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Efeitos do óleo NIM [Azadirachta indica A. Juss (Meliacea)] sobre crescimento, esporulação, viabilidade de esporos, morfologia e produção de Aflatoxina B1 e B2 em Aspergillus flavus.

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Academic year: 2019

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Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)

Costa, Christiane Luciana da

C837e Efeitos do óleo de Nim [Azadirachta indica A. Juss

(Meliaceae)] sobre crescimento, esporulação,

viabilidade de esporos, morfologia e produção de aflatoxinas B1 e B2 em Aspergillus flavus. / Christiane Luciana da Costa. -- Maringá, 2009.

36 f. : il. color., figs., tabs.

Orientador : Prof. Dr. Carlos Kemmelmeier.

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, 2009.

1. Fungos. 2. Micotoxinas. 3. Azadirachta indica. 4. Aflatoxinas. I. Kemmelmeier, Carlos, orient. II. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. III. Título.

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-Resumo geral

As micotoxinas formam um amplo grupo de compostos de diferentes precursores e vias metabólicas, produzidos por fungos filamentosos. As aflatoxinas (AF), as mais importantes micotoxinas, são substâncias carcinogênicas, mutagênicas, teratogênicas e imunossupressoras, produzidas como metabólitos secundários de Aspergillus flavus e A. parasiticus. A via

biossintética policetídica é uma rota comum na formação de várias micotoxinas como as aflatoxinas, a patulina, a citrinina e a ocratoxina. Entre os 18 diferentes tipos de aflatoxinas já identificados, os principais são AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2. A AFB1 é produzida em maior

quantidade e apresenta maior toxicidade, seguida pela AFG1, AFB2 e AFG2. A contaminação

nos estágios de pré e pós-colheita de produtos como milho, amendoim, algodão e nozes por fungos do gênero Aspergillus e a consequente contaminação por micotoxinas representa um

problema de segurança alimentar. Desde a descoberta da aflatoxina como um contaminante carcinogênico em alimentos e rações, muitas pesquisas objetivaram identificar compostos capazes de inibir sua biossíntese. Extratos de determinadas plantas são tóxicas aos fungos e podem ser utilizadas no controle do crescimento fúngico e da produção de micotoxinas. Várias publicações têm documentado o uso de extratos vegetais, óleos essenciais e condimentos capazes de inibir o desenvolvimento fúngico e a produção de micotoxinas. O modo de ação da maioria dos inibidores não está esclarecido, mas muitos deles exibem atividade antioxidante. Um dos mais importantes compostos capazes de inibir a síntese de aflatoxina é o extrato de nim (Azadirachta indica A. Juss). O nim é uma árvore nativa de regiões subtropicais da Ásia e

África. Substâncias obtidas de diversas partes dessa árvore (caule, folhas e sementes) têm demonstrado uma eficácia incomum contra um amplo espectro de pragas (insetos, fungos e vírus). Vários componentes, principalmente os tetranortriterpenóides, têm sido identificados como os princípios ativos responsáveis por essa atividade. Por causa da sua eficácia, da biodegradabilidade e dos efeitos indesejáveis mínimos, a azadiractina, um tetranortriterpenóide obtido a partir de sementes de nim, têm sido apontado como biopraguicida. Diferentes formulações de óleo de nim estão disponíveis comercialmente, e a aspersão recomendada de solução aquosa a 5% em culturas parece ser promissora na proteção durante a fase de armazenamento. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a eficácia desse óleo sobre o crescimento, a morfologia, a esporulação, a viabilidade de esporos e a produção de aflatoxinas B1 e B2 por A.

flavus no meio semissintético Yeast Extract Sucrose. O crescimento micelial (massa seca,

diâmetro das colônias e taxa de crescimento), esporulação e viabilidade dos esporos foram determinados pelo crescimento do fungo em Yeast Extract Sucrose agar na ausência (controle)

(9)

quantificada por meio de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Para isso, o óleo de nim foi avaliado nas concentrações de 0,25, 0,5, 1,0 e 4,0 % (vol/vol) nos meios de cultura. Amostras do crescimento micelial obtidas das culturas submersas e dos meios sólidos foram analisadas em

microscopia de luz. O óleo de nim provocou redução significativa (p≤0,05) no peso seco, diâmetro da colônia e taxa de crescimento do fungo no meio sólido em concentrações de 0,5 a 5,0 % vol/vol. No entanto, houve aumento na esporulação nessas mesmas condições. Esporos obtidos por culturas na ausência do óleo de nim demonstraram redução na germinação quando

incubados em meios suplementados por esse composto.

Além disso, alguns esporos

apresentaram a germinação bipolar. Colônias cultivadas em meios sólidos e em culturas

submersas na presença do óleo exibiram alterações morfológicas, incluindo granulações

no citoplasma, hifas com padrão de ramificação atípico e conidióforos anormais e

indiferenciados. A produção de aflatoxinas B

1

e B

2

foi inibida por óleo de nim. Este

composto em concentrações acima de 0,5 % causou aproximadamente 95 % de inibição

na produção de aflatoxinas B

1

e B

2

. Por outro lado, os resultados demonstram que ele

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General abstract

Mycotoxins form a wide range of compounds from different biochemical precursors and pathways. They are produced by numerous fungi, but grouped together on the basis of their

toxicity. Aflatoxins (AF), the most important mycotoxins, are carcinogenic, mutagenic,

immunosuppressive and teratogenic agents produced as secondary metabolites by Aspergillus

flavus and A. parasiticus. The biosynthetic polyketide pathway is a common route for the

formation of various mycotoxins, such as aflatoxins, patulin, citrinin and ochratoxin. Among 18 different types of aflatoxins identified, major members are aflatoxins B1, B2, G1 and G2.

Aflatoxin B1 is produced most abundantly and is also the most toxic followed by G1, B2 and G2. Pre-harvest and post-harvest contamination of maize, peanuts, cotton and tree nuts by members of the genus Aspergillus and subsequent contamination with the mycotoxin, pose a widespread food safety problem. Since the discovery of aflatoxin as a potently carcinogenic food contaminant, extensive research has been focused on identifying compounds that inhibit its biosynthesis. Extracts of certain plants are toxic to fungi and may be useful in controlling the fungal growth and mycotoxin production. Many publications have documented the use plant extracts, essential oils and spices to inhibit fungal development and mycotoxin production.The action modes of most inhibitors are still poorly understood,but many have antioxidant activity.

One of the most important compounds that inhibit aflatoxin production is neem (Azadirachta

indica A. Juss) extract. Neem is a subtropical tree native to the arid regions of Asia and Africa.

Components taken from the neem tree (bark, leaves, and seeds) have demonstrated an unusual

effectiveness against a wide spectrum of

pests (

insects, fungi, and viruses). Various chemical

components, mostly tetranortriterpenoids, from neem tree have been identified as active principles involved with this activity. Due to its efficacy, biodegradability and minimum side effects, azadirachtin, a tetranortriterpenoid obtained from neem seeds, has emerged as a natural biopesticide. Different commercial formulations of neem oil are available and the recommended the aspersion of aqueous solution at 5.0 % in crops appears promising as a protector of crops during storage. The objective of this research was to evaluate the effectiveness of neem oil on the growth, morphology, sporulation, viability of spores and aflatoxins B1 and B2 production by

A. flavus on a semi-synthetic Yeast Extract Sucrose medium. The mycelial growth (i.e. dry

weight, diameter of colony and growth rate), the sporulation and the viability of spores were determined by growing the fungus

a

Yeast Extract Sucrose

agar in the absence (control) and

presence (treatments) of different concentrations of neem oil: 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0

and 5.0 (vol/vol).

Aflatoxins B1 and B2 production was verified in submerged cultures and

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obtained from submerged cultures and solid media were analyzed under the light

microscope. Neem oil exhibited significant (p

0.05) reduction of dry weight, diameter

of colony and growth rate of the fungus on solid media

at concentrations 0.5 to 5.0% vol/vol.

However, it significantly increased the sporulation in the same conditions.

Spores obtained from cultures grown without neem oil showed reduction on

germination when incubated in a medium supplemented with it. Furthermore, some

spores showed bipolar germination. Colonies grown on solid media and in submerged

cultures in the presence of this oil exhibited morphological alterations, including

granular cytoplasm, atypical hyphae branching pattern, abnormal and undifferentiated

conidiophores.

The production of aflatoxin B

1

and B

2

was inhibited by neem oil. This

oil at concentrations above 0.5% caused approximately 95% inhibition in aflatoxin B

1

and B

2

production. On other hand, the results demonstrate that neem oil does not

Referências

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