EFEITO DO RAMNOLIPÍDEO SOBRE A HIDROFOBICIDADE DOS BIOFILMES DE
Listeria monocytogenes
S.S. Silva1, J. F. Ferreira1, M. Nitschke1
1-Departamento de Físico- Química- Universidade de São Paulo, Instituto de Química de São Carlos- CEP:
13566-590- São Carlos- SP- Brasil, Telefone: +55 (16) 3373-9951 - Fax: +55 (16) 3373-9952- e-mail:
(sumariasousa@iqsc.usp.br; jakeline.ferreira@usp.br; nitschke@usp.br)
RESUMO – Listeria monocytogenes é um patógeno oportunista que forma biofilmes em superfícies bióticas e abióticas. Os biofilmes representam uma fonte crônica de contaminação, pois as células tornam-se mais protegidas e difícil remoção. O uso de ramnolipídeo, um biossurfatante produzido por Pseudomonas aeruginosa pode ser uma estratégia eficiente para controle de biofilmes, pois apresenta potencial antimicrobiano, anti-adesivo e dispersivo. Este estudo analisou o efeito do ramnolipídeo sobre a hidrofobicidade de biofilmes de L. monocytogenes estabelecidos em superfície de poliestireno, em diferentes condições de concentração de ramnolipídeo, temperatura e meio de cultivo. A hidrofobicidade foi avaliada através da medida do ângulo de contato. Os resultados mostraram que os biofilmes formados nos diferentes meios de cultura apresentaram característica hidrofílica, e após o tratamento com ramnolipídeo tornam-se muito hidrofílicos, o que facilita a remoção. Estes resultados demonstram que a investigação de agentes tensoativos de origem biológica é promissora quanto ao controle e combate aos biofilmes.
ABSTRACT – Listeria monocytogenes is an opportunistic pathogen that form biofilms on biotic and abiotic surfaces. Biofilms are a chronic source of contamination, as the cells become more difficult to remove. The use of rhamnolipid, a biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa can be an effective strategy to biofilm control once it has potential as antimicrobial, anti-adhesive and dispersive agent. This study was to investigate the effect of rhamnolipid on the hydrophobicity of biofilms of L. monocytogenes established in polystyrene surfaces, under different conditions of rhamnolipid concentration, temperature and culture medium. The hydrophobicity was evaluated by contact angle measurements. The results showed that biofilms formed in different culture medium have hydrophilic character, and after treatment with rhamnolipid, biofilms become more hydrophilic, which may facilitates their removal. These results demonstrate that the use of surface-active agents of biological origin is promising to control and combating biofilms.
PALAVRAS-CHAVE: Listeria monocytogenes, biossurfatante, hidrofobicidade; poliestireno.
KEYWORDS: Listeria monocytogenes, biosurfactant; hydrophobicity; polystyrene.
1. INTRODUÇÃO
Biofilmes microbianos são comunidades dinâmicas e complexas formadas em superfícies e/ou interfaces ar-líquido na forma de agregados multicelulares envoltos por uma camada polimérica (Donlan, 2002; Bower e Daeschel, 1999). Este tipo de organização é extremamente vantajoso a todas as espécies de microrganismos por fornecer proteção contra adversidades como: desidratação,
colonização por bacteriófagos e resistência a antimicrobianos e sanitizantes (Araújo et al. 2013; Hall- Stoodle et al. 2004).
A formação de um biofilme permite um estilo de vida diferente do estado planctônico (Flemming e Wingender, 2010). Existem vários fatores relacionados ao estabelecimento de biofilmes, dentre eles os principais são: características físico-químicas da superfície e da célula, expressão de proteínas denominadas adesinas, fatores de virulência dos microrganismos, como produção de cápsula e fímbrias (Tortora et al. 2005; Donlan, 2002). No entanto, as interações precisas dos diferentes componentes em nível molecular ainda não sejam bem definidas (Flemming e Wingender, 2010).
Listeria monocytogenes é um cocobacilo curto, Gram-positivo,possuem crescimento em faixa de temperaturas 0°C (mínima), 25° a 30°C (ótima) e 45°C (máxima), não formador de endósporos (Hoffmann, 2001). Um patógeno oportunista de origem alimentar, com características psicrotróficas (crescimento < 7°C), anaeróbio facultativo que pode estar envolvido em vários surtos de doenças transmitidas por alimentos. Os alimentos mais comumente envolvidos na contaminação por essa bactéria são: as carnes prontas para o consumo, queijos frescos, laticínios não pasteurizados e/ou leite pasteurizado inadequadamente (Madigan et al. 2010). Esse microrganismo é único pela sua capacidade de crescer em temperatura de refrigeração, diferentes faixas de pH e de concentrações salinas. Dessa forma, torna-se uma ameaça às indústrias de alimentos que produzem produtos com vida útil prolongada e mantido a uma temperatura baixa (Pan et al., 2006). Além disso, suas células podem se fixar sobre uma grande variedade de superfícies, como polipropileno, poliestireno, borracha, aço inoxidável, plástico e vidro (Weiler et al. 2013).
Estudos evidenciam que a resistência apresentada por L. monocytogenes a agentes antimicrobianos ou sanitizantes em ambientes de processamento de alimentos seja resultante da capacidade de suas células em formar biofilmes. Essa forma de vida bacteriana demonstra ser muito mais resistente ao stress e higienização que as suas células planctônicas (livres). Os biofilmes apresentam resistência devido à formação de uma camada polimérica extracelular, e com isso, promovem resistência a sanitizantes como o cloro, podendo persistir por anos no ambiente de processamento de alimentos (Weiler et al. 2013; Srey et al. 2014).
Os ramnolipídeos (RLs) são glicolipídeos extracelulares produzidos principalmente por Pseudomonas aeruginosa formados em sua maioria por uma ou duas unidades de L-ramnose ligadas a um ou dois β-hidroxi ácidos graxos sendo classificados como mono-ramnolipídeo e di-ramnolipídeo (Müller et al. 2012). Estes compostos representam uma das classes de biossurfatantes mais importantes, pois apresentam propriedades que possibilitam inúmeras aplicações em diversas áreas da indústria, incluindo emulsificação, detergência, formação de espuma, solubilização, biorremediação entre outras (Reis et al. 2011). Além disso, podem ser utilizados no controle de fungos, algas, vírus e bactérias além de apresentar atividade anti-adesiva e de dispersão de biofilmes (Irfan-Maqsood e Seddiq-Shams, 2014). Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo analisar o efeito do ramnolipídeo sobre a hidrofobicidade de biofilmes de Listeria monocytogenes estabelecidos em superfície de poliestireno, em diferentes condições de concentração, temperatura e meio de cultivo.
2. MATERIAL E MÉTODOS
A cepa selecionada para este estudo foi Listeria monocytogenes ATCC 19112 relacionada com contaminação alimentar. O biossurfatante utilizado foi o ramnolipídeo comercial com 99 % de pureza produzido por P. aeruginosa. Este composto consiste na mistura de dois homólogos majoritários:
mono (R1) e di-ramnolipídeo (R2), cujo as fórmulas moleculares e massas molares são C26H48O9 (504 g mol-1) e C32H58O13 (650 g mol-1), respectivamente.
2.1 Formação e Tratamento dos Biofilmes com Ramnolipídeo
Os biofilmes foram formados em cupons de poliestireno, com dimensões de 2,4 x 7,6 cm que foram mergulhados em suspensão bacteriana (109 UFC mL-1) preparada em meios de cultivo (caldo triptona de soja extrato de levedura TSYEB) e leite, em volume total de 40 mL. As amostras foram mantidas em estufa bacteriológica de forma estática para o crescimento do biofilme a 37 °C por 48 h.
Após esse período os cupons foram lavados com água destilada estéril e transferidos para soluções de ramnolipídeo ou água (controle) deixando-se em imersão por 2 h, em temperaturas de 37°C e 4°C, (condições pré-determinadas em que houve maior remoção de biofilme). Decorrido esse tempo, os cupons foram lavados novamente com água destilada, secos em temperatura ambiente e analisados quanto a hidrofobicidade.
2.2 Avaliação da Hidrofobicidade
As medidas de ângulo de contato com a água foram realizadas com o objetivo de determinar a característica hidrofílica/hidrofóbica das superfícies dos biofilmes. Para tanto, utilizou-se o goniômetro CAM200 (KSV) operado pelo método da gota séssil, utilizando gotas de 3 µL. O ângulo entre a gota e a superfície foi determinado a partir da média de no mínimo 6 repetições.
2.3 Microscopia Eletrônica de Varredura
Para avaliar qualitativamente a arquitetura e a presença de matriz polimérica extracelular (MPE) antes e após o tratamento com o ramnolipídeo, os biofilmes foram observados em microscópio eletrônico de varredura. Assim, as amostras controles e tratamentos foram submetidas a desidratação através de imersão em soluções de álcool etílico em concentrações crescentes (10%, 25%, 40%, 50%, 70%, 80% 90% e 95%) e secas por 24h, em temperatura ambiente. Após secagem, as amostras foram metalizadas (banho de ouro) e levadas para a observação no microscópio eletrônico de varredura (ZEISS LEO 440), com detector OXFORD (modelo 7060)
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A medida do ângulo de contato dos biofilmes em superfície de poliestireno foi realizada para verificar se houve alteração da hidrofobicidade com e sem tratamento com o ramnolipídeo. As medidas dos ângulos de contato em diferentes meios de cultivo, temperatura e concentração de RL estão apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1- Medidas de ângulo de contato dos biofilmes de Listeria monocytogenes antes e após o tratamento com o ramnolipídeo.
Amostras Meio de
cultivo Temperatura de
tratamento (°C) Concentração
de RL (%) Ângulo
de contato (°)*
Poliestireno - - - 83,51±2,94
Controle TSYEB 37 0** 7,67 ± 1,24
Tratamento TSYEB 37 0,5 3,79± 1,21
Controle Leite 4 0** 43,23± 7,97
Tratamento Leite 4 0,5 5,82± 2,62
*Média de no mínimo 6 gotas ± desvio padrão
**Os controles foram tratados com água destilada esterilizada
A superfície de poliestireno foi considerada hidrofóbica por apresentar um ângulo de contato entre a água e a superfície maior que 65°. Segundo Vogler (1998), a medida utilizando-se a água é considerada um método qualitativo sendo a superfície classificada como hidrofóbica aquela que apresenta um ângulo de contato superior a 65º, enquanto valores inferiores a este, indica um perfil hidrofílico da superfície.
A superfície do biofilme formado em meio de cultura TSYEB reduziu os ângulos de contato do poliestireno (Tabela 1). A superfície passou a ser classificada como hidrofílica sendo que o tratamento com RL aumentou o caráter hidrofílico do biofilme. Já os biofilmes formados em leite desnatado reduziram a ângulo de contato de 83,5° para 43,2°, e o tratamento com RL também tornou o biofilme muito hidrofílico.
A hidrofobicidade é uma propriedade importante e representa a molhabilidade, ou seja, a capacidade de um líquido (água) manter contato com uma superfície. Se duas superfícies são hidrofóbicas, torna-se mais fácil eliminar a camada de água porque as moléculas de superfícies têm menos atração pelas moléculas de água e maior interação entre elas mesmas, entretanto se essas superfícies são hidrofílicas ocorre o contrário (Teixeira et al. 2005). Portanto, superfícies hidrofílicas desfavorecem o processo de adesão microbiana. De fato, Teixeira et al. (2005) confirmaram que a adesão de isolados de P. aeruginosa foi favorável no aço inoxidável e borracha, que são considerados hidrofóbicos e desfavorável em superfícies de vidro e polimetilacrilato, definidos como hidrofílicos.
A Figura 1 mostra o biofilme de L. monocytogenes formado em TSYEB (Figura 1A e B) e em leite (Figura 1B e C) antes e após tratamento com 0,5% de ramnolipídeo à 37° e 4°C, respectivamente.
Após um período de incubação por 48 h observou-se a formação de um biofilme com grande produção de polímero extracelular, na presença do substrato TSYEB e não em leite. Com a adição do ramnolipídeo sobre o biofilme foi possível observar a redução da matriz polimérica e de grande parte das bactérias aderidas, demonstrando sua eficiente ação. Esses resultados sugerem que a composição dos meios de cultivos são fatores importantes para formação de biofilmes em superfícies de poliestireno.
Figura 1- Eletromicrografias dos biofilmes de L. monocytogenes (ATCC 19112) em TSYEB (A) Controle, (B) Tratado com 0,5% de RL à 37°C e em leite (C) Controle e (D) Tratado com 0,5% de RL à 4°C.
A B
C D
A formação de biofilme é um processo complexo regulado por diversos fatores, incluindo o meio de crescimento e ainda pouco estudado em matriz alimentar (Marchand et al. 2012). O leite é um meio bastante heterogêneo, compreende uma mistura de vários tipos de proteínas, gorduras, minerais e outros. Neste caso, a adsorção de proteínas do leite na superfície de estudo, podem ter contribuído para alterar a hidrofobicidade da superfície. Apesar de algumas controvérsias, a maioria dos estudos indicam que leite ou seus componentes individuais, tais como caseína, β-lactoglobulina, α- lactolbumina são capazes de adsorver em superfícies abióticas, reduzindo a eficiência de fixação de uma variedade de patógenos, incluindo S. aureus, L. monocytogenes e S.marcescens (Barnes et al.
1999). Os resultados obtidos podem ser importantes subsídios para futuras investigações sobre as interações físico-químicas entre ramnolipídeo e a camada de biofilme visando aplicação como agentes sanitizantes em indústria de alimentos.
4. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos neste estudo mostraram que o estabelecimento de biofilmes de L.
monocytogenes em meio TSYEB e em leite torna a superfície do poliestireno hidrofílica, porém em leite essa característica é menos pronunciada. No entanto, após o tratamento com ramnolipídeos ambas as superfícies tornam-se muito hidrofílicas sugerindo que esta alteração pode favorecer a remoção desses biofilmes.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Araújo, L.V., Freire, D. M. G. & Nitschke, M. (2013). Biossurfactantes: propriedades anticorrosivas, antibiofilmes e antimicrobianas. Química Nova (Impresso), 36, 848-858.
Barnes,L.-M., Lo,M. F., Adams,M. R. & Chamberlain, A. H. L. (1999). Effect of milk proteins on adhesion of bacteria to stainless steel surfaces. Applied and Environmental Microbiology, 65 (10), 4543-4548.
Bower, C. K. & Daeschel, M. A. (1999). Resistance responses of microorganisms in food environments. International Journal of Food Microbiology, 50, 33-44.
Donlan, R. M. (2002). Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases, 8(9), 881- 890.
Flemming, H.-C & Wingender, J. (2010). The biofilm matrix. Nature reviews- Microbiology, 8,623- 633.
Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W. & Stoodley, P. (2004). Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology, 2(2), 95-108.
Hoffmann, F. L. (2001). Fatores limitantes à proliferação de microorganismos em alimentos. Brasil Alimentos, (9), 23-30.
Irfan-Maqsood, M. & Seddiq-Shams, M. (2014). Rhamnolipids: Well-characterized glycolipids with potential broad applicability as biosurfactants. Industrial biotechnology, 10( 4), 285-291.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., Dunlap, P. V. & Clark, D. P. (2010). Microbiologia de Brock. (12.
ed.). Porto Alegre: Artmed.
Marchand, S., Block, J. D., Jonghe, V. D., Coorevits, A., Heyndrickx, M. & Herman, L. (2012).
Biofilm Formation in Milk Production and Processing Environments; Influence on Milk Quality and Safety. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 11(2), 133-147.
Müller, M. M., Kügler J.H., Henkel, M., Gerlitzki , M., Hörmann, B., Pöhnlein, M., Syldatk, C. &
Hausmann, R. (2012). Rhamnolipids-next generation surfactants? Journal of Biotechnology, 162(4), 366-380.
Pan,Y., Breidt, J. R. F. & Kathariou, S. (2006). Resistance of Listeria monocytogenes Biofilms to Sanitizing Agents in a Simulated Food Processing Environment. Applied and Environmental Microbiology, 72(12), 7711-7717.
Reis, R. S., Pereira, A. G., Neves, B. C. & Freire,D. M.G. (2011).Gene regulation of rhamnolipid production in Pseudomonas aeruginosa - A review. Bioresource Technology, 102, 6377-6384.
Srey, S., Park, S. Y., Jahid, I. K., Oh, S.-R, Han, N., Zhang, C.-Y, Kim, S.-H., Cho, J.-I. & Ha, S.-D.
(2014). Evaluation of the removal and destruction effect of a chlorine and thiamine dilauryl sulfate combined treatment on L. monocytogenes biofilm. Foodborne Pathogens and Disease, 11(8), 658-663.
Teixeira, P., Lopez, Z., Azeredo, J., Oliveira, R. & VIeira, M.J. (2005). Physicochemical surface characterization of a bacteria population isolated from a milking machine. Food Microbiology, 22, 247–251.
Tortora, G. J., Funke, B. R. & Case, C. L. (2005). Microbiologia. (8. ed.). Porto Alegre: Artemed.
Vogler, E. A. (1998). Structure and reactivity of water at biomaterial surfaces. Advances in Colloid and Interface Science, 74, 69-117.
Weiler, C., Ifland, A., Naumann, A., Kleta, S. & Noll, M. (2013) Incorporation of Listeria monocytogenes strains in raw milk biofilms. International Journal of Food Microbiology, 161, 61-68.
