Caracterização e estudo da do produzido por Bacillus subtilis LAMI005 a partir do suco de caju

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

ANNE KAMILLY NOGUEIRA FELIX

CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO DA APLICABILIDADE DO BIOSSURFACTANTE PRODUZIDO POR Bacillus subtilis LAMI005 A PARTIR DO SUCO DE CAJU

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ANNE KAMILLY NOGUEIRA FELIX

CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO DA APLICABILIDADE DO BIOSSURFACTANTE PRODUZIDO POR Bacillus subtilis LAMI005 A PARTIR DO SUCO DE CAJU

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, do Centro de Tecnologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química. Área de concentração: Processos Químicos e Bioquímicos.

Orientadora: Profª. Dra. Rílvia Saraiva de Santiago Aguiar

Coorientadora: Profª. Dra. Luciana Rocha Barros Gonçalves

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Pós-Graduação em Engenharia - BPGE

F36c Felix, Anne Kamilly Nogueira.

Caracterização e estudo da aplicabilidade do biossurfactante produzido por Bacillus subtilis

LAMI005 a partir do suco de caju. / Anne Kamilly Nogueira Felix – 2012.

103 f. : il. color., enc. ; 30 cm.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Departamento de Engenharia Química, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Fortaleza, 2012.

Área de Concentração: Processos Químicos e Bioquímicos. Orientação: Profa. Dra.Rílvia Saraiva de Santiago Aguiar. Coorientação: Profa. Dra. Luciana Rocha Barros Gonçalves.

1. Engenharia química. 2. Emulsificantes. I. Título.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço inicialmente e principalmente a Deus, pois não houve um só momento em minha vida que eu não me sentisse amparada por ele.

A Nossa Senhora Aparecida e Santo Expedito, dos quais sou devota, agradeço pela vida, saúde e por me atender prontamente em momentos difíceis e me proporcionar momentos inesquecíveis.

Agradeço aos meus pais pelo exemplo, incentivo, apoio e carinho. Meu paizão Wilson, exemplo de homem, pai, alegria e companheirismo, por diariamente me proporcionar manhãs maravilhosas me fortalecendo para a luta do dia-dia. Minha mamãe Idelzuite, exemplo de mulher guerreira, mãe, profissional e zelo, por sempre cuidar de mim com tanto carinho e me apoiar em todas as decisões.

As minhas irmãs, meu orgulho, meninas batalhadoras, estudiosas, lindas e muito especiais. Karollyne, minha gordinha linda que amo incondicionalmente, por ser minha confidente e sempre me apoiar em tudo na minha vida. Ludmila, por ser o alicerce de toda a nossa família e sempre ter a palavra certa na hora certa.

A minha madrinha Alzenir, minha segunda mãe, por proporcionar momentos inigualáveis em minha vida, principalmente em minha infância, pessoa com a qual, mesmo distante, sempre posso contar.

Ao meu noivo Marcelo, pelo amor, companheirismo, paciência ao entender minha ausência em muitos momentos e, ao mesmo tempo, por ser uma pessoa tão presente.

Aos meus amigos Júnior, Carolina Freire e Fernanda por uma amizade tão especial e cúmplice.

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A professora Dra. Rílvia Saraiva de Santiago Aguiar, por acreditar em mim ao me aceitar como sua orientanda.

A professora Dra. Maria Valderez Ponte Rocha, pelas correções na dissertação e, principalmente, por estar sempre à disposição de todos no grupo GPBio do qual fazemos parte.

A enorme galerinha do GPBio: Álvaro, Bete, Cleiton, Cristiane, Darlane, Diana, Edvan, Emanuel, Iuri, Ítalo, Jéssyca, Juliana, Kênia, Leonardo, Ticiane e Tigressa, obrigada pelo companheirismo de todos, pelos conhecimentos compartilhados e momentos de descontração. Em especial a minhas amigas Camilla, Jéssyca, Juliana, Kênia, Marylane e Ticiane por essa amizade tão especial, presente em momentos bons e ruins.

A todos do GPTA: Ana Alice, Daniel, Filipe, Marcinha, Regiane e todos os outros que fazem parte desse grupo que me recebeu de braços abertos.

Ao Gustavo, um amigo que me ajudou muito no desenvolvimento desse trabalho, meus sinceros agradecimentos.

A Larissa e Gaby, pessoas muito queridas.

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“A amizade desenvolve a felicidade e

reduz o sofrimento, duplicando a nossa

alegria e dividindo a nossa dor.”

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RESUMO

Os surfactantes são moléculas anfipáticas, que possuem em sua estrutura química segmentos hidrofóbicos e hidrofílicos, espacialmente separados que auxiliam na formação de emulsões e disponibilizam compostos à célula microbiana. Em função dessas características, os emulsificantes reduzem a tensão superficial na interface das fases imiscíveis, permitindo, portanto, que elas se misturem, formando a emulsão. Muitos tipos de surfactantes quimicamente sintetizados são hoje utilizados, embora o desenvolvimento de produtos alternativos, biodegradáveis e menos tóxicos, como os chamados biossurfactantes, agentes obtidos por via microbiológica, seja uma estratégia importante na obtenção de componentes mais compatíveis com o meio ambiente e na ampliação das propriedades específicas e aplicações desses compostos. Nesse contexto, o presente trabalho tem como objetivo, caracterizar o biossurfactante produzido por Bacillus subtilis LAMI005 utilizando suco de caju como fonte de carbono, ao realizar estudos de conformação e estrutura dos compostos, determinando assim os grupos funcionais pertencentes à molécula; estudar os efeitos toxicológicos da surfactina produzida, visando um maior entendimento sobre a toxicidade do biossurfactante em organismos vegetais e animais; avaliar a manutenção das características tensoativas da surfactina ao ser submetida a diferentes condições ambientais, além de estudar a estabilidade das emulsões formadas com o biossurfactante que foi produzido em suco de caju clarificado, agregando-se valor ao processo, uma vez que a fonte utilizada é disponível e de baixo custo. Os espectros obtidos indicaram a similaridade entre a surfactina produzida neste trabalho e a surfactina padrão (Sigma). O lipopeptídeo produzido apresentou atividade superficial altamente estável, com uma CMC igual a 12,5 mg.L-1 e sendo capaz de reduzir a tensão superficial da água para 31,8 mN.m-1 e a tensão interfacial do n-hexadecano para 2 mN.m-1. A habilidade de emulsificação a altas temperaturas, pHs ácidos e básicos e diferentes concentrações de NaCl também foi demonstrada. Os diagramas de fase mostraram a possibilidade de aplicação do biossurfactante na biorremediação, no tratamento de resíduos e em fluidos de corte. O biossurfactante também apresentou atóxico quando analisado frente à Artemia salina com CL50 igual 612,27 g.mL-1 e frente Lactuca sativa, no qual apresentou índice de germinação superior a 80% em concentrações elevadas, evidenciando seu potencial para aplicações na indústria de cosméticos, alimentos e fármacos. O biossurfactante produzido também se mostrou eficiente ao remover, aproximadamente, 82% do diesel e 77% do petróleo adsorvidos em areia.

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ABSTRACT

The surfactants are amphipathic molecules which have in their chemical structure hydrophobic and hydrophilic segments, spatially separated to assist in the formation of emulsions available compounds and the microbial cell. Due to these characteristics, the emulsifiers decrease the surface tension at the interface of immiscible phases, allowing thus that they mix to form the emulsion. Many types of chemically synthesized surfactants are used used today, although the development of alternative products, less toxic and biodegradable, as so-called biosurfactants obtained by microbiological agents, is an important strategy in obtaining components more compatible with the environment and expanding specific properties and applications of these compounds. In this context, this study aims to characterize the biosurfactant produced by Bacillus subtilis LAMI005 using cashew apple juice as carbon source, to conduct studies of the structure and conformation of the compounds, thereby determining the functional groups belonging to the molecule, to study the toxicological effects of surfactin produced, designed to further understanding of the toxicity of the biosurfactant in vegetable and animal organisms; evaluate the maintenance of the characteristics of surfactants surfactin to be subjected to different environmental conditions, in addition to studying the stability of emulsions formed with biosurfactant which was produced in clarified cashew juice, adding value to the process, since the source used is available and inexpensive. The spectra obtained indicated the similarity between this work produced surfactin and surfactin standard (Sigma). The lipopeptide surface produced had a highly stable activity, with a CMC 12.5 mg.l-1 and capable of reducing the surface tension of water to 31.8 mN.m-1 and interfacial tension of n-hexadecane to 2 mN.m-1. The ability of emulsifying at high temperatures, acidic and basic pH and different concentrations of NaCl was also demonstrated. The phase diagrams shown the possibility of application of the biosurfactant in the bioremediation of waste treatment and cutting fluids. The biosurfactant also showed non-toxic when analyzed in the brine shrimp with LC50 equal to 612.27 µg.mL-1

forward and Lactuca sativa, presented at which germination index higher than 80% high concentrations, demostrating its potential for applications in the cosmetics industry , food and drugs. The biosurfactant produced also efficient in removing, approximately, 82% diesel and 77% petroleum adsorbed on sand.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Organização das moléculas na (1) tensão superficial e (2) interfacial (Barreto, 2011).

27

Figura 2 – Relação da tensão superficial com a concentração de surfactante no sistema. Em destaque a CMC, momento em que as micelas começam a ser formadas (Barreto, 2011).

28

Figura 3 – Estrutura química da molécula de surfactina (Nitschke e Pastore, 2002).

32

Figura 4 – Coluna cromatográfica de fase reversa utilizada para a purificação do biossurfactante produzido por Bacillus subtilis LAMI005 utilizando suco de caju.

39

Figura 5 – Esquema de distribuição das sementes para a realização do teste de toxicidade aguda por meio do índice de germinação e alongamento das raízes de alface Lactuca sativa.

45

Figura 6 – Espectro de infravermelho da fração F:29-35 (biossurfactante purificado).

49

Figura 7 – _{Espectro de RMN}1

H da fração F:29-35 (300 MHz, piridina-d5). 51 Figura 8 – Espectro de RMN 13C da fração F:29-35 (75 MHz, piridina-d5). 53 Figura 9 – Espectro de massa de alta resolução. (1) fração 29-35; (2) surfactina

padrão (Sigma).

54

Figura 10 – Estruturas de [Ile]Surfactina (1) e [Leu]Surfactina (2). (ITOKAWA et

al., 1994).

55

Figura 11 – Concentração Micelar Crítica (CMC) da surfactina produzida por B.

subtilis LAMI005 a partir do suco de caju clarificado. Barras de erro

representam o desvio padrão.

56

Figura 12 – Índice de Emulsificação (IE24) de diferentes emulsões de hidrocarbonetos com biossurfactante de Bacillus subtilis LAMI005. Barras de erro representam o desvio padrão.

58

Figura 13 – Estabilidade da emulsão, até 96 horas, com diferentes hidrocarbonetos. (■) gasolina, (●) diesel, (▲) querosene, (▼) n-hexadecano, (◄) tolueno e (►) heptano. Barras de erro representam o desvio padrão.

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formada com diesel (■) e na atividade superficial (■) do biossurfactante produzido por Bacillus subtilis LAMI005. Barras de erro representam o desvio padrão.

Figura 15 – Efeito da variação da força iônica no Índice de Emulsificação de emulsão formada com diesel (■) e na atividade superficial (■) do biossurfactante produzido por Bacillus subtilis LAMI005. Barras de erro representam o desvio padrão.

62

Figura 16 – Efeito da variação da temperatura no Índice de Emulsificação de emulsão formada com diesel (■) e na atividade superficial (■) do biossurfactante produzido por Bacillus subtilis LAMI005. Barras de erro representam o desvio padrão.

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Figura 17 – Ilustração da obtenção de dados para a construção dos diagramas de fases, com composições de 20 a 90% (v/v) de solução de biossurfactante. a. Condição inicial (surfactina – querosene); b. Condição inicial (surfactina – diesel); c. Condição final após ser submetido a 90ºC (surfactina – querosene); d. Condição final após ser submetido a 90ºC (surfactina – diesel).

66

Figura 18 – Diagramas de fases para o sistema de composição A/O em função da temperatura. (1) Querosene; (2) Diesel. E - fase emulsionada; A – fase aquosa; O - fase óleo.

67

Figura 19 – Índice de Germinação (■) e crescimento das raízes (■) da espécie

Lactuca sativa em diferentes concentrações do biossurfactante

produzido por LAMI005 em suco de caju. Barras de erro representam o desvio padrão.

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Figura 20 – Taxa de mortalidade da espécie Artemia salina em diferentes concentrações do biossurfactante produzido por LAMI005.

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LISTA DE TABELAS

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LISTA DE SÍMBOLOS

IE24 Índice de emulsificação HFE Altura da fase emulsionada HTOTAL Altura total da solução

%GS Porcentagem de germinação de sementes %GE Porcentagem de germinação no extrato %GC Porcentagem de germinação no controle %CR Porcentagem de crescimento da raiz MCE Crescimento no extrato (média) MCC Crescimento no controle (média)

CL50 Concentração letal para 50% da população ppm Partes por milhão

δH Deslocamento químico em ressonância magnética nuclear de hidrogênio δC Deslocamento químico em ressonância magnética nuclear de carbono A Fase aquosa

O Fase óleo

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO... 15

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 17

2.1 Surfactantes e biosssurfactantes... 17

2.2 Classificação dos biossurfactantes... 19

2.3 Aplicação dos biossurfactantes... 22

2.3.1 Aplicações ambientais... 23

2.3.2 Aplicação nas indústrias de alimentos e cosméticos... 24

2.3.3 Aplicações medicinais e biológicas... 26

2.4 Propriedades funcionais dos biossurfactantes... 27

2.5 A utilização de substratos alternativos na produção de biossurfactantes.. 29

2.6 Surfactina... 31

2.7 Recuperação e elucidação estrutural da surfactina... 35

3 MATERIAIS E MÉTODOS... 37

3.1 Produção do biossurfactante... 37

3.1.1 Substrato e meios de cultura... 37

3.1.2 Produção do biossurfactante... 38

3.2 Extração e purificação do biossurfactante... 38

3.2.1 Extração líquido-líquido... 38

3.2.2 Cromatografia em coluna de fase reversa C18... 39

3.3 Análise estrutural do biossurfactante... 40

3.3.1 Espectroscopia de Infravermelho (FTIR)... 40

3.3.2 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)... 40

3.3.3 Espectrometria de Massa de Alta Resolução... 41

3.4 Caracterização físico-química do biossurfactante... 41

3.4.1 Tensão superficial e determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC)... 41

3.4.2 Índice de Emulsificação e estabilidade da emulsão... 42

3.4.3 Avaliação da estabilidade do biossurfactante (efeito do pH, da salinidade e da temperatura)... 42

3.5 Diagrama de fases... 43

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3.6.1 Teste de germinação com Lactuca sativa... 44

3.6.1.1 Procedimento de teste... 44

3.6.2 Bioensaio toxicológico frente às larvas de Artemia salina ... 46

3.7 Aplicação do biossurfactante na remoção de hidrocarbonetos contaminantes de areia... 46

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES... 48

4.1 Caracterização estrutural do biossurfactante purificado... 48

4.2 Tensão superficial e determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC)... 55

4.3 Índice de emulsificação e estabilidade da emulsão... 57

4.4 Efeito do pH, da força iônica e da temperatura na atividade do biossurfactante... 60 4.4.1 Efeito do pH... 60

4.4.2 Efeito da força iônica... 62

4.4.3 Efeito da temperatura... 63

4.5 Diagramas de fases... 65

4.6 Bioensaios toxicológicos... 68

4.6.1 Teste de germinação com Lactuca sativa... 68

4.6.2 Teste de mortalidade do microcrustáceo da espécie Artemia salina... 69

4.7 Aplicação do biossurfactante na remoção de hidrocarbonetos contaminantes de areia... 71

5 CONCLUSÕES... 73

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 74

ANEXO A... 90

ANEXO B... 92

ANEXO C... 98

ANEXO D... 100

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Caracterização e Estudo da Aplicabilidade do Biossurfactante Produzido por Bacillus Subtilis a partir do Suco de Caju

1 – INTRODUÇÃO

Os surfactantes são agentes ativos de superfície que reduzem a energia livre do sistema por substituir a maior parte das moléculas de alta energia na interface, diminuindo assim, a tensão superficial e interfacial dos líquidos (BUENO, 2010). São moléculas anfipáticas contendo porções hidrofílicas e hidrofóbicas que se particionam, preferencialmente, na interface entre fases fluidas que possuem diferentes graus de polaridade e pontes de hidrogênio, como interfaces óleo/água ou ar/água. A porção apolar é frequentemente uma cadeia hidrocarbonada enquanto a porção polar pode ser iônica (catiônica ou aniônica), não-iônica ou anfotérica (DESAI e BANAT, 1997). Estas características permitem aos surfactantes a formação de microemulsões nas quais os hidrocarbonetos podem se solubilizar em água ou a água pode se solubilizar em hidrocarbonetos (RON e ROSENBERG, 2001).

Outra propriedade fundamental dos surfactantes é a tendência de formar agregados chamados micelas que são compostos termodinamicamente estáveis, facilmente reprodutíveis e, geralmente, se formam a baixas concentrações em água (MRESTANI et al., 2000). A concentração mínima na qual se inicia a formação de micelas chama-se Concentração Micelar Crítica (CMC). A CMC é um dos índices mais utilizados para a avaliação da atividade surfactante podendo ser definida, também, como a solubilidade de um surfactante dentro da fase aquosa (RUFINO, 2006). A eficiência e a efetividade são características básicas essenciais que determinam um bom surfactante. A eficiência é medida através da CMC, enquanto que a efetividade está relacionada com as tensões superficiais e interfaciais (BARROS et al., 2007). Estas propriedades tornam os surfactantes adequados para uma gama de aplicações industriais envolvendo: detergência, emulsificação, lubrificação, capacidade espumante, capacidade molhante, solubilização e dispersão de fases (BARROS et al., 2007).

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Biossurfactantes são compostos de origem microbiana que exibem atividade superficial, consistem em subprodutos metabólicos de bactérias, fungos e leveduras, que sintetizam essas moléculas a partir de vários substratos incluindo açúcares, óleos, alcanos e resíduos agroindustriais (CAMEOTRA e MAKKAR, 2004; NITSCHKE E PASTORE, 2002; MESQUITA, 2004).

A possibilidade de produção de surfactantes a partir de substratos renováveis e de diferentes espécies microbianas permite a obtenção de compostos com características estruturais e propriedades físicas distintas, tornando-os comparáveis ou superiores aos surfactantes sintéticos em termos de eficiência. A superioridade dos biossurfactantes é confirmada nas vantagens que estes exercem sobre os seus homólogos químicos, como uma menor toxicidade, biocompatibilidade, maior biodegradabilidade, estabilidade em extremos de temperatura, salinidade e pH (CANET et al., 2002; APARNA et al., 2012; MEDEIROS, 2007). No entanto, a produção de biossurfactante apresenta problemas como o alto custo dos substratos associado com métodos ineficientes de recuperação do produto (OLIVEIRA et al., 2013). Logo, a fim de se aumentar o uso industrial de biossurfactantes, o custo de produção deve tornar-se competitivo com os agentes tensoativos sintéticos. Uma possível estratégia para alcançar este objetivo é o uso de matérias primas alternativas, tais como resíduos agroindustriais como o pedúnculo de caju, uma alternativa barata, que utiliza um produto que tem 80% de seu total desperdiçado (OLIVEIRA et al., 2013).

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2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Surfactantes e biossurfactantes

Os surfactantes são agentes ativos de superfície que reduzem a energia livre do sistema por substituir a maior parte das moléculas de alta energia na interface, diminuindo assim, a tensão superficial e interfacial dos líquidos (BUENO, 2010). São moléculas anfipáticas contendo porções hidrofílicas e hidrofóbicas que se particionam, preferencialmente, na interface entre fases fluidas que possuem diferentes graus de polaridade e pontes de hidrogênio, como interfaces óleo/água ou ar/água. A porção apolar é frequentemente uma cadeia hidrocarbonada, enquanto que a porção polar pode ser iônica (catiônica ou aniônica), não-iônica ou anfotérica (DESAI e BANAT, 1997). Estas características permitem aos surfactantes a formação de microemulsões nas quais os hidrocarbonetos podem se solubilizar em água ou a água pode se solubilizar em hidrocarbonetos (RON e ROSENBERG, 2001).

Outra propriedade fundamental dos surfactantes é sua capacidade em formar micelas, onde a concentração mínima na qual se inicia a formação destas é chamada Concentração Micelar Crítica (CMC). Estas propriedades tornam os surfactantes adequados para uma gama de aplicações industriais envolvendo: detergência, emulsificação, lubrificação, capacidade espumante, capacidade molhante, solubilização e dispersão de fases (BARROS

et al., 2007).

Muitos surfactantes são sintetizados quimicamente a partir do petróleo, o que os tornam tóxicos ao meio ambiente, não facilmente degradável e seu processo de produção e subprodutos podem ser ambientalmente danosos (MAKKAR e CAMEOTRA, 2002), com isso, a demanda industrial por produtos biotecnológicos com características surfactantes é cada vez maior, devido sua eficácia, preocupações econômicas e compatibilidade ambiental (AL-BAHRY et al., 2012).

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Os biossurfactantes são produzidos por diversos micro-organismos e possuem diferentes estruturas químicas e propriedades de superfície (BOSCH, 1988). Essa capacidade de produção confere aos micro-organismos diversas vantagens no ambiente. Uma vez produzidos, os biossurfactantes podem ser liberados para o meio ou podem permanecer na superfície celular microbiana. Quando ficam retidos na parede, essas biomoléculas auxiliam no transporte de substratos insolúveis através da membrana (NITSCHKE e PASTORE, 2002). Quando excretados, são capazes de emulsionar e solubilizar hidrocarbonetos ou compostos insolúveis em água, permitindo o crescimento e desenvolvimento desses micro-organismos em substratos de natureza apolar. Além dessa função, influenciam também a adesão e liberação da célula a superfícies (MANEERAT e PHETRONG, 2007; VIRAMONTES-RAMOS et al., 2010).

O estudo dos biossurfactantes vem se intensificando nas últimas décadas, frente às diversas vantagens oferecidas por eles quando comparados aos surfactantes sintéticos. Dentre as principais vantagens, temos que os biossurfactantes: (i) produzem menor tensão superficial com menores concentrações, o que os tornam mais eficientes e efetivos do que surfactantes convencionais (COOPER e PADDOCK, 1984; BOGNOLO, 1999); (ii) apresentam maior estabilidade quanto às variáveis de temperatura, pH e salinidade, podendo ser utilizados em ambientes com condições extremas (BANAT, 1993; MAKKAR e CAMEOTRA, 1998; DAS e MUKHERJEE, 2005; ILORI et al., 2005; SEPAHY et al., 2005; ROCHA et al., 2007); (iii) apresentam alta biodegradabilidade na água e no solo, o que os tornam adequados para uso em biorremediação e tratamento de resíduos (DESAI e BANAT, 1997), e; (iv) são específicos, pois a grande diversidade química possibilita a escolha para aplicações específicas (DESAI e BANAT, 1997). Além disso, possuem baixa toxicidade (SCHIPPERS et al., 2000; MAKKAR e ROCKNE, 2003; EDWARDS et al, 2003), podem ser sintetizados em meio com uso de fontes de carbono renováveis (MAKKAR e CAMEOTRA 1999; MAKKAR e CAMEOTRA, 2002; MANEERAT, 2005) e ter sua estrutura química e suas propriedades físicas modificadas por meio de manipulações genéticas, biológicas ou químicas, permitindo o desenvolvimento de produtos para necessidades específicas (MULLIGAN e GIBBS, 1989; MUKHERJEE et al., 2006).

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substratos caros, os métodos de recuperação dos produtos nem sempre eficientes e o baixo rendimento por parte das cepas produtoras (NITSCHKE e PASTORE, 2002).

2.2 Classificação dos biossurfactantes

Os surfactantes sintéticos são classificados pela natureza do seu grupo polar, enquanto que os biossurfactantes são classificados de acordo com sua composição e sua origem microbiana. As principais classes incluem glicolipídeos, lipopeptídeos e lipoproteínas, fosfolipídeos e ácidos graxos, surfactantes poliméricos e surfactantes particulados (DESAI e BANAT, 1997).

Os glicolipídeos e os lipopeptídeos são considerados biossurfactantes de baixo peso molecular e são os mais efetivos na redução da tensão superficial (LIN, 1996). Já os biossurfactantes como polissacarídeos, proteínas, lipopolissacarídeos e lipoproteínas, são de alto peso molecular e mais efetivos em estabilizar emulsões O/A (CHRISTOFI e IVSHINA, 2002).

Glicolipídeos

Biossurfactantes da classe dos glicolipídeos têm na sua constituição moléculas de carboidratos (glicose, manose, galactose ou ramnose) em combinação com ácidos alifáticos de cadeias longas (HOLMBERG, 2001). Entre os glicolipídeos, os mais conhecidos são os ramnolipídeos, os trealolipídeos e os soforolipídeos.

Os ramnolipídeos, surfactantes pertencentes à classe dos glicolipídeos produzidos por diversas cepas de Pseudomonas aeruginosa, possuem em sua estrutura uma ou duas moléculas de ramnose ligadas a uma ou duas moléculas de ácido β-hidroxidecanóico, sendo que sete homólogos já foram estruturalmente identificados (ABALOS et al., 2001).

Nos biossurfactantes trealolipídeos produzidos por espécies de Mycobacterium,

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carbonos 6 e 6’ de ácidos micólicos (GAUTAM e TAYAGI, 2006). Trealolipídeos de diferentes organismos diferem no tamanho e estrutura do ácido micólico, no número de átomos de carbono e no grau de insaturação (ASSELINEAU e ASSELINEAU, 1978).

Estruturalmente, os soforolipídeos consistem de um carboidrato dimérico (soforose) ligado glicosidicamente ao grupo hidroxil do penúltimo carbono do ácido graxo de cadeia longa (C16-C18). Eles são produzidos por leveduras, como Candida bombicola, Candida

magnoliae Candida petrophilum, Candida bogoriensis e Candida apicola (GORIN et

al., 1961; TULLOCH et al., 1968; COOPER e PADDOCK, 1984; GOBBERT et al., 1984; HOMMEL et al., 1987; HOMME e HUSE, 1993).

Soforolipídeos têm suas propriedades tensoativas mantidas em condições extremas de pH, NaCl e temperatura (COOPER e PADDOCK, 1984). Além das propriedades tensoativas, os soforolipídeos apresentam um grande potencial como agentes terapêuticos e podem funcionar como antibacterianos (SHAH et al., 2007), anticancerígenos (SCHOLZ et

al., 1998; CHEN et al., 2006), antivirais (SHAH et al., 2005), e antifúngicos (SHAH et al.,

2007).

Lipopeptídeos e lipoproteínas

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Fosfolipídeos, ácidos graxos e lipídeos neutros

Bactérias e leveduras produzem grandes quantidades de ácidos graxos e fosfolipídeos surfactantes quando utilizam alcanos como fonte de carbono e de energia (CIRIGLIANO e GARMAN, 1984). O HLB (balanço hidrófilo-lipófilo), desses biossurfactantes é diretamente relacionado ao comprimento da cadeia hidrocarbônica em suas estruturas. Acinetobacter sp. produz vesículas de cadeias duplas com áreas de cabeça polar pequenas, denominadas fosfatidiletanolamina (KAPPELI e FINNERTY, 1979), as quais são capazes de promover a formação de microemulsões de alcanos em água (DESAI e BANAT, 1997).

Os lipídeos neutros compreendem os ácidos graxos, triacilgliceróis e ácidos micólicos. A maioria dos lipídeos neutros, como os triacilgliceróis e seus ácidos graxos constituintes, mostram algum grau de atividade tensoativa (COOPER e ZAJIC, 1980). Assim como os ácidos micólicos, eles constituem ácidos graxos mais complexos.

Surfactantes poliméricos

Biossurfactantes poliméricos ou lipopolissacarídeos são ácidos graxos ligados covalentemente a polissacarídeos. Os biossurfactantes poliméricos mais bem estudados são o emulsan, o liposan, a manoproteína e outros complexos de proteínas-polissacarídeos. Emulsan é um bioemulsificante extracelular produzido por A. calcoaceticus RAG-1. Foi o primeiro surfactante microbiano a ser produzido e comercializado em larga escala e é um dos mais efetivos emulsificantes (ROSENBERG e RON, 1999). É caracterizado como um heteropolissacarídeo polianiônico (FERRAREZZO, 1998).

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Surfactantes particulados

As células microbianas e vesículas extracelulares com atividades tensoativas são classificadas como biossurfactantes particulados. Algumas células microbianas apresentam elevada hidrofobicidade superficial, sendo consideradas por si só como biossurfactantes, a exemplo de algumas espécies de cianobactérias e patógenos, como S. aureus e Serratia sp. Bactérias do gênero Acinetobacter sp., quando crescem em meio contendo hexadecano, produzem vesículas extracelulares que têm função importante na captação de alcanos para a célula, possuindo elevada atividade surfactante (GAUTAM e TAYAGI, 1979).

Um grande número de micro-organismos tem se mostrado capaz de produzir compostos com atividade superficial variada, cujas funções ainda não foram totalmente elucidadas.

2.3 Aplicação dos biossurfactantes

Os biossurfactantes são uma classe de compostos que possuem ampla diversidade química com propriedades para aplicações específicas. A aplicação comercial dos biossurfactantes é determinada por seu custo de produção e suas propriedades em relação aos surfactantes sintéticos. A aplicação industrial dos biossurfactantes em larga escala ainda não é competitiva devido aos altos custos de produção (RODRIGUES et al., 2006). Contudo, os biossurfactantes têm ganhado considerável atenção mundial devido a sua baixa toxicidade, natureza biodegradável e diversidade de propriedades físico-químicas e biológicas.

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2.3.1 Aplicações ambientais

A maior parte dos resíduos orgânicos líquidos incluem pesticidas, solventes orgânicos e óleos (lubrificantes, combustíveis, hidráulicos, automotíveis e petróleo). Usualmente, a contaminação de solos e água é gerada por plantas de indústrias, derramamentos e/ou vazamentos acidentais de óleo e resíduos depositados inadequadamente em contêineres.

Outros tipos de contaminação provêm de aterros sanitários mal gerenciados, estabelecimentos de serviços automobilísticos, uso indiscriminado de pesticidas na agricultura e corantes usados nos processos de tingimento de roupas. A biorremediação objetiva prover tratamentos biológicos para reduzir a concentração desses contaminantes no ambiente à níveis ambientalmente aceitáveis. No entanto, grande parte desses compostos possuem baixa solubilidade em água. Logo, a solubilidade dos contaminantes é um fator-chave nos processos de biorremediação.

A capacidade dos biossurfactantes de emulsificarem misturas de hidrocarbonetos faz desses compostos uma ferramenta adicional para aplicação em remediação de áreas contaminadas por compostos hidrofóbicos (LIN, 1996). Vários estudos têm mostrado o efeito dos biossurfactantes na biodegradação de contaminantes orgânicos em água e solo. Segundo APARNA et al. (2012), o biossurfactante produzido por Pseudomonas sp. 2B foi responsável pela remoção de valores significativos de petróleo residual em areia contaminada, 92,4%.

Dois mecanismos podem estar envolvidos no aumento da biodegradação na presença dos biossurfactantes: o primeiro consiste no aumento da solubilidade dos compostos hidrofóbicos, tornando-os mais acessíveis à célula; o segundo, na interação dos surfactantes com a superfície celular, o que acarreta um aumento da hidrofobicidade e permite maior interação dessa superfície com os substratos hidrofóbicos (ZHANG e MAIER, 1992).

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secundária (BANAT et al., 2000). A tecnologia pode utilizar micro-organismos e/ou seus metabólitos para recuperar o óleo residual (BANAT, 1995). Os biossurfactantes ajudam na recuperação do petróleo por reduzir a tensão interfacial e as forças capilares entre óleo/rocha, permitindo que o óleo se desloque através dos poros da rocha. Além disso, os biossurfactantes atuam na emulsificação de óleos, diminuindo sua viscosidade e facilitando seu transporte através dos poros (BANAT et al., 2000).

De acordo com BANAT (1995), existem três principais estratégias para o uso dos biossurfactantes na recuperação melhorada de petróleos: a primeira consiste na produção dos biossurfactantes em culturas contínuas ou de batelada, seguida da sua introdução nos reservatórios (MEOR ex situ); a segunda se resume na injeção de micro-organismos produtores de biossurfactantes dentro dos reservatórios de forma que os surfactantes sejam produzidos e liberados diretamente na interface óleo-água; e a terceira seria a injeção de nutrientes apropriados que possam estimular a produção dos biossurfactantes por micro-organismos nativos (MEOR in situ). Para a segunda alternativa, os micro-organismos devem apresentar capacidade de crescimento nas condições extremas encontradas nos reservatórios de óleos, tais como: altas temperaturas, pressão, salinidade e baixos teores de oxigênio (MAKKAR e CAMEOTRA, 1997). Os surfactantes biológicos são ainda estudados para aplicação na redução de viscosidade de óleos pesados facilitando sua recuperação, bombeamento e transporte em oleodutos (BOGNOLO, 1999). Segundo BANAT et al. (1991), aproximadamente 91% dos hidrocarbonetos presentes no resíduo foram recuperados após o biotratamento, sendo que os sólidos restantes continham um baixo teor de óleo residual tornando o descarte desses resíduos ambientalmente seguro.

2.3.2 Aplicação nas indústrias de alimentos e cosméticos

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A capacidade dos biossurfactantes em reduzir a tensão superficial, formar e estabilizar emulsões são determinantes para a aplicação desses biocompostos na indústria de alimentos. Exemplos dessas aplicações consistem no controle da aglomeração de glóbulos de gordura, estabilidade de sistemas aerados, melhoramento da textura e tempo de prateleira de produtos contendo amido, modificação de propriedades reológicas de massas de trigo e na melhora da consistência e textura de produtos baseados em lipídios (KACHHOL e SCHLINGMANN, 1987). Esses bioemulsificadores apresentaram grande potencial de aplicação em preparações de molhos para saladas. Em um trabalho mais recente, IYER et

al. (2006) relataram um bioemulsificador isolado de uma espécie marinha Enterobacter

cloace, descrito como um potente agente aplicado para melhorar a viscosidade de vários

produtos e devido sua atividade em baixos pH, este também pode ser aplicado em alimentos contendo ácido cítrico ou ascórbico. Os biossurfactantes também podem ser aplicados na indústria de alimentos como agentes antiadesivos, ou seja, reduzindo a adesão de micro-organismos em superfícies sólidas e prevenindo a formação de biofilmes. MIRELES et al. (2001) descreveram que o uso de surfactina reduziu a quantidade de biofilmes formados por Salmonella typhimurium, Salmonella enterica,

Escherichia coli e Proteus mirabilis em placas de PVC.

A utilização dos biossurfactantes, concomitantemente aos antibióticos, pode representar uma nova estratégia antimicrobiana onde a destruição dos biofilmes pelos biossurfactantes pode facilitar o acesso dos antibióticos às células microbianas.

Os biossurfactantes também têm encontrado um grande espaço no mercado de produtos farmacêuticos e de higiene pessoal devido suas propriedades físico-químicas e boa compatibilidade com a pele, aceitabilidade ecológica e propriedades biológicas (BANAT et al., 2000). Cosméticos contendo ramnolipídios foram patenteados e usados como produtos antirrugas e antienvelhecimento (PILJAC e PILJAC, 1999).

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2.3.3 Aplicações medicinais e biológicas

O uso e a potente aplicação comercial dos biossurfactantes na área médica tem aumentado na última década (RODRIGUES et al., 2006). Suas atividades antivirais, antitumorais e antibacterianas fazem delas relevantes moléculas para atuar como agentes terapêuticos no combate a doenças. Assim, os biossurfactantes se apresentam como uma alternativa apropriada ao uso de agentes terapêuticos e medicamentos sintéticos. O mecanismo de atuação dos biossurfactantes se dá basicamente pela interação dessas moléculas com superfícies celulares, desestruturando membranas através da emulsificação de lipídios, lipoproteínas e fosfolipídios. Os surfactantes também podem interagir com superfícies sólidas e afetar a adesão de células microbianas. Dentre as diversas categorias de biossurfactantes, os lipopeptídios são particularmente interessantes devido à sua alta atividade de superfície e potencial antimicrobiano (SEYDLOVÁ e SVOBODOVÁ, 2008). Os lipopeptídios podem atuar como agentes antibióticos, antivirais, antitumorais, imunomoduladores ou como específicas toxinas e inibidores enzimáticos.

A surfactina possui uma expressiva atividade de superfície e tem ganhado interesse biotecnológico e farmacêutico (DESAI e BANAT, 1997). Atualmente, a surfactina tem sido relacionada com diversas propriedades biológicas como, por exemplo, indução de formação de canais iônicos em bicamadas lipídicas, inibição de adenosina monofosfato cíclica 2 (PLA2), atividade antimicrobiana, antitumoral, antiviral e antiinflamatória (SEYDLOVÁ e SVOBODOVÁ, 2008). A ação antiviral da surfactina está relacionada, principalmente, com as interações físico-químicas entre o surfactante e a bicamada lipídica (SEYDLOVÁ e SVOBODOVÁ, 2008).

KIM et al. (1998) demonstraram que a surfactina é um seletivo inibidor para PLA2 citosólica e um agente antiinflamatório. Outro estudo relatou que a surfactina apresentou baixíssima citotoxicidade durante o tratamento de células de mamíferos contaminadas por micoplasmas, conduzindo à inativação do micoplasma sem danos efetivos ao metabolismo celular (VOLLENBROICH et al., 1997).

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desordens pulmonares, do miocárdio e cerebrais (RODRIGUES et al., 2006).

Outra propriedade biológica muito explorada é atividade antimicrobiana dos biossurfactantes. CARRILLO et al. (2003) estudaram o mecanismo molecular de permeabilização da surfactina na membrana celular. Este estudo sugeriu que as propriedades de barreira da membrana são igualmente danificadas nas áreas onde os oligômeros interagem com os fosfolipídios, causando flutuações que podem ser consideradas o modelo primário de ação dos antibióticos (YILMAZ et al., 2006). FERNANDES et al. (2007) relataram a ação antimicrobiana de surfactina contra várias linhagens bacterianas, enquanto a surfactina produzida por Bacillus licheniformis apresentou atividade antifúngica contra Magnaporthe grisea, um fungo fitopatogênico encontrado em arroz (TENDULKAR et al., 2007).

2.4 Propriedades funcionais dos biossurfactantes

Os surfactantes são agentes ativos de superfície que reduzem a energia livre do sistema por substituir a maior parte das moléculas de alta energia na interface, diminuindo assim, a tensão superficial e interfacial dos líquidos (BUENO, 2010).

Denomina-se tensão superficial e interfacial o efeito de forças coesivas entre moléculas de água, de modo que estas permaneçam unidas fortemente (Figura 1).

Figura 1 – Organização das moléculas na (1) tensão superficial e (2) interfacial (Barreto, 2011).

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agentes tensoativos, a tensão superficial e a interfacial são reduzidas, podendo um

excelente agente tensoativo, diminuir a tensão superficial da água de 72 para 35 mN.m-1 e

a tensão interfacial do sistema água/n-hexadecano de 40 para 1 mN.m-1 (MULLIGAN, 2005).

Outra propriedade fundamental dos surfactantes é a tendência de formar agregados chamados micelas que são compostos termodinamicamente estáveis, facilmente reprodutíveis e, geralmente, se formam a baixas concentrações em água (MRESTANI et al., 2000). A concentração mínima na qual se inicia a formação de micelas chama-se Concentração Micelar Crítica (CMC) . Uma vez atingida a CMC, a tensão superficial ou interfacial não sofrerá mais nenhuma redução (MANIASSO, 2001). Acima dessa concentração, CMC, as moléculas do tensoativo formam grandes agregados moleculares de dimensões coloidais e dá-se o nome de micelas (Figura 2), onde, em solução aquosa, as moléculas dos surfactantes agregam-se formando uma esfera com caudas hidrofóbicas voltadas para o seu interior e os grupos hidrofílicos ou carregados, voltados para fora. Abaixo da CMC, o tensoativo está predominantemente na forma de monômeros (MORAES e REZENDE, 2004; CORRER et al., 2007).

Figura 2 – Relação da tensão superficial com a concentração de surfactante no sistema. Em destaque a CMC,

momento em que as micelas começam a ser formadas (Barreto, 2011).

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determinam um bom surfactante. A eficiência é medida através da CMC, enquanto que a efetividade está relacionada com as tensões superficiais e interfaciais (BARROS et al., 2007).

Para caracterizar biossurfactantes também se faz necessária uma análise das propriedades da atividade emulsificante e desemulsificante (LEE et al., 2008; VAN HAMME e URBAN, 2009).

Devido a presença de porções hidrofílicas e hidrofóbicas na estrutura dos biossurfactantes, essas moléculas se particionam, preferencialmente, na interface entre fases fluidas que possuem diferentes graus de polaridade e pontes de hidrogênio, como interfaces óleo/água ou ar/água. A porção apolar é frequentemente uma cadeia hidrocarbonada, enquanto que a porção polar pode ser iônica (catiônica ou aniônica), não-iônica ou anfotérica (DESAI e BANAT, 1997). Estas características permitem aos surfactantes a formação de microemulsões nas quais os hidrocarbonetos podem se solubilizar em água ou a água pode se solubilizar em hidrocarbonetos (RON e ROSENBERG, 2001).

2.5 A utilização de substratos alternativos na produção de biossurfactantes

A surfactina ainda não é explorada comercialmente principalmente devido seu elevado custo de produção, associado a processos ineficientes de recuperação (NITSCHKE e PASTORE, 2006). No entanto, as vantagens que esse lipopeptídeo apresenta quando comparada aos surfactantes sintéticos, têm especial significado quando se leva em consideração a viabilidade econômica de formulações que contenham esta substância, já que alguns produtos com alto valor agregado poderiam absorver os altos custos originados a partir da adição deste composto (VELIKONJA e KOSARIC, 1993), sugerindo amplo potencial de aplicação industrial para a surfactina. Nesse contexto, visando o aumento do uso industrial de biossurfactantes, a fim de tornar o custo de produção competitivo com os surfactantes sintéticos, a utilização de matérias-primas alternativas, como resíduos agroindustriais é uma possível estratégia como substrato para a produção destes.

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são gerados, a utilização dos mesmos em processos biotecnológicos parece ser uma alternativa plausível, principalmente quando se considera a utilização de uma grande variedade de resíduos agroindustriais como matéria-prima para processos biotecnológicos (PANDEY et al., 2000). Deste modo, a utilização de resíduos agroindustriais para produção de biossurfactantes é um dos passos na direção da viabilização da implantação desses processos em escala industrial.

BARROS et al. (2007) descreveram a importância da variedade de resíduos industriais como matéria-prima para diversos bioprocessos, segundo os autores, a utilização de resíduos agroindustriais para produção de biossurfactantes é um dos passos para viabilizar e implantar esses processos em escala industrial, sendo necessário um balanço de nutrientes para desenvolver condições adequadas para o desenvolvimento e produção desses compostos.

O suco de caju é um potencial substrato para a produção de surfactina, visto que em estudo realizado por OLIVEIRA et al. (2013), o Bacillus subtilis LAMI005 em meio

contendo suco de caju, foi capaz de produzir 220 mg.L-1.

O cajueiro é disseminado em todo o território brasileiro. Entretanto, a sua importância socioeconômica destaca-se no Nordeste, principalmente nos estados do Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte. A produção ocorre no período seco, na entressafra das demais espécies cultivadas, o que lhe confere papel estratégico na redução da sazonalidade na renda e na ocupação da mão de obra (EMBRAPA).

Outra característica importante do agronegócio caju é a diversidade de derivados oriundos da castanha e do pedúnculo do caju. Da castanha (o fruto verdadeiro) obtêm-se a amêndoa da castanha de caju (ACC) e o líquido da casca da castanha de caju (LCC). Ambos são, em grande parte, exportados na forma de amêndoa semiprocessada e óleo bruto, respectivamente (EMBRAPA).

O pseudofruto (ou pedúnculo), por sua vez, proporciona a obtenção de inúmeros produtos. No ramo de bebidas, por exemplo, destaca-se a cajuína, o suco integral, néctares, licores, refrigerantes, aguardente, entre outros. No fabrico de doces, diferentes modalidades são produzidas: em massa, em calda, seco, tipo ameixa etc. O mercado desses produtos encontra-se basicamente restrito ao plano interno, mais especificamente regional (EMBRAPA).

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estima-se que 80% do pedúnculo produzido seja desperdiçado, logo o aproveitamento deste co-produto, tornará a utilização da surfactina mais viável (OLIVEIRA, 2010).

Diversos autores já estudaram muitos outros substratos alternativos na produção de biosusrfactantes, como SOUSA et al. (2011) que estudaram a produção de ramnolipídeos a partir de um co-produto do biodiesel, co-produto este também utilizado na produção de surfactina, em estudo desenvolvido por SOUSA, 2011.

2.6 Surfactina

A surfactina, o principal e mais efetivo surfactante produzido por linhagens de

Bacillus subtilis, tem sido alvo de diversas pesquisas que exploram sua excepcional

atividade surfactante (BARROS et al., 2007).

Esse lipopeptídeo foi inicialmente descrito em 1968, por ARIMA, KAKINUMA e TAMURA, e foi assim denominado devido seu caráter tensoativo bastante evidente, no entanto, só começou a ser explorado a partir de 1980 (PEYPOUX et al., 1999). A surfactina é capaz de reduzir a tensão superficial da água e interfacial do sistema água/n-hexadecano de

72 para 27 mN.m-1, e de 43 para 1 mN.m-1, respectivamente (NITSCHKE e PASTORE, 2006).

Embora tenha sido descoberta há 43 anos, pesquisas à respeito desta molécula e dos micro-organismos produtores ainda são bastante intensas. Isto se deve, especialmente, à demanda crescente por biossurfactantes efetivos, economicamente viáveis, que possam ser utilizados em substituição aos surfactantes químicos (BANAT et al., 2010). Após a descoberta da surfactina, o gênero Bacillus passou a ser bastante visado em pesquisas relacionadas à produção de biossurfactantes, sendo crescente a procura por novas fontes dessas biomoléculas que apresentem alta eficácia e rendimento, aliado a um baixo custo de produção.

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outros lipopeptídeos, os quais, embora ainda não sejam comercializados, certamente possuem aplicações relevantes (BARRETO, 2011).

A surfactina, produzida por várias cepas de Bacillus subtilis (ARIMA et al., 1968; COSTA, 2005; KOWALL et al., 1998) apresenta estrutura geral conforme Figura 3. É composta por um peptídeo cíclico de sete aminoácidos ligados a uma cadeia de ácido graxo β-hidróxi, sendo que esta cadeia pode variar de 13 a 15 átomos de carbono, permitindo a existência de diferentes compostos homólogos e isômeros (LANG, 2002; KOWALL et al., 1998; KLUGE et al., 1988), sendo o ácido 3 hidroxi-13-metil-tetradecanóico (KOWALL et al., 1998; KLUGE et al., 1988) ligado por ligação lactona, o principal componente (BARROS et al., 2007).

Figura 3 – Estrutura química da molécula de surfactina (Nitschke e Pastore , 2002).

A atividade biológica da surfactina depende tanto da composição de aminoácidos e da sequência do peptídeo, como da natureza da sua parte lipídica (KOWALL et al., 1998). As substituições dos aminoácidos são responsáveis pelas mudanças significativas em suas propriedades causadas pela modificação da distribuição polar/apolar e/ou da acessibilidade de grupos carboxílicos a cátions. Estas modificações acarretam em diferenças na capacidade hemolítica, quelação de metais, concentração micelar crítica (CMC) e atividade superficial (LANG, 2002; PEYPOUX et al., 1999).

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1999; COSTA, 2005; BARROS et al., 2007).

A surfactina apresenta baixa CMC, alto poder de redução da tensão superficial (ARIMA et al., 1968; COSTA, 2005; COOPER et al., 1981; KIM et al., 1997; NITSCHKE, 2004), além de diversas funções biológicas, o que a caracteriza como molécula biologicamente ativa. Apesar dos mecanismos de ação da surfactina não estarem plenamente elucidados, parece claro que essas propriedades da surfactina estão principalmente relacionadas à sua capacidade de alterar a integridade membranal, como consequência do estabelecimento de fortes interações com os constituintes fosfolipídicos da membrana celular (HUSSAIN, et al., 2004).

Essas propriedades apresentadas pela surfactina servem como base para explicação de diversas atividades exercidas por ela, como seguem:

ação anticarcinogênica (BARROS, et al., 2007); atividade antitumoral (NITSCHKE, et al., 2004);

inibição da formação de biofilmes de outras bactéria com sua ação antimicrobiana e antifúngica (STEIN, 2005);

ação antibiótica (NITSCHKE, et al., 2004);

agente facilitador na absorção de fármacos (BARROS, et al., 2007); atividade antiviral (BARROS, et al., 2007).

Devido o vasto campo de atuação da surfactina, sua aplicação é plausível em demandas advindas de diversos setores industriais.

Embora a surfactina seja muito citada como agente surfactante em processos de biorremediação, a ampliação da utilização deste biossurfactante em processos de remediação de águas e solos contaminados com poluentes orgânicos hidrofóbicos tem sido limitada pela falta de conhecimento sobre o destino desses compostos no ambiente, quanto à biodegradação das moléculas e dos metabólitos intermediários e, também, sobre sua toxicidade quando aplicados in situ (HAIGH, 1996; DI GIOIA et al., 2004).

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Os biossurfactantes distinguem-se dos surfactantes sintéticos pelas suas propriedades tensoativas extremamente suaves. Isso significa que apresentam uma alta compatibilidade com as membranas biológicas. Essa característica é atribuída geralmente à sua estrutura polimérica e ao seu conteúdo de grupos polifuncionais, que fazem com que essas substâncias apresentem, em regra, uma menor polaridade que os surfactantes sintéticos. Uma das consequências dessas características estruturais é o fato dos tensoativos biológicos formarem agregados, as micelas, com uma menor carga eletrostática. Como resultado dessa propriedade, os biossurfactantes apresentam uma maior compatibilidade com membranas biológicas quando comparados com muitos dos tensoativos sintéticos utilizados para tratamento de ambientes contaminados com compostos orgânicos hidrofóbicos (AL- TAHHAN et al., 2000; HUA et al., 2003). Nesses processos, a presença de biossurfactantes propicia uma interação entre os compostos orgânicos hidrofóbicos e a superfície celular dos micro-organismos. Este fato não surpreende, dado que muitos dos surfactantes sintetizados pelas bactérias, mesmo sob condições naturais, têm como função a de regular a adesão de células bacterianas às superfícies de substratos lipofílicos (VAN HAMME et al., 2006).

A toxicidade de uma substância depende, além de sua própria natureza, de fatores físico-químicos (pH, temperatura e salinidade), do organismo-teste, da concentração da substância e das condições impostas para o teste (KOZLOVA et al., 2004).

A proposta geral dos testes de toxicidade é estabelecer o impacto potencial de substâncias químicas sobre a biota de um dado ambiente. A informação adquirida pode ser usada para se administrar o tratamento ou para a liberação do uso de substâncias químicas. Testes de ecotoxicidade são bastante úteis, pois podem ser avaliados em um curto tempo (VAN BEELEN e DOELMAN, 1997).

Dentre os bioensaios, encontrasse a toxicidade sobre Artemia salina, que é um microcrustáceo de água salgada comumente usada como alimento para peixes. A simplicidade com que pode ser manuseado, a rapidez dos ensaios e o baixo custo favorece a sua utilização rotineira em diversos estudos, além do que, tais ensaios de letalidade são muito utilizados em análises preliminares de toxicidade geral (LUNA et al., 2005).

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A germinação é um fenômeno biológico que, para os tecnologistas de sementes, é definida como a emergência e o desenvolvimento das estruturas essenciais do embrião, manifestando a sua capacidade para dar origem a uma planta normal, sob condições ambientais favoráveis (NASSIF et al., 1998).

Os problemas de toxicidade em uma planta surgem quando certos constituintes (íons tóxicos) do solo ou da água são absorvidos e acumulados em seus tecidos em concentrações suficientemente altas para provocar danos e reduzir seus rendimentos (AYERS e WESTCOT, 1999).

As vantagens do teste de germinação são devido ao seu baixo custo e pela sua simplicidade, contribuindo para que estes sejam muito utilizados em bioensaios de toxicidade. Nas últimas décadas, dezenas de publicações têm sido dedicadas à explicação das razões por que as sementes de alface não germinam em determinadas condições e, ou, quais tratamentos permitem a germinação (ANDRADE, 2009).

A falta de maior compreensão dos mecanismos que envolvem a interação de surfactantes com poluentes orgânicos hidrofóbicos, organismos e componentes do solo, leva a muitas controvérsias com respeito à aplicação de surfactantes em biorremediação de solos contaminados com compostos orgânicos hidrofóbicos (OU, 2000). Isto também é indicativo da necessidade de pesquisas sobre biodegradabilidade e toxicidade de surfactantes antes da sua aplicação em processo de biorremediação de ambientes contaminados. Idealmente, os surfactantes não devem causar uma poluição secundária, como resultado de sua aplicação em processo de remediação.

2.7 Recuperação e elucidação estrutural da surfactina

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(MUKHERJEE et al., 2006), ultra-filtração (SEN e SWAMINATHAN, 2005), precipitação com ácido ou sal (SEN e SWAMINATHAN, 2004; SHABTAI e GUTNICK, 1986), extração por solvente (REILING et al., 1986; DUBEY, 2005) e cromatografia de troca iônica (REILING et al, 1986). No entanto, os métodos mais comumente usados para a recuperação de biossurfactante em meios de cultivo, são precipitação ácida, separação de espuma ou a combinação de ambos (CHEN e JUAN, 2008).

Uma grande variedade de solventes, a exemplo de compostos orgânicos como hexano, etanol, diclorometano, clorofórmio, éter etílico, acetona e metanol, tem sido usada na forma pura ou combinada em processos de extração. Entretanto, o solvente mais eficaz é a mistura de clorofórmio e metanol, em diferentes proporções, o que facilita o ajuste da polaridade ao material a ser extraído (KUYUKINA et al., 2001).

A surfactina e outros biossurfactantes produzidos por Bacillus podem ser extraídos por precipitação ácida, ajustando-se o pH do meio para o ponto isoelétrico do composto desejado (MULLIGAN e GIBBS, 1990). Em estudo desenvolvido por CHEN e JUAN (2008), a surfactina produzida foi recuperada por precipitação ácida, seguida de extração líquido-líquido ou extração sólido-líquido, sendo que no sistema de ELL a purificação foi mais efetiva.

A elucidação estrutural de biossurfactantes é baseada em espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), espectroscopia de infravermelho (IV) e espectrometria de massa (EM). Atualmente, os progressos em técnicas de purificação, como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com fase reversa, e a disponibilidade de técnicas espectroscópicas melhoradas, como NMR, MS com Bombardeamento de Átomos Rápidos (FAB-MS) e, mais recentemente, Ionização/Dessorção a Laser Assistida por Matriz com Tempo de Voo (MALDI-TOF), têm demonstrado que novas estruturas de biossurfactantes podem ser determinadas em tempos relativamente curtos e com uma quantidade muito pequena de amostras (BODOUR et al., 2004).

Várias estruturas de biossurfactantes produzidos por diferentes espécies microbianas vêm sendo elucidadas. Estrutura da surfactina de Bacillus subtilis ATCC 21332 foi determinada por meio de técnicas unidimensionais de RMN 1H e de EM-FAB (CHEN et

al., 2006). Biossurfactantes de Klebsiella sp. foram separadas por diálise e sua estrutura

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3 – MATERIAIS E MÉTODOS

No presente capítulo, apresentam-se os materiais utilizados para o desenvolvimento deste trabalho, assim como a metodologia empregada para a elucidação da estrutura molecular do biossurfactante produzido, para a caracterização físico-química, para o estudo das propriedades tensoativas e emulsionantes, e para a realização de testes toxicológicos do biossurfactante produzido. Os experimentos foram realizados nos laboratórios do Grupo de Pesquisa em Processos Biotecnológicos – GPBio/DEQ/UFC, no Centro Nordestino de Aplicação e Uso de Ressonância Magnética Nuclear – CENAUREMN, no Laboratório de Espectrometria de Massas do Nordeste – LEMANOR e na EMBRAPA Agroindústria Tropical.

3.1 Produção do biossurfactante

3.1.1 Substrato e meios de cultura

Foi utilizado suco de caju clarificado como meio de cultivo, obtido a partir de caju da espécie Anacardium occidentale L., fornecido pela Embrapa Agroindústria Tropical da Universidade Federal do Ceará.

A cepa Bacillus sp., nomeada LAMI005, proveniente da coleção de culturas do Laboratório de Embriologia e Biotecnologia (LEMBIOTECH) do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, foi mantida em meio APGE (peptona 5,0 g.L-1, glicose 5,0 g.L-1, extrato de levedura 2,5 g.L-1 e ágar 15,0 g.L-1) e incubada em estufa bacteriológica a 30ºC por 24 horas e após, mantida sob refrigeração a 4ºC, sendo repicada a cada 60 dias.

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crescimento conforme OLIVEIRA (2010), três alçadas da cultura foram transferidas para Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio estéril para o inoculo.

Os meios de cultura utilizados para a propagação do inoculo do micro-organismo

Bacillus subtilis LAMI005 e para a produção de biossurfactante, foram elaborados de acordo

com OLIVEIRA et al., (2013), aonde usou-se suco de caju clarificado com concentração de ART (Açúcares Redutores Totais) de 22,92 g.L-1 e sulfato de amônio ((NH4)2SO4) na concentração de 1,0 g.L-1 como suplementação de fonte de nitrogênio. O pH do meio foi ajustado para 7,0 com NaOH (3 mol.L-1) ou HCl (3 mol.L-1) e esterilizado em autoclave a 110ºC por 10 minutos.

3.1.2 Produção do biossurfactante

A densidade óptica do inoculo foi medida a 600 nm em espectrofotômetro (Spectronic® 20 Genesys) e ajustada a uma faixa entre 0,10 – 0,20 a partir de diluições com o meio de cultivo, para a padronização do número de células iniciais utilizadas em cada experimento. A produção do biossurfactante foi realizada de acordo com OLIVEIRA et al., (2013) com modificações, onde em frascos de Erlenmeyer de 500 mL foram adicionados 10% de inoculo ao meio de cultivo para um volume final de 200 mL. Logo após, os frascos inoculados foram incubados em agitador orbital a 180 rpm, 30ºC por 48 horas em condições isotérmicas.

3.2 Extração e purificação do biossurfactante

3.2.1 Extração líquido-líquido