,33 6,06 Total 123 3 2,44
Tabela 3. Ocorrência do BVDV-2 nos bovinos de corte, nas diferentes faixas etárias da
fazenda B.
Classes (dias) Total de amostras Número de Positivos Ocorrência na classe (%) 0 – 365 365 – 730 730 – 1095 13 10 34 0 0 1 0 0 2,94 Total 57 41 1,75
Tabela 4. Ocorrência do BVDV-2 dos suínos, nas diferentes fases, da fazenda B.
Classes (Meses) Total de amostras Número de Positivos Ocorrência na classe (%) 0 – 21 21 – 63 63 – 120 120 – 1825 35 30 30 33 0 0 0 0 0 0 0 0 Total 125 0 0
Nas fazendas estudas não havia nenhum tipo de contato direto entre as espécies, embora se sabia que a transmissão entre espécies do BVDV-2 aos suínos comumente requer contato direto com ruminantes (BECHENHAUER et al., 1961; LEFORBAN et al., 1992). A distância entre as criações de bovinos e suínos, em ambas as fazendas, eram de aproximadamente 50 metros, sendo
uma medida de segurança requisitada pelos abatedouros de carne suína, como medida de biossegurança.
Durante o período da colheita das amostras foi observado a utilização dos mesmos funcionários tanto para o manejo dos bovinos, como dos suínos, o que tornaria o homem como principal veiculador do vírus, principalmente no fluxo dos bovinos para os suínos, de todas as fases, além dos bovinos para outros bovinos. A não especialização das fazendas resultou na seguinte situação, visto que não há mão de obra suficiente e presente para cada espécie, facilitando a transmissão de diversas doenças. Embora a via de transmissão esteja mais elucidada nos bovinos, entre os suínos ainda é um fato permanentemente desconhecido segundo os estudos de Tao et al. (2013).
Além do mais é necessário salientar a questão do homem no tipo de manejo em cada propriedade, visto que na fazenda A o manejo feito pelos funcionários com os bovinos era diário, facilitando a maior disseminação do vírus tanto para os suínos quanto no próprio rebanho, o que foi observado no estudo. Já na fazenda B os bovinos são manejados poucas vezes por ano, o que provavelmente reduz a disseminação principalmente entre nos suínos. Determinados funcionários que manejam os suínos diariamente são redirecionados para manejar os bovinos nos determinados dias pelos proprietários. Como normalmente o manejo dos bovinos é relativamente demorado, podendo levar um dia inteiro, os mesmos funcionários entram em contato novamente com os suínos apenas no dia seguinte, o que pode explicar a redução da ocorrência do BVDV-2 nos suínos nessas situações que condizem com os estudos de Pacheco (2010).
Nesse estudo também foi possível observar que tanto os bovinos como os suínos mais que permaneceram na granja por um tempo maior apresentaram maior ocorrência de infecções devido ao maior tempo de exposição a fatores de risco. Mesmo o número de amostras de bovinos na classe de 730 – 1095 dias sendo relativamente pequena, sugere-se que provavelmente os restos do rebanho, no caso dos animais adultos, possuíam uma ocorrência elevada também. Os bezerros foram mais afetados dos que os leitões, principalmente na fazenda A (Tabela 1 e 2). A hipótese de alta ocorrência de anticorpos neutralizantes de BVDV-2 nos bezerros (0 – 365 dias) foi também confirmada. Sugere-se que esse fato seja decorrente da alta ocorrência da BVD no rebanho dessa propriedade e assim elevando provavelmente a infecção nos animais mais jovens. Os leitões lactantes não foram afetados devidos provavelmente à baixa exposição e pelo fato de receberem imunidade passiva. Logo resume que a presença de ruminantes na propriedade amplificou a infecção nos animais em crescimento, elevando assim o número de infectados conforme o avanço da idade dos suínos. No presente estudo sugere novamente que os bovinos podem ser a fonte de infecção dos suínos, corroborando os estudos de Passler e Walz, 2010, mas não concluindo qual foi a via de transmissão, logo sugere que outros estudos sejam realizados para melhor compreensão da patogenia do vírus nessa situação.
Devido a elevada ocorrência de anticorpos neutralizantes de BVDV-2 na fazenda A nas fases de 0 – 365 dias, sugere estudos futuros para a identificação e consequente eliminação desse animais do rebanho, minimizando a eliminação do vírus e consequentemente reduzindo a infecção entre os bovinos e dos bovinos para os suínos.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A profilaxia da BVD nas propriedades é baseada na adoção de medidas de biossegurança, como a identificação e eliminação de animais PI nos bovinos, realização de quarentena para animais recém-adquiridos, independente da espécie e o uso de vacinação. No caso de criações mistas, local onde os mesmos funcionários são utilizados para ambas as espécies, é necessário a mudança de vestimenta e até mesmo a utilização de banhos.
A não especialização de muitas criações brasileiras e a falta de mão de obra específica para cada tipo de criação facilita o aparecimento de milhares de doenças interespecíficas, como a BVD entre bovinos e suínos. É importante que os produtores se conscientizem da presença do vírus e desenvolvam medidas preventivas para minimizar a dissipação do vírus nesse modelo de propriedade. É importante manter a conscientização dos proprietários para o uso de materiais estéreis, como seringa e agulhas, visto que é uma prática muito comum o uso da mesma seringa, principalmente de agulhas, para vários animais, o que aumenta a transmissão de doenças, como no caso a BVD, entre diferentes espécies, assim com o entre diferentes fases e idades em uma mesma espécie. As medidas indicadas poderão reduzir a incidência da BVD assim como inúmeras doenças nas propriedades.
8. CONCLUSÃO
Esse trabalho foi de extrema importância para obtenção da prática a campo. As visitas nas propriedades proporcionaram ao residente uma visão diferente dentro da Medicina Veterinária, mais prática e próxima da realidade encontrada fora dos “muros” da universidade, visto que a rotina do Hospital Veterinário
“Governador Laudo Natel”, FCAV, UNESP, Câmpus de Jaboticabal desenvolve seus atendimentos apenas dentro das estruturas da própria Universidade. Durante as visitas foi possível observar as condições de cada propriedade, dos animais, assim como as principais dificuldades e as doenças de maior ocorrência, e o manejo local. Essas informações agregaram ainda mais na grade profissional do residente.
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