UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E
ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DETECÇÃO DO VÍRUS DA CINOMOSE EM CÃES
NATURALMENTE INFECTADOS NO MATO GROSSO
Leticya Lerner Lopes
Cuiabá - MT 2014
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E
ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DETECÇÃO DO VÍRUS DA CINOMOSE EM CÃES
NATURALMENTE INFECTADOS NO MATO GROSSO
Autor: Leticya Lerner Lopes
Orientadora: Profª. Dr ª. Caroline Argenta Pescador Co-Orientador: Prof. Dr. Daniel Moura de Aguiar
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias,
Área de concentração: Sanidade de animais domésticos e silvestres, da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso para obtenção do
título de Mestre em Ciências Veterinárias.
Cuiabá - MT 2014
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por me dar saúde todos os dias e me permitir buscar os meus sonhos!
Agradeço aos meus pais pelo amor e educação!
Agradeço aos meus irmãos pela paciência e companheirismo.
Agradeço a profª Caroline pela oportunidade e confiança.
Agradeço aos amigos do Laboratório de Patologia Veterinária e Laboratório de Virologia pela cooperação e paciência.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado.
EPÍGRAFE
Disfarce o medo que lhe esconde o sorriso e deixe-o dormir sob as sombras que lhe perturbam. Ah! O medo de novo! Esse infeliz escudeiro é um mero aprendiz dos teus lábios, deixe-os percorrerem o desconhecido, esse amálgama que ladrilha o caminho, a estrada que personifica o medo, mas que nutre de sopro a vida e a faz incendiária!!!
RESUMO
O vírus da cinomose canina (VCC) é um vírus RNA, que pertence ao gênero
Morbillivírus e família Paramyxoviridae. A capacidade de resposta imune, assim
como sua virulência são fatores críticos para a invasão viral dos tecidos epiteliais e do sistema nervoso central (SNC). O VCC é o maior responsável pelas encefalites em cães, acometendo diversas idades. O objetivo desse estudo foi detectar o VCC nos cães com sinais neurológicos encaminhados para necropsia no Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT). Durante um período de um ano, 85% (68/80) dos cães necropsiados tinham lesões microscópicas compatíveis com encefalomielite causada pelo VCC. Desses, 67.6% (46/68) foram confirmadas positivas através da imuno-histoquímica (IHQ). Microscopicamente, as lesões do SNC foram classificadas em encefalite desmielinizante aguda em 15.2% (7/46) dos cães, em subaguda em 73.9% (34/46) e crônica em 10.8% (5/46) dos cães. O cerebelo foi principal órgão a apresentar marcação positiva na IHQ (97.8%). O VCC é responsável pelos sinais neurológicos em cães principalmente abaixo de um ano de idade. A cinomose demonstrou sua relevância dentro da população canina de Cuiabá, sendo necessário ao nosso entendimento, caracterizar a estirpe viral relacionada à região.
Palavras-chave: vírus da cinomose canina, gene H, imuno-histoquímica, sinais neurológicos, Brasil.
ABSTRACT
Canine distemper virus (CDV) is a RNA virus classified under the genus
Morbillivirus within the family of Paramyxoviridae. The time of onset of the immune
response and, likely, also the virulence of the virus are critical factors in the extent of viral invasion of epithelial tissues and of the central nervous system. The CDV is the most responsible of encephalitis in dogs from different ages. In this study, the aim was to detected CDV in dogs with neurologicals signs referred for necropsy at the Laboratory of Veterinary Pathology, Federal University of Mato Grosso (LPV-UFMT).Over a period of 1 year, 85% (68/80) of the dogs necropsied had microscopic lesions compatible encephalomyelitis by CDV. Which 67.6% (46/68) were confirmed by immunohistochemistry (IHC). Microscopically, the CNS lesions were classified demyelinating encephalitis in 15.2% (7/46) to acute, 73.9% (34/46) in subacute and 10.8% (5/46) to chronic. The cerebellum (97.8%) was the main target organ to verify positivity in the IHC. Canine distemper virus is a pathogen responsible for neurological clinical signs in dogs mainly under one year of age. Distemper demonstrated its relevance within the canine population of Cuiabá, being necessary to our understanding, characterizing the viral strain related to the region.
Keywords: Canine distemper virus, hemagglutinin (H) gen, immunohistochemistry, neurologic signs, Brazil.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 10
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 12
2.1 Vírus da Cinomose Canina 12
2.2.1 Histórico 12 2.2.2 Etiologia e Morfologia 14 2.2.3 Epidemiologia 15 2.2.4 Patogênese 16 2.2.5 Imunologia 18 2.2.6 Sinais Clínicos 19 2.2.7 Patologia 20 2.2.7.1 Achados Macroscópicos 20 2.2.7.2 Achados Microscópicos 21 2.2.8 Técnicas de Diagnóstico 23 2.2.8.1 Exame Hematológico 23 2.2.8.2 Swab ocular 23
2.2.8.3 Sorologia - ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay)
23
2.2.8.4 Detecção Molecular 24
2.2.8.5 Imuno-Histoquímica 24
2.2.9 Cinomose nas Demais Espécies Animais 25
3 MATERIAL E MÉTODOS 25
3.1 Animais do Estudo 25
3.2 Necropsia 26
3.3 Histopatologia 26
3.4 Imuno-Histoquímica 26
3.5 Transcriptase Reversa - Reação de Cadeia Em Polimerase 27
3.5.1 Extração de RNA 27
3.5.2 RT-PCR Gene N 27
3.5.3 Touchdown PCR Gene H 28
4 RESULTADOS 30
4.1 Cães 30
4.3 Análise Molecular 34
4.4 Outras Causas 35
5 DISCUSSÃO 35
6 CONCLUSÃO 36
7 REFERÊNCIAS 37
Anexo I – Ficha clínica de cães com cinomose 48
1 INTRODUÇÃO
A cinomose é uma doença infecciosa pantrópica causada pelo vírus da cinomose canina (VCC) (KOUTINAS et al., 2002). O vírus é frequentemente letal em cães e carnívoros (SUMMERS e APPEL, 1994) sendo as principais lesões observadas no sistema respiratório, gastrointestinal e sistema nervoso central (SNC). O vírus pode infectar animais de diversas idades, mas os filhotes são os mais acometidos devido à perda dos anticorpos maternos, a não utilização de vacinas e a falha vacinal (APPEL e SUMMERS, 1995; CHAPPUIS, 1995).
No Brasil a cinomose representa até 6% de todas as ocorrências atendidas em clínicas veterinárias sendo responsável por até 11% das mortes de cães (HEADLEY e GRAÇA, 2000). Em um levantamento na Mesorregião do Estado do Rio Grande do Sul a cinomose foi considerada a maior causadora de óbitos em cães com uma prevalência de 12,4%, perdendo dentro da categoria filhotes, apenas para a parvovirose canina. (FIGHERA et al., 2008).
Segundo HEADLEY et al., (2012) os custos financeiros de cães com sinais clínicos do VCC, podem variar de R$ 258,3 milhões/ano a R$ 280,5 milhões/ano, demonstrando que a cinomose é uma doença de alto impacto econômico nas clínicas de pequenos animais no Brasil.
O vírus da cinomose tem predileção pelos tecidos epiteliais, linfóides e tecido nervoso, a sua patogenicidade irá variar de acordo com a diversidade dos biotipos, apesar de ser conhecido, até o momento, um único sorotipo (ALVES et al., 2006).
O diagnóstico post-mortem é realizado através da histopatologia principalmente com a visualização do corpúsculo de inclusão eosinofílico intracitoplasmático e intranuclear localizados em células epiteliais, linfóides e no SNC (APPEL e SUMMERS, 1999). Técnicas como reação de polimerase em cadeia (PCR) e imuno-histoquímica são utilizadas em casos que não são visualizados os corpúsculos de inclusão no exame histopatológico, mas que lesões microscópicas compatíveis são visualizadas (FRISK et al., 1999; SONNE et al., 2009).
Dentro deste contexto, as doenças virais exercem grande importância dentre os diagnósticos de cães necropsiados no Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT). O presente trabalho teve por objetivo analisar os achados patológicos, imuno-histoquímicos e moleculares de cães portadores de quadros neurológicos e apresentação clínica sugestiva de
cinomosenecropsiados no LPV dentro do período de fevereiro de 2012 a fevereiro de 2013.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Vírus da Cinomose Canina
2.2.1 Histórico
A cinomose foi descrita pela primeira vez em 1746, no Peru como uma doença altamente contagiosa nos cães (HOWELL, 1965).
Em 1905 CARRÉ propõe (1905 apud APPEL e SUMMERS, 1995) a etiologia viral do agente que causava a cinomose. Em 1926, um estudo experimental realizado por Laidlaw e Dunkin com furões comprovou a etiologia da doença (GLEDHILL, 1953; 1962 apud KRAKOWKA et al., 1980). Em 1969, foi identificado o primeiro caso natural da doença em furões (Mustela putorius), sendo considerado o modelo experimental para estudos sobre o vírus da cinomose canina (APPEL, 1969).
Embora o cão doméstico seja considerado o reservatório do vírus (ANDERSON, 1995; APPEL e SUMMERS, 1995; DOMINGO et al., 1995) , vários animais selvagens já foram infectados pelo VCC, como por exemplo, as espécies da família Canidae, Mustelidae, Procionidae, Ailuridae, Viveridae, Hyaenidae, Protelidae
Ursidae, Tayassuidae, Felidae, além de mamíferos marinhos de várias famílias
(baleias, golfinhos, botos, leões marinhos e focas). Na tabela 1 encontra-se os principais eventos históricos do vírus da cinomose .
Tabela 1. Eventos históricos sobre o estudo do vírus da cinomose.
ANO CONTRIBUIÇÃO REFERÊNCIA
1746 Descoberta uma doença altamente contagiosa em cães HOWELL, 1965;
1760-1770
A doença se dissemina para Europa e Estados Unidos BLANCOU, 2004
1870 A cinomose é identificada como uma doença que infecta cães de todas as raças e idades no Reino Unido
McBRIDGE, 1870 1890 Mais de 90% dos cães britânicos morrem com secreção óculo nasal, diarreia,
anorexia e febre
MILLAIS, 1890
1905 Etiologia viral é proposta por Henri Carré APPEL, 1987; MACLACHLAN e
DUBOVI, 2011 1905 Teoria viral contestada devido à presença da bactéria Haemophilus
bronchisepticus nos pulmões dos cães necropsiados
GLEDHILL, 1953
1908 Primeira descrição clássica dos sinais clínicos da doença - Edward Jenner em 1908
APPEL, 1987; MACLACHLAN e
DUBOVI, 2011 1926 Estudo experimental com furões, com ausência de alterações neurológicas GLEDHILL, 1953
1940-1950
Surto de encefalite em cães HOWELL, 1965 1947 Forma epitelial é descrita por Rubarth in 1947 GLEDHILL, 1953 1948 Holmes sugere que o VCC entre no grupo do vírus da Influenza devido à
sintomatologia respiratória
HOLMES, 1948 1956 A partir de um embrião de frango foi desenvolvida primeira vacina viva
modificada contra VCC em Onderstepoort, África do Sul
HAIG, 1956
1959 Vacina viva atenuada desenvolvida através da cultura celular de um cão do primeiro relato de VCC na Suécia
ROCKBORN, 1959 1962 Formação da família Paramyxoviridae com os componentes: VCC, Measle
vírus e Vírus da Peste Bovina.
ANDREWES, 1962
1987 Diferentes espécies da Ordem Carnívora são consideradas susceptíveis ao virus
MONTALI et al., 1987
1991-1992
Mortalidade de grandes felinos (leões, tigres e leopardos) pelo VCC na América do Norte
APPEL et al., 1994
1999 Primeiro relato de VCC em animais selvagens (Furão Grande e Lobo Guará) no estado de SP- Brasil
REGO et al., 1997 1999 Detecção do RNA viral através da RT-PCR através nucleoproteína (N) FRISK et al., 1999 2007 Análise parcial da sequência de nucleotídeos do gene N para conhecimento
das estirpes circulantes no Brasil
CASTILHO et al., 2007 2010 Inclusão de uma nova estirpe viral África WOMA et al., 2010 2013 Classificação gene H em subgenotipos BUDASZEWSKIA et
al., 2013
2013 Primeira infecção em um urso COTTRELL et al.,
2.2.2 Etiologia e Morfologia
O VCC canina pertence à família Paramyxoviridae, gênero Morbillivirus, sendo antigenicamente relacionado ao vírus do sarampo (ÖRVELL e NORRBY, 1980; SUMMERS e APPEL, 1994; MACLACHLAN e DUBOVI, 2011), da peste dos pequenos ruminantes, da peste bovina (GREENE e APPEL, 2006; ARNS et al., 2007), da cinomose dos golfinhos, da cinomose das focas e da cinomose dos botos (GREENE e APPEL, 2006; BEINEKE et al., 2009).
O genoma do VCC consiste de uma fita de RNA com polaridade negativa, não segmentada de 16.000 a 20.000 pares de base (pb) de extensão e seis sequências abertas de leitura (open reading frame –ORF) (DIALLO, 1990). A organização genômica, a partir da extremidade 3’, é constituída pelos genes das proteínas: nucleoproteína (N), atualmente chamada de proteína de ligação do RNA (RNA
binding protein), fosfoproteína (P), proteína da matriz (M), proteína de fusão (F),
hemaglutinina (H) e a grande proteína (Large–L) (Figura 1) (MACLACHLAN e DUBOVI, 2011). Todos os genes são intercalados por regiões não-codificadoras (CURRAN et al., 1992). As três proteínas internas são as proteínas L, N e P e as inseridas no envelope são a H e F, a proteína M é a única inserida entre o envelope viral e o nucleocapsídeo (BARRETT, 1999; ZEE e MACLACHLAN, 2004).
Fig. 1. Estrutura viral do gênero Morbillivirus. Fonte: Viral Zone, 2011.
As proteínas L, N, P e o RNA viral formam o complexo ribonucleoprotéico (complexo RNP). A proteína M (matriz) é importante para a maturação viral e
funciona como conectora das glicoproteínas de superfície (F e H) e ao nucleocapsídeo (BEINEKE et al., 2009). As glicoproteínas H (hemaglutinina) e F (fusão) desempenham funções importantes na patogenia da neuroinvasividade; a proteína H é responsável pela adsorção do vírus aos receptores da célula do hospedeiro, e a F pela fusão do envelope viral na membrana celular do hospedeiro (BARRETT, 1999; ZEE e MACLACHLAN, 2004; PARDO et al., 2005; ARNS et al., 2007), possibilitando a entrada do complexo RNP no citoplasma da célula. A proteína F também confere a formação de sincícios sendo responsável pela disseminação do vírus de célula para célula e pela fusão entre as células do hospedeiro (ZEE e MACLACHLAN, 2004).
A hemaglutinina, por ser a maior glicoproteína do envelope, é considerada o melhor alvo para o estudo e comparação entre sequencias do genoma viral das estirpes isoladas de cinomose (ÖRVELL et al., 1990; BOLT et al., 1997; HAAS et al., 1997).
Até o presente momento foi isolado apenas um sorotipo do VCC. Porém, os casos de infecção natural apresentam isolados com uma grande variabilidade antigênica, os quais são divididos em linhagens que apresentam variações de patogenicidade e virulência (ZEE e MACLACHLAN, 2004; ARNS et al., 2007; MCVEY e KENNEDY, 2008) sendo associadas principalmente com a região geográfica onde a cepa foi isolada (SUMMERS et al., 1984). Existem várias linhagens conhecidas: América-1. América-2, Europa, Ártica, Ásia 1 e Ásia 2 (LAN et al., 2007; MCVEY e KENNEDY, 2008). Além dessas linhagens já conhecidas uma nova linhagem na África do Sul foi identificada e denominada África (WOMA et al., 2010).
2.2.3 Epidemiologia
A transmissão do vírus acontece principalmente através de aerossóis produzidos por secreções respiratórias e o seu período de incubação dura aproximadamente 7 dias (APPEL e SUMMERS, 1995). Após o período de incubação o animal começa a eliminar o vírus através das secreções ocular e nasal (GREENE e APPEL, 2006).
A infecção pelo VCC pode acometer cães de todas as idades, principalmente os filhotes (3-6 meses de idade) devido à diminuição de anticorpos maternos (APPEL e SUMMERS, 1995; CHAPPUIS, 1995; GREENE e APPEL, 2006). Além
disso, os cães que se recuperam da infecção podem permanecer imunes por toda a vida sem eliminar o vírus (APPEL e SUMMERS, 1995).
Os casos de cinomose são observados com maior frequência em épocas de temperaturas mais baixas (HEADLEY e GRAÇA, 2000; MARTINO et al., 2004). Não há predileção sexual nem racial pelo vírus (HEADLEY e GRAÇA, 2000; BORBA et al., 2002). Cães sem raça definida (SRD) lideraram as estatísticas da doença quando comparado às diferentes raças caninas, possivelmente por este grupo ser extremamente representativo no Brasil (HEADLEY e GRAÇA, 2000).
Cães de rua parecem ser mais susceptíveis que cães domiciliados, já que geralmente não são vacinados e devido a isso apresentam títulos baixos de anticorpos contra o vírus, além de apresentarem maior chance de entrar em contato com partículas virais provenientes de outros cães infectados (BORBA et al., 2002).
Apesar de a cinomose ter sido controlada durante vários anos em países desenvolvidos, surtos frequentes com alto índice de mortalidade têm ocorrido (MAES et al., 2003).
Segundo DI FRANCESCO et al., (2012) mais de 50% dos cães infectados com o VCC eram cães vacinados acima de 1 ano de idade. Possivelmente o armazenamento inadequado ou a exposição a temperaturas extremas podem comprometer a efetividade da imunização assim como erros nos protocolos de imunização, levando a uma resposta imunológica falha ou ausente.
2.2.4 Patogênese
O vírus é inalado ou ingerido juntamente com secreção nasal ou ocular de animais infectados que começam a eliminar o vírus cerca de sete dias após a infecção (GILLESPIE, 1962; GREENE e APPEL, 2006; MACLACHLAN e DUBOVI, 2011). Inicialmente o VCC se replica nos macrófagos das tonsilas e linfonodos bronquiais, causando uma imunossupressão grave e de longa duração (APPEL, 1969). Aproximadamente, 10 dias após a infecção, o vírus se dissemina pela via hematógena para os demais órgãos, incluindo as células do sistema respiratório, digestivo, urinário, endócrino, reprodutivo, linfóide (APPEL, 1969; APPEL, 1970), tegumentar (GRÖNE et al., 2003; GRÖNE et al., 2004; KOUTINAS et al., 2004), nervoso e vascular (KRAKOWKA et al., 1987).
Acredita-se que os leucócitos sejam os principais carreadores do vírus pela via hematógena (ROCKBORN, 1958), pois o antígeno viral é detectado
primeiramente nos capilares e endotélio de vênulas do SNC 5 a 6 dias pós-infecção (PI) e em linfócitos perivasculares, processos podais astrocíticos e pericitos 8 dias PI (SUMMERS e APPEL, 1987).
A infecção no SNC ocorre predominantemente através da via hematógena (KRAKOWKA, 1989) e a neuroinvasão pode ocorrer através de quatro formas: (1) uma disseminação direta através da pia mater atingindo as células meningeais; (2) através das células endoteliais na substância branca; (3) pelas células epiteliais do plexo coróide e (4) através das células do epêndima (Figura 2) (BEINEKE et al., 2009).
Os mecanismos que ocasionam a desmielinização ainda são incertos, já que os oligodendrócitos não são as células alvo do VCC (BEINEKE et al., 2009). Sabe-se que ocorrem distúrbios circulatórios como edema, congestão e tromboSabe-se em áreas próximas aos oligodendrócitos levando a apoptose dos mesmos e destruição da mielina (YAO-QIAN et al., 2013). Outra hipótese sugerida é um distúrbio metabólico caracterizado pelo aumento dos receptores de hialuranato nos CD44 (ALLDINGER et al., 2000; BEINEKE et al., 2009), o que levaria a danos nos astrócitos que por sua vez, tem a função de manter a barreira hematoencefálica (BHE) e nutrir os oligodendrócitos (YAO-QIAN et al., 2013).
Segundo SEEHUSEN et al., (2010) a morte de alguns neurônios piramidais ocasionam danos nos axônios e consecutivamente a perda da mielina em uma fase inicial, levando ao desaparecimento da mielina e desencadeando por conseguinte, uma desmielinização severa (YAO-QIAN et al., 2013).
Fig.2: Disseminação do VCC através do SNC. Corte transversal do cerebelo: setas azuis: disseminação viral através das células meningeais infectadas; círculos pretos: disseminação viral por células endoteliais infectadas; setas amarelas: disseminação viral pelas células do epitélio do plexo coróide; setas vermelhas: disseminação viral pelas células do epêndima. Quadros destacados com marcação do antígeno VCC. Anticorpo monoclonal específico anti-VCC-N, método HRP-DAB. Fonte: BEINEKE et al., 2009.
2.2.5 Imunologia
A gravidade das lesões no SNC decorrente da infecção pelo VCC irá depender basicamente de três fatores: idade, estado imunológico e cepa viral (GREENE e APPEL, 2006). A idade do animal, assim como seu desenvolvimento e a eficiência do sistema imunológico podem influenciar na intensidade do quadro clinico-patológico (KRAKOWKA e KOESTNER, 1976; MACLACHLAN e DUBOVI, 2011). Os filhotes são considerados os mais susceptíveis a infecção devido à imaturidade do sistema imune que não é capaz de produzir uma quantidade adequada de anticorpos neutralizantes contra o vírus (GILLESPIE, 1962; APPEL, 1969).
Os animais que apresentarem uma boa resposta imunológica, após o 14º dia, podem não apresentar sinais clínicos da cinomose canina, uma vez que anticorpos específicos neutralizam o vírus e inibem a sua propagação. Os animais que apresentam uma resposta imunológica intermediária não conseguem inibir a propagação do vírus pelo epitélio tecidual, mas podem conter a infecção quando os níveis de anticorpos aumentarem (GREENE e APPEL, 2006). Quando não há
resposta humoral, seja pela queda de anticorpos maternos, falha vacinal ou não vacinação ou até mesmo por falha na resposta imune individual, o vírus se dissemina por múltiplos tecidos desenvolvendo sinais clínicos graves que podem levar o animal a óbito (APPEL, 1969; GREENE e APPEL, 2006).
TATSUO et al., (2000) identificaram uma glicoproteína de membrana expressa em algumas células T e células B conhecida como molécula sinalizadora de linfócitos ativados (SLAM) ou CD150 que tem a função de receptor celular para os Measles virus (MV). Essa molécula é expressa em algumas células do sistema imune, como células dendríticas maturas, macrófagos e células B e T ativadas (ROMERO et al., 2004), o que explicaria a capacidade dos Morbillivirus se disseminarem pelo organismo através do sistema imune.
Devido a imunossupressão causada pelo vírus nas primeiras semanas PI (APPEL, 1969), pode ocorrer co-infecções com diversos agentes comumente conhecidos como Toxoplasma gondii (MORETTI et al., 2006, HEADLEY et al., 2013), Adenovírus canino tipo 1 e tipo 2 (CHVALA et al., 2007; RODRIGUEZ-TOVAR et al., 2007; HEADLEY et al., 2013), Parvovírus canino (HEADLEY e SAITO 2003; HEADLEY et al., 2013), Orthopoxvirus em gato doméstico (WIENER et al., 2013) e infecções causadas por fungos oportunistas (DILLEHAY et al., 1987, FLEGEL et al., 2012).
2.2.6 Sinais Clínicos
A cinomose apresenta uma grande variabilidade de sinais clínicos. Os sinais sistêmicos que podem ser observados variam desde anorexia, desidratação, vômito, secreções óculo-nasais muco purulentas (MOHANTY e DUTTA, 1981; SWANGO, 1997) e diarreia com ou sem sangue (APPEL, 1970; JONES et al., 2000). Em casos que o animal apresenta diarreia pode ocorrer uma piora do quadro clínico devido à desidratação grave (JONES et al., 2000). Alguns animais desenvolvem a fase epitelial com formação de pústulas na região abdominal ventral e/ou hiperqueratose dos coxins digitais (GREENE e APPEL, 2006).
Os sinais clínicos neurológicos são muito variáveis e dependem da região do SNC acometida (SUMMERS et al., 1984). Os sinais neurológicos podem aparecer isoladamente ou iniciarem com os demais sinais sistêmicos, podem surgir entre uma a três semanas após a recuperação da doença sistêmica ou serem os únicos sinais observados no animal (SUMMERS et al., 1995; VANDEVELDE e ZURBRIGGEN,
2005; GREENE e APPEL, 2006). As alterações neurológicas observadas são: apatia, alterações no comportamento, convulsão, sinais cerebelares (ataxia de cabeça e tronco, tremores de intenção e hipermetria), sinais vestibulares (inclinação de cabeça, quedas, andar em círculos e nistagmo), déficits visuais, paraplegia/paresia, tetraplegia/paresia, atrofia muscular, hiperestesia, mioclonia e coma (GILLESPIE, 1962; VANDEVELDE et al., 1982b; TIPOLD et al., 1992; AMUDE et al., 2006b; AMUDE et al., 2007).
Os sinais neurológicos mais frequentemente observados em cães com cinomose são as mioclonias, convulsões e ataxia (MCGRATH, 1960, KOUTINAS et al., 2002; GEBARA et al., 2004; SILVA et al., 2007; HEADLEY et al., 2012). A mioclonia é caracterizada pela contração repetitiva de um músculo ou de um ou mais grupos musculares, envolvendo principalmente os músculos da mastigação e apendiculares (LORENZ e KORNEGAY, 2006).
Foram descritas quatro síndromes clínico-patológicas causadas pelo VCC: encefalite em cães jovens, de caráter grave e agudo, com desenvolvimento de sinais clínicos sistêmicos e neurológicos; encefalite do cão adulto, considerada crônica, na qual os sinais neurológicos normalmente são isolados; encefalite do cão velho e a encefalite recidivante crônica, sendo de ocorrência esporádica (BRAUND, 1994).
2.2.7 Patologia
2.2.7.1 Achados macroscópicos
Os cães acometidos podem desenvolver na fase aguda secreções nasais e oculares serosas, catarrais ou mucopurulentas caso haja uma infecção bacteriana secundária associada (LÓPEZ, 2013). A fase epitelial pode ocorrer com o surgimento de dermatites pustulares na região abdominal ventral e hiperqueratose dos coxins digitais (KOUTINAS et al., 2004; GREENE e APPEL, 2006). Ao realizar a necropsia, os pulmões podem não estar colabados, de coloração avermelhada e edemaciada (BEINEKE et al., 2009; LÓPEZ, 2013). No intestino pode ocorrer uma enterite catarral ou hemorrágica (SONNE et al., 2009). Pode ser observado atrofia parcial ou total do timo devido à capacidade que o vírus tem que se replicar e destruir os tecidos linfóides (ALVES et al., 2006). Os linfonodos podem estar congestos ou hemorrágicos (APPEL, 1969). Em animais que não desenvolveram os dentes permanentes o vírus infecta o alvéolo dentário, podendo levar a uma hipoplasia do esmalte dentário (DUBIELZIG, 1979).
2.2.7.2 Achados microscópicos
Os pulmões podem apresentar pneumonia intersticial e histologicamente ser observado infiltrado inflamatório mononuclear associado a macrófagos espumosos, hiperplasia de pneumócitos tipo II e edema alveolar (PANDHER et al., 2006; LÓPEZ, 2013).
Os coxins digitais podem apresentar hiperqueratose paraqueratótica ou ortoqueratótica, presença do corpúsculo viral, vacuolização de queratinócitos e hiperplasia epitelial (GRÖNE et al., 2004).
No SNC, as alterações histopatológicas envolvem frequentemente a substância branca e a substância cinzenta, embora a lesãopossa predominar em uma delas (SUMMERS et al., 1995). A lesão predominante na maioria dos casos de cinomose é a desmielinização, ela pode ocorrer principalmente na substância branca, enquanto as lesões na substância cinzenta podem estar ausentes (VANDEVELDE et al., 1982b; VANDEVELDE e ZURBRIGGEN, 2005).
As alterações histopatológicas como degeneração neuronal, gliose, infiltrado linfoplasmocitário perivascular podem ocorrer no córtex cerebral, cerebelar, tálamo, núcleo basal e medula espinhal (SUMMERS et al., 1995).
As diferenças entre as cepas influenciam no tropismo viral, refletindo um padrão de lesão que pode ser predominantemente de desmielinização, quando, por exemplo, a cepa infecta um maior número de células da glia, especialmente astrócitos do que se infectassem neurônios (SUMMERS et al., 1984).
A desmielinização pode ocorrer na fase inicial da doença, quando ainda não há inflamação, ou em uma fase mais crônica em que normalmente a inflamação está frequentemente presente (TIPOLD et al.,1992, VANDEVELDE e ZURBRIGGEN, 2005). A resposta inflamatória se inicia a partir do momento que o hospedeiro começa a restabelecer a sua resposta imunológica na tentativa de eliminar o vírus do SNC após imunossupressão grave nos estágios iniciais da infecção, VANDEVELDE et al., 1982a, SUMMERS et al., 1995).
As lesões são classificadas como Encefalite desmielinizante de acordo com o seu grau de desmielinização e inflamação em: hiperaguda, aguda, subaguda e crônica, apresentando algumas diferenças entre os autores (VANDEVELDE et al., 1981; VANDEVELDE et al., 1985; TIPOLD et al., 1992; SCHOBESBERGER et al., 2002; JACHARY, 2013).
Histologicamente as lesões hiperagudas não apresentam desmielinização; há discreta ou nenhuma reação astroglial, ausência de inflamação; pequenos vacúolos na substância branca e corpúsculo de inclusão intranuclear em 25% dos astrócitos (SUMMERS et al., 1979; VANDEVELDE et al., 1981; SCHOBESBERGER et al., 2002). Por ocorrer próximo do oitavo dia pós-infecção (SUMMERS et al., 1979), a replicação viral é bastante acentuada nessa fase (SCHOBESBERGER et al., 2002).
A fase aguda é caracterizada por desmielinização da substância branca, principalmente nas regiões subependimárias, periventriculares e subpiais, astrogliose leve ou moderada; ausência de lesões inflamatórias; formação de sincícios de astrócitos e corpúsculos de inclusão intranuclear em 30% dos astrócitos (SUMMERS et al., 1979; VANDEVELDE et al., 1981; VANDEVELDE e ZURBRIGGEN, 2005; GREENE e APPEL, 2006).
A fase subaguda é caracterizada por desmielinização moderada, formação de esferóides axonais e pequena quantidade de infiltrado linfocítico nos espaços de Virchow-Robin. Células gitter e microgliose também podem ser observadas nessa fase. Os corpúsculos de inclusão podem ser vistos em até 50% das lesões nessa fase (VANDEVELDE et al., 1981; VANDEVELDE et al., 1982a; SUMMERS et al., 1994; SCHOBESBERGER et al., 2002).
Nas lesões crônicas a desmielinização observada é extrema, sendo acompanhada de infiltrado inflamatório mononuclear difuso acentuado podendo estar presente nas leptomeninges, plexo coróide e espaço de Virchow-Robin em regiões adjacentes à lesão. Os manguitos perivasculares de linfócitos e plasmócitos são exuberantes e chegam a formar até 5 camadas ao redor dos vasos. Há formação de sincícios de astrócitos e os corpúsculos de inclusão intranuclear em astrócitos podem ser observados (VANDEVELDE et al., 1981; VANDEVELDE et al., 1982b; SCHOBESBERGER et al., 2002; GREENE e APPEL, 2006).
Os corpúsculos de inclusão observados na cinomose são formados por agregados de nucleocapsídeos virais e debris celulares, resultados da infecção viral. A presença dos corpúsculos de inclusão na histologia confirma o diagnóstico (GREENE e APPEL, 2006).
Infecções secundárias podem ocorrem devido a imunossupressão causada pela infecção viral, levando a pneumonias bacterianas secundárias principalmente por Bordetella bronchiseptica e Mycoplasma sp (CHVALA et al., 2007; LÓPEZ, 2013) ou associação com outros vírus como o adenovírus tipo 2 ou vírus da
parainfluenza (DAMÍAN et al., 2005; CHVALA et al., 2007; RODRIGUEZ-TOVAR et al., 2007).
Infecções concomitantes de VCC com Neospora caninum e Toxoplasma
gondii tem ocasionado encefalite supurativa, miosite e radiculoneurite (LEMBERGER
et al., 2005; GREENE e APPEL, 2006; MORETTI et al., 2006).
2.2.8 Técnicas de Diagnóstico 2.2.8.1 Exame hematológico
Exames hematológicos podem ser utilizados como diagnóstico auxiliar, já que o vírus causa linfopenia devido à destruição linfóide (KRAKOWKA e KOESTNER, 1977).
2.2.8.2 Swab ocular
A detecção do corpúsculo de inclusão in vivo pode ser realizada por um método simples e barato através do esfregaço de swab ocular em lâmina histológica. Deve-se ter cuidado ao realizar esse método, pois ele pode dar resultado falso negativo (MOHANTY e DUTTA, 1981; SWANGO, 1997). A demonstração de corpúsculos de inclusão em esfregaços conjuntivais ou em células inflamatórias associadas ao exsudato, confirma o diagnóstico. No entanto, estes testes são frequentemente negativos e a ausência não exclui a infecção pelo VCC (SWANGO, 1997).
2.2.8.3 Sorologia - ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)
Testes sorológicos como ELISA, podem ser utilizados, porém se o animal estiver na fase aguda da infecção os títulos de anticorpos podem estar baixos devido à imunossupressão e não serem detectados. Animais que foram vacinados recentemente podem apresentar um pico alto de anticorpos o que pode ser confundido com um animal infectado o que dificulta a utilização desse método como diagnóstico, devido aos erros ocasionados na interpretação (SOMA et al., 2003; SOMA et al., 2013). A sorologia pode ser ineficiente, já que muitas vezes os animais que morrem de cinomose podem ou não ter anticorpos mensuráveis (SWANGO, 1997).
Durante a avaliação de 26 cães infectados naturalmente pelo VCC, 26,9% (7) animais foram detectados positivos através do ELISA (SOMA et al., 2003). SOMA et
al., 2003 comparou o título de IgM dos 26 cães infectados naturalmente com os cães vacinados contra o VCC, foi possível observar que os títulos de IgM induzidos por uma estirpe virulenta do vírus são muito mais altos do que os títulos de IgM induzidos pela vacina. LATHA et al., (2007) demonstraram que o IgM-ELISA detectou 49% dos casos positivos, enquanto a técnica de Slot blot detectou apenas 36% dos casos das mesmas amostras. O IgM-ELISA é um método rápido e sensível quando comparado ao outros testes que utilizam amostras de soro para a detecção do antígeno nas fases iniciais da infecção.
2.2.8.4 Detecção Molecular
A técnica de Transcriptase Reversa em Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) para detecção do RNA do VCC tem sido realizada amplamente para diagnósticos ante-mortem com amostras de sangue, soro, urina e liquor por muitos laboratórios (GEBARA et al., 2004; SAITO et al., 2006; AMUDE et al., 2007; NEGRÃO et al., 2013). Para a detecção post-mortem do RNA viral através do RT-PCR utilizam-se órgãos como cerebelo, córtex cerebral e pulmão (FRISK et al., 1999; AMUDE et al., 2007; ROSA et al., 2012).
A técnica de RT-PCR detectou 86% das amostras de soro como positivas e 88% das amostras de sangue total e do SNC, de cães previamente positivos pela imuno-histoquímica (IHQ) (FRISK et al., 1999). Porém no estudo de SHIN et al., (1995), apenas 53,1% das amostras de sangue periférico foram positivas, mesmo utilizando dois pares de oligonucleotídeos distintos.
Fatores como: a seleção da sequência alvo de nucleotídeos a ser amplificado, método de extração do RNA a ser utilizada, padronização dos reagentes empregados na técnica, seleção do material biológico a ser utilizado para o diagnóstico, forma de conservação e tempo de estocagem podem interferir na técnica, ocasionando em um resultado falso-negativos (DI FRANCESCO et al., 2012).
2.2.8.5 Imuno-histoquímica
A técnica de IHQ tem sido empregada como excelente diagnóstico auxiliar nos casos em que há lesão histopatológica, porém não são visualizados corpúsculos de inclusão (SONNE et al., 2009). O antígeno pode ser detectado no epitélio
respiratório, epitélio da bexiga, estômago, coxins digitais assim como no encéfalo, sendo a marcação visualizada principalmente no cerebelo (KOUTINAS et al., 2004; LIANG et al., 2007; SONNE et al., 2009).
Segundo SONNE et al., (2009), dos 46 coxins analisados através da IHQ, 31 (67.4%) foram positivo, sendo considerado o principal órgão para marcação viral. De acordo com KOUTINAS et al., (2004), mesmo quando os coxins digitas não apresentam corpúsculos de inclusão viral podem apresentar marcação imuno-histoquímica intensa no epitélio.
O estômago é um dos órgãos de eleição para o diagnóstico histológico e imuno-histoquímico da cinomose canina, por usualmente conter, um grande número de corpúsculos de inclusão viral, sendo considerado o segundo melhor órgão para alvo da IHQ com 32 (62,7%) amostras positivas de 51 casos testados, mesmo em casos de autólise tecidual (SONNE et al., 2009).
O cerebelo apresentou 23 (45,1%) positivos de 51 testados. Porém a marcação viral não foi visualizada em locais em que havia uma desmielinização moderada a severa e formação de manguitos acentuados, caracterizando a forma crônica da doença (SONNE et al., 2009). ALLDINGER et al., (2000) relatam que o antígeno da cinomose encontra-se ausente ou restrito as áreas de lesões em casos mais crônicos.
2.2.9 Cinomose nas demais espécies animais
São susceptíveis ao VCC famílias de espécies selvagens como: Mustelidae (furão, ferret e marta) (PAVLACIK et al., 2007; MEGID et al., 2013), Procionidae (jupará, quati, guaxinim e panda) (NIKOLIN et al., 2012), Ailuridae (panda vermelho) (QIN et al., 2007), Viveridae (gato de alcália) (CHANDRA et al., 2000), Hyaenidae (hiena) (HAAS et al., 1996), Protelidae (protelo-mamífero semelhante à hiena), alguns membros da família Ursidae (COTTRELL et al., 2013), Tayassuidae (Javalis-pecari de coleira, Tayassu tajacu) (APPEL et al., 1991), Felidae (leões, tigres e onças) (APPEL et al., 1994; ROELKE-PARKER et al., 1996; SEIMON et al., 2013), mamíferos marinhos de várias famílias (baleias, golfinhos, botos, leões marinhos e focas) e primatas não humanos (SAKAI et al., 2013).
3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Animais do estudo
O estudo prospectivo foi realizado com cães que vieram a óbito durante o período de fevereiro de 2012 a fevereiro de 2013, apresentando sinais clínicos neurológicos, com suspeita clínica prévia de infecção natural pelo vírus da cinomose canina (CDV), foram encaminhados ao Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT) para a realização da necropsia.
Os cães encaminhados ao LPV-UFMT faziam parte da casuística de atendimento do HOVET-UFMT e de clínicas veterinárias particulares da região de Cuiabá, MT. Uma ficha padrão (Anexo 1) contendo dados referentes ao caso como: idade, sexo, raça, esquema de vacinação e sinais clínicos apresentados foi confeccionada sendo utilizada durante o estudo.
3.2 Necropsia e amostras biológicas
Na necropsia, as lesões macroscópicas observadas nos cães necropsiados foram registradas. Fragmentos de encéfalo, medula espinhal, intestino delgado e grosso, timo, baço, rim, fígado, estômago, bexiga, coração, pulmão e linfonodo mesentérico foram coletados e fixados em formalina a 10%.Adicionalmente, secções do encéfalo e medula espinhal foram padronizadas de acordo com SILVA et al., (2009). Essas secções incluiram: (1) ponte, cerebelo, (2) diencéfalo, mesencéfalo; (3); lobo parietal, lobo temporal e (4) lobo frontal. A medula espinhal foi seccionada em três regiões: cervical, torácica, lombar. Secções do encéfalo como: ponte, cerebelo, lobo parietal, lobo temporal e lobo frontal, seções da medula espinhal cervical, torácica e lombar e pulmão foram coletadas e armazenadas em microtubos a -20ºC para posterior análise.
3.3 Histopatologia
Os fragmentos dos órgãos coletados durante a necropsia foram fixados em formalina a 10% e processadas rotineiramente para a análise histológica e coradas pela técnica de hematoxilina e eosina (HE) (BEHMER et al., 1976).
As lesões microscópicas apresentadas pelos cães com achados patológicos compatíveis com o vírus da cinomose foram identificadas, e posteriormente graduadas em aguda, subaguda e crônica de acordo com SILVA et al., (2009).
O teste imuno-histoquímico para a identificação do VCC foi realizado obrigatoriamente em cortes do cerebelo em todos os casos selecionados. Nos casos que não foi visualizada a marcação positiva no cerebelo, optou-se pelo estômago por ser um órgão epiteliotrópico alvo do vírus e nos casos em que havia pneumonia mononuclear ou supurativa também era realizada a técnica em cortes do pulmão para identificar a presença do vírus na lesão.
Foi realizada a padronização da técnica de imuno-histoquímica a fim de estabelecer o melhor método de visualização antígeno viral do VCC. Como controles positivos, foram utilizados casos de cães naturalmente infectados pelo VCC contendo lesões histopatológicas compatíveis associadas à visualização do corpúsculo de inclusão. A IHQ foi realizada pelo método streptavidina-biotina conjugada com fosfatase alcalina (LSAB + System AP - DAKO®) descrita por SONNE et al., (2009), contendo algumas modificações.
3.5 Transcriptase Reversa - Reação de Cadeia em Polimerase (RT-PCR) 3.5.1 Extração de RNA
O RNA viral foi extraído a partir de 120µg de um pool do fragmento de encéfalo congelado macerado em 300µl de solução de PBS (Phosphate Buffered Saline) estéril diluído em água DEPC (Invitrogen Life Techolology, Carlsbad, CA, USA). A extração foi realizada por meio de kit SV Total RNA Isolation System (Promega® Z3100) seguindo as instruções do fabricante.
3.5.2 RT-PCR Gene N
As amostras de encéfalo previamente extraídas foram analisadas por RT-PCR com primers de oligonucleotídeos (Invitrogen Life Technologies, USA) CDV 1 (sense) [5’-aca gga ttg ctg agg acc tat-3’, nt 769-789] and CDV2 (anti-sense) [5’-caa gat aac cat gta cgg tgc-3’, nt.769-1055], selecionados para amplificar um fragmento 257 pb do gene da Nucleoproteína do VCC (FRISK et al., 1999).
A transcriptase reversa foi realizada com 9µl de RNA extraído e 2,0 pmol de CDV1, finalizando uma solução de 10 µl. A solução foi desnaturada a 70°C por 10 minutos e imediatamente transferia para cubos de gelo por 5 minutos. Foi então adicionado o solução RT-MIX que constituía 0,2mM de cada dNTP (Invitrogen Life Technologies, USA), 1x PCR buffer (Invitrogen Life Technologies, USA) (20 mM Tris-HCl pH 8.4 and 50 mM KCl), 1.5 mM MgCl2, 100 unidades da enzima transcriptase
reversa M-MLV (Invitrogen Life Technologies, USA) e água ultrapura estéril para um volume final de 20 µl. Depois da homogeneização a solução foi incubada a 42°C por 30 minutos seguido a 70°C por 5 minutos para inativação da enzima.
Para a reação da RT-PCR foi usado 2,5 µl do cDNA, 0,4 pmol de cada primers (CDV1 e CDV2), 0,2 mM of cada dNTP, 1x PCR-buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4 e 50 mM KCl), 1,5 mM MgCl2, 2,5 unidades Taq DNA Polymerase (Invitrogen Life Technologies, USA) e água ultrapura estéril para um volume final de 25 µl (AMUDE et al., 2006a), com algumas modificações. A reação foi realizada no termociclador MULTIGENE MINI24 (Labnet International Inc.) usando as seguintes condições de tempo e temperatura: i) desnaturação inicial a 94°C por 1 minuto; ii) desnaturação a 40 ciclos a 94° C por 1 minuto, primeiro anelamento a 59°C por 2 minutos e extensão a 72°C por 1 minuto; iii) a extensão final foi realizada a 72°C por 7 minutos. Uma amostra sabiamente positiva do nosso laboratório foi utilizada durante a reação como controle positivo e uma alíquota de água ultrapura estéril foi utilizada como controle negativo.
Os produtos amplificados foram visualizados através de gel de agarose 2% em eletroforese em tampão de TBE 0,5X (44,58 MTris-base; 0,44 M ácido bórico; 12,49 mM EDTA pH 8,0)em voltagem constante (120v/60mA) por aproximadamente 45 minutos. O gel de agarose foi corado com GelRed Nucleic Acid Gel Stain, 10000x em água (Biotium - Uniscience), e visualizado sob luz ultravioleta (UV) em câmara escura. O tamanho esperado foi amplicons com 257 pb para o gene N.
3.5.3 Touchdown PCR Gene H
Amostras de encéfalo previamente extraídas foram analisadas por RT-PCR com primers de oligonucleotídeos (Invitrogen Life Technologies, USA) CDV-H1 (5’- GTT GCC ACA AAA RCT AAACGA-3’, posição 453 do gene H) e CDV-H2 (5’- CCT CCY AAG GGT TCC CAT GA -3’, posição 1196 do gene H), resultando em um
amplicon esperado de 882 pb do gene da Hemaglutinina do VCC (ROSA et al.,
2012).
Para a reação foi utilizado o método Touchdown-PCR (DON et al., 1991) e utilizado o kit GoTaq® Green Master Mix (Promega® M7113) segundo instruções do fabricante, 2 µl do cDNA, 1 pmol de cada iniciador CDV-H1e CDV-H2 e água q.s.p.para uma reação final de 50 µl.
A mistura foi aquecida por 5 min. a 94°C para a desnaturação, caindo para 55°C, caindo 0,5°C por ciclo durante 35 ciclos, cada ciclo dura 1 min., seguindo a 37,5° por 1,5 min, subindo a 72°C por 2 min. e extensão final a 72°C por 10 min. em um termociclador Bio-Rad T100. O produto amplificado foi analisado por eletroforese em gel de agarose 0,7% contendo 0,5mg de brometo de etídio/mL de gel e usando 0,5x de tampão TBE (Tris base89 mM, Ácido Bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8.0), em voltagem constante (90V) por 40 min. O produto visualizado sob UV em câmara escura. O tamanho esperado foi amplicons com 882 pb para o gene H.
4 RESULTADOS
4.1 Cães
Entre os meses de fevereiro de 2012 a fevereiro de 2013, um total de 80 cães com suspeita clínica de cinomose foram selecionados para a realização da necropsia. Em 48,75% (39/80) dos casos a idade dos cães afetados eram inferior a um ano, seguido por 18,75% (15/80) dos casos entre 1 a 2 anos de idade; 18,75% (15/80) entre 3 a 7 anos; 5% (4/80) entre 11 e 15 anos e 2,5% (2/80) entre 8 a 10 anos de idade. Em 6,25% (5/80) dos casos a idade não foi informada.
Um total de 56% (45/80) dos cães com sintomalogia neurológica eram fêmeas e 44,5% (35/80) eram machos. Dentre as raças, a predominante foi a SRD (sem raça definida) com 66% (539/80) dos casos conforme a Tabela 2.
Tabela 2. Dados clínico-epidemiológicos dos 80 cães necropsiados entre Fevereiro 2012 a Fevereiro de 2013 no LPV-UFMT.
Dados clínico-epidemiológicos Raça
Sem raça definida Pinscher PitBull Labrador Rottweiler Doberman Poodle Boxer Dálmata Lhasa Apso Pug Yorkshire Sexo Fêmea Macho Idade (anos) < 1 1-2 3-7 8-10 11-15 Não informado N (%) 53 (66,25%) 6 (7,5%) 6 (7,5%) 3 (3,75%) 3 (3,75%) 2 (2,5%) 2 (2,5%) 1 (1,25%) 1 (1,25%) 1 (1,25%) 1 (1,25%) 1 (1,25%) 45 (56%) 35 (44,5%) 39 (48,75%) 15 (18,75%) 15 (18,75%) 2 (2,5%) 4 (5%) 5 (6,25%)
Dos 80 cães com sinais clínicos neurológicos, a mioclonia foi o sinal predominante, estando presente em 43,7% (35/80) dos casos, seguido por convulsão em 40% (32/80) e dificuldade de locomoção em 31,2% (25/80), conforme Tabela 3.
Tabela 3. Sinais Neurológicos predominantes nos 80 cães. Sinais Neurológicos N(%) Mioclonia 35 (43,7%) Convulsão 32 (40%) Dificuldade de locomoção 25 (31,2%) Nistagmo 13 (16,2%) Vocalização 8 (10%) Opistótono 5 (6,2%) Compressão de cabeça 5 (6,2%) Cegueira 3 (3,7%) Movimentos de pedalagem 3 (3,7%) Andar em círculos 1 (1,2%) Bruxismo 1 (1,2%)
4.2 Achados patológicos e Imuno-histoquímicos
Dos 80 cães com sinais clínicos neurológicos, 68 (85%) apresentaram algum tipo de lesão microscópica no SNC. Destes, 46 (67,6%) foram positivos na IHQ para CDV. Os principais dados clínicos e epidemiológicos destes cães estão resumidos na Tabela 4.
Os principais achados macroscópicos observados durante necropsia dos 46 cães positivos para VCC foram: pulmões não colabados em 39,1% (18/46) dos casos (Fig. 3A), atrofia de timo em 39,1% (18/46), hiperqueratose dos coxins digitais em 13% (6/46) (Fig. 3B) e em 8,6% (4/46) descarga nasal e ocular (Fig. 3C).
Tabela 4. Dados clínico-epidemiológicos dos 46 cães positivos para VCC na IHQ necropsiados entre Fevereiro 2012 a Fevereiro de 2013 no LPV-UFMT.
Dados clínico-epidemiológicos IHQ positive VCC (%)
Raça
Sem raça definida Labrador Pinscher PitBull Rottweiler Boxer Doberman Poodle Sexo Macho Fêmea Idade (anos) < 1 1-2 3-7 8-10 11-15 Não informado Sinais clínicos Mioclonia Dificuldade de locomoção Convulsão Dificuldade respiratória Diarréia hemorrágica 31 (67,3%) 3 (6,5%) 3 (6,5%) 3 (6,5%) 3 (6,5%) 1 (2,1%) 1 (2,1%) 1 (2,1%) 17 (36,9%) 29 (63%) 24 (52,1%) 10 (21,7%) 6 (13%) 1 (2,1%) 2 (4,3%) 3 (6,5%) 27 (58,6%) 24 (52,1%) 18 (39,1%) 8 (17,3%) 5 (10,8%)
Fig. 3. Cães. Cinomose. 3A. Pulmões não colabados. 3B. Hiperqueratose coxim plantar. 3C. Secreção ocular purulenta.
Microscopicamente, as lesões do SNC foram classificadas como: aguda em 15,2% (7/46) dos casos, sendo caracterizadas por desmielinização leve, astrogliose leve a moderada e ausência de reação antiinflamatória (Fig. 4A); subaguda em 73,9% (34/46) dos casos, sendo caracterizada por desmienilização moderada, infiltrado linfoplasmocitário leve a moderado ao redor de vasos; pequena quantidade de células gitter e alguns casos corpúsculos de inclusão (Fig. 4B); e crônica em 10,8% (5/46) sendo caracterizadas por desmielinização acentuada, presença intenso infiltrado inflamatório ao redor de vasos, de moderada a acentuada quantidade de células gitter e em alguns casos corpúsculos de inclusão (Fig.4C e D).
Fig. 4. Cães. Cinomose. 4A. Cerebelo. Fase Aguda. Desmielinização da substância branca com infiltrado inflamatório linfocítico perivascular moderado. Hematoxilina e Eosina. Barra = 10µm. 4B. Cerebelo. Fase Subaguda. Desmielinização da substância branca com infiltrado inflamatório linfocítico perivascular moderado. Hematoxilina e Eosina. Barra = 100µm. 4C. Cerebelo. Fase Crônica. Infiltrado inflamatório linfocítico perivascular acentuado. Hematoxilina e Eosina. Barra = 50µm. 4D. Cerebelo. Fase Crônica. Infiltrado inflamatório linfoplasmocitário acentuado. Hematoxilina e Eosina. Barra = 50µm.
Dos 68 casos testados na IHQ, 46 (67,6%) foram positivos. Destes, 45 (97,8%) a marcação foi observada no cerebelo (Fig. 5A), em 3 (6,5%) a presença do
vírus foi visualizada também em cortes de pulmão e 3 (6,5%) casos somente no estômago, conforme Tabela 5.
Tabela 5. Achados histopatológicos nos cães positivos para VCC necropsiados no município de Cuiabá.
Achados histopatológicos
Aguda (desmielinização leve e ausência de reação inflamatória) Subaguda (desmielinização
moderada e reação inflamatória leve a moderada)
Crônica (desmielinização e reação inflamatória acentuada) N (%) 7 (15,2%) 34 (73,9%) 5 (10,8%) IHQ SNC Pulmão Estômago 7 31 5 1 2 0 0 3 0 Total 46 43 3 3
Fig. 5. Cães. Cinomose. 5A. Astrócitos são positivos para o anticorpo monoclonal anti-cinomose. Imuno-histoquímica – fosfatase alcalina – cromógeno permanent red, contra corado com Hematoxilina de Mayer. Barra = 20 μm. 5B. Astrócitos são positivos para o anticorpo monoclonal anti-cinomose. Imuno-histoquímica – fosfatase alcalina – cromógeno permanent red, contra corado com Hematoxilina de Mayer. Barra = 20 μm.
4.3 Análise Molecular
Das 46 amostras submetidas à análise molecular, 28 (60,8%) foram positivas para o gene N através da RT-PCR e 5 (10,8%) foram positivas para o gene H através da Touchdown PCR.
4.4 Outras causas
Dos 80 cães necropsiados, em 42,5% (34/80) dos casos, a etiologia dos sinais clínicos neurológicos foram atribuídos a outras causas (Tabela 6).
Tabela 6. Diagnóstico das outras causas de histórico clínico neurológico.
Causa
Inconclusivo
Encefalite Parasitária Encefalite Fúngica
Insuficiência Renal Crônica Neoplasias Encefalite supurativa Encefalite granulomatosa Encefalopatia hepática Endocardite bacteriana Hepatite infecciosa Hidrocefalia Pneumonia supurativa N (%) 17 (50%) 3 (8,8%) 3 (8,8%) 3 (8,8%) 2 (5,8%) 2 (5,8%) 1 (2,9%) 1 (2,9%) 1 (2,9%) 1 (2,9%) 1 (2,9%) 1 (2,9%) IHQ VCC Positivo - 0 2 - - - - - - - - - - Total 34 5 DISCUSSÃO
No período de um ano, um total de 67,6% dos cães com sinais clínicos neurológicos foram confirmados positivos para VCC através da técnica de IHQ. Avaliação macroscópica e histopatológica foi realizada, e todos os achados foram consistentes com a doença clínica causada pelo VCC (KOUTINAS et al., 2002). Em nosso estudo, cães com menos de um ano de idade foram os mais afetados pelo VCC, sendo este achado similar a de outros autores (JÓZWIK e FRYMUS, 2002;
GREENE e APPEL 2006; SONNE et al., 2009).
A atrofia do timo foi o achado macroscópico mais observado (39,1%) em cães jovens (<1 ano), sugerindo que o vírus ocasiona uma destruição das células linfóides (MORO et al., 2003; SONNE et al., 2009).
As lesões microscópicas observadas no encéfalo de cães positivos foram caracterizadas principalmente pela desmielinização (86,9%), a qual foi associada à
entrada do vírus no SNC através do LCR ou pelo rompimento a BHE via células linfóides infectadas (KOUTINAS et al., 2002; BEINEKE et al., 2009) havendo por conseguinte, replicação em neurônios e ocasionando danos nos axônios (KOUTINAS et al., 2002; SEEHUSEN et al., 2010).
Em 54,3% dos cães, foi observado infiltrado linfocítico perivascular no SNC, sendo este achado diferente do observado por outros autores (SONNE et al., 2009), sugerindo que as lesões observadas podem estar associadas a presença de diferentes estirpes virais (KOUTINAS et al., 2002). O cerebelo (97,8%) foi o principal fragmento do SNC onde a marcação da IHQ foi visualizada, sendo este achado similar ao VAN MOLL et al., (1995).
As amostras submetidas à técnica de RT-PCR assim como Touchdown PCR apresentaram um número menor de amostras positivas quando comparada a técnica de IHQ. Segundo SHIN et al., (1995), essas técnicas são muito sensíveis, porém a sensibilidade pode variar de acordo com o tipo de amostra, o método de extração do ácido nucléico viral e a escolha do primer. Em seu estudo foram utilizados dois pares distintos de oligonucleotídeos iniciadores demonstrando uma positividade de 53,1% nas amostras provenientes de cães com sinais clínicos de cinomose. Adicionalmente um estudo realizado por FRISK et al., (1999), com os mesmos oligonucleotídeos iniciadores revelou uma freqüência de 88% de animais positivos. Apesar de termos utilizado como critério de seleção amostras positivas na IHQ para realizar a RT-PCR e Touchdown-PCR, nossos resultados positivos foram inferiores ao encontrado por FRISK et al., (1999) sugerindo que ainda é preciso contornar alguns inconvenientes da técnica de RT-PCR que podem interferir substancialmente na maioria dos métodos de diagnóstico post-mortem (GEBARA et al., 2004).
6 CONCLUSÃO
Considerando que a cinomose é uma doença de distribuição mundial a combinação de exames laboratoriais como a histopatologia, técnicas moleculares e a imuno-histoquímica são recomendadas na obtenção de um diagnóstico definitivo.
A cinomose demonstrou sua relevância dentro da população canina de Cuiabá, sendo necessário ao nosso entendimento, caracterizar a estirpe viral relacionada à região, através do sequenciamento e análise filogenética das amostras previamente estabelecidas como positivas na RT-PCR.
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