UNIVERSIDADE CEUMA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA MARCIA BARROS ALVES

UNIVERSIDADE CEUMA

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA

MARCIA BARROS ALVES

PROPRIEDADES E FATORES DE VIRULÊNCIA E GENOTIPAGEM MOLECULAR

DE ISOLADOS CLÍNICOS DE Candida parapsilosis

São Luís 2015

MARCIA BARROS ALVES

PROPRIEDADES E FATORES DE VIRULÊNCIA E GENOTIPAGEM MOLECULAR

DE ISOLADOS CLÍNICOS DE Candida parapsilosis

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Biologia Parasitária como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária.

Orientadora: Profa. Dra. Cristina de Andrade Monteiro

São Luís 2015

Alves, Márcia Barros.

Propriedades e fatores de virulência e genotipagem molecular de isolados clínicos de Candida parapsilosis. / Márcia Barros Alves.

São Luís: UNICEUMA, 2015.

70 p.:il.

Dissertação (Mestrado) – Curso de Biologia Parasitária.

Universidade CEUMA, 2015.

1. Microssatélites. 2. Candida parapsilosis. 3. SADH. I. Monteiro, Cristina de Andrade (Orientadora). II. Título.

CDU: 504.06 A474p

FOLHA DE APROVAÇÃO

MARCIA BARROS ALVES

PROPRIEDADES E FATORES DE VIRULÊNCIA E GENOTIPAGEM MOLECULAR DE ISOLADOS CLÍNICOS DE Candida parapsilosis

A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / , considerou a candidata

( ) APROVADA ( ) REPROVADA

1) Examinador _____________________________________________________

2) Examinador ______________________________________________________

3) Examinador ______________________________________________________

4) Presidente (Orientador)______________________________________________

Dedico este trabalho a todos

que contribuíram para que ele fosse concretizado.

Agradeço

À Deus, que me deu forças para conseguir chegar até aqui apesar de todas as adversidades e que sempre ouviu minhas preocupações nas horas em que eu não conseguia falar.

Aos meus pais, João Gualberto Alves e Helena Álvares Barros, que são responsáveis por todas as coisas boas que já fiz na vida e ainda farei, pelo amor, carinho e por estarem ao meu lado todo o tempo, incentivando e mostrando os melhores caminhos a serem tomados e apoiam- me de todas as maneiras possíveis para que juntos alcancemos mais e mais objetivos de vida.

Ao meu irmão, Marcio Barros Alves, que é o grande torcedor da “maninha” dele, por sempre ser solícito a ouvir meus problemas, minhas alegrias e até minha fúria.

Aos tios e primos, que mesmo de longe, acompanham-me, compartilhando a felicidade e o orgulho que sentem com todas as minhas conquistas, mesmo as pequenas.

Ao meu namorado, amigo, companheiro, Rossini Carlos Silva Sousa, que deu amor, carinho, atenção, acompanhou a minha vida acadêmica nos momentos bons e ruins, me fazendo rir em dias de desânimo e ensinando a ser mais forte para não deixar a “peteca” cair e que, além de incentivar, cobrava resultados também.

Às minhas amigas, Ellen Naianne da Silva Cantanhede, Pollyanna Lindoso Kromek, Rafaella Cristine de Souza e Daniella Patrícia Brandão Silveira por desejarem o melhor para mim e fazerem parte de todos os momentos (principalmente aqueles acompanhados de pizza, cinema, refrigerante e risos).

A profa. Dra. Cristina de Andrade Monteiro (para mim, a teacher), a quem eu tanto admiro como pessoa e como profissional e devo quase tudo o que aprendi para a vida profissional porque acreditou em mim quando eu era apenas uma estudante de biologia, pela paciência e dedicação na minha orientação.

Aos professores Dr. Lídio Gonçalves Lima Neto e Dra. Maria Rosa Quaresma Bomfim, que foram co-orientadores, ajudando a solucionar problemas, discutindo, dando sugestões e, além disso, ainda tentaram acompanhar o desenvolver das etapas do trabalho mesmo com todas as ocupações que já tinham.

A Margareth Santos Costa Penha, por sempre me receber com um sorriso todos os dias e, além de ter se tornado uma parceira, ajudou sempre de maneira solícita e com muito carinho.

A todos os meus colegas de “labuta”, em especial Iven Neylla Farias Vale Mendes, Fernanda Costa Rosa, Laura, Patrícia Valéria Gomes Castelo Branco, Reinaldo Oliveira Araújo Júnior e Willyson Richard Jardim Araújo, todos foram mais que meros colegas de pesquisa ajudando aqui e ali e regando as muitas horas de testes no laboratório com risadas e brincadeiras até quando o momento era de completo “aperreio”.

Aos colegas da química na UFMA, em especial Victor Eduardo de Araújo França, Afonso Vilar Guimarães Pereira Júnior e Talita Cristina Raiol Carvalho, por esperarem por esse título comigo só porque me acham legal, mas legais mesmo são eles.

Ao professor Thiago Azevedo Feitosa Ferro, por ajudar nos testes estatísticos e dar apoio moral e incentivos para o futuro na pesquisa.

À Fundação de Amparo à Pesquisa e Desenvolvimento do Maranhão (FAPEMA), pelo financiamento e apoio à minha pesquisa.

“ O sucesso é ir de fracasso em fracasso sem perder entusiasmo.”

Winston Churchill

LISTA DE FIGURA

Figura 1 Gel de agarose mostrando os perfis da reação PCR para a detecção de microssatélite CP1 em isolados de C. parapsilosis stricto sensu ... 35 Figura 2 Gel de agarose mostrando a reação de PCR do gene SADH em isolados de C.

parapsilosis ... 36 Figura 3 Gel de agarose mostrando o perfil de reação RFLP com enzima de restrição Ban I ... 37 Figura 4 Distribuição dos isolados estudados de acordo com as espécies do complexo C.

parapsilosis e os espécimes clínicos ... 38 Figura 5 Níveis de intensidade da capacidade de adesão a vidro de isolados de C.

parapsilosis...40 Figura 6 Lâmina de teste de adesão a vidro em isolados de C. parapsilosis... 40 Figura 7 Distribuição dos níveis de intensidade de adesão a vidro por espécimes clínicos dos isolados de C. parapsilosis ... 41 Figura 8 Distribuição da intensidade de formação de biofilme por C. parapsilosis ... 43 Figura 9 Intensidade da capacidade de formação de biofilme dos isolados de C. parapsilosis em relação aos espécimes clínicos ... 44 Figura 10 Intensidade da produção de hemolisina em isolados de C. parapsilosis ... 46 Figura 11 Distribuição da produção de hemolisinas por C. parapsilosis de acordo com os espécimes clínicos dos isolados ... 47 Figura 12 Intensidade da produção de fosfolipases em C. parapsilosis ... 49 Figura 13 Distribuição da produção de fosfolipases por espécimes clínicos de C.

parapsilosis...50 Figura 14 Intensidade de produção de proteinases por C. parapsilosis ... 51 Figura 15 Distribuição da produção de proteinases por espécimes clínicos de C. parapsilosis.

... 52 Figura 16 Distribuição de produção de catalase por espécimes clínicos de C. parapsilosis. ... 54 Figura 17 Distribuição da capacidade de adesão e da formação de biofilme por espécimes clínicos de C. parapsilosis ... 55 Figura 18 Correlação positiva entre biofilme e adesão para os isolados de C. parapsilosis .... 56 Figura 19 Distribuição da produção de exoenzimas por sítios anatômicos de C. parapsilosis 56

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Sequência dos iniciadores da região de microssatélites específicos para Candida parapsilosis stricto sensu ... 29 Tabela 2 Sequência dos iniciadores para região do gene SADH para C. metapsilosis e C.

orthopsilosis ... 29 Tabela 3 Classificação da formação de biofilme ... 32 Tabela 4 Distribuição dos isolados de C. parapsilosis por espécimes clínicos. ... 37 Tabela 5 Distribuição dos níveis de capacidade de adesão a vidro pela espécie do complexo C.

parapsilosis ... 42 Tabela 6 Distribuição das intensidades de formação de biofilme por espécie do complexo C.

parapsilosis ... 45 Tabela 7 Distribuição dos níveis de produção de hemolisinas por espécie do complexo C.

parapsilosis ... 48 Tabela 8 Distribuição das intensidades de produção de fosfolipases por espécie do complexo C. parapsilosis ... 51 Tabela 9 Distribuição das intensidades de produção de proteinases por espécie do complexo C.

parapsilosis ... 53 Tabela 10 Distribuição das intensidades de produção de catalase por espécie do complexo C.

parapsilosis ... 54

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

°C – graus Celsius ou graus centígrados ALS – Agglutinin-Like Sequence

BCR- Biofilm and cell wall regulator BHI – Brain Heart Infusion

CIA – Clorofórmio Álcool-Isoamílico DNA – Ácido desoxirribonucleico D.O.i- Densidade óptica do isolado D.O.c- Densidade óptica do controle EDTA- Ethylenediamine tetraacetic acid EFG – Enhanced Filamentous Growth EPA – Epithelial adhesion

HBECS- Células epiteliais bucais humanas H.I.- Índice hemolítico

HPW- Hyphal wall protein

ITS- Internal transcribed sequence NaCl- Cloreto de Sódio

pb – pares de bases

PBS – Phosphate buffered saline PCR – Polimerase Chain Reaction pH- potencial Hidrogeniônico P.z.- Zona de precipitação

RAPD- Random amplication of polymorphic DNA RFLP- Restriction fragment length polymorphism SADH- Secondary alcohol dehydrogenase

SAP – Secreted Aspartic Proteinase SDS – Sodium dodecyl sulfate TE – Tris e EDTA

TL – Tampão de lise TRIS – tampão TRIS

UFCs – Unidades formadoras de colônias

RESUMO

O gênero Candida é alvo de estudos desde a década de 40, sempre voltados para os aspectos médicos como acontece até os dias de hoje. Em pacientes imunocomprometidos as espécies de Candida se tornam um dos principais agentes causadores de infecções da corrente sanguínea, estando inclusive, associadas ao uso de cateteres e dispositivos protéticos. Dentre as espécies uma das mais frequentemente isolada é a Candida parapsilosis sendo considerada em geral a segunda ou terceira espécie mais comum em isolados de culturas de sangue. De acordo com a literatura vigente os três diferentes grupos de C. parapsilosis são considerados espécies diferentes de acordo com o grau de variação de sequências de microssatélites, de modo que o grupo I corresponde a Candida parapsilosis (stricto sensu), o grupo II é denominado Candida orthopsilosis e o grupo III, Candida metapsilosis. Desse modo o presente trabalho fez a identificação de isolados previamente identificados como C. parapsilosis, provenientes de diferentes espécimes clínicos, por meio da análise de marcadores microssatélites e do gene SADH e observou a associação destes com as propriedades e fatores de virulência para adesão, formação de biofilme, produção de hemólise, fosfolipase, proteinase, catalase e gelatinase por elas apresentados e o espécime clínico ao qual pertenciam. Foram analisados 57 isolados (28 de secreção vaginal e 29 de outros sítios, como urina, ponta de cateter, sangue e sítios desconhecidos). Destes 54 foram identificados como C. parapsilosis stricto sensu, 1 como C.

metapsilosis e 2 como C. orthopsilosis. As espécies apresentaram variação intraespecífica para os fatores e propriedades de virulência e foi encontrada uma correlação positiva entre adesão e biofilme. Por fim, não foi encontrada associação entre os espécimes clínicos e a espécie dos isolados, nem das espécies e os fatores e propriedades de virulência analisados.

Palavras-chave: Candida parapsilosis, microssatélites, SADH, identificação.

ABSTRACT

The genus Candida is the subject of studies since the 40s, always focused on the medical aspects as it does to this day. In immunocompromised patients Candida species become one of the leading causes of bloodstream infections, including being associated with the use of catheters and prosthetic devices. Among species one of the most frequently isolated Candida parapsilosis and is generally considered the second or third most common species isolated from blood cultures. According to the current literature C. parapsilosis three different groups are considered different species according to the degree of variation of microsatellite sequences, so that the group I is Candida parapsilosis (sensu stricto), group II is named Candida orthopsilosis and group III, Candida metapsilosis. Thus this work made the identification of previously identified as C. parapsilosis isolates from different clinical specimens, through the analysis of microsatellite markers and SADH gene and observed their association with the properties and virulence factors for adhesion, biofilm, the haemolysis production, phospholipase, protease, catalase, and gelatinase, and they present the clinical specimen to which they belonged. 57 isolates were analyzed (28 vaginal secretion and 29 other sites such as urine, catheter tip, blood and unknown sites). Of these 54 were identified as C. parapsilosis stricto sensu, as C.

metapsilosis 1 and 2 as C. orthopsilosis. The species present intraspecific variation for virulence factors and properties and found a positive correlation between adherence and biofilm. Finally, no association was found between clinical specimens and species of isolated, or of species and the factors and virulence properties analyzed.

Keywords: Candida parapsilosis, microsatellite, SADH, identification

Sumário

1. INTRODUÇÃO ...15

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...19

2.1 CANDIDA PARAPSILOSIS ... 19

2.2 FATORES E PROPRIEDADES DE VIRULÊNCIA ... 20

2.2.1 Enzimas hidrolíticas ... 21

2.2.2 Adesão ... 22

2.2.3 Biofilme ... 24

3. OBJETIVOS ...27

3.1OBJETIVO GERAL ... 27

3.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 27

4. MATERIAL E MÉTODOS ...28

4.1NATUREZA E OBTENÇÃO DOS ISOLADOS ... 28

4.2IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS ... 28

4.2.1 Extração de DNA genômico ... 28

4.2.2 Amplificação por PCR das regiões de microssatélites e do gene SADH ... 28

4.2.3 RFLP do gene SADH ... 30

4.3ANÁLISE DAS PROPRIEDADES E FATORES DE VIRULÊNCIA ... 30

4.3.1 Capacidade de Adesão a vidro ... 30

4.3.2 Formação de biofilme ... 31

4.3.3 Produção de hemolisinas ... 32

4.3.4 Produção de fosfolipases ... 32

4.3.5 Produção de proteinases ... 33

4.3.6 Produção de catalase ... 33

4.3.7 Produção de gelatinase ... 33

4.4ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 34

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...35

5.1IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS ... 35

5.2FREQUÊNCIA E DISTRIBUIÇÃO DOS ISOLADOS ... 37

5.3ADESÃO A VIDRO ... 39

5.4FORMAÇÃO DE BIOFILME ... 42

5.5PRODUÇÃO DE EXOENZIMAS ... 46

5.5.1 Hemolisinas ... 46

5.5.2 Fosfolipases ... 48

5.5.3 Proteinases ... 51

5.5.4 Catalase ... 53

5.5.5 Gelatinase ... 55

5.6CORRELAÇÕES ENTRE OS FATORES DE VIRULÊNCIA AVALIADOS ... 55

6. CONCLUSÕES ...57

REFERÊNCIAS ...58

ANEXOS...65

ANEXOA-PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA E PESQUISA DA UNIVERSIDADE CEUMA ... 66

ANEXOB-PROTOCOLOS DE SUBMISSÃO DO ARTIGO “PREVALÊNCIA DE CANDIDA SPP. EM AMOSTRAS DE SECREÇÃO VAGINAL E SUA RELAÇÃO COM FATORES ASSOCIADOS À VULVOVAGINITE” ... 69

ANEXOC-CERTIFICADO DE APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NO VIICONGRESSO BRASILEIRO DE MICOLOGIA ... 70

1. Introdução

O gênero Candida é alvo de estudos desde a década de 40, sempre voltados para os aspectos clínicos como acontece até os dias de hoje (SKINNER; FLETCHER, 1958; MOTA, 2007). Candida spp. desenvolvem um estado comensal em indivíduos saudáveis e nesse estado não causam doenças podendo inclusive alcançar uma grande densidade populacional sem desenvolver qualquer sintomatologia (MOTA, 2007). Porém, em pacientes imunocomprometidos as espécies de Candida se tornam um dos principais agentes causadores de infecções da corrente sanguínea, estando inclusive, associadas ao uso de cateteres e dispositivos protéticos (SABINO et al., 2010).

As espécies do gênero Candida têm sido os agentes mais frequentemente isolados e correspondem a cerca de 80% das infecções fúngicas de origem hospitalar. São consideradas a quarta causa de infecção da corrente sanguínea, estando associadas a uma letalidade de 40%

(GERMAIN et al., 2001; TAMURA et al., 2007).

Em 1963 eram conhecidas cerca de cinco espécies de Candida consideradas de importância médica: C. albicans, C. stellatoidea, C. parapsilosis, C. tropicalis e C.

guilliermondii. Estudos registraram mais de vinte espécies de Candida causadoras de infecções (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003; BACELO, 2008). Dentre estas de interesse clínico, a Candida albicans é a espécie frequentemente mais isolada de infecções superficiais e invasivas em diferentes sítios anatômicos, apresentando grande potencial patogênico sendo, portanto, bastante estudada (BACELO, 2008).

As candidemias continuam a ser um importante problema de saúde pública; estudos recentes documentam um declínio em infecções bacterianas da corrente sanguínea associadas à cateter, porém o mesmo não é observado em infecções causadas por espécies de Candida associadas aos mesmos dispositivos médicos (SCHULMAN et al., 2011; CLEVELAND et al., 2015). O tratamento em casos de candidíases tem se mostrado complicado devido ao aumento relativo na proporção de isolados de Candida não albicans que demonstram muitas vezes uma resistência intrínseca aos agentes antifúngicos específicos (SHIVAPRAKASHA;

RADHAKRISHNAN; KARIM, 2007; SHARMA et al., 2015). Dados epidemiológicos recentes revelam uma mudança micológica quanto às espécies relacionadas à candidemia de C. albicans para espécies de Candida não albicans, como C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C.

krusei (WISPLINGHOFF et al., 2004; GUPTA; GUPTA; VARMA, 2015).

Dentre estas espécies, uma das mais frequentemente isolada é a Candida parapsilosis, como apontam estudos desenvolvidos em algumas instituições hospitalares na América Latina, Canadá e Ásia, nos quais é considerada em geral a segunda ou terceira espécie mais comum em isolados de culturas de sangue (PFALLER et al., 2000; BASSETI et al., 2006; LASKER et al., 2006; SOUZA, 2007).

Diante da importância clínica apresentada pela Candida parapsilosis, nota-se a importância do estudo dessa espécie que vem demonstrando cada vez mais expressiva em infecções hospitalares. Inclusive, diferente das demais espécies de Candida, a C. parapsilosis tem sido encontrada nas mãos de profissionais de saúde que instalam e mantêm os dispositivos médicos, sugerindo uma rota potencial de transmissão (WENZEL; EDMOND, 2001; SABINO et al., 2010).

Epidemiologicamente e clinicamente as características correspondentes a cada espécie de Candida causadora de candidíase tem sido pobremente documentadas, uma vez que o diagnóstico fenotípico delas é pouco confiável por esse motivo é que se torna importante a identificação rápida e correta da espécie de Candida em laboratórios clínicos para o tratamento de pacientes com candidemia (HAYS et al., 2011).

Os diagnósticos de Candida eram baseados em identificar se o isolado em questão era Candida albicans ou Candida não albicans, para tanto era feita a identificação de C. albicans através da formação de tubo germinativo em soro humano ou animal a 37 °C ou por meio de testes de assimilação de carboidratos (MADHAVAN et al., 2011). Na tentativa de melhorar o diagnóstico da espécie de Candida desenvolveram-se métodos laboratoriais menos laboriosos e mais rápidos, como os meios cromógenos (consistem na mudança de cor do meio de acordo com o pH produzido por cada espécie) e os métodos comerciais, baseados em assimilação de carboidratos (ARRAM, 2008).

Há vários relatos e pesquisas que mostram identificação errada de várias espécies de Candida quando os pesquisadores usam técnicas de identificação fenotípica (ROWEN et al., 1999; REILLY et al., 1999; MOTA, 2007). Diante desse quadro era importante se desenvolver estudos que pudessem trazer um diagnóstico confiável e rápido dessas leveduras e como demonstraram os estudos de Xu et al. (2002) e Mota (2007), os métodos moleculares mostraram-se como excelentes métodos de identificação de Candida spp.

A rápida identificação dos isolados envolvidos em infecções e a elucidação dos padrões de diversidade genética são questões relevantes clinicamente, uma vez que esse conhecimento pode contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e tratamento das infecções (SABINO et al., 2010).

Com o avanço nos estudos de biologia molecular desenvolveram-se técnicas de genotipagem molecular rápida para análises clínicas e epidemiológicas. Vários métodos de tipagem molecular foram desenvolvidos para diferenciar isolados de C. albicans inicialmente, fazendo uso, por exemplo, de cariotipagem eletroforética, uso de sondas específicas para a espécie em análise de enzimas de restrição ou mesmo uso de métodos baseados em PCR (SAMPAIO et al., 2003).

Hoje é empregada uma variedade de métodos moleculares baseados no DNA para subtipagem de Candida spp., como os métodos baseados na análise de polimorfismo em marcadores microssatélites (WISE et al., 2007). Microssatélites ou repetições em “tandem”

consistem em trechos de repetições de nucleotídeos únicas e dispersas pelo genoma e com um alto nível de polimorfismo quando comparado com outros marcadores moleculares. Em leveduras, os loci de microssatélites tem uma variação de tamanho considerável e isso faz deles marcadores moleculares atrativos para vários de tipos de análises. O polimorfismo de microssatélites manifesta-se como diferenças no comprimento alélico devido ao diferente número de repetições únicas presentes em alelos que podem ser facilmente analisadas em amplificações por PCR (SAMPAIO et al., 2005).

Candida parapsilosis emergiu na década de 1990 como uma das principais espécies causadoras de candidemias, mas a sua incidência continua a aumentar e, ainda, a sua habilidade em aderir a dispositivos, como implantes médicos, é similar àquela de Candida albicans, conferindo-lhe grande resistência a agentes antifúngicos, levando a um real problema terapêutico (HAYS et al., 2011). C. parapsilosis foi identificada pela primeira vez como agente causador de um caso fatal em 1940, quando foi associada a endocardite (TROFA; GÁCSER;

NOSANCHUK, 2008). Nos últimos anos esta espécie além de ter um aumento de sua prevalência, tem sido responsável por uma significante taxa de mortalidade em unidades de tratamento hospitalar (CHICKERING, 2013).

Fisiologicamente, os isolados de C. parapsilosis são indistinguíveis, mas geneticamente são relatados como uma espécie heterogênea. Vários estudos baseados em diversas análises como RAPD (Random amplication of polymorphic DNA), análise com isoenzimas, análise de nucleotídeos de ITS (Internal transcribed sequence), hibridização de DNA, apontam a espécie como sendo composta por três grupos distintos, que seriam os grupos I, II e III (SABINO et al., 2010).

Tavanti et al. (2005) propuseram que os três diferentes grupos de C. parapsilosis fossem considerados espécies diferentes de acordo com o grau de variação de sequências de microssatélites, de modo que o grupo I corresponderia a Candida parapsilosis (stricto sensu), o grupo II seria denominado Candida orthopsilosis e o grupo III, Candida metapsilosis.

O uso de marcadores microssatélites para identificação de C. parapsilosis é vantajoso porque permite a identificação até mesmo de micro-organismos com baixo grau de variação de sequência (LASKER et al., 2006), permitindo uma identificação confiável. Além do que, cada uma dessas espécies apresenta características diferentes quanto à virulência como sugerido por Tavanti et al. (2007). No entanto, apesar da importância crescente do complexo de espécies C.

parapsilosis, poucos trabalhos avaliando a virulência in vitro destas espécies foram realizados e pouco se sabe sobre as características da virulência que lhes permitem causar doenças (SABINO et al., 2011).

2. Revisão bibliográfica 2.1 Candida parapsilosis

Candida parapsilosis é ubíquo na pele humana, sendo a segunda causa principal de infecções fúngicas com morte (GÁCSER et al., 2007). Esta espécie é comumente relacionada a cateter, hiperalimentação intravenosa e associada a candidemia devido à sua capacidade de aderir e formar biofilmes sobre as superfícies de dispositivos intravasculares. Na verdade, C.

parapsilosis tem sido considerado um importante patógeno nosocomial, com manifestações clínicas que incluem endoftalmite, endocardite, artrite séptica, peritonite e fungemia sendo geralmente associada a procedimentos invasivos ou próteses (BARBEDO; SGARBI, 2010;

CANTÓN et al., 2011).

C. parapsilosis foi isolado pela primeira vez por Ashford (como uma espécie de Monilia que era incapaz de fermentar maltose) a partir das fezes de um paciente com diarréia em Porto Rico, em 1928. A espécie foi nomeada Monilia parapsilosis para distingui-lo do isolado mais comum, Monilia psilosis, hoje conhecido como Candida albicans. Embora inicialmente considerada não patogênica, C. parapsilosis foi identificada como sendo agente causador de um caso fatal de endocardite em 1940 (TROFA; GÁCSER; NOSANCHUK, 2008).

As células de C. parapsilosis exibem formas ovais, redondas e cilíndricas quando crescidas em ágar Sabouraud dextrose, formam colônias brancas, cremosas, brilhantes, homogêneas ou enrugadas. Diferente de C. albicans e C. tropicalis, que podem apresentar múltiplas formas morfogenéticas, C. parapsilosis não forma hifas verdadeiras e pode se apresentar em forma leveduriforme ou de pseudohifa (TROFA; GÁCSER; NOSANCHUK, 2008).

Diferente da C. albicans, a transmissão e a aquisição da infecção causada por C.

parapsilosis são principalmente exógenas e os isolados provenientes do ambiente são frequentes fontes de infecção (SABINO et al., 2011).

Desde os anos 80, C. parapsilosis apresenta-se como um importante patógeno hospitalar de fungemias, sendo responsável por 7% a 15% das candidemias na maioria das pesquisas publicadas nos EUA e Europa. Sua ocorrência foi registrada como ainda maior em crianças e recém-nascidos prematuros internados em unidades de terapia intensiva onde a prevalência de candidemias por C. parapsilosis foi documentada entre as faixas de 17% a 50% dos casos (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003).

Desde 2005, C. parapsilosis é considerada um complexo de espécies, com três espécies distintas, baseadas em critério genético: C. parapsilosis, C. metapsilosis e C. orthopsilosis (HAYS et al., 2011).

Análise retrospectiva com base nos estudos moleculares indica que C. metapsilosis e C.

orthopsilosis representam de 1-10% das infecções / colonizações atribuídas a C. parapsilosis em testes bioquímicos convencionais. Estudos relacionados ao potencial patogênico de isolados pertencentes às três espécies do complexo de C. parapsilosis apontam C. metapsilosis como o membro menos virulento do grupo (BERTINI et al., 2013). Segundo Gonçalves et al. (2010), a prevalência das espécies de C. parapsilosis provenientes de 141 isolados de corrente sanguínea testadas no Brasil representaram 88% de C. parapsilosis, 9% de C. orthopsilosis e 3% de C.

metapsilosis.

Embora as três espécies estejam intimamente relacionadas, elas diferem acentuadamente em sua prevalência clínica, virulência e suscetibilidade aos antifúngicos. No entanto, todas as três espécies são capazes de causar doenças graves com diversas manifestações clínicas, incluindo a fungemia. Vários estudos epidemiológicos indicam que a maioria dos casos associados ao complexo C. parapsilosis são causados por isolados de C. parapsilosis stricto sensu e C. orthopsilosis é responsável por cerca de 1 a 10% dos casos, dependendo da região geográfica, no entanto, C. orthopsilosis é mais frequentemente identificada do que C.

metapsilosis, apesar de ambas as espécies serem associadas com vários focos de infecção (MIRHENDI et al., 2010; PRYSZCZ et al., 2014).

2.2 Fatores e propriedades de virulência

Fatores e propriedades de virulência bem como o mecanismo de defesa do hospedeiro atenuada desempenham um papel crítico no desenvolvimento de infecções por Candida spp.

As enzimas hidrolíticas extracelulares das espécies de Candida facilitam a adesão e penetração no tecido e, por conseguinte, invasão do hospedeiro. Além disso, a produção de biofilme é conhecida por ser mais resistente a agentes antimicrobianos e de resposta imune, o que conduz ao fracasso do tratamento (ATALAY et al., 2015).

Uma variabilidade notável da virulência foi observada para C. parapsilosis, tais como a capacidade de formação de biofilme ou de produção de enzimas hidrolíticas (TAVANTI et al., 2010).

2.2.1 Enzimas hidrolíticas

O estudo das enzimas hidrolíticas é mais frequentemente descrito em C. albicans, onde se sabe que elas desempenham um papel central na patogenicidade da candidíase (BRANCO et al., 2012). Enzimas hidrolíticas contribuem para os fatores de virulência em espécies de Candida. As enzimas produzidas são hemolisina, proteinase, lipase e fosfolipase, fatores que são responsáveis pela capacidade de invasão e proliferação de fungos causando a destruição dos tecidos (RAMESH et al., 2011).

Capacidade hemolítica é um importante fator de virulência, onde a produção de hemolisina e o rompimento de hemácias pelas mesmas levam os fungos do gênero Candida a adquirirem ferro a partir de tecidos do hospedeiro, o qual é utilizado para o metabolismo, crescimento e invasão durante a infecção. Em seres humanos, o ferro é encontrado em algumas proteínas, incluindo hemoglobina (um componente de eritrócitos) (ROSSONI et al., 2013).

Estudos apontam que a produção de hemolisinas é regulada pela presença de glicose no meio de crescimento e que C. glabrata, C. parapsilosis e C. tropicalis são capazes de produzir hemolisinas in vitro em vários níveis (SILVA et al., 2011). Foi reportado em testes (LUO;

SAMARANAYAKE; YAU, 2001; MALCOK et al., 2009) que C. parapsilosis não exibem hemólise em meios sem o acréscimo de 3% de glicose e mesmo com o acréscimo exibem apenas alfa hemólise.

A produção de proteinases se dá em função da expressão de genes denominados Secreted aspartyl proteinases (Saps). As proteinases facilitam a invasão e colonização de tecidos dos hospedeiros pela ruptura das mucosas e degradam importantes proteínas de defesa imunológica e estrutural, como albumina, hemoglobina, queratina, colágeno, mucina, lactoferrina, lactoperoxidase e imunoglobulinas como as da classe IgA (BRANCO et al., 2012).

Para C. parapsilosis três genes SAP foram identificados (SAPP1-3), dos quais dois permanecem pouco caracterizados. A isoenzima Sapp1 tem sido estudada para caracterização bioquímica, a Sapp2 codifica uma proteinase funcional que constitui apenas 20% de Saps isoladas e a expressão de genes SAPP1-3 varia em diferentes isolados clínicos de C.

parapsilosis (SILVA et al., 2011).

As fosfolipases atuam invadindo as células hospedeiras, provocando danos nos tecidos, ruptura das membranas das células epiteliais e permitindo que as hifas penetrem para o citoplasma (MATTEI et al., 2013). A atividade de fosfolipases é estudada em C. albicans utilizando vários sistemas experimentais de virulência.

O papel das fosfolipases na patogênese de C. parapsilosis é menos clara e pouco estudada (TROFA; GÁCSER; NOSANCHUK, 2008; SILVA et al., 2010). Resultados contraditórios são relatados nas pesquisas, nas quais há atividade de fosfolipases em até 51%

dos isolados de C. parapsilosis, outras não apresentam esta atividade (TROFA; GÁCSER;

NOSANCHUK, 2008).

Outras duas importantes enzimas hidrolíticas produzidas por espécies do gênero Candida são a gelatinase e a catalase. A gelatinase é também chamada de metaloendopeptidase extracelular, é codificada pelo gene gelE e hidrolisa gelatina, colágeno, caseína, hemoglobina e outros compostos bioativos (BRANCO et al., 2012). Também foi reportado que a gelatinase secretada por C. albicans desempenha importante papel na degradação de matriz extracelular córnea em testes em coelhos (ZHAI; XIE; DONG, 2007). Duarte et al. (2011) estudando o aumento da expressão de queratinases e outras peptidases em C. parapsilosis mutantes observou atividade de gelatinase a 60 kDA em zimogramas com substratos proteicos.

A catalase é um importante mecanismo enzimático usado por um micro-organismo contra danos oxidativos (LINARES et al., 2006). O oxigênio é uma molécula indispensável no metabolismo da maioria dos organismos aeróbicos, mas durante a fosforilação oxidativa nas mitocôndrias (uma etapa da respiração celular) são geradas como subprodutos espécies reativas de oxigênio, tais como peróxido de hidrogênio e superóxido, e estes degradam compenentes celulares, como proteínas, lipídeos e DNA. Para reduzir a toxicidade das espécies reativas de oxigênio os micro-organismos patogênicos possuem enzimas antioxidantes, como a catalase, que decompõe peróxido de hidrogênio (NAKAGAWA, 2008).

Foi observado por Nakagawa (2008), que isolados de C. albicans sem produção de catalase apresentam também a perda da habilidade para produção de hifas, sendo que a produção de hifas está relacionada com o aumento da virulência das leveduras patogênicas. Nas espécies de C. parapsilosis, os estudos de Miyasaka, Unterkircher e Shimizu (2008) demonstraram variação na produção de catalase para esta espécie.

2.2.2 Adesão

A adesão dos micro-organismos para sediar as células e tecidos é o primeiro evento necessário para a colonização inicial ou estabelecimento da infecção. Além disso, o contato de superfície microbiana pode desencadear vários comportamentos celulares, incluindo a formação de biofilme, o que também está fortemente associado com a candidose (DE PAULA et al., 2014).

A adesão aos tecidos epiteliais facilita a colonização de biomateriais e a iniciação da formação de biofilme, de modo que demonstra ser um importante fator de virulência. C.

parapsilosis adere a células epiteliais e biomateriais de maneira semelhante a C. albicans e essa adesão pode ser reduzida por nistatina. Variações na adesão em isolados de pele são mais comuns do que em isolados sistêmicos (PAMMI et al., 2013).

O processo de aderência é essencial para os membros do gênero Candida para desenvolver o seu potencial patogênico, uma vez que se desencadeia o processo que leva à colonização e permite a sua persistência no hospedeiro. Por exemplo, os isolados de Candida relativamente mais patogênicos apresentam maior capacidade de aderência em células epiteliais orais humanas (SPECIAN et al., 2013).

C. albicans tem um conjunto especializado de proteínas (adesinas) que medeiam a adesão a outras células de C. albicans, outros micro-organismos, superfícies abióticas e células do hospedeiro. A espécie C. albicans conta com adesinas ALS (agglutinin like sequence) que são proteínas que formam uma família composta por oito membros (Als1-7 e Als9).

Das oito proteínas ALS, a adesina Als3 é especialmente importante para a expressão do gene de adesão que regula o processo de infecção de células epiteliais bucais in vitro e infecção vaginal in vivo e também contribuem para a formação de biofilme agindo como adesina complementar (FRANÇOIS; DUNCAN; BERNHARD, 2013).

Atribuiu-se às adesinas o fenômeno de agregação celular como revelaram trabalhos anteriores (KING; LEE; MORRIS, 1980). A adesão seguida de agregação celular tem sido documentada em vários estudos envolvendo uma miríade de alvos biológicos. Quando C.

albicans encontra uma proteína ancorada, uma célula ou tecido, o fungo adere e então agrega (KLOTZ; LIPKE, 2010).

Dados de bioinformática indicaram uma série de genes de adesinas específicas em C.

parapsilosis (SILVA et al., 2011). Estudos recentes comparam a atuação de alguns genes relacionados à adesão entre C. albicans e C. parapsilosis. O produto do gene BCR1 (biofilm and wall cell regulator) é um fator de transcrição conservado requerido na formação de biofilme tanto em C. albicans quanto em C. parapsilosis. Alguns dos principais alvos de BCR1 em C.

albicans incluem genes que codificam adesinas e proteínas de parede celular (ALS1, ALS3, HWP1 e genes relacionados) sugerindo que BCR1 está envolvido na fase inicial da adesão e desenvolvimento de biofilme (DING et al., 2011).

Descrevendo uma análise do papel da BCR1 em C. parapsilosis, Ding et al. (2011) mostraram que C. parapsilosis gera biofilmes in vivo em modelo de cateter em ratos e que BCR1 é necessário para este processo, além disso demonstraram existir pouca sobreposição entre os alvos de BCR1 nas duas espécies.

Colonização e infecção por C. parapsilosis são dependentes da capacidade do fungo para aderir a células hospedeiras e tecidos, particularmente em superfícies mucosas. A adesão a dispositivos médicos facilita a formação de biofilme e promove danos no hospedeiro. A hidrofobicidade da superfície celular tem sido associada com a adesão inicial de C. parapsilosis para superfícies e a produção de muco foi ligada a tendência de C. parapsilosis aderir a cateteres de plástico (TROFA; GÁCSER; NOSANCHUK, 2008).

Estudos retrospectivos indicam que se sabe pouco sobre as propriedades de virulência das espécies Candida metapsilosis e Candida orthopsilosis e os seus papéis no estabelecimento / progressão da infecção (BERTINI et al., 2013).

2.2.3 Biofilme

Uma das principais propriedades de virulência das espécies de Candida associada à patogenicidade é a sua capacidade de formar biofilme em dispositivos médicos implantados.

Os biofilmes são compostos de comunidades de micro-organismos associados com uma superfície e embebidos numa matriz extracelular e acredita-se ser a forma principal de crescimento de micro-organismos na natureza (HOLLAND et al., 2014).

São extremamente resistentes à terapia antimicrobiana e o tratamento geralmente envolve a remoção do dispositivo infectado (HOLLAND et al., 2014). São cruciais ao desenvolvimento das infecções, uma vez que servem de nichos aos agentes patogênicos e estão associados a altos níveis de resistência a agentes antimicrobianos, de maneira que limitam a penetração das substâncias através da matriz e protegem as células da resposta imune do hospedeiro (TAMURA et al., 2007; SILVA et al., 2010).

A formação de biofilme de Candida começa com a aderência inicial de células das leveduras à superfície de dispositivos médicos, seguido da formação de microcolônias e o desenvolvimento de uma camada de hifas ou pseudohifas que se estende até o exterior. Isto é acompanhado pela formação em torno da matriz extracelular de ambas as camadas de hifas e pseudohifas das leveduras. O biofilme então se desenvolve como uma estrutura em três dimensões e consiste em um denso trabalho das leveduras e de filamentos das células profundamente embebidas na matriz extracelular composta por polissacrídeos (GEBREMEDHIN et al., 2014).

As infecções associadas a utilização de implantes médicos invasivos estão relacionadas com a formação de biofilmes nesses dispositivos. O desenvolvimento de biofilme depende do tipo e do número de células que aderem ao dispositivo e do tipo de superfície que o constitui.

A formação de biofilme inicia-se com a adesão microbiana seguida pela fase de maturação (TAMURA et al., 2007). Essa formção em C. albicans foi bem caracterizada e ocorre em várias etapas sendo constituído por uma camada compacta basal de células de levedura e uma camada mais espessa de hifas menos compactas. Em contraste, C. parapsilosis não faz hifas verdadeiras e os biofilmes são compostos de células de levedura e pseudohifas apenas. A capacidade de C.

parapsilosis para produzir biofilme também é altamente dependente do isolado (HOLLAND et al., 2014).

Em geral, a formação de biofilme e o controle genético da formação do mesmo são melhor conhecidos em C. albicans, indicando que a formação de biofilme começa com a ligação de células individuais de levedura com a superfície e é seguida pela iniciação, onde microcolônias e tubos germinativos são formados. Durante a maturação, a biomassa se expande e se acumula na matriz extracelular. Após a dispersão, células de levedura são liberadas para o meio. O passo inicial na adesão de C. albicans é controlada pelo fator de transcrição Efg1, um regulador positivo da expressão da adesina Eap1 (PANNANUSORN et al., 2014).

A produção de biofilme em C. albicans está associada com a mudança dimórfica de levedura para crescimento de hifas e a estrutura do biofilme formado envolve duas camadas distintas. Em contraste, isolados de C. parapsilosis produzem quantitativamente menos biofilme e estruturalmente menos complexo do que C. albicans. O fenótipo de pseudohifas em C. parapsilosis, no entanto, produz mais biofilme e é mais invasivo em ágar do que os isolados predominantemente sob a forma de levedura. O biofilme de C. parapsilosis pode ocorrer em diversos dispositivos médicos, incluindo cateteres venosos centrais e periféricos, de hemodiálise e cateteres de diálise peritoneal, dispositivos protéticos intracardíacos e articulações protéticas. Como é um comensal da pele humana, o organismo pode entrar em contato com o mesmo através de dispositivos médicos, antes ou durante o uso pelo paciente, particularmente em ambientes de cuidados de saúde, onde lapsos de boa higiene das mãos pode ocorrer (TROFA; GÁCSER; NOSANCHUK, 2008).

A formação de biofilme de C. parapsilosis é iniciado com a adesão de células individuais de levedura para a superfície, mesmo sob condições de crescimento, onde já seja observada uma extensa aglutinação celular. Isto indica que a levedura expressa adesinas específicas da superfície celular no início da formação de biofilme (PANNANUSORN et al., 2014).

A matriz extracelular do biofilme de C. parapsilosis contém grandes quantidades de hidratos de carbono com baixos níveis correspondentes a proteínas. O biofilme é facilmente formado por isolados de C. parapsilosis cultivados em meio contendo alta concentração de glicose e lípidos e pode ser associado com o aumento da prevalência deste organismo em infecções da corrente sanguínea em pacientes que recebem nutrição parentérica (SILVA et al., 2011).

Os aminoácidos estimulam a morfogênese de células de levedura para pseudohifas em C. parapsilosis e isto pode explicar a alta incidência de infecções por C. parapsilosis em neonatos sondados que recebem nutrição parenteral ricas em soluções de aminoácidos (PAMMI et al., 2013).

A preferência seletiva da espécie para o plástico em dispositivos médicos é de particular interesse assim como a formação de biofilme aumentando a capacidade de o organismo colonizar cateteres intravenosos. Tal como C. parapsilosis, as duas espécies de Candida recentemente identificadas (C. orthopsilosis e C. metapsilosis) também são capazes de formar biofilme (SILVA et al., 2011).

3. Objetivos 3.1 Objetivo geral

Caracterizar fenotipicamente isolados de C. parapsilosis estudando seus fatores e propriedades de virulência e geneticamente por meio de análise de marcadores microssatélites e de PCR-RFLP do gene secondary alcohol dehydrogenase (SADH).

3.2 Objetivos específicos

 Avaliar a aplicabilidade da técnica de genotipagem por marcadores microssatélites e também do gene SADH para a diferenciação das espécies do complexo C. parapsilosis;

 Identificar os fatores e propriedades de virulência das espécies do complexo C.

parapsilosis;

 Verificar a associação das espécies do complexo C. parapsilosis com os fatores e propriedades de virulência por elas apresentados;

 Analisar a existência de predileção das espécies do complexo C. parapsilosis por algum sítio para colonização no ser humano.

4. Material e métodos

4.1 Natureza e obtenção dos isolados

Os isolados de Candida parapsilosis analisados foram previamente identificados pelo sistema VITEK 2 (bioMérieux, Marcy-I´Etoile, France). Foram utilizados no trabalho vinte e oito (28) isolados provenientes de secreção vaginal coletadas no Hospital da Mulher de São Luís (CEP/UNICEUMA 267/10) e outros vinte e nove (29) espécimes clínicos diferentes, recuperados em um laboratório particular da cidade de São Luís- MA e gentilmente cedidos para a Micoteca do Laboratório de Micologia Médica do Núcleo de Doenças Endêmicas e Parasitárias da Universidade Ceuma.

As culturas foram mantidas a -20ºC e recuperadas em meio ágar Sabouraud-dextrose com cloranfenicol, a 37ºC por 24 horas. Foram então estocadas em caldo BHI (Brain Heart Infusion- Difco) a 4ºC durante o período experimental (SAMBROOK et al., 2002). Os isolados refrigerados foram renovados de 15 em 15 dias para preservação de suas propriedades, neste mesmo meio de cultivo.

4.2 Identificação molecular dos isolados 4.2.1 Extração de DNA genômico

A extração foi realizada tomando-se como base a metodologia descrita por Raeder e Broda (1985) e a partir desta foram feitas adaptações não descritas por estarem sob sigilo de patente.

O DNA recuperado foi lavado em etanol 70% e ressuspendido em 40 µL de água deionizada. A qualidade e quantidade de DNA obtido foram avaliadas visualmente em gel de agarose a 0,8%.

4.2.2 Amplificação por PCR das regiões de microssatélites e do gene SADH

A seleção dos loci de microssatélites bem como a região de amplificação e o desenho dos iniciadores para PCR seguiu o protocolo feito por Sabino et al. (2010), que buscaram no DNA genômico de C. parapsilosis regiões contendo mais de 20 repetições de microssatélites em busca de elevado grau de polimorfismo; a partir disto selecionaram a sequência de microssatélites espécie específica para identificação de C. parapsilosis stricto sensu e desenharam os iniciadores, por eles denominados CP1 em alusão a C. parapsilosis.

O par de iniciadores CP1 para identificação de C. parapsilosis stricto sensu, previamente reconhecidos no Database do Sanger Institute, está de acordo com a tabela a seguir:

A reação de amplificação por PCR foi feita com 25 ng de DNA genômico em um volume de reação de 25 µL contendo tampão 1X PCR Master mix buffer (Promega); 0,25 µM de cada iniciador (Invitrogen). No termociclador (Biorad) adotou-se o programa inicial de um pré- aquecimento de 95ºC por 2 minutos, seguido de 28 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 54ºC por 30 segundos, 72ºC por 1 minuto e mais uma fase de extensão final a 72ºC por 7 minutos.

Avaliou-se a reação de PCR visualmente por meio de gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio (10mg/mL) e visualizado em luz ultravioleta.

Para a identificação dos isolados de C. metapsilosis e C. orthopsilosis seguiu-se o protocolo de Cantón et al. (2011), utilizando-se dois iniciadores para amplificação do gene SADH, de acordo com a tabela 2, com posterior RFLP da sequência amplificada.

Tabela 2 Sequência dos iniciadores para região do gene SADH para C. metapsilosis e C.

orthopsilosis

Iniciadores Sequência

S1F 5’- TTGATGCTGTTGGATTGT-3’

S1R 5’-CAATGCCAAATCTCCCAA-3’

Microssatélite Acesso (Sanger Institute)

Sequência dos iniciadores Repetição motifs

CP1 Cpara1131

h11.p1k

FWD:5’ -AAAGTGCTACACACGCATCG-3’

REV: 5-GGCTTGCAATTTCATTTCCT-3’

(AAG)27

Fonte: CANTÓN et al., 2011 Fonte: SABINO et al., 2010

Tabela 1 Sequência dos iniciadores da região de microssatélites específicos para Candida parapsilosis stricto sensu

A reação de amplificação foi realizada segundo o trabalho de referência (CANTÓN et al., 2011) com adaptações na qual foram usadas um volume total de 25µL para a reação: 50 ng de DNA genômico, tampão 1X PCR Master mix buffer (Promega) e 0,25 µM de cada iniciador (Invitrogen). O programa adotado no termociclador (Biorad) contém uma fase de prévio aquecimento de 95ºC por 1 minuto, 30 ciclos com 1 minuto de desnaturação a 95ºC, 1 minuto e 30 segundos de hibridização dos iniciadores a 46ºC e 1 minuto e 30 segundos de extensão a 72ºC. Após essa fase, tem mais um ciclo adicional com 10 minutos a 72ºC para completar a reação. A visualização do produto amplificado foi verificada por eletroforese em gel de agarose 1,2%, corado com brometo de etídio (10mg/mL) e visualizado em luz ultravioleta.

4.2.3 RFLP do gene SADH

O produto de amplificação obtido com a PCR para o gene SADH, com fragmentos de 716 pares de bases, foi digerido com a enzima de restrição Ban I (Promega), segundo as recomendações do fabricante, em um volume de 20 µL contendo 12µL de produto amplificado e 20 unidades da enzima. A reação foi incubada a 50ºC por 2 horas. O produto da digestão foi separado em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídio (10mg/mL) e visualizado em luz ultravioleta. Na análise do produto digerido, os isolados de C. parapsilosis stricto sensu apresentam um sítio de restrição, com fragmentos de 516 e 200 pares de bases, aqueles pertencentes à espécie C. orthopsilosis não apresentam sítios de restrição e os isolados de C.

metapsilosis apresentam três sítios de restrição, com fragmentos de 416, 200 e 100 pares de bases.

4.3 Análise das propriedades e fatores de virulência

Foram testadas as propriedade de virulência quanto às capacidades de adesão e produção de biofilme dos isolados. Além disso, foram testadas as produções de exoenzimas como hemolisinas, fosfolipases, proteinases, catalase e gelatinase por parte das mesmas.

4.3.1 Capacidade de Adesão a vidro

Para a análise da aderência a vidro, lamínulas de vidro redondas estéreis (Glasscyto) foram colocadas em placas de microtitulação de 24 poços (TPP Zellkultur Testplatte 24F). Um poço foi utilizado como controle recebendo apenas meio de cultura para se verificar a integridade do meio. Os demais poços receberam 40µL de inóculo (10⁶UFC/mL) além de 960 µL de BHI (Brain Heart Infusion – Acumedia Manufactures) suplementado com 6% de glicose.

As placas de microtitulação foram incubadas a 37°C durante 8 horas. Posteriormente, o meio de incubação foi removido e as microplacas lavadas com água ultrapura para remover as células não aderidas. As lamínulas foram coradas com 1% (v/v) de violeta cristal por cinco minutos, posteriormente lavadas com água ultrapura estéril para remover o excesso de corante, e colocadas sobre lâminas para visualização em microscopia óptica (NIKON Eclipse E100). O experimento foi realizado em triplicata.

A classificação da capacidade de aderência a vidro foi feita por dois observadores, para melhor certificação dos resultados, de acordo com a quantidade de células aderidas nas lamínulas por campo, em um microscópio óptico, com aumento de 1000 vezes (BIASOLI;

TOSELLO; MAGARO, 2002; MENEZES et al., 2013).

Para análise dos resultado foram contadas as leveduras aderidas em cada lamínula, no máximo de 70 campos, escolhidos aleatoriamente e em sentido unidirecional. Considerou-se negativo quando não se observou nenhuma levedura por campo, num total de 70 campos observados; fraco, quando houve de uma a 10 leveduras aderidas às lamínulas num total de 50 campos avaliados; moderada, quando houve mais que 10 leveduras aderidas em 30 campos; e, forte quando houve mais de 25 leveduras aderidas em 20 campos analisados.

4.3.2 Formação de biofilme

Para os testes de formação de biofilme usou-se o método proposto por Shin et al. (2002) com adaptações de Ferro et al. (2012). Foram colocados em microplacas de 96 poços 180 µL de BHI suplementado com 6% de glicose e adicionados 20µL de suspensão do inóculo (10⁶UFC/ml) a cada poço em triplicata, incubados a 37°C por 24 horas. Após a incubação foi removido o conteúdo dos poços, a microplaca foi lavada três vezes com água destilada estéril.

Foi adicionado 200 µL de água destilada a cada poço e 1% de violeta cristal para coloração e a realização da leitura por espectrofotometria.

As leituras espectrofotométricas foram realizadas em 450 nm com uma leitora de microplacas. Baseando-se na densidade óptica (D.O.i) produzida pelos isolados e tomando como base o controle negativo (D.O.c) os isolados foram classificados de acordo com as categorias representadas na Tabela 3. Cada isolado foi testado em triplicata, para evitar qualquer discrepância nos valores de absorbância obtidos.

Tabela 3 Classificação da formação de biofilme

4.3.3 Produção de hemolisinas

Para os testes de produção de hemolisinas foi usado o método de análise em placa descrito por Branco et al. (2012). As leveduras em suspensão (3µL), preparadas em salina 0,85% comparada com escala de Mc Farland 0.5 (1 x 10⁶ células/mL), foram inoculadas em Ágar Sabouraud Dextrose (Difco), acrescido de 3% de glicose e 5% de sangue de carneiro desfibrinado e permaneceram incubadas por 48 horas a 37ºC. A presença de um halo transparente em torno da colônia indica a atividade hemolítica positiva. A intensidade da produção do fator hemolítico foi estimada quantificando o diâmetro do halo mais a colônia em centímetros em relação ao tamanho da colônia (índice hemolítico ou H.I.). Os isolados hemolíticos foram classificados de acordo com o H.I. como positivos (H.I.<1,5 cm) ou fortemente positivos (H.I.>1,5cm). Os experimentos foram feitos em triplicata e os resultados foram dados como a média dos valores obtidos.

4.3.4 Produção de fosfolipases

Para os testes de fosfolipase foi usado o método em placa com gema de ovo descrito por Price, Wilkinson e Gentry (1982) com modificações de D’Eça Jr. et al. (2011). O meio consiste em ágar Sabouraud dextrose acrescido de 1M de cloreto de sódio; 0,5M de cloreto de cálcio e 2% de gema de ovo. O meio foi inoculado com 3µL de inóculo em salina 0,85%, comparado com escala de McFarland 0.5 (1 x 10 ⁶ células/mL). As placas de Petri foram incubadas a 37ºC e o diâmetro das colônias e da área de precipitação mais a colônia foram medidos 7 dias após a inoculação. Os experimentos foram feitos em triplicata. As medidas e cálculos da zona de precipitação (Pz) da fosfolipase foram feitos de acordo com o descrito por Price et al. (1982), a partir da média dos valores obtidos na triplicata, os coeficientes encontrados foram classificados em 5 grupos: Pz = 1, negativo; Pz entre 0.9 e 0,99, fraco; Pz entre 0.80 e 0.89, moderado; Pz entre 0.70 e 0.79, forte; Pz < 0.70, muito forte.

Classificação Densidade

óptica

Não produtor D.O.i < D.O.c

Produtor pobre D.O.c < D.O.i ≤ (2x D.O.c.)

Produtor moderado (2x D.O.c) < D.O.i ≤ (4x D.O.c)

Produtor forte (4x D.O.c) < D.O.i

Fonte: O autor, 2015

4.3.5 Produção de proteinases

Para análise de produção de proteinases usou-se o método de Aoki et al. (1990) com modificações de D’Eça Jr. et al. (2011). O teste foi feito em placas com 140 mL do meio de cultura ágar Sabouraud dextrose contendo 60 mL de solução composta por 0,04g de MgSO47 H2O; 0,5 g de K2HPO4; 1g de NaCl; 0,2g de extrato de levedura; 4g de glicose e 0,5g de BSA, pH ajustado para 4,0 e esterilizada por filtração. As placas foram inoculadas com 3µL de salina 0,85 % contendo células de leveduras, comparada a escala de McFarland 0.5 (1 x 10 ⁶ células/mL), e incubadas a 37ºC por 7 dias.

A atividade de proteinases foi medida e calculada de acordo com o método descrito por Price, Wilkinson e Gentry (1982) em termos da proporção de diâmetro da colônia e a colônia mais a zona de precipitação (Pz) das proteinases. Os testes foram feitos em triplicata e tirada a média do valor de Pz, agrupando-se os coeficientes obtidos em 5 grupos: Pz =1, negativo; Pz entre 0,9 e 0,99, fraco; Pz entre 0,80 e 0,89, moderado; Pz entre 0,7 e 0,79, forte e Pz < 0.70, muito forte.

4.3.6 Produção de catalase

O teste de catalase foi feito segundo Trabulsi e Altherthum (2005) e Branco et al. (2012).

Os isolados de Candida foram transferidos para lâmina de microscópio e depois 1 gota (0,05 mL) de 3% de peróxido de hidrogênio foi adicionada e a imediata formação de bolhas na superfície da lâmina corresponde a reação positiva para catalase, indicando a conversão de H2O2

em água e O2.

4.3.7 Produção de gelatinase

Para análise de presença de gelatinase foi usado o teste proposto por Kurtzman et al.

(1998) com modificações de Branco et al. (2012). Os isolados de Candida foram inoculados em BHI e depois de incubados a 37ºC por 24 horas, os inóculos foram profundamente semeados em tubos contendo 5 mL de uma solução de gelatina (Difco) a 12% preparada em tampão PBS com pH 7,4. Depois de incubadas a 37ºC por 24 horas o teste é considerado positivo para gelatinase quando ocorre a liquefação da gelatina.

4.4 Análise estatística

Os dados foram analisados com o programa estatístico BioStat 5.8.4 (versão 2009) de AnalystSoft Inc. Inicialmente foram feitas tabelas de frequência das variáveis e posteriormente, para os cruzamentos das variáveis classificatórias foi aplicado o teste do qui-quadrado de independência (χ²). Depois aplicou-se o teste não paramétrico de correlação de Spearman. Em todos os testes o nível de significância (α) aplicado foi de 5%, ou seja, considerou-se significativo quando p<0,05.

5. Resultados e discussão

5.1 Identificação molecular dos isolados

A partir dos iniciadores CP1 foram identificados 41 isolados como C. parapsilosis stricto sensu. Destas positivas, 8% dos isolados foram heterozigotos, ou seja, apresentaram formação de duas bandas em gel de agarose 1% com tamanhos diferentes (de 290 e 270 pb) e 92% foram homozigotos, apresentando apenas uma banda correspondente a 290 pb, como se pode observar na figura 1.

Figura 1 Gel de agarose mostrando os perfis da reação PCR para a detecção de microssatélite CP1 em isolados de C. parapsilosis stricto sensu: L- DNA ladder 100 pb; 1, 4, 5, 6, 8, 9 e 10- sangue; 2-ponta de cateter; 3 e 7- urina

Esses resultados obtidos eram esperados uma vez que os iniciadores aqui trabalhados são espécie-específicos para C. parapsilosis stricto sensu (SABINO et al., 2010). Também segundo os autores um ou dois fragmentos de PCR por locus são obtidos para cada isolado, uma vez que C. parapsilosis é uma espécie diploide onde cada fragmento é atribuído para um alelo. Assim os isolados que mostram dois produtos de PCR são considerados heterozigotos, enquanto que aqueles que apresentam um único produto de amplificação são considerados homozigotos.

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Fonte: O autor (2015) 300 pb

200 pb

290pb 300pb

200pb

300 pb

Em Sabino et al. (2010), a análise de 233 isolados mostrou que 73% dos isolados amplificados com CP1 foram heterozigotos, diferente dos resultados obtidos no presente trabalho, sendo um resultado possível devido à grande variação na repetição da sequência de microssatélites nos loci polimórficos.

O DNA dos 16 isolados restantes que não foram amplificados com os iniciadores para o marcador CP1 foram submetidos a reações de amplificação para detecção do gene SADH (Figura 2). O produto amplificado foi submetido a digestão enzimática com Ban I (Figura 3) e então se observou que apenas 2 isolados apresentaram o perfil de digestão enzimática para as espécies C. orthopsilosis e 1 isolado para C. metapsilosis, revelando que os iniciadores CP1 não foram capazes de identificar todas as C. parapsilosis stricto sensu no grupo analisado.

Sabino et al. (2010) relataram que o uso dos iniciadores CP1 constitui um método de fácil execução, com alto poder discriminatório e ideal para estudos de identificação em larga escala, porém o presente trabalho utilizando a mesma metodologia não conseguiu a identificação de 16 isolados, sendo necessária a aplicação de outra metodologia para identificação destes. Tavanti et al. (2007) e Cantón et al. (2011) relataram alta reprodutibilidade e eficácia da técnica com o gene SADH para identificação de C. orthopsilosis e C. metapsilosis em isolados inequivocadamente atribuídos a espécie C. parapsilosis.

Fonte: O autor (2015)

L 1 2 3 4 5 6 7

800 pb

700 pb 716 pb

Figura 2 Gel de agarose mostrando a reação de PCR do gene SADH em isolados de C.

parapsilosis: L- DNA ladder 100 pb; 1- controle negativo; 2- isolado de sítios não identificado;

3 a 7- isolados de secreção vaginal

5.2 Frequência e distribuição dos isolados

Foram utilizados neste estudo 57 isolados recuperados a partir de espécimes clínicos de sangue, ponta de cateter, urina, secreção vaginal e sítios com baixa frequência de isolados organizados no grupo Outros (líquido ascítico, fezes e sítios desconhecidos) (Tabela 4).

Tabela 4 Distribuição dos isolados de C. parapsilosis por espécimes clínicos.

Espécimes clínicos Número de isolados n (%)

Sangue 8 (14)

Ponta de cateter 10 (17)

Urina 5 (9)

Secreção Vaginal 28 (49)

Outros 6 (11)

Total 57

516pb

200pb

716pb

416pb

Fonte: Próprio autor (2015)

200pb

Figura 3 Gel de agarose 2% mostrando o perfil de reação RFLP com enzima de restrição Ban I: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 9- C. parapsilosis stricto sensu; 5- C. orthopsilosis; 8- C.

metapsilosis; L- DNA ladder 100 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 L

516pb

200pb

100pb

500pb

100pb

Destes isolados trabalhados, 54 foram identificados molecularmente como sendo C.

parapsilosis stricto sensu, estando presente em todos os espécimes clínicos estudados, sendo que todos os isolados de sangue, ponta de cateter e urina pertenciam a esta espécie e, ainda, 27 isolados de secreção vaginal e 4 isolados do grupo outros também foram pertencentes a mesma.

Apenas um isolado foi identificado como C. metapsilosis proveniente de um sítio não identificado e dois isolados como C. orthopsilosis, sendo um provenientes de sítio não identificado e um de secreção vaginal (Figura 4), não havendo relação estatística significante entre a espécie e o sítio do isolado.

Figura 4 Distribuição dos isolados estudados de acordo com as espécies do complexo C.

parapsilosis e os espécimes clínicos

C. parapsilosis C. metapsilosis C. orthopsilosis 0

10 20 30

Sangue P.cateter Urina S.vaginal Outros

Espécies

Número de isolados

De acordo com os estudos de Tavanti et al. (2010) e Sabino et al. (2011), isolados de C.

parapsilosis stricto sensu são mais comuns que as outras duas espécies do complexo “psilosis”, corroborando com os resultados obtidos neste trabalho que mostram que a maioria dos isolados pertenciam a espécie de C. parapsilosis stricto sensu.

Resultados obtidos aqui também mostraram que alguns isolados previamente identificados como C. parapsilosis eram na verdade pertencentes a espécies C. metapsilosis e C. orthopsilosis. Os dados da epidemiologia global indicam que aproximadamente 10% das infecções atribuídas a C. parapsilosis são relacionadas na verdade a C. orthopsilosis e C.

metapsilosis (CANTÓN et al., 2011; ROMEO et al., 2012).