UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
DANIEL DE LIMA BELLAN
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS BIOLÓGICOS INDUZIDOS POR POLISSACARÍDEOS EXTRAÍDOS DE ALGAS EM LINHAGEM B16-F10 (MELANOMA MURINO)
CURITIBA
2016
DANIEL DE LIMA BELLAN
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS BIOLÓGICOS INDUZIDOS POR POLISSACARÍDEOS EXTRAÍDOS DE ALGAS EM LINHAGEM B16-F10 (MELANOMA MURINO)
Dissertação apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Biologia Celular e Molecular, no curso de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná.
Orientadora: Profª Drª. Célia Regina Cavichiolo Franco Coorientador: Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade
CURITIBA
2016
Agradecimentos
Primeiramente agradeço às pessoas mais importantes da minha vida: meu pai e minha mãe, que sempre torceram, rezaram e me apoiaram incondicionalmente! Vocês são os meus exemplos de vida, e eu jamais vou conseguir expressar o quão sou grato por tê-los como pais!
Agradeço às minhas irmãs, Glaucia e Janaina, por cuidarem de mim a vida toda, por sempre me incentivarem a correr atrás dos meus objetivos e por terem dado para nossa família as alegrias que se chamam Ingrid, Rafael e Isadora! Agradeço também aos meus cunhados João Edson e Anderson, por serem os irmãos que eu não tive!
Agradeço também à Dona Inês, pelo carinho e torcida!
Agradeço à minha namorada, Fernanda, por permanecer do meu lado nos momentos felizes e de dificuldade, não deixando que eu desistisse dos meus objetivos quando eu já não acreditava que conseguiria!
Agradeço à minha orientadora, Professora Doutora Célia Regina Cavichiolo Franco, pela oportunidade de trabalhar, aprender e conviver com ela. Poucos minutos de convivência são necessários para perceber o exemplo de vida que você é, Célia, e eu sou grato por ter tido a oportunidade de vivenciar isso!
Agradeço a meu coorientador, Professor Doutor Edvaldo da Silva Trindade, por todos os ensinamentos pessoais e profissionais, e por todo o esforço que empregou e emprega diariamente para que eu e outras pessoas possamos desenvolver nossos trabalhos científicos!
Agradeço à Professora Doutora Carolina pelos ensinamentos e discussões de protocolo!
Agradeço ao Professor Doutor Hugo Alexandre, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, por gentilmente ceder o polissacarídeo da alga Codium isthmocladum utilizado nesta dissertação.
Agradeço à Professora Maria Eugênia e a seu marido Miguel Noseda, da Universidade Federal do Paraná, por gentilmente ceder o polissacarídeo da alga Gayralia brasiliensis utilizado nesta dissertação.
Agradeço aos amigos de laboratório pelas risadas e ajuda, aos que já saíram e
aos que permanecem: Stellee, Gustavo, Jenifer, Thais, Malu, Ana, Fávia, Viviane,
Maíra, Bia, Fernanda, Cléber, Aline, Tabata, Fernando, Patrícia, Divino, Kátia e Bruno!
Agradeço especialmente à Stellee, minha irmã científica, por ter me ensinado tanto do que sei hoje no laboratório! Ao Gustavo e a Jenifer, pela amizade e pela sempre disponibilidade em ajudar! À Thais e a Malu, pela amizade e ajuda na bancada!
Agradeço aos amigos de mestrado, Dandie, Gislene, Thaylise, Manu e Nilce!
Agradeço aos amigos da vida, peças tão importantes nessa caminhada:
Emanuel, Izabela, Marcelo, André e Bruna!
Agradeço à Professora Sheila Winnischofer e à Professora Katia Paludo pelo tempo e paciência empregados nas correções dos relatórios de mestrado, assim como pelas sugestões feitas!
Agradeço à Professora Lucélia, por permitir de bom grado o uso dos equipamentos de seu laboratório!
Agradeço aos técnicos de microscopia do Cêntro de Microscopia Eletrônica e da Microscopia Confocal da UFPR pelo trabalho por eles realizado para essa dissertação!
Agradeço a todos os envolvidos no Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular do Departamento de Biologia Celular, Setor de Ciências Biológicas, da UFPR!
Agradeço às pessoas responsáveis pela limpeza das salas de laboratório e corredores do departamento e da UFPR!
Agradeço a todos os outros professores e colegas que fizeram e fazem parte do caminho que estou trilhando!
Agradeço à Universidade Federal do Paraná pela incrível jornada que tive e estou tendo a oportunidade de vivenciar!
Agradeço às agências de fomento CAPES, CNPq e Fundação Araucária!
Nas três últimas décadas, o câncer vem alterando o perfil epidemiológico do país. Este evento caracteriza-se pelo aumento dos agravos e da mortalidade provenientes de doenças não transmissíveis, pelo aumento da expectativa de vida com números cada vez maiores de idosos em detrimento ao número de jovens, e por uma predominância da morbidade em relação à mortalidade, gerando grandes impactos no sistema de saúde e na economia. Apesar do conhecimento de que a luz Ultra Violeta é o principal fator ambiental relacionado ao câncer do tipo melanoma, modelo de estudo do presente estudo, os mecanismos pelos quais este deflagra a doença, bem como os componentes genéticos associados a esta patologia, não estão totalmente esclarecidos. A ciência busca compostos naturais para a cura de inúmeras doenças, e as pesquisas científicas têm sido intensificadas com o objetivo de investigar a ação farmacológica de diferentes produtos naturais, os quais tenham papel promissor no tratamento do câncer. Nosso objetivo é avaliar o potencial biológico de uma galactana sulfatada extraída da alga verde Codium Isthmocladum (CI), e de uma heteroramnana extraída da alga verde Gayralia brasiliensis (GB), em diferentes concentrações e tempos de tratamento, empregando ensaios in vitro com células das linhagem B16-F10 e RAW 264.7, melanoma e macrófago murino, respectivamente. Polissacarídeos com efeitos medicinais já foram e ainda são amplamente encontrados e descritos em fungos (majoritariamente em cogumelos), plantas, algas, animais e bactérias, sendo que a atividade desses compostos está intimamente associada a sua estrutura química, como composição monossacarídica, peso molecular e modificação de grupos funcionais. Entre suas diversas funcionalidades biológicas, são descritas atividades antitumorais através de inibição do crescimento tumoral, inibição de angiogênese, indução de apoptose, aumento de imunocompetência, diminuição de capacidade metastática e desencadeamento da perda de viabilidade celular. A galactana aqui estudada demonstrou diminuir a viabilidade celular (detectada pelo método de vermelho neutro) da linhagem em estudo no período de exposição de 72h em todas as concentrações testadas (1, 10, 100 e 1000ug/mL), não gerando comprometimento da atividade mitocondrial (ensaio de MTT) nas mesmas condições. Nos mesmos ensaios e condições de tratamento, a heteroramnana em estudo demonstrou comprometer a viabilidade celular e a atividade mitocondrial da linhagem B16-F10 nos três tempos testados (24, 48 e 72h) em pelo menos uma das concentrações. Ambos os polissacarídeos diminuíram a proliferação celular em 48h de tratamento. Com estes resultados, as concentrações de 10 e 100ug/mL e o tempo de tratamento de 72h foram escolhidos para o prosseguimento dos experimentos. Nestes parâmetros de tratamento, os polissacarídeos não comprometeram o potencial de membrana mitocondrial, além de não gerar arrasto do ciclo celular. A análise da morfologia celular em microscopia eletrônica de varredura apresentou alterações nas células tratadas com ambos os compostos. O ensaio de migração celular demonstra um promissor comprometimento dessa mecânica quando a linhagem B16-F10 foi exposta ao polissacarídeo GB. Entre as possíveis explicações para essa modulação, a marcação do receptor CD44 diminuiu de forma estatisticamente significativa frente ao tratamento com o polissacarídeo GB. Ambos os compostos aumentaram a marcação de CD54 e a produção de espécies reativas de oxigênio em macrófagos, o que pode indicar diferenciação dessas células na ativação clássica M1. Assim, esses polissacarídeos apresentaram resultados promissores frente as linhagem em estudo, porém outros experimentos in vitro ein vivo devem ser realizados para se identificar as biomoléculas envolvidas, bem como rotas e vias que possam estar sendo moduladas frente aos tratamentos com esses compostos.
PALAVRAS CHAVE: melanoma, polissacarídeos,Codium isthmocladum,Gayralia brasiliensis, B16-F10, RAW 267.4, algas verdes.
In the last three decades, cancer is changing the epidemiological profile of the country. This event is characterized by the increase in diseases and mortality from non-communicable diseases, increased life expectancy with increasing numbers of elderly people over the number of young people, and a predominance of morbidity in relation to mortality, generating major impact on the health system and the economy. Despite the knowledge that UV light is the main environmental factor related to cancer of the melanoma type, model of this study, the mechanisms by which this triggers the disease and the genetic components associated with this disease are not fully understood. Science seeks natural compounds for curing numerous diseases and scientific research has been intensified in order to investigate the pharmacological action of different natural products, which have promising role in treating cancer. Our goal was to assess the biological potential of an extracted sulphated galactan from the green alga Codium Isthmocladum, and an extracted heteroramnana from the green alga Gayralia brasiliensis, both at different concentrations and treatment times (exposure), using in vitro assays with murine melanoma cells B16-F10 lineage and RAW 264.7 macrophage lineage. Polysaccharides with medicinal effects are widely found and described in fungi (mainly in mushrooms), plants, algae, animals and bacteria, where the activity of these compounds is closely related to its chemical structure, such as monosaccharide composition, molecular weight and modification of functional groups. Among its various biological functions, antitumor activity are described by inhibiting tumor growth, inhibiting angiogenesis, induction of apoptosis, increased immunocompetence, decreased metastatic capacity and outbreak of loss of cell viability. The galactan studied here shown to decrease cell viability (detected by the neutral red method) of the lineage under study at 72h exposure period in all tested concentrations (1, 10, 100 and 1000μg/ml),and not genetare impairment of mitochondrial activity (MTT assay) in the same conditions. In the same tests and conditions of treatment, the heteroheteroramnana under study demonstrated compromising cell viability and mitochondrial activity of B16-F10 line in the three times tested (24, 48 and 72h) in at least one of the concentrations. Both polysaccharides decreased cell proliferation at 48 hours of treatment. With these results, the concentrations of 10 and 100μg/mL and 72h treatment time were chosen for further experiments. In these treatment parameters, polysaccharides did not affect the mitochondrial membrane potential, as well as not to generate cell cycle arrest. The analysis of cell morphology in scanning electron microscopy showed changes in cells treated with both compounds. The cell migration assay demonstrates a promising commitment of this mechanic when the B16-F10 lineage was exposed to the polysaccharide GB. Among the possible explanations for this modulation, the immunostaining of the CD44 receptor statistically significantly decreased toward the treatment with the polysaccharide GB. Both compounds increased the immunostaining of CD54 and production of reactive oxygen species in macrophages, which may indicate differentiation of cells in classical activation (M1). Thus, these polysaccharides have shown promising results against the lineages under study, but other experiments in vitro and in vivo should be conducted to identify the biomolecules involved , as well as routes and signaling pathways that may be being modulated by the treatments with these compounds.
KEYWORDS : melanoma, polysaccharides , Codium isthmocladum , Gayralia brasiliensis , B16 -F10 , RAW 267.4, green algae.
FIGURA 1 – Tipos de câncer mais incidentes. ... 14
FIGURA 2 – Fases do processo de metástase. ... 18
GRÁFICO 1 – Ensaio de Vermelho Neutro. ... 49
GRÁFICO 2 – Ensaio de Vermelho Neutro. ... 50
GRÁFICO 3 – Ensaio de MTT. ... 50
GRÁFICO 4 – Ensaio de MTT. ... 51
GRÁFICO 5 – Ensaio de Proliferação Celular. ... 54
GRÁFICO 6 – Ensaio de Proliferação Celular. ... 54
GRÁFICO 7 – Potencial de membrana mitocondrial. ... 57
GRÁFICO 8 – Ciclo celular. ... 60
FIGURA 3 – Morfologia celular em microscopia eletrônica de varredura (MEV). ... 63
GRÁFICO 9: Ensaio de Colônias. ... 65
GRÁFICO 10 – Migração celular... 66
FIGURA 4 – Migração celular. ... 67
FIGURA 5 – Migração celular. ... 68
GRÁFICO 11: Migração celular. ... 73
FIGURA 6 –Migração celular. ... 74
GRÁFICO 12 – Imunomarcação de NG2. ... 76
GRÁFICO 13 – Imunomarcação de N-caderina. ... 77
GRÁFICO 14 – Imunomarcação de CD44. ... 79
GRÁFICO 15 – Imunomarcação de CD54. ... 82
GRÁFICO 16 – Detecçao de ROS. ... 84
1.
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REFERÊNCIAS ... 881. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA 1.1 CANCER
A organização tecidual característica dos metazoários permitiu grande diversificação anatômica. Parte dessa plasticidade deve-se ao complexo sistema de controle gênico que permite que células com o mesmo genoma se diferenciem e proliferem, gerando estruturas únicas, promovendo o crescimento e o reparo de lesões.
O controle de acesso às capacidades proliferativas tem de ser extremamente preciso, e erros nesse sistema podem dar início à multiplicação descontrolada de uma célula, a qual sai da conformação usual de seu tecido de origem, gerando um corpo estranho, um tumor (WEINBERG, 2014).
A compreensão de que tumores são originados a partir dos tecidos do próprio corpo é hoje óbvia, e o conjunto de mais de 100 doenças que podem surgir a partir desses aglomerados de células, o câncer, é atualmente a segunda maior causa de mortes no mundo. A origem dessa patologia pode ser traçada até uma única célula inicial, sendo que a linhagem desta acumulou danos que escapam do sistema de reparo do DNA e alterações epigenéticas (como a metilação de DNA, modificação de histonas e remodelamento de cromatina), resultando na ativação de oncogenes e/ou o silenciamento de supressores tumorais, induzindo à formação de um tumor. Esta patologia pode ser denominada benigna quando as células não invadem outros tecidos, sendo possível a remissão completa, na maioria das vezes através da destruição ou extirpação cirúrgica da massa tumoral. Será considerado câncer somente se for maligno, onde as células adquirem a capacidade de invadir e até mesmo colonizar órgãos e tecidos vizinhos e/ou distantes, processo conhecido como metástase, dificultando em muito o tratamento (SUDHAKAR, 2009; VAIOPOULOS et al, 2014).
Em 2012, mais de 14 milhões de novos casos foram diagnosticados, com
aproximadamente 8 milhões de óbitos associadas ao câncer. Nas últimas décadas essa
doença assumiu status global, acometendo todas as populações em todos os países. A
distribuição e as características clínicas das ocorrências registradas variam
enormemente entre as diferentes regiões, refletindo diferenças econômicas, culturais e sócio-ambientais: o câncer associado a infecções crônicas (como o de colo de útero) representa um grande desafio às nações em subdesenvolvimento e desenvolvimento, sendo pouco significativo nos locais de maior poder econômico, segundo o último relatório disponobilizado pela Agência Internacional de Pesquisa do Câncer (IARC, 2014).
Entre homens e mulheres os cinco tipos de cânceres mais diagnosticados no ano de 2012 foram o de pulmão, colo retal e estômago. Para os homens destaca-se ainda o câncer de próstata e fígado, e para as mulheres o câncer de mama e colo de útero. Em ambos os sexos essas foram as formas da doença que mais levaram ao óbito. O gráfico abaixo (Figura 1) representa as maiores incidências dos diferentes tipos de câncer em ambos os sexos para todas as idades, no ano de 2012 (omitindo os casos de câncer de pele) (IARC, 2014).
FIGURA 1 – Tipos de câncer mais incidentes. Formas mais prevalentes de câncer diagnosticadas em 2012, em ambos os sexos e para todas as idades. Neste ano, estima-se que mais de 14 milhões de novos casos foram dianosticados (FONTE: Adaptado de World Cancer Report, IARC 2014).
Nas três últimas décadas, o câncer vem alterando o perfil epidemiológico do país. Este evento caracteriza-se pelo aumento dos agravos e da mortalidade provenientes de doenças não transmissíveis, pelo aumento da expectativa de vida com números cada vez maiores de idosos em detrimento ao número de jovens, e por predominância da morbidade em relação à mortalidade, gerando grandes impactos no
Pulmão (13%)
Outros (35.3%)
Mama (11.9%)
Colorretal (9.7%) Bexiga (3.1%)
Esôfago (3.2%) Colo de útero (3.7%)
Fígado (5.6%)
Próstata (7.9%) Estômago (6.8%)
sistema de saúde e na economia. Atualmente o câncer é a segunda maior causa de mortes da população brasileira, tendo sido responsável por 17% dos óbitos com razão conhecida em 2007, com expectativa de 576 mil novos casos em 2014 (INCA,2014).
Existem dois tipos de câncer de pele: o melanoma e o não melanoma. O câncer denominado não melanoma representa tumores de diferentes linhagens, sendo as formas mais freqüentes as de carcinoma basocelular (70%) e o carcinoma epidermóide (25%). Este é o mais freqüente no Brasil, e é o de menor mortalidade (INCA, 2014).
O câncer de pele do tipo não melanoma é o tumor mais incidente em seres humanos, afetando todas as etnias, grupos socioeconômicos e regiões geográficas, podendo ocorrer em qualquer fase de vida, sendo responsável por aproximadamente 95% das neoplasias de pele detectadas. Desde 1960, esta forma de câncer apresenta crescimento de incidência na ordem de até 8% ao ano. (DEMERS et al, 2005; INCA, 2014).
No Brasil, o tumor de pele não melanoma corresponde a 25% dos casos de câncer maligno detectados, sendo mais comum em pessoas com mais de 40 anos, portadoras de pele clara ou com doenças cutâneas prévias. A estimativa é de mais de 182 mil novos casos registrados em 2014 no país. O melanoma, modelo experimental deste estudo, corresponde a apenas 4% dos diagnósticos, porém é a forma mais grave, pois possui alta capacidade metastática e rápida progressão ao óbito. Clinicamente se enfatiza que cânceres quando em estado metastático avançado são insensíveis aos tratamentos clínicos, os quais acarretam diversos efeitos colaterais, com comprometimento da qualidade de vida dos pacientes (INCA, 2014).
1.2 MELANOMA
Melanócitos são originados da diferenciação de células da crista neural durante o desenvolvimento embrionário, e através de um complexo sistema de sinalização e interação com queratinócitos, essas células presentes na camada basal da derme são capazes de produzir melanina, pigmento responsável pela coloração da pele e proteção contra radiação ultravioleta (CICHOREK et al, 2013).
O fator mais fortemente associado ao desenvolvimento do melanoma é
ambiental: a radiação ultravioleta (UV), capaz de gerar danos ao DNA, mutações
genéticas, imunossupressão, estresse oxidativo e induzir respostas inflamatórias, processos diretamente envolvidos na progressão tumoral (GORDON, 2013). A luz solar está dividida em três espectros de onda: UVA (315 a 400 nm), UVB (280 a 315 nm) e UVC (100 a 280 nm, a qual é filtrada pela camada de ozônio). UVA e UVB são portanto os principais responsáveis pelos danos celulares relacionados ao aparecimento deste tipo de câncer, gerando danos diretos ao DNA, mutações genéticas, estresse oxidativo e imunossupressão. Estudos mostram maior relação entre exposição a UVR e desenvolvimento de câncer em indivíduos com a pele clara e pessoas do gênero masculino (NARAYANAN et al,2010; MULLIKEN, RUSSAK, RIGEL, 2012; GORDON, 2013).
Entre os fatores relacionados a maior incidência de câncer de pele em causasianos está a composição da melanina produzida pelos melanócitos desses indivíduos. Este pigmento constitui-se de eumelanina (mais escura e de maior capacidade fotoprotetora) e feomelanina (mais clara), ambos derivados de dopaquinona. Sua produção ocorre em melanossomos, os quais são exportados para os queratinócitos, e a relação eumelanina/feomelanina é dependente da atividade da enzima tirosinase, regulada pelo pH melanossomal, o qual por sua vez é regulado pela via de sinalização do hormônio estimulante de melanócitos (α-MSH). Pessoas de pele mais clara possuem maior quantidade de feomelanina, o que aumenta sua predisposição aos danos causados pela exposição ao sol (SHERER e KUMAR, 2010;
SIMON et al,2009).
Apesar do conhecimento do principal fator ambiental relacionado ao melanoma, os mecanismos pelos quais este deflagra a doença, bem como os componentes genéticos associados a ela, os alvos e vias de sinalização não estão totalmente esclarecidos. Fatores hereditários, modificações genéticas espontâneas e alterações epigenéticas (nomeadamente a metilação do DNA, seja através de hipermetilação de supressores tumorais ou hipometilação de oncogenes, bem como a acetilação de histonas) figuram entre os possíveis promotores desta doença (ZAIDI, DAY e MERLINO, 2008).
Entre as alterações genéticas mais comumente presentes temos mutações no
gene CDKN2, responsável por codificar as proteínas supressoras tumorais p16 e p14
(ZAIDI, DAY e MERLINO, 2008). Demais fatores ambientais, socioeconômicos e fisiológicos modulam ou promovem o desenvolvimento desta doença. Dentre este, destacam-se o aumento de incidência de melanoma em regiões de baixa latitute; em grandes altitudes; maior prevalência nas populações de pele clara; uso de bronzeamento artificial; queimaduras pela exposição ao sol; pacientes com familiares acometidos pela patologia (RUSSAK e RIGEL, 2012).
Estimativas do Instituto Nacional do Câncer apontam aproximadamente 5.890 novos casos de melanoma em 2014 no Brasil. Em 2010, 1.507 pacientes foram a óbito devido a essa patologia (INCA, 2014).
O prognóstico deste câncer é favorável quando é detectado nos estágios iniciais,
“in situ”, quando as células cancerosas ainda não invadiram além da membrana basal, não tendo acesso aos vasos sanguíneos e linfáticos, sendo possível a remoção do tumor. Os melanócitos quando inicialmente transformados são benignos, mas podem progredir para um tumor maligno. Quando em estágio de progressão tumoral (intensa proliferação celular), este tumor maligno apresenta duas fases de desenvolvimento, as quais podem levar à metástase. A fase de crescimento radial (RGP) caracteriza-se por lesão intra-epidérmica local na derme. Estas podem progredir para uma fase posterior denominada fase de crescimento vertical (VGP), com potencial metastático, caracterizando-se pela invasão das células tumorais na derme (melanoma invasivo). No estágio metastático, a expectativa de vida do paciente cai drasticamente, o qual apresenta tempo médio de vida menor que um ano, sendo que a estimativa de sobrevida para cinco anos é menor que 15%. Os locais mais recorrentes de metástase são o cérebro, pulmões e fígado (DUNKI-JACOBS et al, 2013).
1.3 METÁSTASE
É um processo complexo e ineficiente, no qual poucas células, que conseguem
cumprir uma série de etapas, deixam o tumor primário, são transportadas pela corrente
sanguínea e invadem e colonizam novos tecidos e órgãos. O novo local de crescimento
tumoral é determinado por fatores mecânicos (como semelhança no padrão circulatório
entre a região do tumor primário e a região do secundário) e similaridades moleculares
(hipótese do “soil and seed”, de Stephen Paget em 1889). As células que deixam a
neoplasia inicial são heterogêneas, sendo este um dos motivos da resistência a tratamentos em cânceres metastáticos (CHAMBERS et al, 2002; FIDLER, 2003). A Figura 2 representa os passos do processo metastático.
FIGURA 2 – Fases do processo de metástase. A intensa proliferação celular do tumor primário leva a secreção de fatores angiogênicos e metaloproteases, forma-se uma rede de capilares na massa tumoral, facilitando a invasão de tecidos vizinhos, respectivamente. Ao cair na circulação sanguínea, a maioria das células morrem, mas algumas poucas podem sobreviver nos capilares de órgãos distantes. Após degradar a matriz extracelular, estas podem invadir e colonizar o novo tecido. Caso a formação do microambiente tumoral seja bem sucedida, um tumor secundário terá sido estabelecido (Fonte: adaptado de FIDDLER, 2003).
O processo de metástase é altamente complexo e envolve outras células do
Proliferação/
Células caem na circulação
Invasão Aderência a capilares
Chegada em outros tecidos e órgãos
Invasão Aderência a
capilares
Chegada em outros tecidos e órgãos
de um microambiente
Proliferação/
microambiente tumoral, como por exemplo os macrófagos associados ao tumor (TAM).
O fenótipo metastático é adquirido através da expressão de diversos genes associados à motilidade celular, o que permite que o tumor responda a estímulos disponíveis no microambiente frente a invasão celular. A migração celular ocorre normalmente em movimentação sobre a matriz extracelular, em direção a quimioatratores, como o fator de crescimento endotelial (EGF), que chegam através de difusão dos vasos sanguíneos e por secreção de macrofagos. Estes liberam EGF e expressam receptores de fatores estimulantes de formação de colônia (CSF-1), enquanto que células cancerígenas expressam receptores de EGF e secretam CSF-1, atraindo mais macrófagos para o local (YAMAGUCHI; WYCKOFF; CONDEELIS, 2005).
Uma importante fonte de células metastáticas está relacionada a uma mudança de fenótipo denominada transição epitélio-mesenquimal (EMT, epithelial-mesenchymal transition), em que marcadores epiteliais – como E-caderinas, lamininas e entactinas – diminuem ou deixam de ser expressos, dando lugar a marcadores mesenquimais – como N-caderinas e certos dímeros de integrinas, como α
vβ
3e α
5β
1(KALLURI;
WEINBERG, 2009).
1.4 ALVOS, BIOMOLÉCULAS E EVENTOS BIOLÓGICOS ENVOLVIDOS NA PROGRESSÃO TUMORAL
1.4.1 Receptores de Superfície Celular
A transformação celular com indução da malignização tumoral e progressão do
melanoma envolve inúmeros eventos que modulam as metástases para viabilizar a
migração das células para outros alvos teciduais. As células transformadas alteram o
perfil de expressão de moléculas de adesão célula/célula e célula/matriz. Dentre as
moléculas envolvidas destacam-se as caderinas e as β-cateninas, as quais ancoram as
células epiteliais em junções aderentes. Em epitélios normais que não apresentam
patologias, os melanócitos mantêm-se unidos aos queratinócitos, mantendo sua
característica epitelial induzida pela expressão de E-caderina. Após transformação
celular, os melanócitos diminuem ou não expressam E-caderina, e aumentam a
expressão de N-caderina, induzindo perda do ancoramento (adesão) epidérmica e
adotando um fenótipo mesenquimal, bem como apresentando aumento de proliferação devido a presença de β-catenina livre. Esses eventos resultam em difusão dessas células pelo tecido, proporcionado pela falta de aderência, promovendo a penetração em vasos sanguíneos, migração para diferentes órgãos e estabelecimento de novas colônias (focos metastáticos) (WEELOCK et al, 2008).
Em situações não patológicas, os melanócitos e os queratinócitos mantêm interações que promovem a homeostase. A progressão tumoral envolve a perda deste equilíbrio, e ocorre através de supressão de receptores envolvidos na comunicação de melanócitos e queratinócitos, aumento da expressão de moléculas de interação entre células transformadas e fibroblastos, e alteração do padrão de expressão de moléculas de adesão célula-matriz. Além da perda de E-caderina, desmogleina 1 (um co-receptor de E-caderina) é suprimida, comprometendo a integridade dos demossomos; N- caderina passa a ser expressa, o que aumenta a afinidade dos melanócitos a fibroblastos e células do endotélio vascular; ocorre aumento de expressão de integrinas, como a integrina α
5β
3, aumentando a interação entre células malignizadas; e há desestruturação de gap junctions, devido a diminuição da expressão de conexinas, principalmente Cx43 (CHATELAIN; CIARLETTA; AMAR, 2011; HAASS e HERLYN, 2005).
Integrinas são proteínas heterodiméricas que recebem esse nome devido a sua
função mediadora entre os componentes extra e intracelulares, conectando ligantes
externos ao citoesqueleto e participando de vias de sinalização. Uma das suas funções
mais bem conhecidas é a promoção da migração celular: formam-se adesões focais na
porção anterior da célula em migração, as quais são constituídas de clusters de
integrinas associadas aos filamentos de actina através de proteínas intermediárias,
como a vinculina; esse pontos de adesão são conectados, através das integrinas, a
componentes da matriz extracelular; a movimentação lateral desses contatos focais
juntamente com a constante remodelação do citoesqueleto de actina permite a
migração celular (WEHRLE-HALLER e IMHOF, 2003; LUO; CARMAN; SPRINGER,
2007). O papel da integrina no câncer é amplamente estudado, sendo que diferentes
heterodímeros de integrinas podem ser inibidos ou super expressos em diferentes tipos
de câncer. A linhagem B16-F10 contêm maior expressão de integrina α
vna superfície
celular, a qual é moduladora da interação com a matriz extracelular, especialmente a ligação com fibronectina. Esta integrina é recrutada para modular o processo metastático, bem como a sobrevivência celular em frente a morte por desadesão ao substrato, mecanismo denominado anoikis (QUIAN et al, 2005). Zhao e colaboradores (2008) mostraram uma correlação positiva entre inibição de integrina α
4e diminiução da capacidade metastática e de adesão de células da linhagem B16-F10 em modelo in vivo, após tratamento com ácido gambógico. Mizuno e colaboradores (2008) estudaram o efeito da expressão de duas variantes de integrina α
3β
1(α
3Aβ
1e α
3Bβ
1) em células de carcinoma hepatocelular humano (linhagem HepG2), através de transfecção de cDNA, induzindo a maior produção desses receptores. Células transfectadas apresentaram maior adesão em laminina-5, maior capacidade migratória neste mesmo substrato e maior capacidade invasiva através de membranas também cobertas com laminina-5 (ZHAO et al, 2008; MINUZO et al, 2008).
Na embriogênese, a formação dos diversos órgãos e tecidos está relacionado à conversão de células epiteliais, imóveis e com alta interação inter-celular, em células mesenquimais, as quais possuem alta mobilidade e fraca interação célula-célula.
Recentemente essa transição epitélio-mesenquimal (EMT, epithelial-mesenchymal transition) tem sido alvo de diversos estudos em oncologia devido a sua aparente relação com o aumento da capacidade invasiva, e por conseqüência capacidade metastática, em diversos modelos tumorais (YANG e WEINBERG, 2008).
A EMT inclui diversas modificações celulares e do microambiente tumoral, entre
elas: células com características epiteliais perdem as interações célula-célula devido a
modificações nos desmossomos (junções aderentes), resultantes da substituição de E-
caderinas por N-caderinas; há reformulação do citoesqueleto e de receptores da
superfície celular, em parte modulado pela maior expressão de proteínas da família Rho
associadas a GTP (Rho-GTRases); há secreção de metaloproteases, tanto por células
tumorais como por células do hospedeiro; ocorre nessas células grande produção de
exossomos, vesículas recentemente associadas a sinalização com as células da
vizinhança do tumor primário e com o tumor secundário, bem como com o
remodelamento do microambiente tumoral, através da secreção de proteínas de
adesão, miRNAs, e informação genética. Esses e outros processos auxiliam na
transição da morfologia celular e aumentam a capacidade invasiva das células cancerosas (VOULGARI e PINTZAS, 2009; MATHIAS; GOPAL; SIMPSON, 2012).
Portanto, a baixa expressão de E-caderina induz perda de adesividade das células tumorais, desestabilizando as adesões célula-célula via junções aderentes, aumentando a motilidade celular. Com a supressão de E-caderina, β-catenina livre induz proliferação celular e expressão de metaloproteases da matriz extracelular (MMPs), as quais são endopeptidases que clivam as proteínas que constituem a matriz extracelular, modulando a capacidade invasiva e migratória das células tumorigênicas (DANILOV et al, 2008; OUHTIT et al, 2009).
Células B16-F10 apresentam aumento da produção de proteases. Dentre essas destacam-se as MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP, as quais degradam, entre outros substratos, o colágeno IV, maior integrante das membranas basais, resultando na capacidade invasiva das células, possibilitando ultrapassar barreiras teciduais, como a matriz extracelular e a parede vascular (KASAOKA et al, 2007).
1.4.2 Metaloproteinases
Metaloproteinases de matriz (MMPs) são proteínas dependentes de íons
metálicos (geralmente zinco), dependentes de ativação enzimática, capazes de
degradar diferentes componentes da matriz extracelular, remodelando o ambiente
tecidual, possuindo grande importância biológica no desenvolvimento dos seres vivos e
em patologias. São reguladas em vários níveis, no controle da transcrição, na ativação
por outros componentes celulares, durante a secreção e em sua degradação. Estão
presentes mais ativas no microambiente tumoral do que em tecidos normais
(STERNLICHT e WERB, 2001). A expressão é regulada por fatores de crescimento,
citocinas, hormônios e oncogenes. A atividade das MMPs é altamente controlada no
microambiente tumoral e é empregada no remodelamento da matriz, na promoção da
angiogênese e da migração celular. Algumas MMPs atuam degradando inibidores de
proteinases, como a inibidora de proteinase α1, permitindo assim a
conversão de MMPs inativas em ativas. Outra forma de regulação é através de
espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidas por células inflamatórias presentes no
ambiente tumoral. As ROS são capazes de oxidar o domínio de cisteína da MMP,
ativando-a (KESSENBROCK, PLAKS e WERB, 2010).
Uma das funções das MMPs no ambiente tumoral está em direcionar a invasão de tecidos adjacentes e as metástases. O fator de crescimento β (TGF- β) atua inicialmente como um supressor tumoral, promovendo a diferenciação celular. Com a progressão da doença, o acúmulo de mutações no gene que expressa o receptor desse fator torna as células tumorais irresponsivas a ele, porém este passa a ser usado pelas células cancerígenas para diminuir a vigilância do sistema imune nos tecidos adjacentes, facilitando a invasão e posterior metástase. O TGF- β é expresso em sua forma inativa, dependendo de ação proteolítica de outras proteínas para atuar. Estudos mostram que MMP-9 e MMP-2 são capazes de clivar e ativar TGF- β, sendo que em situações tumorais, ambas encontram-se amplamente concentradas em clusters na superfície celular, associadas aos receptores CD44 e integrina α
Vβ
3respectivamente, promovendo a capacidade invasiva e metastática (KESSENBROCK, PLAKS e WERB, 2010; YU e STAMENKOVIC, 1999).
1.4.3 Proteoglicanos e Glicosaminoglicanos
Glicosaminoglicanos (GAGs) são cadeias polissacarídicas formadas por
dissacarídeos repetidos, sendo um destes sempre um amino açúcar, apresentando
normalmente carga negativa devido a grupos sulfato e carboxila presentes nessas
unidades repetitivas. Proteoglicanos são proteínas associadas a um número variado de
GAGs de forma covalente. GAGs diferem de acordo com a unidade dissacarídica
repetida que aprensetam e a geometria da ligação glicosídica entre essas. Podem ser
não sulfatados (ácido hialurônico) ou sulfatados (heparam sulfato, condroitim sulfato,
dermatam sulfato, queratam sulfato e heparina). Exercem funções de adesão,
crescimento, diferenciação e sinalização celular, além de propriedades anticoagulantes
(GANDHI e MANCERA, 2008). Os Proteoglicanos de Heparam Sulfato (HSPG) estão
presentes em todas as células animais, e atuam como moléculas de reconhecimento e
de ativação para uma variedade de ligantes extracelulares. Os HSPG de superfície
celular estão associados principalmente a duas famílias de proteínas: sindecans,
proteínas transmembranicas com alto conteúdo de prolinas, resultando em estruturas
extendidas; e glipicans, proteínas transmembranicas globulares com um domínio conservado de 14 cisteínas, associadas a glicosil-fosfatidil-inositol (BERNFIEL et al, 1999).
Em processos tumorais, os HSPGs têm sido associados principalmente a sua participação na angiogênese tumoral. Fuster e colaboradores (2007) estudaram o efeito de alterações na sulfatação de HSPGs quanto a angiogênese de tumores pulmonares de Lewis e de melanoma (linhagem celular B16BL6), em linhagens de ratos manipulados para expressar menor atividade de N-acetilglucosamina N- desacetilase/Nsulfutransferases -1 (Ndst1), uma família de quatro proteínas associadas a modificações nesses proteoglicanos. Em ambos os tumores houve menor aumento de massa tumoral no grupo com comprometimento da atividade da Ndst1, bem como menor densidade microvascular (FUSTER et al, 2007).
Os pontos de adesão focal (pontos de contato entre as células e a matriz extracelular) regulam diversos aspectos celulares, como proliferação, diferenciação e migração. O HSPG sindecan 4 é constituinte e modulador destas adesões focais, podendo se ligar a moléculas da matriz extracelular, como a fibronectina (PETIT e THIERY, 2000). O fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF-2) é constitutivamente expresso em células de melanoma, modulando a progressão tumoral e o desenvolvimento de características metastáticas, tendo como receptores FGF-1, FGF-4 e HSPGs (MEIER et al, 2003). Chalkiadaki e colaboradores (2008) demonstraram o efeito do pré-tratamento com FGF- 2 em células de melanoma da linhagem M5, gerando significativa queda na expressão de sindecan-4, com conseqüente aumento da capacidade migratória e menor capacidade aderente dessas células sobre FN, o que pode estar associado a perda dos pontos de adesão focal. No mesmo estudo, células M5 tratadas com heparatinases (enzima que cliva heparam sulfato) apresentaram menor capacidade aderente e maior capacidade migratória sobre substrato de FN.
Proteoglicanos da superfície celular de células tumorigênicas podem sofrer ação de enzimas proteolíticas denominadas shedases e heparanases secretadas pela própria célula. Esta ação cliva o ectodomínio destes PGs, ou atuam sobre as cadeias de GAGs, liberando PGs livres ou fragmentados, os quais podem atuar no alojamento tumoral.
(CHALKIADAKI et al, 2008).
Os GAGs também exercem modulações celulares quando presentes na matriz extracelular, como é o caso do ácido hialurônico (HA), um dos principais componentes da matriz, presente na forma de alto peso molecular (HMW-HA), composto de dissicarídeos repetitivos com unidades de N-acetilglucosamina e ácido glucurônico, sendo CD44 o principal receptor de superfície celular para esse GAG (ARUFFO et al., 1990). O ácido hialurônico é um importante determinante do comportamento das células tumorais. A elevada síntese de HA por essas células induz a formação de uma matriz tênue e densa, a qual propicia a mobilidade e a invasão tecidual. O receptor CD44 também atua no remodelamento da matriz através de regulação da disponibilidade de HA, promovendo a captação deste, modificando assim a dinâmica de migração celular (PONTA; SHERMAN; HERRLICH, 2003).
Expondo a linhagem de carcinoma pulmonar de Lewis a fragmentos de ácido hialurônico, Fieber e colaboradores (2003) mostraram aumento da produção de mRNAs codificantes de MMP-9 e MMP-13 em resposta a fragmentos pequenos de HA (menores do que 60 kDa). Em outro estudo, Voelcker e colaboradores (2007) utilizaram hialuronidases para gerar fragmentos de HA, os quais foram então adicionados a culturas de melanoma (linhagem Bro). Análises de PCR em tempo real mostraram que após 6 horas de exposição houve super-expressão de mRNAs codificantes para interleucina-8 (IL-8) e MMP-2 (resposta não encontrada quando as células foram expostas a HMW-HA). Ambos os estudos demonstram a capacidade de produção de moléculas que promovem o remodelamento do micro-ambiente tumoral em resposta a fragmentos de HA e sua interação com as células tumorais, sendo que muitos estudos apontam a capacidade de síntese de hialuronidases em diferentes células cancerígenas (STERN, 2008).
1.5 TRATAMENTO DO CÂNCER E PRODUTOS NATURAIS
O diagnóstico precoce, a ampliação do acesso à centros médicos e o desenvolvimento de novas terapias aumentou significativamente a possibilidade de cura e/ou sobrevida para pacientes com câncer, apesar de esta ainda ser a segunda maior causa de mortes no mundo (IARC, 2014).
A remoção cirúrgica continua sendo a forma mais efetiva no combate a tumores
primários sólidos, e o advindo da radioterapia e da quimioterapia permitiu um uso mais conservador e menos invasivo dessa forma de intervenção, obtendo-se resultados promissores através de tratamentos complementares envolvendo essas três técnicas.
Além dessas abordagens, o crescente conhecimento do perfil molecular da célula cancerígena e do papel do microambiente tumoral vem permitindo o desenvolvimento de novas terapias contra a doença, como por exemplo através do uso de inibidores moleculares específicos, da modulação do sistema imune do paciente e do comprometimento da angiogênese do tumor (URRUTICOECHEA et al, 2010).
O tratamento do câncer torna-se muito mais complexo quando há a metástase do tumor primário, aumentando a relevância das terapias auxiliares à cirurgia, como a quimioterapia. Este tipo de abordagem baseia-se em causar danos ao ciclo celular, afetando mais intensamente células com alta taxa de divisão, havendo períodos de intervalo entre as intervenções para permitir a recuperação dos tecidos normais também afetados. Para maior taxa de sucesso, são administrados quimioterápicos com diferentes alvos moleculares, permitindo máxima sinergia do efeito antitumoral e mínima toxicidade pela associação de quimioterápicos. Porém, mesmo em terapias que utilizam um conjunto de medicamentos, pode haver desenvolvimento de resistência às drogas e/ou prevalência de sítios tumorais, seja por mecanismos celulares ou pela inadequada perfusão do tratamento no ambiente tumoral (GALMARINA et al, 2012; CALEY; JONES, 2012).
Assim como em outros tipos de câncer, o tratamento contra o melanoma baseia- se no estágio de desenvolvimento da doença. Tumores com até 2mm de espessura têm a remoção cirúrgica como procedimento mais adotado. A partir do estágio II (espessura maior do que 2mm e presença de metástases) adota-se o uso de terapias adjuvantes à excisão. Além do uso da quimioterapia e radioterapia, destacam-se o uso de algumas abordagens: interferon-α2b (INF-α-2b), possui atividade imunomoduladora e antiangiogênica, apresentando resposta heterogênea na sobrevida dos pacientes e altos níveis de hepatotoxicidade; vemurafinib e dabrafenib, inibidores do gene BRAF, o qual participa da sinalização de proliferação celular, estando mutado em 40 a 70% dos melanomas, porém muitos tumores desenvolvem resistência a essa inibição;
imunoterapias e vacinas, como o uso de interleucina-2, promovendo o reconhecimento
e ativação das células do sistema imune contra as células cancerígenas (GARBE et al, 2011; MAVERAKIS et al, 2015).
Existem atualmente mais de 30 drogas citotóxicas utilizadas no tratamento de tumores malignos. A falta de seletividade dessas drogas gera diversos efeitos colaterais, como a destruição de células do sistema imune, aparecimento de úlceras orais, diarréia, perda de cabelo, dano ao tecido nervoso e aos rins (IARC,2014).
A atuação de polissacarídeos no combate ao câncer foi primeiramente identificada há mais de 100 anos e descrita por Nauts e colaboradores em 1946. Em seu artigo, Nauts descreve relatos do médico William Coley fazendo uso do emprego de toxinas produzidas por bactérias em casos de câncer ditos como inoperáveis, resultando em remissão da doença e aumento de sobrevida de alguns pacientes (NAUTS et al,1946).
Polissacarídeos são moléculas longas formadas pela união de monossacarídeos através de ligações glicosídicas, resultando em estruturas lineares ou ramificadas.
Muitos efeitos medicinais desses compostos já foram e ainda são amplamente
encontrados e descritos na literatura, obtidos a partir de fungos (majoritariamente em
cogumelos), plantas, algas, animais e bactérias. Entre suas diversas funcionalidades
biológicas, são relatadas atividades antitumorais através de inibição do crescimento
tumoral, inibição de angiogênese, indução de apoptose, aumento de
imunocompetência, diminuição de capacidade metastática e perda de viabilidade
celular (ZONG, CAO e WANG, 2012). A tabela (Tabela 1) abaixo apresenta alguns
exemplos de fontes, modelos tumorais em que foram testados e efeitos de alguns
polissacarídeos.
TABELA 1: Polissacarídeos extraídos de variadas fontes apresentam atividades antitumorais e imunoestimulatórias em diferentes modelos experimentais.
Espécie Modelo Tumoral Efeitos
Origem: Fungos
Agaricus brasiliensis Tumor de Ehrlich em camundongos Diminuição da produção de IL-10 induzida pelo tumor; alteração do
microambiente tumora
Inonotus obliquus Tumor induzido por linhagem B16-F10 em camundongos
Aumento da taxa de sobrevivência;
inibição do crescimento tumoral; aumento de proliferação de macrófagos Origem: Plantas
Cactus pear fruit Tumor induzido pela linhagem celular S180
Inibição do crescimento tumoral; indução de apoptose; aumento de atividade
imunológica
Gynostemma pentaphyllum Makino Linhagens celulares HepG2 e Hela Inibição da proliferação celular; inibição da progressão do ciclo celular Origem: Algas
Fucus evanescens Carcinoma pulmonar de Lewis induzido em camundongos
Efeito antimetastático; potenciação do efeito da ciclofosfamida
Sargassum sp Linhagens celulares B16 e de carcinoma pulmonar de Lewis
Inibição da proliferação celular; indução de apoptose; aumento de atividade de
células NK Origem: Animais
Gekko swinhonis Guenther Linhagens celulares Bel-7420 e SMMC- 7721 de hepatocarcinoma
Inibição de proliferação celular; inibição de migração celular através de regulação
do citoesqueleto de actina
Hyriopsis cumingii Linhagem celular HepG2 Inibição da proliferação celular; inibição da progressão do ciclo celular; indução
de apoptose
(Fonte: adaptado de ZONG et al, 2012)
