Calibração em química analítica: uma breve revisão.
Claudio Antonio Tonegurri Professor do Departamento de Química da Universidade Federal do Paraná (UFPR) tonegutti@ufpr.br
Introdução
Uma medida analítica quantitativa tem por objetivo determinar a quantidade de uma dada espécie (analito) em uma massa ou volume definido da amostra. Se o analito não pode ser diretamente medido, então um parâmetro macroscópico deve ser encontrado que seja funcionalmente relacionado à quantidade (concentração) do analito. O valor desse parâmetro é a medida do sinal analítico (Hulanicki, 1995).
Quando o relacionamento funcional pode ser descrito tendo por base as constantes físicas e as quantidades universais, o método pode ser considerado absoluto. O valor numérico do fator de proporcionalidade entre a quantidade (concentração) x, e o sinal, y, é chamado de sensitividade (dy/dx) (Hulanicki, 1995).
O componente puramente instrumental desse fator é denominado de constante do instrumento. No caso de medidas experimentais para determinar a sensitividade, amostras padrão de vários tipos são indispensáveis, pois, dependendo das características da técnica analítica utilizada, as amostras padrão podem exibir diferentes graus de similaridade em relação à amostra analisada (Hulanicki, 1995).
Exemplos de métodos químicos absolutos são a gravimetria, a titrimetria e a coulometria.
Quando um método absoluto de análise química não está disponível ou não pode ser utilizado, por qualquer razão, à análise em questão, a escolha de uma estratégia adequada de calibração é essencial para o sucesso de qualquer análise química quantitativa.
Os principais métodos de calibração univariada empregados na química analítica quantitativa instrumental são a calibração por padrão externo, a calibração por adição de padrão e a calibração por padrão interno, métodos esses que serão objeto de detalhamento neste trabalho.
Existem outros métodos de calibração univariada, alguns derivados desses, que também serão comentados neste trabalho. A calibração multivariada não será abordada neste artigo.
Calibração por padrão externo
A calibração por padrão externo é o método mais utilizado devido à sua simplicidade e facilidade de interpretação.
Em uma calibração por padrão externo, para a quantificação de um analito, dados conhecidos da concentração do padrão de calibração são combinados com dados de uma amostra de concentração desconhecida para gerar uma resposta ao problema.
A denominação de padrão externo é devido ao fato de que o padrão está separado, ou fora de contato, com a amostra de concentração desconhecida.
Ela envolve a comparação da resposta instrumental à amostra com a resposta instrumental aos padrões.
A principal vantagem deste método é que ele é simples de realizar e se aplica a um conjunto grande de técnicas instrumentais.
A principal desvantagem é que o método não permite corrigir o efeito da matriz, quando existente, na qual se encontra o analito.
Na calibração externa se assume:
1. Que o sinal do instrumento é proporcional à concentração conhecida das soluções padrão;
2. A sensitividade (sinal/concentração) é a mesma para as amostras e os padrões;
3. Que o sinal é proveniente apenas do analito;
4. Não leva em conta efeitos de matriz ou de flutuação do sinal devido ao instrumento.
Na construção de uma curva de calibração deseja-se que ela passe o mais perto possível dos pontos obtidos experimentalmente e, para que isso ocorra, o método estatístico mais utilizado é o dos mínimos quadrados, que fornece resultados não tendenciosos e com variância mínima, dentro de certas suposições de natureza estatística (Pimentel & Barros Neto, 1996).
Para se elaborar a curva de calibração externa é necessário medir a resposta do instrumento para um determinado número (recomenda-se no mínimo 05) de padrões analíticos (soluções preparadas a partir de uma solução estoque de concentração conhecida) de diferentes concentrações. A escolha dos níveis de concentração para os quais a resposta será medida deve estar dentro da faixa na qual se encontra o sinal das amostras e, também, onde a curva se enquadra
no modelo linear. Diluições ou pré-concentração das amostras podem ser necessárias para o enquadramento das medidas experimentais nesses requisitos. Uma abordagem estatística desses aspectos pode ser vista no artigo de Pimentel & Barros Neto (1996).
Na utilização de padrões externos, considera-se que as mesmas concentrações do analito no padrão vão gerar sinal idêntico no instrumento.
Desta forma, a função de calibração relacionando a resposta instrumental e a concentração do analito deve-se aplicar à amostra. Em geral, a resposta analítica é corrigida por meio de um controle chamado de branco. O branco deve ser idêntico à amostra sem o analito (Skoog, West, Holler, & Crouch, 2006).
Na prática, é difícil preparar um branco ideal que reproduza a matriz na qual se encontra o analito e, assim, alguma aproximação deve ser considerada desde que não introduza distorção significativa no resultado.
O branco pode ser de solvente, contendo o mesmo solvente no qual o analito está dissolvido como também de reagente, contendo o solvente mais os reagentes usados no preparo da amostra. Mesmo com as correções efetuadas através do branco, vários fatores podem causar erro no método do padrão externo. Destacamos o efeito de matriz, introduzido pela não similaridade entre os ambientes em que se encontra o analito na amostra e nos padrões preparados (Skoog, West, Holler, & Crouch, 2006).
Assume-se que o sinal analítico (Sa) é proporcional (k) à concentração do analito (C), conforme a equação 1:
Sa = k C eq.1
Como exemplo de uma curva de calibração externa, apresentamos o sistema Cu2+-NH3 cuja absorbância do complexo formado, Cu(NH3)42+
, é medido a 605 nm, contendo as seguintes soluções, preparadas a partir de uma solução estoque de 0,01634 mol L-1 em Cu2+ às quais se adicionou excesso de NH3
para a formação do complexo.
Tabela 1: Dados para a elaboração da curva de calibração externa.
Concentração de Cu2+ (mol L-1)
Absorbância
1,31E-03 0,058
2,61E-03 0,126
3,92E-03 0,190
5,23E-03 0,253
6,54E-03 0,322
Fonte: dados do autor
Com os dados da tabela 1 pode-se gerar o gráfico 1, correspondente à curva de calibração externa.
Gráfico 1: Curva de calibração externa correspondente aos dados da tabela 1
Uma amostra de concentração desconhecida de Cu2+, submetida ao mesmo tratamento das soluções padrão, forneceu uma absorbância de 0,247. A medida, inserida na equação da curva de calibração externa, encontrada no gráfico 1, resultou na concentração da amostra de 0,0051 mol L-1.
Para a utilização do método de calibração externa, bem como para o cálculo dos desvios padrão associados, recomendamos consultar o capítulo 8 de Skoog et. Al. (2006).
Calibração por adição de padrão
O método da adição de padrão é bastante importante para a análise química quantitativa de espécies inorgânicas e orgânicas pelo fato de permitir atenuar os efeitos de interferência da matriz (Kelly, Pratt, Guthrie, & Martin, 2011).
Aparentemente, a sua introdução se deu a partir de um livro sobre análise química por polarografia de autoria de Hans Hohn (1906-1978), publicado em 1937 (Hohn, 1937). Anos depois, o método foi introduzido em análises químicas quantitativas realizadas com a utilização de espectroscopias ópticas, tais como espectroscopia de fluorescência de raio-X e fotometria de chama (Kelly, Pratt, Guthrie, & Martin, 2011).
A adição de padrão é especialmente apropriada quando a composição da amostra é desconhecida ou complexa e afeta o sinal analítico. A matriz é tudo que existe na amostra desconhecida, além do sinal do analito. O efeito de uma matriz pode ser considerado como uma mudança no sinal analítico causada por qualquer coisa na amostra diferente do analito. Logo, o método de adição padrão compensa uma série de interferências quando se adiciona quantidades
y = 50,051x - 0,0064 R² = 0,9997
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350
0,00E+001,00E-032,00E-033,00E-034,00E-035,00E-036,00E-037,00E-03
conhecidas de analito à amostra desconhecida em sua matriz complexa (Harris, 2005).
É oportuno registrar que existem dois tipos de efeito de matriz, o chamado efeito rotacional e o chamado efeito translacional, exemplificados nos gráficos 02 e 03 adiante.
Gráfico 2: Efeito de Matriz rotacional
O efeito de matriz rotacional se caracteriza pela variação no coeficiente angular da curva obtida na adição de padrão, em relação à curva obtida em condições similares na padronização externa.
Gráfico 3: Efeito de matriz translacional
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35
0 2 4 6 8 10 12
Padrão Externo Adição padrão
O método de adição de padrão pode ser eficiente quando se verifica o efeito de matriz rotacional, mas não se aplica para o efeito de matriz translacional.
Na prática, as soluções as soluções padrão da curva analítica são preparadas na matriz da amostra contendo o analito. O sinal analítico obtido (Sa) corresponde à soma do sinal da amostra mais ao do padrão adicionado (Sa = Asam + Sap) e será proporcional à concentração do analito (amostra + padrão).
A concentração do analito, na amostra desconhecida, é determinada por extrapolação, fazendo y na equação da reta igual a zero (e tomando o módulo de x).
O método de adição de padrão é eficiente para a correção de efeitos de matriz, mas não corrige flutuações do sinal analítico, decorrentes da instrumentação utilizada.
Método da Padronização Interna
O método da padronização interna (padrão interno) é utilizado para corrigir flutuações das leituras instrumentais bem como dos efeitos de matriz.
Entretanto, obter um padrão interno com propriedades físico-químicas compatíveis com o analito não é simples, além do que o padrão interno não deverá estar presente na amostra, ou se estiver, deverá ser em quantidades abaixo do limite de detecção.
Neste método, uma quantidade conhecida do padrão interno é adicionada a todas as amostras, padrões e brancos.
O sinal de resposta considerado será a razão entre o sinal do analito e o do padrão.
Uma curva de calibração é preparada na qual o eixo y é a razão entre as respostas e o eixo x a concentração do analito nos padrões.
O método do padrão interno pode compensar erros que incidem sobre o analito e também sobre o padrão.
Figura 1: Ilustração do método do padrão interno em cromatografia
Fonte: (Skoog, West, Holler, & Crouch, 2006)
Análise por diluição padrão
A análise por diluição padrão (Jones, Donati, Jones, & Calloway Junior, 2015) pode ser aplicada à maioria das técnicas instrumentais que aceitam amostras líquidas e são capazes de monitorar dois comprimentos de onda simultaneamente.
Ele é um método que combina os métodos de adição de padrão e de padrão interno. Não é necessário preparar uma série de soluções padrão nem a construção de curvas de calibração. A análise é realizada por combinar duas soluções em um recipiente (uma cubeta, p. ex.). A primeira solução deve conter 50% da amostra e 50% da mistura padrão e a segunda solução deve conter 50% da amostra e 50% do solvente. Os dados são coletados em tempo real quando a primeira solução é diluída na segunda (Jones, Donati, Jones, &
Calloway Junior, 2015).
Com os resultados coletados, é construído um gráfico da razão do sinal do analito com relação ao padrão interno, no eixo y, versus o inverso da concentração do padrão interno, no eixo x. A concentração do analito na
amostra é determinada pela razão entre a inclinação e o intercepto desse gráfico.
O método foi testado, dentre outros, para a análise de metais em produto destinado à lavagem bucal, sendo observado que os resultados, tanto em precisão como em exatidão, foram melhores do que aqueles obtidos com a utilização de calibração externa ou de calibração por padrão interno, utilizando a técnica de espectroscopia de emissão atômica (Jones, Donati, Jones, &
Calloway Junior, 2015).
Calibração com um Único Ponto
Nesta calibração é obtido um fator de calibração (FC) que é a razão da concentração da solução padrão (Cp) pelo sinal analítico do padrão (Sap) (Fortunato, 2017). Assumindo-se que o coeficiente linear é igual a zero e que a variação do sinal analítico é proporcional à concentração do analito, o FC é calculado por:
FC = Cp / Sap Eq. 2
A concentração do analíto na amostra é calculada pela multiplicação de FC pelo sinal analítico da amostra. Essas suposições, entretanto, implicam que o método é bastante vulnerável a problemas de falta de linearidade, efeito de matriz e flutuações do sinal analítico (Cuadros-Rodriguez, Gámiz-Gracia, Almanza-López, & Bosque-Sendra, 2001)
Calibração com Dois Pontos
Em métodos nos quais existe um sinal de background (ruído da linha base) e, portanto, o intercepto de uma calibração hipotética é diferente de zero, uma calibração com ao menos dois pontos pode ser requerida a fim de evitar erros.
A concentração de dois padrões deve definir o intervalo que contém todas as amostras a serem analisadas (Cuadros-Rodriguez, Gámiz-Gracia, Almanza- López, & Bosque-Sendra, 2001).
A constante de calibração será definida como:
K = [x(padrão1) – x(padrão2)] / [y(padrão1) – y(padrão2)] Eq.3 A concentração do analito é calculada por:
xanalito = xpadrão(1 ou 2) + K (yamostra – ypadrão(1 ou 2)
Os cuidados com este método são similares ao observado com relação ao método de ponto único.
Na prática, este método é rotineiramente utilizado para a calibração de pHmetros.
Método das Diluições Sucessivas
O método se baseia em sucessivas diluições de uma solução padrão e de uma amostra. A cada etapa de diluição as soluções são analisadas e a cada duas etapas a concentração do analito é determinada por interpolação, utilizando um gráfico de dois pontos. A concentração calculada é chamada de concentração aparente. Com as sucessivas diluições, as interferências vão sendo eliminadas e as concentrações aparentes, portanto, se aproximam da concentração real do analito (Fortunato, 2017).
Método da Calibração Indireta
Este método é utilizado quando a técnica adotada não é capaz de medir ou não tem sensibilidade para medir o analito de interesse. O método é baseado em reações envolvendo o analito, medindo-se a formação de um produto formado na reação ou o consumo de reagentes (Fortunato, 2017).
As curvas analíticas são obtidas a partir de concentrações crescentes do analito que reagem com um reagente e assume-se que o aumento (formação de produto) ou decréscimo (consumo de reagente) do sinal analítico é proporcional à concentração do analito.
A concentração do analito pode ser facilmente calculada por gráfico ou equação da reta. Entretanto, o método é vulnerável a interferências, dependendo da especificidade das reações
Método de Compatibilização de Matriz
O método é fundamentado na preparação de padrões analíticos com composição química similar às das amostras. As soluções devem conter concentrações crescentes do analito e, de forma análoga ao método por calibração de padrão externo, uma curva de calibração é construída (Fortunato, 2017).
Métodos de Calibração Utilizados Simultaneamente
A utilização de dois métodos de calibração simultaneamente tem por objetivo melhorar o desempenho analítico, aproveitando as vantagens de cada método.
Uma das possibilidades é a utilização simultânea do método de adição de padrão e do método de padronização interna (Fortunato, 2017). A curva analítica é preparada em meio da amostra pela adição de quantidades crescentes de padrão a uma quantidade fixa de padrão interno. Assume-se que o sinal do analito (Sa) dividido pelo sinal do padrão interno (Spi) é proporcional à concentração do analito presente na amostra e a concentração do padrão (Cam + Cp), conforme a equação:
Sa / Spi = k (Cam + Cp) Eq. 4
Outra possibilidade é a combinação do método de compatibilização da matriz com o método da padronização interna (O'Reilly, et al., 2014).
Este método vem sendo empregado principalmente na análise direta de sólidos. Os padrões são preparados empregando uma matriz isenta ou uma matriz preparada com composição semelhante a das amostras. O padrão interno pode ser adicionado como uma quantidade fixa aos brancos, soluções analíticas e amostras ou pode-se empregar um componente majoritário das amostras analisadas que tenha pouca variação entre elas. A concentração do analito na amostra é calculada de maneira semelhante à da padronização interna (Fortunato, 2017).
Métodos de Calibração Integrados
Nesta abordagem, é criado um novo método com base em dois outros já existentes, originando um novo conceito teórico e experimental.
Um desses métodos é o chamado de adição padrão no ponto H, usado para contornar problemas de sobreposição de espectros. O procedimento envolve o preparo de duas funções diferentes do método de adição de padrão tradicional (distintos comprimentos de onda, pH, etc.). Nessa situação, ambas as funções tem condição de se cruzarem em um ponto (chamado de ponto H), que indica a concentração do analito e o efeito aditivo do interferente (Fortunato, 2017).
Também temos como opção o método de calibração integrado.
Segundo Fortunato (2017):
“...
Este método é fundamentado nos princípios dos métodos de calibração externa e método de adição de padrão e tem como principais características a identificação e eliminação de possíveis interferentes nas análises. Neste procedimento são preparadas seis soluções analíticas (R1 – R6) e um branco (R0), na qual, R0: diluente; R1: 2/3 de padrão + 1/3 de diluente; R2: 2/3 de padrão + 1/3 de amostra; R3: 2/3 de diluente + 1/3 de amostra; R4: 2/3 de amostra + 1/3 de diluente; R5: 2/3 de amostra + 1/3 de padrão; e R6: 2/3 de diluente + 1/3 de diluente. A partir da análise das seis soluções + branco, são produzidos 7 sinais analíticos (S0 – S6), e utilizando os sete sinais analíticos são plotadas quatro curvas de calibração de dois pontos (S0 e S1; S2 e S3; S4 e S5; S6 e S0). Por meio destas quatro curvas são calculadas seis concentrações aparentes para o analito de interesse (C1 – C6), destas seis concentrações C1 e C2 são calculadas de modo interpolativo, C3 e C4 são calculados de modo semi-extrapolativo e C5 e C6 são calculadas de modo extrapolativo. A concentração do analito pode ser resumida em 4 etapas: (i)
caso as seis concentrações aparentes sejam concordantes entre si, a concentração do analito é dada por uma média aritmética de C1-C6; (ii) caso C1 - C6 não sejam concordantes, é um indicativo que algum efeito de matriz está prejudicando a qualidade dos resultados, quando isso ocorre verifica-se se (C3 + C4)/2, C5 e C6 são concordantes, caso sim, a concentração do analito é dado por uma média aritmética de C3 – C6; (iii) se as concentrações aparentes não respondem adequadamente as condições de (i) e (ii), amostras e padrões são diluídas sucessivamente até que umas duas condições sejam atendidas;
(iv) se mesmo com as diluições sucessivas não for possível atender as condições de (i) e (ii) é necessário um pré-tratamento da amostra de modo a eliminar está interferência antes de repetir todo o procedimento.
---”
Outra opção é o método de calibração generalizado. O método é baseado na integração dos conceitos do método da calibração integrada com o método das diluições sucessivas.
O padrão e a amostra são diluídos sucessivamente e para cada ponto da diluição é realizado o método da calibração integrada. Com as diluições sucessivas, os possíveis interferentes são eliminados (Fortunato, 2017).
Também temos a proposta do método de adição de padrão interno. Esse método combina os princípios da padronização interna com os da adição de padrão, se constituindo em uma modificação do método da diluição padrão anteriormente mencionado (Fortunato, 2017). A principal diferença é que na adição padrão interna diversas soluções padrão são requeridas.
Em uma análise de magnésio e cálcio em biodiesel, utilizando a espectroscopia de emissão atômica, e usando manganês e estrôncio como padrões internos para cálcio e magnésio, respectivamente, os resultados obtidos estão em concordância com aqueles dos materiais certificados, em um nível de confiança de 95%. O desvio padrão para ambos os analitos, com doze determinações, ficou em 6% (Fortunato, Bechlin, Gomes Neto, Donati, & Jones, 2015).
Nesse método é assumida uma relação linear entre o sinal analítico do padrão interno (Spi) e sua concentração (Cpip):
Spi = Kpi Cpip Eq. 5
Pode-se deduzir a seguinte equação para o método (Fortunato, 2017):
Sa/Spi = (ka (Caam + Cap)) / (kpi Cpip)
Sa/Spi = [(ka Cap) / (kpi Cpip)] + [(ka Caam) / (kpi Cpip)] Eq. 6
É um equação de reta na qual a razão do sinal do analito pelo sinal do padrão interno é a variável y e o inverso da concentração do padrão interno é a variável x.
Y = Spa / Spi ; x = 1 / Spip ; coeficiente linear = [(ka Cap) / (kpi Cpip)] ; coeficiente angular = [(ka Caam) / (kpi)]
As adições da solução estoque contendo o analito mais o padrão interno terão uma proporção fixa dos mesmos (Cap + Cpip) nas amostras, assim, o coeficiente linear será um valor que dependerá apenas do efeito de matriz.
A concentração do analito na amostra pode ser calculada por:
Cam = (coeficiente angular / coeficiente linear) (Cap / Cpip) Eq.7
O método de adição de padrão interno une as vantagens da adição de padrão com a padronização interna, sem ter a concentração do padrão interno fixada nos brancos e amostras e da não preocupação com os teores do padrão interno originalmente presente nas amostras (Fortunato, 2017).
Comparação entre métodos
Em nossa discussão neste trabalho, é interessante ter uma ideia de como um conjunto de métodos responde a um determinado problema químico.
Para tal fim, vamos exemplificar com análises de cálcio e magnésio em biodiesel.
O biodiesel é um combustível biodegradável derivado de óleo vegetal ou gordura animal. Entre os parâmetros de controle de qualidade do biodiesel estipulado pela Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis (ANP), a resolução ANP n° 14 prevê os teores máximos permitidos de Ca e Mg (ANP - Agência Nacional do Petróleo, Gas e Biocombustíveis, 2012). A presença desses íons pode ocasionar problemas mecânicos como corrosão de peças e a desativação dos catalisadores. A complexidade da matriz e a dificuldade no preparo das amostras dificultam essas análises (Fortunato, 2017).
Na tese de doutorado de Fortunato (2017) foram realizadas comparações entre métodos para a determinação de Ca2+ e Mg2+ em biodiesel, e a sua confrontação com materiais certificados.
Apresentamos, na tabela 1, um resumo desses resultados:
Tabela 1: Análise de Ca2+ e Mg2+ em biodiesel por vários métodos de calibração.
Análise Valor certificado
(mg Kg-1)
Calibração externa (mg Kg-1)
Padronização interna (mg Kg-1)
Adição de padrão (mg Kg-1)
Adição de padrão interno (mg Kg-1) Ca2+ 2,5 6,29 ± 0,20 2,71 ± 0,18 2,91 ± 0,10 2,53 ± 0,13 Mg2= 2,5 2,86 ± 0,10 2,46 ± 0,11 2,81 ± 0,15 2,60 ± 0,15 Fonte: (Fortunato, 2017)
Para a calibração externa, os resultados para Ca2+ e Mg2+ não foram concordantes com os valores certificados, no nível de confiança de 95% de acordo com o teste t de Student.
Na padronização interna, os resultados foram concordantes com os valores certificados, no nível de confiança de 95%.
Para o método de adição de padrão interno, os valores foram concordantes no nível de confiança de 95%.
No caso do método de adição de padrão os resultados não são concordantes com os valores certificados.
Um outro conjunto de análises para Ca2+ em biodiesel é apresentado na tabela 2.
Tabela 2: Análises de Ca2+ em biodiesel utilizando vários métodos de calibração.
Amostras de biodiesel
Calibração externa (mg Kg-1)
Padronização interna (mg Kg-1)
Adição de padrão (mg Kg-1)
Adição de padrão interno (mg Kg-1) 1 1,59 ± 0,44 0,70 ± 0,01 0,77 ± 0,06 0,69 ± 0,03 2 2,34 ± 0,56 1,00 ± 0,11 1,15 ± 0,04 1,13 ± 0,04 3 2,33 ± 0,70 1,01 ± 0,16 1,19 ± 0,15 1,05 ± 0,10 4 2,80 ± 0,28 1,17 ± 0,13 1,28 ± 0,13 1,20 ± 0,04 5 3,22 ± 0,23 1,39 ± 0,14 1,57 ± 0,11 1,46 ± 0,06 Fonte: (Fortunato, 2017).
Os resultados obtidos pelo método de calibração externa foram bastante distintos dos demais métodos, provavelmente pelo fato de que este método não corrige os efeitos de matriz.
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